专利名称：在具有碱性pH的自由溶液中毛细管电泳的方法
技术领域：
本发明涉及一种使用含有用于这种分离的添加剂的缓冲体系组合物通过毛细管电泳分离蛋白质和肽的方法。
通常，尤其是为了诊断目的分析血液蛋白质。对单克隆蛋白质的测定能够早期诊断，或者治疗跟踪的某些疾病。
蛋白质日常是通过电泳，或者常规凝胶电泳，或者通过毛细管电泳(CE)分离的。CE的一个优点是分析所用样品的量非常少。而且，使用内径小的毛细管进行动电分离极其好地分散了焦耳效应产生的热量。与毛细管的高电阻有关的高效散热使得要施加高的张力，并因此产生非常短的分离时间。由于毛细管在每次分析之间可以容易地再包装和填充新鲜溶液，因此自由溶液CE，其中分离介质是单缓冲溶液，特别适用。
为了提高使用CE获得的分离，一种技术是使用内表面经过处理的毛细管。然而，这些涂层不是非常稳定并且它们在使用期间变质，因此在进行大量分析时可靠性低，这样限制了日常分析用的该技术的优点。
为了使用自由溶液CE分析血液蛋白质，使用pH为9-11，优选约10的缓冲体系是有益的。
碱性缓冲体系包括例如美国专利US-A-5120413中所述的硼酸盐缓冲液。这些缓冲液与糖蛋白形成络合物。大多数血液蛋白质被糖基化。这些络合物的形成改善了糖蛋白的电泳迁移率。就这种硼酸盐缓冲液而言，在约10的pH下，血液蛋白质经常被分成6个部分(γ、β-2、β-1、α-2、α-1、白蛋白)。存在的危险是一些单克隆蛋白质将与正常蛋白质成分共同迁移，并且在分析期间，某些正常蛋白质成分可能掩蔽某些单克隆蛋白质。
作为例子，对含有单克隆蛋白质，尤其是某些IgMκ型蛋白质的血清的分析显示，相应的峰与蛋白质成分之一(β-2成分)共同迁移，导致未测定这种IgMκ的高危险。
本申请人现已证实，使用碱性缓冲液，即具有9-11，更精确地约10的pH作为缓冲体系，含有两性离子生物缓冲液作为缓冲液并且另外含有至少一种能够增加缓冲体系的离子强度的添加剂的自由溶液CE可以进行快速且高效的蛋白质分离。
本发明提供了一种碱性pH、自由溶液毛细管电泳以分析含蛋白质组分的临床样品的方法，该方法包括至少一个步骤，其中将所述样品加入到含有缓冲体系的毛细管中，所述缓冲体系含有25℃下pKa为8.8-10.7的生物缓冲液作为缓冲液并且含有至少一种能够增加缓冲体系的离子强度的添加剂。
本申请人已证实选择具有9-11，更精确地约10的碱性pH的两性离子生物缓冲液和可以增加电泳介质的离子强度的添加剂的组合可以提高分离。
这些分离可再现。而且，所述两性离子具有大多数pH为约10的负电荷，它们在本发明上下文中可能是有益的。
最后，由这些实施例可以看出，当与使用硼酸盐缓冲液获得的测定比较时，某些蛋白质出现并且可以更清楚的峰的形式测定或者清楚地与其它成分分离。
从这些实施例中将清楚地看到，使用本发明缓冲液进行的分离可以产生与用其它技术，尤其是凝胶电泳可以观察到分离等价或相同的分离，并且具有更大的精确性、再现性和分辨率。
由参照附图的以下详细描述，本发明的其它特征和优点将显而易见。
图1A和1B显示了使用本发明的缓冲体系通过毛细管电泳获得的电泳图谱。
图1C和1D分别显示了使用凝胶电泳的相同血清的凝胶和光密度测量图谱。
图2A显示了使用本发明的缓冲体系通过毛细管电泳分析具有单克隆丙种球蛋白病(gammapathy)的血清的电泳图谱。
图2B和2C分别显示了使用凝胶电泳获得的相同血清的凝胶和光密度测量图谱。
图3A显示了使用本发明的缓冲液通过毛细管电泳分析具有双克隆丙种球蛋白病的血清的电泳图谱。
图3B和3C分别显示了通过凝胶电泳进行的相同血清的凝胶和光密度测量图谱。
图4A显示了使用本发明的缓冲液通过毛细管电泳分析具有低单克隆丙种球蛋白病的血清的电泳图谱。
图4B和4C分别显示了通过凝胶电泳进行的相同血清的凝胶和光密度测量图谱。
图5A显示了使用本发明的缓冲液通过毛细管电泳分析含有在γ和β成分的限制下迁移的单克隆蛋白质的血清的电泳图谱。
图5B和5C分别显示了通过凝胶电泳进行的相同血清的凝胶和光密度测量图谱。
图5D显示了使用常规硼酸盐缓冲液通过毛细管电泳分析的相同血清的电泳图谱。
图6显示了使用本发明的缓冲液用毛细管电泳在10个连续分析期间获得的相同血清的电泳图谱，编号为1-10。
根据本发明，缓冲体系可以是已知为25℃下pKa为8.8-10.7的生物缓冲液的任何正常已知的缓冲液，即可以与体内应用相容，适用于所需分离，并且可用于大多数电泳，特别是毛细管电泳的缓冲液。优选选择pH为约10的具有高缓冲力的生物缓冲液。
在适用于本发明的生物缓冲液中，尤其可以列举包括下述CAPS的Good类缓冲液与类似物。本发明的Good缓冲液为pka值在25℃为8.8-10.7的两性离子缓冲液。Good型缓冲液及其类似物含有酸与胺官能团。
可以引证的特别适宜的生物缓冲液是AMPD(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)、TABS(N-三[羟基甲基]甲基-4-氨基丁磺酸)、AMPSO(3-[(1，1-二甲基-2-羟基乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸)、CHES(2-(N-环己基氨基)乙磺酸)、CAPSO(3-[环己基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸)、AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)、CAPS(3-环己基氨基-1-丙磺酸)和CABS(4-[环己基氨基]-1-丁磺酸)及其混合物，但是可以将任何其它的两性离子生物缓冲液用于本发明。
根据本发明，优选AMPD、TABS、AMPSO、CAPSO、AMP、CAPS和CABS缓冲液。更优选使用CAPS、CAPSO或CABS。尤其优选使用CAPS。
可以引证的用作可增加电解质的离子强度的本发明使用的缓冲液的添加剂的化合物选自碱金属氯化物、硫酸盐、磺酸盐、碳酸盐、羧酸盐、氟化物和磷酸盐及其混合物。其中优选碱金属氯化物、硫酸盐和磺酸盐及其混合物。
更优选使用硫酸盐。
优选选择钠盐或钾盐。
在上面引证的添加剂中，优选硫酸钠。
根据本发明，优选CAPS与硫酸钠联合。
这些化合物本身为已知并且可以商购获得。
术语“本发明的样品”意思是待分析的生物样品，例如用适宜的稀释溶液或缓冲体系稀释过的，或者是纯的，用缓冲体系，即电解质例如通过将样品加入填充有缓冲液的毛细管中进行分析。
本文所用的分析用的临床样品和术语“临床样品”意思是来自健康人或患者的任何生物液体。人生物液可以是正常或患病血清，并且还可以是溶血的血清、血浆、尿、或者脑脊液。
样品也可以是合成蛋白质，并且例如本发明的方法可以打算生产对照。
本发明的方法尤其适用于分析血清，并用于分离血液蛋白。
在血样中，待分离的血液蛋白主要是白蛋白和α1、α2、β(或β1和β2)、和γ球蛋白成分。
本发明缓冲液的pH，即具有所述添加剂的生物缓冲液的pH可以是9-11，更优选是约10。
本发明的缓冲体系也可以含有至少一种pH调节的组分。所述pH调节的化合物可以是选自以下的化合物氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铷、氢氧化铯、氢氧化钫、或在烷基部分中含有1-8个碳原子的氢氧化一、二、三或四烷基铵。
根据本发明，所述生物缓冲液在常规条件下以缓冲体系的浓度级别为10-500mM，优选大于20和小于200mM下使用。
用作本发明添加剂的盐是以10mM-500mM，优选50mM-200mM，更优选150mM的缓冲体系的浓度使用的。
本发明的缓冲体系也可以含有至少一种含有pH大于9的带负电的阴离子极和疏水部分的添加剂，尤其是选自C6-C22烷基单、二或三羧酸盐、C6-C22烷基单、二或三磺酸盐和C6-C22烷基羧基磺酸盐，特别是C6-C10烷基磺酸盐。上述二和三羧酸盐、二和三磺酸盐与在羧基磺酸盐因此是一或多个羧酸根或磺酸根官能团与C6-C22烷基链的组合形式。作为非限制性实例，可以列举含有3个羧酸根官能团和一个C19链的1，2，3-十九烷三羧酸、含有一个羧酸根官能团一个磺酸根官能团和一个C18链的2-甲基-2-磺基十八烷酸以及含有2个羧酸根官能团和一个C12链的1，12-十二烷二羧酸。优选使用辛磺酸盐，其浓度约为1-5mM，尤其是1-4mM，优选2.5mM。
本发明的缓冲组合物是以制备缓冲体系组合物时为正常的方式下制备的，即通过将这些组分以液体形式加入，或者作为待稀释的固体加入到可接收的载体中。通常，所述载体是经过蒸馏的或者是经过软化的水。
用于毛细管的材料是日常用于毛细管电泳的那些。可以使用内径为5-200μm的熔融二氧化硅毛细管。优选使用内径低于100μm，更优选低于50μm的毛细管。优选使用内表面未处理过的毛细管。熟练人员能够确定与分析需要相适应的毛细管的性能和大小。
实施例材料和方法
A)毛细管电泳(方法A)使用配备有内径为25μm的熔融二氧化硅毛细管的CE设备对临床样品进行毛细管电泳。在200nm下进行测定。将这些样品放置在设备的样品交换器中并通过液体动力注射进行自动注射(50mbar，7秒钟)。在10分钟内通过施加约400V/cm的电场将样品分离。在每次分析之前将毛细管用0.5M氢氧化钠洗涤，然后用缓冲体系洗涤。
缓冲体系使用分析级化学物质。
本发明的第一缓冲液是通过将11.07g的CAPS(摩尔质量221.3g/mol)和21.3g的硫酸钠(摩尔质量142.04g/mol)溶于1升(l)软化水中制备的。最终浓度是50mM的CAPS和150mM的硫酸钠，并通过加入氢氧化钠颗粒(摩尔质量40.0g/mol)将其pH调整至10.0。
如上所述加入浓度为2.5mM的辛磺酸盐制备第二优选的缓冲体系。
使用上面的方法A采用CAPS/硫酸钠缓冲液进行电泳产生具有5种成分的蛋白质图谱，从左至右读取是γ、β、α-2、α-1和白蛋白成分。
硼酸盐缓冲液是通过将9.3g的硼酸(摩尔质量61.83g/mol)溶于1升软化水和5.1g的氢氧化钠(摩尔质量40.0g/mol)中制备的。最终浓度是150mM并且其pH是10.0。
使用上面的方法A采用硼酸盐缓冲液进行电泳产生具有6种成分的蛋白质图谱，从左至右读取是γ、β-2、β-1、α-2、α-1和白蛋白成分。
B)琼脂糖凝胶电泳(方法B)使用琼脂糖凝胶进行血液蛋白质的对比分析。将10μl血清载入欧洲专利EP-A-0493996、US-A-5464515和US-A-5405516中所述膜敷料器的每一孔中。然后将载荷的敷料器施加到琼脂糖凝胶的表面上持续30秒钟。在20W的功率下使用能够将温度调节到20℃的仪器将涂敷到该凝胶上的样品通过电泳分离约7.5分钟。迁移之后，将凝胶干燥并用酸性黑染色。染色之后，将凝胶脱色并且再次干燥。然后通过光密度术分析这些凝胶以产生蛋白质图谱。
就正常血清而言，获得具有5种成分的蛋白质图谱，从左至右读取是γ、β、α-2、α-1和白蛋白成分。
C)临床样品就该CE而言，在缓冲体系中将人血清稀释至1/10倍。
实施例1使用如上所述的第一和第二缓冲液分析正常血清。
使用上面的方法A进行电泳。
从图1A和1B可以看出，获得的电泳图谱呈现5个峰，从左至右读取相继属于γ、β、α2、α1球蛋白和白蛋白成分。
实施例2(对比)使用上面的方法B通过分析与前面实施例相同的血清获得蛋白质图谱(图1C中的凝胶和图1D中的其光密度测量图谱)。从这些图可以看出，获得的蛋白质图谱呈现5种成分，从左至右读取为γ、β、α2、α1和白蛋白。与实施例1获得的结果比较可显示，本发明的实施可以产生可与用琼脂糖凝胶获得的类似的具有5种成分的蛋白质图谱。
实施例3使用上述的第二缓冲液分析具有单克隆丙种球蛋白病的血清。
如实施例1所述进行电泳。
从图2A可以看出，获得的电泳图谱呈现5个连续峰，分别属于γ、β、α2、α1球蛋白和白蛋白成分。在γ成分中存在一补充峰，相应于分析血清中存在的单克隆蛋白质。
实施例4(对比)使用上面的方法B通过分析与前面实施例相同的血清获得蛋白质图谱(图2B中的凝胶和图2C中的其光密度测量图谱)。与实施例3中获得的结果比较显示，本发明的实施可以获得与琼脂糖凝胶获得的分辨率等价的分辨率。
实施例5使用上述的第二缓冲液分析具有双克隆丙种球蛋白病的血清。
如实施例1所述进行电泳。
从图3A可以看出，获得的电泳图谱在γ成分中显示2个补充峰，相应于分析血清中存在的2个单克隆蛋白质。
实施例6(对比)使用上面的方法B通过分析与前面实施例相同的血清获得蛋白质图谱(图3B中的凝胶和图3C中的其光密度测量图谱)。与实施例5中获得的结果比较后显示，本发明的实施可以产生比用琼脂糖凝胶获得的分辨率高的分辨率。在琼脂糖凝胶上，单克隆蛋白质之一与β成分共同迁移。
实施例7使用上述的第二缓冲液分析具有弱单克隆丙种球蛋白病的血清。
如实施例1所述进行电泳。
从图4A可以看出，获得的电泳图谱显示在γ成分中的小的补充峰，相应于分析血清中存在的单克隆蛋白质。
实施例8(对比)使用上面的方法B通过分析与前面实施例相同的血清获得蛋白质图谱(图4B中的凝胶和图4C中的其光密度测量图谱)。与实施例7中获得的结果比较后显示，本发明的实施可以获得与琼脂糖凝胶获得的基本上相同的灵敏度。
实施例9使用上述的第二缓冲液分析具有迁移至γ和β成分的限制的IgMκ型的单克隆蛋白质的血清。
从图5A可以看出，获得的电泳图谱显示γ成分中的补充峰，相应于分析血清中存在的单克隆蛋白质。
实施例10(对比)使用上面的方法B通过分析与前面实施例相同的血清获得蛋白质图谱(图5B中的凝胶和图5C中的其光密度测量图谱)。与实施例9中获得的结果比较显示，本发明的实施可以获得与琼脂糖凝胶获得的基本上相同的测定。
实施例11(对比)按照实施例1的步骤，所用缓冲体系是如上所述制备的正常硼酸盐缓冲液。
使用上面的方法A进行电泳。
从图5D可以看出，获得的电泳图谱呈现6个连续峰，从左至右读取分别属于γ、β2、β1、α2、α1球蛋白和白蛋白成分。
用本硼酸盐缓冲液观察到蛋白质图谱中没有干扰，仅β成分的百分比增加超出正常值，这可能产生怀疑血清中存在单克隆蛋白质；与实施例9中获得的结果比较后显示，与对某些κIgM型单克隆蛋白质使用正常硼酸盐缓冲液用CE获得的分辨率相比，本发明的实施可以获得更高的分辨率。
实施例12使用第二优选的缓冲液，使用上述的方法A通过毛细管电泳对相同血清进行10个连续分析；从图6可以看出，图谱的再现性优异。
权利要求
1.一种碱性pH、自由溶液毛细管电泳以分析含蛋白质组分的临床样品的方法，其特征在于它包括至少一个步骤，其中将所述样品加入到含有缓冲体系的毛细管中，所述缓冲体系含有25℃下pKa为8.8-10.7的生物缓冲液作为缓冲液并且含有至少一种能够增加缓冲体系的离子强度的添加剂。
2.如权利要求1的方法，其特征在于它还包括通过迁移分离蛋白质组分并测定所述组分。
3.如权利要求1或2的方法，其特征在于所述样品是血样、血浆、溶血的血液、尿或脑脊液。
4.如权利要求1-3任一的方法，其特征在于所述组分是血液蛋白。
5.如权利要求1-4任一的方法，其特征在于所述组分是白蛋白并且所述成分是α1、α2、β或β1、β2和γ球蛋白。
6.如权利要求1-5任一的方法，其特征在于所述生物缓冲液选自AMPD、TABS、AMPSO、CHES、CAPSO、AMP、CAPS和CABS。
7.如权利要求1-6任一的方法，其特征在于所述生物缓冲液选自AMPD、TABS、AMPSO、CAPSO、AMP、CAPS和CABS。
8.如权利要求1-7任一的方法，其特征在于所述生物缓冲液选自CAPS、CAPSO和CABS。
9.如权利要求1-8任一的方法，其特征在于所述生物缓冲液是CAPS。
10.如权利要求1-9任一的方法，其特征在于生物缓冲液在缓冲体系中的浓度是10-500mM。
11.如权利要求1-10任一的方法，其特征在于生物缓冲液在缓冲体系中的浓度是大于20并小于200mM。
12.如权利要求1-11任一的方法，其特征在于所述能够增加离子强度的添加剂选自碱金属氯化物、硫酸盐、磺酸盐、羧酸盐、氟化物、碳酸盐和磷酸盐及其混合物。
13.如权利要求1-12任一的方法，其特征在于所述能够增加离子强度的添加剂选自碱金属氯化物、硫酸盐、磺酸盐、羧酸盐、氟化物和碳酸盐及其混合物。
14.如权利要求1-13任一的方法，其特征在于所述能够增加离子强度的添加剂是氯化物、硫酸盐或磺酸盐。
15.如权利要求1-14任一的方法，其特征在于所述能够增加离子强度的添加剂是硫酸钠。
16.如权利要求1-15任一的方法，其特征在于所述能够增加缓冲体系的离子强度的添加剂的浓度是10-500mM。
17.如权利要求1-16任一的方法，其特征在于所述能够增加电解质的离子强度的添加剂的浓度是大于50并小于200。
18.如权利要求1-17任一的方法，其特征在于所述缓冲体系还含有至少一种选自以下的缓冲组分C6-C22一、二或三羧酸盐、C6-C22烷基一、二或三磺酸盐和C6-C22烷基羧基磺酸盐。
19.如权利要求1-18任一的方法，其特征在于所述缓冲体系还含有C6-C10烷基磺酸盐。
20.如权利要求1-19任一的方法，其特征在于所述缓冲体系还含有辛磺酸盐。
21.如权利要求19-20的方法，其特征在于烷基磺酸盐的浓度是1-4mM。
22.如权利要求1-21任一的方法，其特征在于所述缓冲液的pH是9-11。
23.如权利要求1-22任一的方法，其特征在于所述缓冲液的pH是约10。
24.如权利要求1-23任一的方法，其特征在于所述毛细管是由熔融二氧化硅生产的。
25.如权利要求1-24任一的方法，其特征在于所述缓冲体系还含有至少一种pH调节剂。
全文摘要
本发明涉及一种碱性pH、自由溶液毛细管电泳分析含蛋白质组分的临床样品的方法。所述方法其特征在于它包括至少一个步骤，其中将所述样品加入到含有分析缓冲液的毛细管中，所述缓冲体系含有25℃下pKa为8.8－10.7的生物缓冲液作为缓冲液并且含有至少一种能够增加分析缓冲液的离子强度的添加剂。
文档编号G01N33/483GK1620606SQ02800137
公开日2005年5月25日 申请日期2002年1月18日 优先权日2001年1月19日
发明者F·罗伯特 申请人:莎碧亚公司