本发明涉及一种昆虫病原线虫的快速清洗方法，属于生物繁殖培养
技术领域：
。
背景技术：
：昆虫病原线虫是在自然界寄生于昆虫体内的线虫，包括斯氏线虫科[steinernematidaecarpocapsae(sc-2)]和异小杆线虫科[herorhabditidaebacteriophora(hb-1)]；这类线虫以第三龄感染期虫态(infectivejuvenile，ij)从昆虫的气孔、口部、肛门或节间膜进入虫体内，随后释放出自身携带的xenorhabdus属(与斯氏线虫共生)或photorhabdus属(与异小杆线虫共生)共生细菌，线虫及共生细菌繁殖并释放有毒物质导致昆虫死亡。昆虫病原线虫能有效防治农林、园艺植物的土栖和钻蛀性害虫，如韭蛆、蛴螬、桃小食心虫、黄曲跳甲等，具有寄主广泛，致病力强，并且对人畜无害的特点，是一种新型的生物杀虫剂。昆虫病原线虫培养方式主要分为活体培养和离体培养两种；其中，离体培养又根据培养基质状态的不同，分为固体培养和液体培养。固体培养方法对技术的难度和培养条件的要求明显低于液体培养，固体培养方法生产的线虫致病力、活力也要优于液体培养方法，因此，固体培养方法特别适合新入行业的公司，或已成熟的公司在市场需求量大时快速扩大规模；进而，昆虫病原线虫的固体培养方法具有很好的发展前景。现有固体培养方法主要经过共生菌的分离制备、线虫繁殖、收获、清洗及存储等过程，清洗是其中重要的步骤，目的是尽可能多地、完好地将线虫从固体培养物中快速分离下来，以获得纯度高、浸染力和成活率好的昆虫病原线虫产品。现有的昆虫病原线虫的清洗方法多采用静置浸泡的方法，线虫的提取时间较长，提取率仅为80-90％，有待进一步提高。如中国专利文献cn106172259a公开了一种昆虫病原线虫清洗方法，步骤包括：(a)将线虫连同固体培养物浸泡在装有清水的较大容器中，容器中设有活动筛网，容器中带有通气震荡装置；(b)静置分离，让线虫通过筛网，留下海绵等杂质，95％左右的感染期线虫从培养物中爬出；(c)产业化生产中将除去杂质的线虫原液按10:1的比例加入硅藻土粉，通过压滤机进行固液分离，压滤机压力设置小于3公斤，所得含线虫的硅藻土粉进行计数分包存储。上述发明针对的是昆虫病原线虫固体培养方法的线虫收获清洗储存问题，该方法能够达到较好的收获效果，对线虫的损伤小，后期制成的线虫产品中线虫成活率高。但该发明中昆虫病原线虫清洗方法采用静置浸泡的方法，线虫的提取时间较长，提取率也有待提高，且并未涉及昆虫病原线虫的浸染力和成活率等相关数据。技术实现要素：针对现有技术存在的不足，本发明提供一种昆虫病原线虫的快速清洗方法，针对的是昆虫病原线虫固体培养完成后线虫快速清洗收获储存问题。本发明方法简单，所用器具易得，能够有效提高线虫的回收效率，缩短回收时间，对线虫损伤小，提高线虫的质量和品质，所得线虫成活率高、侵染力强。本发明的技术方案如下：一种昆虫病原线虫的快速清洗方法，包括步骤：(1)清洗：将昆虫病原线虫固体培养方法得到的培养混合物放入到洗衣机的洗衣桶中，通过设置洗衣机洗衣程序，依次进行单次洗涤-脱水-漂洗-脱水或单次洗涤-脱水-漂洗-脱水-漂洗-脱水，同时收集洗衣机排出液；(2)浓缩分离：将步骤(1)得到的排出液静置沉淀，弃上清；然后沉淀物用蒸馏水搅拌清洗，得到昆虫病原线虫浓缩液；(3)保存：向步骤(2)得到的昆虫病原线虫浓缩液中加入苯并异噻唑啉-3-酮，然后用海绵吸附，密封包装后低温保存。根据本发明，步骤(1)中，昆虫病原线虫固体培养方法得到的培养混合物是指：采用固体培养方法培养昆虫病原线虫，培养完成后培养容器中所得物质，包括培养基、碎海绵、昆虫病原线虫以及共生细菌；所述昆虫病原线虫的固体培养方法按现有技术即可。根据本发明优选的，步骤(1)中，采用固体培养方法培养昆虫病原线虫18～30天后得到培养混合物；优选的，采用固体培养方法培养昆虫病原线虫20～26天后得到培养混合物。上述培养时间为昆虫病原线虫培养的最佳时间，所得培养混合物中，感染期线虫产量最高，其它虫态的线虫比例最小。根据本发明优选的，步骤(1)中，所述洗衣机为波轮式单筒全自动洗衣机。根据本发明优选的，步骤(1)中，洗衣机中的注水量与培养混合物的体积比为1～4：1。根据本发明优选的，步骤(1)中，所述单次洗涤的转速均为30～50rpm，所述漂洗的转速均为30～50rpm，所述脱水的转速均为300～500rpm。根据本发明，步骤(1)中，所述培养混合物中90～98％的昆虫病原线虫在洗衣机排出液中。根据本发明优选的，步骤(1)中，所述单次洗涤时间为4～12min，优选为8min；每次漂洗时间为3～5min，优选为4min；每次脱水时间为1～3min，优选为1min；清洗总时间为9～31min。根据本发明优选的，步骤(2)中，排出液是在倾斜水槽中静置沉淀20～30min；所述水槽为长方体水槽，槽内的长宽比为2～3:1，水槽和水平面之间的夹角为10～45°；沿倾斜方向，水槽较低的侧面上设置有清液排出口，所述清液排出口距水槽最底部的距离为5～20cm；水槽最底部设置有昆虫病原线虫浓缩液排出口；所述排出液静置沉淀后，上清液经清液排出口流出。优选的，步骤(2)中，所述搅拌清洗是在倾斜水槽中进行；用蒸馏水搅拌清洗1～5次，搅拌清洗时间为1～2min；每次搅拌清洗后静置5～20min，上清液经清液排出口流出。根据本发明优选的，步骤(3)中，所述苯并异噻唑啉-3-酮的加入量是昆虫病原线虫浓缩液质量的0.5～2％。苯并异噻唑啉-3-酮的作用是抑制真菌繁殖。根据本发明优选的，步骤(3)中，所述昆虫病原线虫浓缩液和海绵的质量比为5～9:1～5。根据本发明优选的，步骤(3)中，所述海绵由碎海绵组成，每个碎海绵的体积为0.2～27cm3，优选为0.5～8cm3；每个碎海绵的孔隙密度为25～35ppi。根据本发明优选的，步骤(3)中，所述低温保存是在4～10℃条件下保存。有益效果如下：1、本发明针对的是昆虫病原线虫固体培养方法中线虫清洗收获储存问题。本发明的清洗方法简单，所用器具易得，借助波轮式洗衣机清洗程序，通过波轮式洗衣机特有的清洗原理，促使线虫爬出并沉淀，再加上漂洗和脱水程序，尽可能完全地促进线虫的爬出，并且清洗过程所用时间短(9-31min)；本发明清洗过程中的脱水过程，可以进一步促进线虫的完全爬出，提高线虫的提取率，从而缩短清洗所用时间；并且，本发明是将培养混合物直接加入洗衣机的洗衣桶内进行清洗，方法简单并有利于线虫的完全爬出。与传统的静置浸泡的清洗方法相比，本发明方法能够极大地缩短清洗回收时间，提高线虫的回收效率，提高线虫产量；所得线虫质量和品质好，活力高、成活率高、侵染力强。2、本发明采用的清洗方法清洗力度和时间适中，对线虫的生理指标不产生负面影响，能够提高浸染期线虫的质量和品质；本发明优选采用倾斜水槽进行静置沉淀和搅拌清洗，方法简单；后续利用海绵进行储存，海绵可重复利用，节约成本。本发明的清洗方法对昆虫病原线虫的规模化生产和对地下害虫的生物防治具有非常重要的意义。3、传统昆虫病原线虫的清洗方法为静置浸泡法，清洗步骤时间长(2-3小时)，线虫的提取时间较长，提取率仅为80-90％；而本发明清洗步骤最长31min内即可完成，线虫的提取率可达90～98％，提取率较高。具体实施方式以下通过具体的实施例对本发明的内容作出进一步详细说明，但不应将此理解为本发明的内容仅限于下述实施例。同时下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂、材料、器具，如无特殊说明，均为现有技术，可从商业途径获得。实施例中，所用洗衣机为三洋(sanyo)db6035bxs波轮式单筒全自动洗衣机。按现有技术采用固体培养方法培养昆虫病原线虫hb-1，培养22天后得到培养混合物。实施例1一种昆虫病原线虫的快速清洗方法，包括步骤：(1)清洗：将上述得到的培养混合物放入洗衣机的洗衣桶中(注水量为40l)，洗衣机中的注水量与培养混合物的体积比为2：1；通过设置洗衣机洗衣程序依次进行单次洗涤8min-脱水1min-漂洗4min-脱水1min-漂洗4min-脱水1min，清洗总时长为19min，并收集洗衣机排出液；所述单次洗涤的转速均为40rpm，所述漂洗的转速均为40rpm，所述脱水的转速均为300rpm；96％左右的线虫在排出液中。(2)浓缩分离：将步骤(1)得到的排出液在倾斜水槽中静置沉淀20min；所述水槽为长方体水槽，槽内的长宽比为2:1，水槽和水平面之间的夹角为30°；沿倾斜方向，水槽较低的侧面上设置有清液排出口，所述清液排出口距水槽最底部的距离为10cm；水槽最底部设置有昆虫病原线虫浓缩液排出口；排出液静置沉淀后，上清液经清液排出口流出；再加入蒸馏水搅拌清洗2次，搅拌清洗时间为2min，每次清洗后静置10min，上清液经清液排出口流出后得到干净的昆虫病原线虫浓缩液。(3)保存：向步骤(2)得到的昆虫病原线虫浓缩液中加入苯并异噻唑啉-3-酮，苯并异噻唑啉-3-酮的加入量是昆虫病原线虫浓缩液质量的0.8％，然后用1.54kg碎海绵吸附(每个碎海绵的形状为正方体，体积为8cm3，孔隙密度为30ppi)，昆虫病原线虫浓缩液和海绵的质量比为7:3，密封包装后放于4℃的冷库中保存。实施例2一种昆虫病原线虫的快速清洗方法，包括步骤：(1)清洗：将上述得到的培养混合物放入洗衣机的洗衣桶中(注水量为40l)，洗衣机中的注水量与培养混合物的体积比为3：1；通过设置洗衣机洗衣程序依次进行单次洗涤4min-脱水2min-漂洗3min-脱水2min，清洗总时长为11min，并收集洗衣机排出液；所述单次洗涤的转速均为40rpm，所述漂洗的转速均为40rpm，所述脱水的转速均为500rpm；95％左右的线虫在排出液中。(2)浓缩分离：将步骤(1)得到的排出液在倾斜水槽中静置沉淀25min；所述水槽为长方体水槽，槽内长宽比为2.5:1，水槽和水平面之间的夹角为10°；沿倾斜方向，水槽较低的侧面上设置有清液排出口，所述清液排出口距水槽最底部的距离为5cm；水槽最底部设置有昆虫病原线虫浓缩液排出口；排出液静置沉淀后，上清液经清液排出口流出；再加入蒸馏水搅拌清洗1次，搅拌清洗时间为2min，每次清洗后静置5min，上清液经清液排出口流出后得到干净的昆虫病原线虫浓缩液。(3)保存：向步骤(2)得到的昆虫病原线虫浓缩液中加入苯并异噻唑啉-3-酮，苯并异噻唑啉-3-酮的加入量是昆虫病原线虫浓缩液质量的0.5％，然后用1.54kg碎海绵吸附(每个碎海绵的形状为正方体，体积为8cm3，孔隙密度为30ppi)，昆虫病原线虫浓缩液和海绵的质量比为5:3，密封包装后放于6℃的冷库中保存。实施例3一种昆虫病原线虫的快速清洗方法，包括步骤：(1)清洗：将上述得到的培养混合物放入洗衣机的洗衣桶中(注水量为40l)，洗衣机中的注水量与培养混合物的体积比为4：1；通过洗衣机快速洗衣程序依次进行单次洗涤12min-脱水2min-漂洗5min-脱水2min-漂洗5min-脱水2min，清洗总时长为28min，并收集洗衣机排出液；所述单次洗涤的转速均为40rpm，所述漂洗的转速均为40rpm，所述脱水的转速均为500rpm；97％左右的线虫在排出液中。(2)浓缩分离：将步骤(1)得到的排出液在倾斜水槽中静置沉淀30min；所述水槽为长方体水槽，槽内的长宽比为3:1，水槽和水平面之间的夹角为45°；沿倾斜方向，水槽较低的侧面上设置有清液排出口，所述清液排出口距水槽最底部的距离为10cm；水槽最底部设置有昆虫病原线虫浓缩液排出口；排出液静置沉淀后，上清液经清液排出口流出；再加入蒸馏水搅拌清洗4次，搅拌清洗时间为1min，每次清洗后静置15min，上清液经清液排出口流出后得到干净的昆虫病原线虫浓缩液。(3)保存：向步骤(2)得到的昆虫病原线虫浓缩液中加入苯并异噻唑啉-3-酮，苯并异噻唑啉-3-酮的加入量是昆虫病原线虫浓缩液质量的1.5％，然后用1.54kg碎海绵吸附(每个碎海绵的形状为正方体，体积为8cm3，孔隙密度为30ppi)，昆虫病原线虫浓缩液和海绵的质量比为9:4，密封包装后放于10℃的冷库中保存。对比例1一种昆虫病原线虫的清洗方法，采用静置沉淀法。将上述得到的培养混合物浸泡在装有40l清水的倾斜水槽(所述倾斜水槽结构如实施例1所述)中，水槽中设有活动筛网并带有通气装置，静置沉淀3h，让线虫从海绵中爬出，线虫通过筛网留下海绵等杂质，将筛网连同固体培养物移走，线虫沉降到水槽的底部，上清液经清液排出口流出；再加入蒸馏水搅拌清洗2次，搅拌清洗时间为2min，每次清洗后静置10min，上清液经清液排出口流出后得到干净的昆虫病原线虫浓缩液。保存步骤如实施例1所述。对比例2一种昆虫病原线虫的清洗方法，采用振荡清洗法。方法同对比例1，不同之处在于，水槽水平放置在振荡装置上，震荡幅度为50rpm/h，震荡清洗2h；其它步骤与对比例1一致。对比例3一种昆虫病原线虫的清洗方法，如实施例1所述，所不同的是：清洗程序为单次洗涤20min-脱水5min-漂洗10min-脱水5min-漂洗10min-脱水5min，清洗总时长为55min；其它步骤与实施例1一致。对比例4一种昆虫病原线虫的清洗方法，如实施例1所述，所不同的是：清洗程序为单次洗涤8min--脱水1min，清洗总时长为9min；其它步骤与实施例1一致。对比例5一种昆虫病原线虫的清洗方法，如实施例1所述，所不同的是：清洗程序为：单次洗涤45min后，收集排出液；然后加入40l水，单次洗涤45min后，收集排出液；再加入40l水，单次洗涤45min后，收集排出液；其它步骤与实施例1一致。试验例1线虫产量计算密封包装后放于4℃的冷库中保存实施例1和对比例1-5得到的昆虫病原线虫浓缩液采用梯度稀释法计算产量。将1ml浓缩液梯度稀释3次，每次稀释倍数10倍，取2ml稀释后的浓缩液到6孔细胞培养板中，用体视显微镜观测计数，并计算昆虫病原线虫浓缩液中线虫总产量，结果如表1所示。表1不同清洗方法对线虫产量的影响由表1可以看出，对比例5和对比例3的清洗程序所收集的昆虫病原线虫的浓缩液中，线虫数量最多，且线虫提取率最高，均为97％，但清洗时间较长，分别为135min和55min，而实施例1清洗时间仅为19min，分别较对比例5和对比例3的清洗时间缩短116min和36min，但是线虫提取率仅降低1个百分点，为96％；分别采取静置沉淀和震荡清洗方式的对比例1和对比例2的清洗时间分别为180min和120min，是所有清洗方式中时间最长和第3长的处理，但线虫提取率分别仅为86％和90％；而缺少漂洗程序的对比例4，虽然清洗时间最短，仅为9min，但所得的线虫浓缩液中线虫数量最少，线虫提取率仅为40％，是其他清洗方式处理的一半还少。由上述结果可见，本发明清洗方法能以较少的清洗时间得到较多的线虫。试验例2线虫存活率测定实施例1和对比例1-5得到的昆虫病原线虫产品于4℃的冷库中保存20d后取出，置于室温2h，解剖镜下观察线虫死亡情况；线虫经针头机械刺激无反应活动，则认为个体已经死亡，记录和计算线虫存活率。线虫存活率(％)＝(存活线虫数/线虫总数)*100％。表2不同清洗方法对线虫存活率的影响实施例1对比例1对比例2对比例3对比例4对比例5线虫存活率(％)96.389.288.779.697.790由表2可知，对比例4和实施例1所得产品中线虫存活率最高，之后依次是对比例5、对比例1、对比例2和对比例3；由上述可见，本发明清洗方法得到的线虫成活率较高。试验例3线虫浸染力的测定将实施例1和对比例1-5得到的昆虫病原线虫浓缩液分别稀释至线虫浓度为500条/ml，分别将2ml稀释的线虫浓缩液加到铺有双层滤纸的培养皿中作为处理组，并设置一不加稀释的线虫浓缩液的对照组，每皿放置10条大蜡螟，25℃下培养，24h后每隔12h调查每皿大蜡螟死亡数量，计算校正死亡率。校正死亡率(％)＝[(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)]*100表3校正死亡率数据由表3对线虫hb-1浸染力测定结果显示，培养24h后对比例1收集的线虫使大蜡螟校正死亡率最高，实施例1次之，之后依次是对比例4、对比例2、对比例5和对比例3；培养36h后除对比例3收集的线虫浸染力较差外，其余各清洗方法收集的线虫使大蜡螟校正死亡率都达到50％左右，并且本发明实施例1清洗方法所得线虫使大蜡螟校正死亡率最高；培养48h后，各清洗方法所收集的线虫使大蜡螟校正死亡率均达到95％以上，本发明实施例1清洗方法所收集的线虫使大蜡螟校正死亡率可达到100％。由上述可见，本发明清洗方法得到的线虫侵染力较强。由上述试验例1-3可知，对比例5和对比例3方法清洗充分，尽可能完全多地收集了线虫，但用时较长，且对比例3的线虫存活率和浸染率都最低，说明对比例3的清洗方法对线虫的影响较大，而对比例5中线虫存活率和浸染率都均高于对比例3，但都低于本发明的实施例1，且对比例5提取的线虫在第一天的大蜡螟校正死亡率也低于实施例1，说明综合比较，本发明的实施例1在线虫提取效率和质量方面均优于对比例5；对比例4缺少漂洗程序，清洗不完全，虽然线虫存活率和浸染率较高，但线虫产量和提取率最低；对比例1(静置沉淀)和对比例2(震荡清洗)经过长时间的浸泡清洗，线虫产量、存活率和浸染力相对较高，但线虫产量、存活率和浸染力不及本发明，且清洗时间过长，最长达3小时。而本发明实施例1所获得的线虫产量仅次于对比例5和对比例3，线虫存活率和浸染力均优于其它清洗方法，且清洗时间也仅19分钟，尤其少于对比例5、对比例1和对比例3，能够以较少的清洗时间得到高产量、存活率高、侵染力强的线虫。当前第1页12