专利名称：一种纯钛微弧氧化涂层及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种纯钛微弧氧化涂层及其应用。
背景技术：
钛及其合金是应用最广泛的骨组织替代材料，因为其具有良好的强度、韧性和生物相容性，但是其生物活性及骨诱导性能较差。对钛合金表面改性可以提高其表面的生物活性，常用的改性方法有等离子喷涂、电化学沉积、溶胶凝胶等。微弧氧化(Microarcoxidation, MAO)又称微等离子体氧化(Microplasmaoxidation, ΜΡ0)，是 一种是通过电解液与相应电参数的组合，在铝、镁、钛及其合金表面依靠弧光放电产生的瞬时高温高压作用，生长出以基体金属氧化物为主的陶瓷膜层的新技术，由于其制备方法简单，膜基结合度高，成本低、可在复杂材料上均匀制备涂层，同时可引入对生物活性有益的微量元素等优点而广受关注。钙是人体内最丰富的矿物质，参与人体整个生命过程，是人体生命之本。对骨骼的生长发育起着重要作用，可谓骨骼健康的基石。钙元素在人体生理代谢中，担负着信使的重任，几乎参加与所有细胞活动中。钙元素直接调节神经和肌肉的兴奋性。下它在人体中起着自身所能支持的各种作用。硅在水中呈偏硅酸形态被人体吸收，主要分布于人体皮肤及结缔组织之中，在骨骼化过程中具有生理上的作用，促进骨骼发育生长。硅还参与多糖的代谢，是构成一些葡萄糖氨基多糖羧酸的主要成分。硅与心血管病有关，人如缺硅，可引起关节炎、动脉硬化、冠心病等心血管病。目前尚未有在微弧氧化涂层中引入S1、Ca元素的报道，更没有将这种涂层用于细胞相容性研究的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种纯钛微弧氧化涂层及其应用。本发明所提供的纯钛微弧氧化涂层，由基体，以及与所述基体紧密结合的表面多孔的致密氧化膜组成；所述基体为钛；所述氧化膜为含有硅元素和钙元素的锐钛矿型二氧化钛；所述硅元素在所述氧化膜中的质量百分含量为2.2% ;所述钙元素在所述氧化膜中的质量百分含量为1.5%。所述孔的直径具体为2 μ m。本发明的再一个目的是提供一种制备所述纯钛微弧氧化涂层的方法。本发明所提供的制备所述纯肽微弧氧化涂层的方法，具体包括如下步骤:将钛置于电解液中，以所述钛为阳极，以不锈钢为阴极，在电压为200V、频率为600Hz、占空比为8%的条件下，氧化5min，得到所述纯钛微弧氧化涂层；所述电解液的溶质为硅酸钠、氢氧化钠、乙酸钙、乙二胺四乙酸二钠，溶剂为水；所述硅酸钠、所述氢氧化钠、所述乙酸钙、所述乙二胺四乙酸二钠和所述水的配比为14.2g:20g:8.8g:15g:9L ;所述电解液的 pH 为 7.2。在上述方法中，置于所述电解液中的钛为经过如下前处理的钛:将钛片依次经300#或800#或1500#的砂纸打磨后，用丙酮、无水乙醇、去离子水依次超声清洗、50°C烘干，得到处理后的钛。所述纯钛微弧氧化涂层在作为动物体硬组织替换材料或植入体中的应用也属于本发明的保护范围。所述动物体硬组织可为关节、骨骼、牙齿等。所述植入体可为人工关节、人工骨、脊骨矫正杆、骨髓内钉、牙科植入物或头盖骨等。所述纯钛微弧氧化涂层在作为细胞培养基底材料中的应用也属于本发明的保护范围。所述纯钛微弧氧化涂层在制备促进细胞增殖的产品中的应用也属于本发明的保护范围。本发明所提供的纯钛微弧氧化涂层主要成分为锐钛矿型二氧化钛，并且在涂层表面成功引入了硅元素和钙元素。实验证明，与纯钛基体相比，本发明所提供的纯钛微弧氧化涂层具有更强的细胞相容性。培养7天时，作为对照的纯钛基体表面细胞的增殖率仅为
1.8，而本发明所提供的纯钛微弧氧化涂层表面细胞的增殖率可高达4.3。
图1为纯钛微弧氧化涂层和钛片的X射线衍射图谱。图2为纯钛微弧氧化涂层和钛片的扫描电子显微镜图谱及其X射线能谱。其中，A为扫描电子显微镜图谱 ；B为X射线能谱。图3为纯钛微弧氧化涂层和钛片表面细胞黏附率的统计结果。图4为纯钛微弧氧化涂层和钛片表面MC3T3_ElSubclonel4细胞贴壁4h时的扫描电子显微镜图谱。其中，A为钛片；B为纯钛微弧氧化涂层。图5为纯钛微弧氧化涂层和钛片表面细胞增殖率的统计结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、纯钛微弧氧化涂层的制备及鉴定一、纯钛微弧氧化涂层的制备电解液:14.2g硅酸钠、20g氢氧化钠、8.8g乙酸钙、15g乙二胺四乙酸二钠，溶于9L的去离子水中，pH7.2。采用商业医用纯钛，尺寸规格为IOXlOXlmm的钛片。试样表面分别依次采用300#, 800#和1500#的砂纸打磨(制作涂层时每组都利用这三种不同砂纸打磨)，然后用丙酮、无水乙醇、去离子水依次超声(超声参数功率100赫兹)清洗、50°C烘干。将清洗后的钛片作为阳极，置入电解液(配方如上)中，不锈钢为阴极。氧化电压为200V、频率600Hz、占空比8%,氧化时间5min。得到纯钛微弧氧化涂层。
二、纯钛微弧氧化涂层的鉴定以尺寸规格相同的钛片为对照，利用X射线衍射仪(XRD，D/max-Y B, Japan)对步骤一制备的纯钛微弧氧化涂层进行物相分析，使用CuKaX射线源，管电压40KV，管电流为40mA，连续扫描模式，扫描速度4° /min，衍射角2Θ为10 90°。步骤一制备的纯钛微弧氧化涂层表面形貌观察利用扫描电子显微镜(SEM, Quanta200, FEIC0., American),表面元素含量检测采用扫描电镜系统配备的X射线能谱仪(EDS，EDAX, American)。X射线衍射图谱如图1所示，从图中可以看出，纯钛经过步骤一中200V微弧氧化处理后，出现了锐钛矿衍射峰，图中钛的衍射峰主要来自于钛基体。此外，在2 Θ =25 35°之间出现较宽的背底峰，说明涂层中有非晶态物相。而XRD图谱没有发现含硅钙元素的新物相，因而涂层中含硅钙产物为非晶态。扫描电子显微镜图谱及其X射线能谱如图2所示，从扫描电子显微镜图谱(图2中A)中可以看出，纯钛经过步骤一中200V微弧氧化处理后，钛基体表面形成典型的微弧氧化多孔结构，多孔直径的尺寸约为2 μ m。从X射线能谱(图2中B)中可以看出，步骤一制备的纯钛微弧氧化涂层除了 Ti、0元素外还含有S1、Ca元素，其中Si的质量百分含量约为2.2%，Ca的质量百分含量约为1.5%。这说明在步骤一制备的纯钛微弧氧化涂层中成功的引入了S1、Ca元素。实施例2、纯钛微弧氧化涂层细胞活性实验实验细胞:MC3T3-ElSubclonel4 (小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14)，中国科学院上海生命科学研究院。实验试剂:改良型a -MEM Hyclone培养基(赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)；FBS Gibco胎牛血清；Cou Counting kit-8 (CCK8,碧云天生物技术研究所)；C0222青霉素-链霉素溶液(碧云天生物技术研究所);PBS缓冲液(pH值为7.2-7.6，武汉博士德生物工程有限公司);戊二醛(国药集团化学试剂有限公司);多聚甲醛(天津科密欧化学试剂有限公司)；叔丁醇；锇酸；无水乙醇(体积分数为50%、70%、90%、95%和100%)。实验分组:实施例1中步骤一制备得到的纯钛微弧氧化涂层(实验组);尺寸规格与纯钛微弧氧化涂层相同的钛片(对照组)。一、细胞黏附测试1、细胞培养待MC3T3-ElSubcl0nel4细胞完全汇合时，倒掉旧的培养液，PBS缓冲液洗涤后，力口入消化液(终浓度为0.25g/100mL的胰蛋白酶+终浓度为0.03g/100mL的EDTA)消化，显微镜下观察见细胞间隙增大，回缩变圆，少许细胞已脱壁时，用完全培养液(改良型a -MEMHyclone培养基中加入体积含量10%的FBS，以及终浓度为20% (20g/100ml)的C0222青霉素-链霉素)中和胰蛋白酶终止其消化作用，吹打制成单细胞悬液，洗涤离心5min (1000转/min)，用完全培养液重新悬起制成单细胞悬液。置于37°C、5%C02及饱和湿度条件下的二氧化碳细胞培养箱中培养。24h后换液，以后每3天换液一次，细胞长满培养皿底70%左右时，以消化液传代(传代比例为1:2)。倒置显微镜观察细胞生长情况，期间注意有无污染。2、细胞黏附测试将实施例1中步骤一制备得到的纯钛微弧氧化涂层(实验组)，以及尺寸规格与纯钛微弧氧化涂层相同的钛片(对照组)分别置于24孔培养板内，细胞以消化液消化后按5 X 1O5个/孔的密度接种于培养板中，每孔加入完全培养液1.0ml，置入培养箱中培养，细胞接种后分别在0.5h、lh、2h、4h终止培养，用PBS缓冲液轻轻冲洗试件(涂层或钛片)3次，洗去未能贴附的MC3T3-ElSubcl0nel4细胞后，将试件转入另一个24孔培养板中，每孔加
.0.3ml消化液消化3分钟，加完全培养液终止消化，轻轻吹打试件，制成单细胞悬液，计细胞数，按公式(I)计算细胞黏附率Ln。实验中，对于每一检测时间点，两组均设置3次重复，结果取3次重复的平均值，并采用SAS6.0软件包对数据进行单因素方差分析。Ln= (Tn/Jn) X (Sp/Ss) X 100% (I)式中，Tn为粘附在试件上的细胞数Jn为接种细胞数；Sp为培养孔底面积；Ss为试件表面积。另外，在细胞培养4h时，对试件(涂层或钛片)表面的MC3T3_ElSubclonel4细胞采用扫描电子显微镜进行形态观察。具体如下:细胞依次采用PH7.2的PBS缓冲液配置体积分数为2.5%的戊二醛、体积分数为1%锇酸固定，固定时间均为30分钟。然后用体积分数分别为50%、70%、90%、100%的乙醇依次脱水，用纯叔丁醇置换乙醇，然后将样品放入_20°C的冰箱冷冻30min，用ES-2030 (HITACHI)型冷冻干燥仪对样品进行临界干燥。处理后样品喷金后利用扫描电子显微镜(SEM, Quanta200, FEIC0.，American)观察细胞形态。细胞黏附率的统计结果如表I和图3所示，细胞贴壁0.5、l、2h、4h的两组数据之间P〈0.05，具有统计意义。随着时间的增加细胞在实施例1中步骤一制备得到的纯钛微弧氧化涂层表面及钛片表面的粘附率均提高，接种4h后钛片表面细胞黏附率约为38.5%，而实施例1中步骤一制备得到的纯钛微弧氧化涂层表面细胞黏附率约为29.6%，两者之间差距明显变小。另外，细胞贴壁4h时，对试件(涂层或钛片)表面的MC3T3-ElSubclonel4细胞采用扫描电子显微镜进行形态观察的结果如图4所示，从图中可以看出，贴壁4h后钛片表面的成骨细胞形态丰满，已经出现丝状伪足和板状伪足，细胞完全黏附在钛的表面，伸展的面积大；而实施例1中步骤一制备得到的纯钛微弧氧化涂层表面成骨细胞成球形，尚未完全伸展。表I不同时间点两组中细胞黏附率的统计结果(单位:％)
重复I重复2重复3平均值
实验组对照组实验组对照组实验组对照组实验组对照组
0.5h 0.203 0-245 0,234 0.256 0.210 0.223 0-215667 0.241333 Ih 0.221 0.256 0.250 0.248 0.223 0.238 0.231333 0.247333 2h 0-256 0.319 0.245 0.312 0.259 0.320 0.253333 0.317667 4h 0.294 0.388 0.298 0.385 0.297 0.381 0.296333 0.384667二、细胞增殖测试1、细胞培养同步骤一中I所述。2、细胞增殖测试将实施例1中步骤一制备得到的纯钛微弧氧化涂层(实验组)，以及尺寸规格与纯钛微弧氧化涂层相同的钛片(对照组)分别置于24孔培养板内，同时设置不加入试件(涂层或钛片)的孔作为无试件对照，细胞以消化液消化后按5X IO4个/孔的密度接种于培养板中，每孔加入完全培养液1.0mL,置入培养箱中培养，分别培养1、4、7、10天后，用PBS缓冲液冲洗3次后，每孔加0.3mL消化液消化3分钟，加完全培养液终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液，洗涤离心5min( 1000转/min)，用200 μ L完全培养液重新悬起制成单细胞悬液，并加入CCK-8液20 μ L，在5%C02、饱和湿度、37°C环境下继续培养4h，4h后于各孔中吸出100 μ L置于96孔板中，以酶标仪在450nm波长测定吸光度OD值，同时设置仅加入200 μ L完全培养液和20 μ L CCK-8液，但不加入细胞的空白孔，进行0D450的检测，进而按照公式(2)计算细胞增值率ODa。实验中，对于每一检测时间点，两组均设置3次重复，结果取3次重复的平均值，并采用SAS6.0软件包对数据进行单因素方差分析。ODa=(ODs-ODb)/(ODc-ODb)X100% (2)
式中，ODs为实验组或对照组(含有试件、细胞、完全培养液和CCK-8液)的0D450值；0Dc为无试件对照组(含有细胞、完全培养液和CCK-8液)的0D450值；0Db为空白孔(含有完全培养液和CCK-8液)的0D450值。细胞增殖率的统计结果如表2和图5所示，从表中可以看出，在相同的培养时间内，实施例1中步骤一制备得到的纯钛微弧氧化涂层表面细胞的增殖能力明显好于钛片对照，接种细胞I天后实施例1中步骤一制备得到的纯钛微弧氧化涂层表面的细胞增殖率达到0.593以上，随着细胞培养时间的增长，钛片和实施例1中步骤一制备得到的纯钛微弧氧化涂层表面细胞的增殖率均提高，在细胞培养7天时钛片表面增殖率约为0.713，实施例1中步骤一制备得到的纯钛微弧氧化涂层表面增殖率达到约1.172。细胞培养10天，细胞增殖率基本不再增加，并且成骨细胞数量有所下降，表明细胞培养10天时活力已经下降。实验结果表明实施例1中步骤一制备得到的纯钛微弧氧化涂层能促进成骨细胞在其表面增殖。由于在细胞增殖阶段，只有当细胞达到一定的数量，才能保证后续过程中形成三维的细胞外基质结构，进而促进成骨细胞在种植体表面进一步分化和行使功能，所以相对于钛片对照，实施例1中步骤一制备得到的纯钛微弧氧化涂层能加快细胞增殖速率，更加有利于快速形成三维细胞外基质结构。表2不同时间点两组中细胞增殖率的统计结果
权利要求
1.纯钛微弧氧化涂层，由基体，以及与所述基体结合的表面多孔的氧化膜组成； 所述基体为钛；所述氧化膜为含有硅元素和钙元素的锐钛矿型二氧化钛； 所述硅元素在所述氧化膜中的质量百分含量为2.2% ;所述钙元素在所述氧化膜中的质量百分含量为1.5%。
2.根据权利要求1所述的纯钛微弧氧化涂层，其特征在于:所述孔的直径为2μ m。
3.制备权利要求1或2所述纯钛微弧氧化涂层的方法，包括如下步骤:将钛置于电解液中，以所述钛为阳极，以不锈钢为阴极，在电压为200V、频率为600Hz、占空比为8%的条件下，氧化5min，得到所述纯钛微弧氧化涂层； 所述电解液的溶质为硅酸钠、氢氧化钠、乙酸钙、乙二胺四乙酸二钠，溶剂为水；所述硅酸钠、所述氢氧化钠、所述乙酸钙、所述乙二胺四乙酸二钠和所述水的配比为14.2g:20g:8.8g:15g:9L ;所述电解液的pH为.2。
4.权利要 求1或2所述纯钛微弧氧化涂层在作为动物体硬组织替换材料或植入体中的应用。
5.权利要求1或2所述纯钛微弧氧化涂层在作为细胞培养基底材料中的应用。
6.权利要求1或2所述纯钛微弧氧化涂层在制备促进细胞增殖的产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种纯钛微弧氧化涂层及其应用。本发明所提供的纯钛微弧氧化涂层由基体，以及与所述基体结合的表面多孔的氧化膜组成；所述基体为钛；所述氧化膜为含有硅元素和钙元素的锐钛矿型二氧化钛；所述硅元素在所述氧化膜中的质量百分含量为2.2%；所述钙元素在所述氧化膜中的质量百分含量为1.5%。实验证明，与纯钛基体相比，本发明所提供的纯钛微弧氧化涂层具有更强的细胞相容性，培养7天时，作为对照的纯钛基体表面细胞的增殖率仅为0.713，而本发明所提供的纯钛微弧氧化涂层表面细胞的增殖率可高达1.172。
文档编号C25D11/26GK103147111SQ20131009645
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月25日 优先权日2013年3月25日
发明者邹智群, 李元忠, 赵秀兰, 李德超, 刘云, 朱建华, 王洪艳, 潘攀, 黑晓霞, 胡忠博, 王萌, 姜全春, 刘楠楠, 吴孝楠, 曲平川, 刘晓晶, 王春娜, 刘苗, 陈乙滋, 周宏志, 张蕊 申请人:邹智群