专利名称：通过活化血红蛋白清除剂受体生产血细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及刺激干细胞生长、增殖、分化和/或动员以生产血细胞的方法和组合物。更具体而言，本发明涉及刺激血细胞生成的方法，包括分别通过刺激干细胞以及红细胞系和髓细胞系祖细胞以刺激红细胞生成和髓细胞生成。
背景技术：
最近已经鉴定了单核细胞和巨噬细胞上的血红蛋白清除剂受体(Kristiansen，2001)。该受体通过介导触珠蛋白一血红蛋白复合物的胞吞作用而清除血红蛋白。该受体已经鉴定为M130/CD163，是急性期调节的跨膜蛋白质，据报道专门在单核细胞和巨噬细胞上表达。CD163属于富含半胱氨酸的B基团清除剂受体超家族，该受体家族包括分别存在于B、T和CD4-8-γδT淋巴细胞上的CD5、CD6和WC1。血红蛋白和多聚体触珠蛋白的复合物与血红蛋白和二聚体触珠蛋白的复合物相比，对CD163的功能性亲和力更高。
先前对培养的单核细胞上抗体介导的CD163交联进行研究已经证明表面CD163的连接诱导酪氨酸激酶依赖性信号，引起细胞内钙的动员、肌醇三磷酸产生以及抗炎症细胞因子(包括白细胞介素6(IL-6)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))分泌增强(van denHeuvel等人，1999)。
红细胞生成作用定义为血细胞的产生和发育，包括红细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞(esoinophils)、嗜碱性粒细胞、巨核细胞、B细胞和T细胞(Wintrobe，1999)。发生红细胞生成作用是造血干细胞增殖和分化的结果。造血干细胞是多潜能细胞，能够产生血液中发现的多个细胞系。造血干细胞存在于骨髓中，其生长、增殖和分化受造血生长因子和骨髓内基质细胞的影响。干细胞被认为平常以静止的非分裂状态存在，直至受到特异的生长因子的刺激，其于是分裂并产生高度增殖性祖细胞，产生一种或多种血细胞系，例如红细胞系、髓细胞系或淋巴细胞系。
称为血细胞减少症的某些临床疾病，其特征在于循环血液中特定类型细胞的水平降低。例如中性粒细胞减少症是循环中的中性粒细胞水平减低的一种疾病。该疾病可利用两种不同的造血生长因子GM-CSF或G-CSF治疗。然而，使用这些生长因子常常伴随高发的不良副作用。例如，同种异体的骨髓移植后给药G-CSF可引起呼吸困难、胸痛、恶心、低氧血症、发汗、过敏性反应、昏厥和面色潮红(Khoury等人，2000)。
中性粒细胞减少症也和AIDS相关，其当前用生长因子治疗(Dubreui1-Lemaire等人，2000)。还有严重的先天性中性粒细胞减少症的形式(Dale等人，2000)，其中生长因子给药治疗对很低百分比的患者无效。
贫血症是血红蛋白不足以满足身体对氧运输需求的病理结果。历史上，利用血液或红细胞输血治疗某些贫血症。多种输血相关的并发症(包括溶血、发热和变态反应，以及传播疾病的可能性)使这种疗法不够理想。在治疗贫血症中需要刺激红细胞生长和发育(红细胞生成)。贫血症有几种病因，包括过量失血、红细胞破坏增加、红细胞合成降低以及血红蛋白产生异常。缺铁(饮食、胃肠道吸收不良(maladsorption)、发育红细胞运输铁或利用铁的效率低)、红细胞生成素(Epo)生成不足(肾功能障碍)或者骨髓衰退可引起红细胞产生减少。既然在铁和Epo依赖性贫血症中骨髓的红细胞生成活性完好，可以分别用铁或Epo治疗这种贫血症。
缺铁性贫血症一般通过口服或静脉内给予铁进行治疗。慢性肾衰竭患者由于肾脏不能生成Epo，一般患有Epo依赖性贫血症。这些患者经受透析，并90％是临床上贫血的。传统治疗透析患者的贫血症包括多次输血，其已经基本由给予EPO所取代。实际上，大约88％的透析患者用Epo治疗。Epo治疗的患者中，三分之一发展为高血压，一般利用抗高血压药物进行纠正。红细胞系祖细胞经Epo刺激分化为成熟红细胞，并合成红细胞的主要蛋白质，血红蛋白。
Epo治疗的主要限制因素是长期治疗的费用。慢性肾衰竭患者一般使用的Epo剂量为225单位/公斤/周，分三次给药。在美国，对于Epo治疗的医疗保险每1,000单位偿付$10.00，因此70公斤患者一般每年的费用将是大约$8,000。1995年，175,000名美国患者透析，仅该病的市场就超过八亿八千三百万美元。估计1996年治疗费用为约11亿美元。因此，可降低治疗贫血症所需Epo的新疗法对患者和保健系统均有益。发现能够降低治疗Epo依赖性贫血症所需Epo的其它药物将有益处。
此外，很多贫血症对Epo治疗没有响应。该类贫血症的例子包括化疗诱导的贫血症以及慢性疾病(包括恶性肿瘤)的贫血症。获得性免疫缺陷患者也会患有贫血症，用AZT治疗的AIDS患者也如此。可能由于Epo生成抑制或者骨髓对Epo的反应性降低而致无效性红细胞生成，从而引起该类贫血症。治疗这类贫血症包括治疗其原发的病症。然而，如果原发病症不容易治疗，那么贫血症的治疗可包括红细胞输血。输血不利的副作用包括急性和迟延性溶血反应，以及潜在的输血传播性疾病。
由此看来，本领域有必要开发通过刺激患者血细胞生成而增加血细胞数目的改进方法。
发明概述本发明人已经确定活化血红蛋白清除剂受体CD163能够刺激红细胞系和髓细胞系祖细胞两者的生长、增殖和分化，导致血细胞生成增加。本发明人还证明CD34+造血干细胞表达CD163。
因此，本发明提供了刺激能够表达CD163受体、或者能够对该受体刺激的信号转导途径进行应答的干细胞的生长、增殖、分化和/或动员的方法，包含给予有此需要的细胞或动物有效量的能够活化干细胞CD163的物质。
本发明也提供刺激血细胞生成的方法，包含给予有此需要的细胞或动物有效量的能够活化CD163的物质。
本发明进一步提供刺激红细胞生成的方法，包含给予有此需要的细胞或动物有效量的能够活化CD163的物质。
本发明还提供刺激髓细胞生成的方法，包含给予有此需要的细胞或动物有效量的能够活化CD163的物质。
本发明也包括药物组合物，其包含有效量的、与适当的稀释剂或载体混合的、能够活化CD163的物质。
本发明另外提供细胞培养添加剂，其用于增强干细胞和/或祖细胞以及细胞的生长、增殖、分化和/或动员，其包含有效量的能够活化CD163的物质。
本发明也提供选择样品中干或祖细胞的方法，包含(a)将样品与能够结合CD163的物质接触，以及(b)选择与该物质结合的细胞。
根据以下详细说明书，显而易见本发明的其它特征和优点。然而应当理解，本发明的详细说明书以及表示本发明优选实施方案的特定实施例仅以说明方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变更和修改对本详细说明书领域内的技术人员是显而易见的。
附图简述本发明将结合附图进行描述，其中
图1为利用抗CD163抗体的CD34+细胞的Western印迹分析。
图2表明造血集落形成试验中CD163抗体的影响。
图3表明从BFU-E集落制备的细胞裂解物中可检测到CD163免疫反应性。
发明详述I.发明方法如上所述，本发明人已经证明CD34+干细胞表达血红蛋白清除剂受体CD163。因此，本发明提供了刺激干细胞生长、增殖、分化和/或动员的方法，其包含给予有此需要的细胞或动物有效量的能够活化干细胞上CD163的物质。本发明也提供了有效量的能够活化CD163的物质刺激干细胞生长、增殖、分化和/或动员的用途。本发明另外提供了有效量的能够活化CD163的物质制备刺激干细胞生长、增殖、分化和/或动员的药物的用途。
此处所用短语″能够活化CD163的物质″包括能够结合、交联或者连接细胞上CD163血红蛋白清除剂受体或者CD163相关受体、并导致刺激该细胞生长、增殖、分化和/或动员的所有物质。该术语还包括能够激活因响应CD163或CD163相关受体的活化而活化的信号转导途径的任何物质。例如，该物质可激活因响应CD163的活化而活化的下游信号转导途径，包括而不限于酪氨酸激酶、钙动员以及肌醇三磷酸(IP3)和肌醇四磷酸(IP4)动员。短语″能够活化CD163途径的物质″进一步包括，可阻断因响应CD163或CD163相关受体的活化而活化的任何信号转导途径失活的任何物质。
此处所用短语″刺激干细胞的生长、增殖、分化和/或动员″是指与不存在该物质时的干细胞的生长、增殖、分化和/或动员相比，能够刺激或增强干细胞生长、增殖、分化和/或动员的物质。
此处所用术语″有效量″是指在达到所希望的结果(例如，刺激干细胞、红细胞系和/或髓细胞系祖细胞的生长、增殖、分化和/或动员和/或刺激血细胞生成、红细胞生成或髓细胞生成)所需的剂量和时间的有效量。
此处所用术语″动物″包括动物界的所有成员，优选人类。给予动物一种物质包括体内和离体给药。
此处所用术语″细胞″包括单个细胞以及多个细胞或细胞群体。给予细胞一种物质包括体外和体内给药。
此处所用术语″干细胞″是指能够在动物中分化为包括造血细胞在内的任何细胞的细胞。干细胞表达或者能够表达CD163受体或者应答该受体刺激的信号转导途径。
优选的干细胞是CD34+干细胞。传统上认为CD34+细胞是″干″细胞是由于它们能够自我更新并用各系造血细胞重新增殖为个体。利用共同表达的其它标志(例如CD38)及其再输入并重新增殖造血系统的能力，将CD34+细胞进一步分为亚群(例如Henon等人，2001)。
刺激干细胞可促进从血管外骨髓处到循环血液的干细胞动员，这是将供者外周血用于自体或异体移植所需的方案。重组人G-CSF广泛用来动员CD34+干细胞(综述参见Korbling，1998)。本发明人已经证明CD34+细胞表达CD163，刺激该细胞的CD163途径很可能会使其生长和增殖，并可能动员到外周血中。代之以使用CD163的刺激物(例如交联的抗体)或联用减量的G-CSF可以动员可移植的干细胞，而没有与细胞因子给药有关的副作用。
本发明人已经表明，活化CD163途径可用于刺激多系血细胞生成，因为已经证明能够通过活化CD163刺激红细胞系和髓细胞系祖细胞。刺激血细胞生成用于产生血细胞以及免疫系统的细胞，包括红细胞、髓细胞(例如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和巨核细胞)和淋巴细胞(B细胞、T细胞和NK细胞)，以及髓样和淋巴样起源的树突状细胞。
因此，本发明提供刺激血细胞生成的方法，其包含给予有此需要的细胞或动物有效量的能够活化CD163的物质。本发明还提供有效量的能够活化CD163的物质刺激血细胞生成的用途。本发明进一步提供有效量的能够活化CD163的物质制备刺激血细胞生成的药物的用途。
刺激血细胞生成用于治疗多种疾病，包括细胞减少症，并用于刺激血细胞发育以供移植之用，或者刺激免疫系统的细胞以用于治疗免疫缺陷。
此处所用短语″刺激血细胞生成″是指与不存在该物质时的适血干细胞或祖细胞的生长、增殖、分化和/或动员相比，能够刺激或增强造血干细胞或造血祖细胞(例如红细胞系、髓细胞系或淋巴细胞系祖细胞)生长、增殖、分化和/或动员的物质。
本领域技术人员可以确定能够活化CD163的物质是否能刺激血细胞生成。例如，集落形成试验是定量造血干细胞和祖细胞的方法(McCulloch，1984)。在集落形成试验中，将细胞铺于半固体培养基例如甲基纤维素，其中含有支持造血祖细胞生长、存活和分化的各种细胞因子。形成的造血集落种类包括红细胞系爆式集落形成单位(BFU-E)、红细胞系集落生成单位(CFU-E)、粒细胞巨噬细胞系集落形成单位(CFU-GM)、巨噬细胞系集落形成单位(CFU-M)、巨核细胞系集落形成单位(CFU-Meg)以及粒细胞、红细胞、单核细胞、巨核细胞系(GEMM)集落。在半固体试验中，干或祖细胞可应答各种细胞因子，已经针对红细胞系祖细胞(例如联用IL-3和EPO)的生长和分化或成粒细胞系/单核细胞系集落(例如IL-10、IL-6和SCF)优化了这些细胞因子的组合。需要某些组合(除计数更原始的″混合″集落以外)来分别计数髓细胞系和红细胞系集落(例如，包括G-CSF和GM-CSF的组合，综述参见Messner；1991，718-22)。
每个干细胞或祖细胞增殖并分化形成形态不同的集落。根据其在半固体培养基中生成形态上可识别的集落的能力来鉴定两种功能不同的红细胞系祖细胞(BFU-E和CFU-E)。BFU-E代表最原始的红细胞系祖细胞，形成大的多丛(multi-clustered)血红蛋白化集落。CFU-E是更加分化的红细胞系祖细胞，形成较小的血红蛋白化集落。BFU-E是可以确认的最原始祖细胞，完全负责红细胞生成，并比较成熟的CFU-E具有更大的自我更新能力。红细胞系祖细胞集落的发育一般需要培养基中存在红细胞生成素(Epo)。然而在初期，原始的红细胞系祖细胞以Epo非依赖方式增殖。
集落形成试验提供了定量造血干细胞和祖细胞的方法，也为获得有关影响干和祖细胞后代增殖和分化的因素的信息提供了方法。例如，红细胞系祖细胞集落起源于单个祖细胞的分裂和分化，因此成熟集落主要由血红蛋白化的有核红细胞组成。形态学上，红细胞系集落的大小可提供有关红细胞系祖细胞后代增殖的速率或幅度的信息。此外，较红的红细胞系集落提示血红蛋白含量较多，并且有核红细胞的分化度可能较高。
如前所述，本发明人已经表明CD163活化可增强红细胞系细胞的增殖和分化。因此，在另一实施方案中，本发明提供刺激红细胞生成的方法，其包含给予有此需要的细胞或动物有效量的能够活化CD163的物质。本发明还提供有效量的能够活化CD163的物质刺激红细胞生成的用途。本发明进一步提供有效量的能够活化CD163的物质制备刺激红细胞生成的药物的用途。
此处所用短语″刺激红细胞生成″是指与不存在该物质时红细胞系细胞或红细胞系祖细胞或干细胞的生长增殖、分化和/或动员相比能够刺激或增强红细胞系细胞或红细胞系祖细胞或干细胞生长、增殖、分化和/或动员的物质。本领域技术人员可以确定能够活化CD163的物质是否能刺激红细胞生成。例如，可以使用如上所述以及实施例中所述的集落形成试验。
刺激红细胞生成可用于治疗贫血症。因此，在特定实施方案中，本发明涉及治疗贫血症的方法，其包含给予有此需要的细胞或动物有效量的能够活化CD163的物质。本发明还提供有效量的能够活化CD163的物质治疗贫血症的应用。本发明进一步提供有效量的能够活化CD163的物质制备治疗贫血症的药物的应用。
本发明人也已表明，活化CD163可增强髓细胞系细胞的增殖。因此，在另一实施方案中，本发明提供刺激髓细胞生成的方法，其包含给予有此需要的细胞或动物有效量的能够活化CD163的物质。本发明还提供有效量的能够活化CD163的物质刺激骨髓细胞生成的应用。本发明进一步提供有效量的能够活化CD163的物质制备刺激骨髓细胞生成的药物的应用。
此处所用短语″刺激髓细胞生成″是指与不存在该物质时髓细胞或髓细胞系祖细胞或干细胞的生长、增殖、分化和/或动员相比，能够刺激或增强髓细胞或髓细胞系祖细胞或干细胞生长、增殖、分化和/或动员的物质。本领域技术人员可以确定能够活化CD163的物质是否能刺激髓细胞。例如，可以使用如上所述以及实施例中所述的集落形成试验。
刺激骨髓细胞生长、增殖、分化和/或动员可用于治疗中性粒细胞减少症。通过CD163途径活化CD163而刺激骨髓细胞可以取代或增强生长因子对于克服骨髓移植相关的中性粒细胞减少的效果，而且具有副作用较小的好处。该方法还能用来治疗AIDS相关的中性粒细胞减少症或者严重的先天性中性粒细胞减少症。因此，在特定实施方案中，本发明提供治疗中性粒细胞减少症的方法，其包含给予有此需要的细胞或动物有效量的能够活化CD163的物质。本发明还提供有效量的能够活化CD163的物质治疗中性粒细胞减少症的应用。本发明进一步提供有效量的能够活化CD163的物质制备治疗中性粒细胞减少症的药物的应用。
此处所用以及本领域所理解的″治疗″是为了获得有利的或者期望得到的结果(包括临床结果)的方法。有利的或者期望得到的临床结果可包括而不限于，减轻或改善一种或多种症状或病情、降低疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状况、预防疾病传播、延迟或减缓疾病发展、改善或缓和病况以及缓解(无论部分或全部)，无论其是否可以检测到。″治疗″还可以意味着与若不接受治疗的预期存活相比存活延长。
II.活化CD163的物质本发明包括可活化CD163(如上所述)的任何和所有物质在本发明方法中的应用。该物质可以是任何类型的物质，包括而不限于蛋白质(例如抗体)、肽、核酸、碳水化合物、有机化合物、无机化合物、小分子、药物、CD163配基、CD163受体的可溶性形式、CD163的任何和所有激动剂以及抑制CD163拮抗剂的任何和所有物质。
在优选实施方案中，活化CD163的物质是与所治疗细胞的CD163受体结合的物质。结合CD163的物质的例子包括抗体和CD163配基。
(a)抗体在特定的实施方案中，可活化CD163的物质是与CD163受体结合的抗体。CD163的抗体可来自易于得到的商业来源，例如Serotec Inc.或Maine Biotechnology Services。另外，本领域技术人员利用本领域已知技术很容易制备CD163的抗体，例如Kohler和Milstein，Nature 1975，256495以及美国专利NO.RE 32，011；4,902,614；4,543,439和4,411,993所述技术，在此引入以供参考。(也参见Monoclonal Antibodies，HybridomasA New Dimension inBiological Analyses，Plenum Press，Kennett，McKearn，andBechtol(eds.)，1980，以及AntibodiesA Laboratory Manual，Harlow and Lane(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988，也在此引入以供参考)。
例如，利用标准方法，通过使用CD163的肽可制备多克隆抗血清或单克隆抗体。可以用在哺乳动物中引发抗体反应的免疫原性肽免疫哺乳动物(例如小鼠、仓鼠或兔)。给予肽免疫原性的技术包括结合载体或者本领域公知的其它技术。例如，可以在佐剂存在下给予蛋白质或肽。可以通过检测血浆或者血清中的抗体滴度监测免疫进程。标准ELISA或者其它的免疫测定方法能够以免疫原为抗原来评定抗体的水平。免疫之后，可以得到抗血清，如果需要，还可从血清中分离多克隆抗体。
为了制备单克隆抗体，可以从免疫动物收集抗体产生细胞(淋巴细胞)，利用标准的体细胞融合方法与骨髓瘤细胞融合，从而使这些细胞永生化，产生杂交瘤细胞。该技术为本领域所公知(例如，Kohler和Milstein最先开发的杂交瘤技术(Nature 256，495-497(1975))以及其它技术，例如人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，Immunol.Today 4，72(1983))，制备人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等人Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy(1985)Allen R.Bliss，Inc.，pages 77-96)，以及组合抗体文库的筛选(Huse等人，Science246，1275(1989))。免疫化学筛选可产生与肽特异性反应的抗体的杂交瘤细胞，分离单克隆抗体。
此处所用术语″抗体″意在包括也与CD163特异性反应的其片段或其肽。抗体可以利用传统方法片断化，并利用上述相同方法筛选该片段。例如，可以通过用胃蛋白酶处理抗体产生F(ab’)2片段。得到的F(ab’)2片段经处理还原二硫键制备Fab’片段。
嵌合抗体衍生物(即结合非人动物可变区和人恒定区的抗体分子)也在本发明范围之内。嵌合抗体分子可包括例如小鼠、大鼠或其它物种抗体的抗原结合结构域以及人的恒定区。可用常规方法来制备包含识别CD163抗原的免疫球蛋白可变区的嵌合抗体。(例如参见Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.81，6851(1985)；Takeda等人，Nature 314，452(1985)，Cabilly等人，美国专利No.4,816,567；Boss等人，美国专利No.4,816,397；Tanaguchi等人，欧洲专利公开EP171496；欧洲专利公开0173494，英国专利GB 2177096B)。可以期望，嵌合抗体比相应的非嵌合抗体在人类受试者中的免疫原性可能更小。
此处所述的与本发明的蛋白质特异性反应的单克隆或嵌合抗体，可以通过制备人恒定区的嵌合体而进一步人源化，其中可变区部分，特别是抗原结合结构域的保守框架区来源于人，只有高变区是非人类来源。可利用本领域已知技术制备这种免疫球蛋白分子(例如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80，7308-7312(1983)；Kozbor等人，Immunology Today，4，7279(1983)；Olsson等人，Meth.Enzymol.，92，3-16(1982))，以及PCT公开WO92/06193或EP0239400)。人源化抗体还可以是商业上制备的(Scotgen Limited，2Holly Road，Twickenham，Middlesex，Great Britain.)也可以通过筛选编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库(在细菌中表达由编码CD163或其部分的核酸分子产生的肽)产生与CD163反应的特异性抗体或抗体片段。例如，可以利用噬菌体表达文库在细菌中表达完整的Fab片段、VH区和FV区(例如参见Ward等人，Nature341，544-546(1989)；Huse等人，Science 246，1275-1281(1989)；以及McCafferty等人，Nature 348，552-554(1990))。另外，SCID-hu小鼠(例如Genpharm Inc开发的模型)可用于制备抗体或其片段。
本发明的抗体也包括双功能抗体，其包含与干细胞表面上另一抗原的特异性抗体直接连接的CD163特异性抗体。将一个抗体与另一抗体化学偶联(例如使用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP))可制备双功能抗体。本发明的C35抗体还包括双特异性抗体。双特异性抗体包含CD163特异性抗体的可变区以及特异性针对所靶向的干细胞表面上至少一种抗原的可变区。双特异性抗体可通过形成杂合的杂交瘤来制备。杂合的杂交瘤可利用本领域已知的方法制备，例如Staerz & Bevan(1986，PNAS(USA)831453)以及Staerz & Bevan(1986，Immunology Today，7241)公开的方法。双特异性抗体也可通过化学方法构建，例如利用Staerz等人(1985，Nature，314628)以及Perez等人(1985，Nature，316354)描述的方法，或者通过表达重组免疫球蛋白基因构建体的方法构建。
(b)其它物质除抗体之外，可活化CD163的其它物质也可以鉴定并用于本发明的方法中。例如，可通过将CD163与可能结合CD163的物质反应，然后检测在CD163和该物质之间是否形成复合物来鉴定可以结合干细胞或祖细胞上CD163的物质。可以进一步评价在此分析中结合CD163的物质以确定其是否适用于本发明的方法。
因此，本发明也包括可结合CD163的物质的鉴定方法，包含以下步骤(a)在能够使CD163和待测物质形成复合物的条件下，将CD163和待测物质反应，以及(b)分析CD163和待测物质的复合物、游离的该物质或者未复合的CD163，其中存在复合物表明待测物质能够结合CD163。
可考虑诸如该物质和该蛋白质的性质和量因素，选择使该物质和CD163的复合物形成的条件。
可利用常规分离技术(例如盐析、层析、电泳、凝胶过滤、分级分离、吸附、聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝集或其组合)分离物质-CD163复合物、游离物质或未复合的蛋白质。为了便于组分分析，可使用针对CD163或该物质的抗体、或标记的CD163、或标记的物质。可以用可检测的物质标记抗体、CD163或该物质。
本发明方法使用的CD163或待测物质可以是不溶性的。例如，CD163或该物质可结合合适的载体。合适载体的例子有琼脂糖、纤维素、葡聚糖、Sephadex、Sepharose、聚苯乙烯羧甲基纤维素、滤纸、离子交换树脂、塑料膜、塑料管、玻璃珠、二氧化硅、聚胺-甲基乙烯基-醚-马来酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚物、尼龙、丝等。载体可能是例如管、试验板、珠、圆盘、球等形状。
可利用已知的化学或物理方法，例如溴化氰偶联，通过该物质与合适的不溶性载体反应而制备不溶性的CD163或物质。
上述分析中，CD163或待测物质也可表达在细胞表面上。
III.组合物本发明也包括包含可活化CD163的物质的药物组合物，其用于刺激血细胞生成、刺激红细胞生成、刺激髓细胞生成或刺激干细胞和/或祖细胞生长、增殖、分化和/或动员。因此，本发明提供刺激血细胞生成的药物组合物，其包含与合适的稀释剂或载体混合的有效量的能够活化CD163的物质。本发明也提供刺激红细胞生成的药物组合物，其包含与合适的稀释剂或载体混合的有效量的能够活化CD163的物质。本发明也提供刺激髓细胞生成的药物组合物，其包含与合适的稀释剂或载体混合的有效量的能够活化CD163的物质。本发明进一步提供刺激干细胞生长、增殖、分化和/或动员的药物组合物，其包含与合适的稀释剂或载体混合有效量的能够活化CD163的物质。本发明进一步提供刺激红细胞系的和/或髓细胞系细胞生长、增殖、分化和/或动员的药物组合物，其包含与合适的稀释剂或载体混合的有效量的能够活化CD163的物质。
为了刺激红细胞生成，该药物组合物可另外包含一种或多种造血生长因子，例如红细胞生成素。为了刺激髓细胞生成，该药物组合物可另外包含一种或多种造血生长因子，例如G-CSF，GM-CSF，IL-3等。
这种药物组合物可以伤口内、静脉内、表面、直肠、非肠道、局部、吸入或皮下、皮内、肌内、鞘内、经腹膜、口腔和脑内使用。该组合物可以是液体、固体或半固体形式，例如丸、片、膏、胶囊(gelatincapsules)、胶囊(capsules)、栓、软胶囊、凝胶、膜、小管、溶液或混悬液。
本发明的药物组合物可用于人或动物给药。给药剂量取决于个体需求、预期效果和选择的给药途径。
可以利用本身已知的制备可给予病人的药物可接受的组合物的方法来制备药物组合物，这样将有效量的活性物质与药物可接受的赋形剂组合成混合物。例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences描述了合适的赋形剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，Pa.，USA 1985)。
在此基础上，该药物组合物包含而不仅仅限于活性化合物或物质，其结合一种或多种药物可接受的赋形剂或稀释剂，并包含于合适pH以及与生理性液体等渗的缓冲液中。该药物组合物也另外包含其它的药剂，例如可以刺激血细胞生成、红细胞生成或髓细胞生成、或者可以刺激干细胞和/或祖细胞生长、增殖、分化和/或动员的其它药剂。
IV.培养添加剂可活化CD163的物质可用作培养基的添加剂增强哺乳动物祖细胞或干细胞生长、增殖、分化和/或动员，或者刺激血细胞生成、红细胞生成或髓细胞生成。因此，本发明提供了用于增强祖细胞和/或干细胞生长、增殖、分化和/或动员的细胞培养添加剂，其包含有效量的可活化CD163的物质。活化CD163的物质可以添加到传统上用于造血干细胞表达的无血清培养基中。例如，添加生长因子(例如干细胞因子(SCF)、白细胞介素3(IL-3)、GM-CSF、Flt配基(FL)、血小板生成素(TPO)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF))的无血清培养基(Kobari等人，2000所述)能够补充可活化CD163的物质。
V.细胞富集或检测如上所述，本发明人已经证明来源于脐带血液或者成人骨髓或外周血的CD34+细胞上存在CD163受体。这些细胞上存在CD163提供了重要的研究和临床工具，因为能够进一步检查CD34+/CD163+亚群细胞再移植和重新增殖造血系统各部分的能力。此外，可以根据CD163的表达富集或分选各种来源(骨髓、动员的外周血或脐带血)的″干″细胞。
因此，本发明提供选择样品中造血祖细胞或干细胞的方法，包含(a)用可结合CD163的物质接触样品，以及(b)选择与该物质结合的细胞。
在优选实施方案中，该物质是可结合CD163的抗体，利用免疫化学技术选择细胞。例如，利用抗CD163抗体，将抗体与固相支持物复合，将CD163阳性细胞从样品的其它细胞中去除，然后从固相支持物上去除CD163阳性细胞，可以″分选″或选择表达CD163受体的干细胞。例如，抗CD163抗体可以与磁珠复合。CD163阳性细胞可以结合抗体，并利用磁力源与样品中其它细胞分开。与非CD163阳性细胞分离后，将CD163阳性细胞和磁珠分离。另外，利用荧光标记的抗CD163通过荧光活化细胞分选(FACS)，干细胞上CD163的表达可用于分选这些细胞。对于本领域技术人员，许多纯化CD163阳性细胞的其它方法应当是显而易见的。该方法可用于选择能够形成红细胞系和髓细胞系集落的细胞，或者潜在地能够利用红细胞系和髓细胞系细胞重新繁殖生物体的细胞。因此，本发明提供选择能够形成红细胞系和髓细胞系集落的细胞的方法，包含(a)用可结合CD163的物质接触样品，以及(b)选择与该物质结合的细胞，其中结合的细胞能够形成红细胞系和髓细胞系集落。本发明也提供选择潜在地能够利用红细胞系和髓细胞系细胞重新繁殖生物体的细胞的方法，包含(a)用可结合CD163的物质接触样品，以及(b)选择与该物质结合的细胞，其中结合的细胞潜在地能够利用红细胞系和髓细胞系细胞重新繁殖生物体。
本发明还包括在阴性选择方案中可结合CD163的物质(例如抗体)从样品中去除祖细胞或干细胞的应用。因此，本发明提供从样品中去除造血细胞的方法，包含(a)用可结合CD163的物质接触样品，以及(b)从样品中去除与该物质结合的细胞。
以下非限制性实施例阐释本发明实施例实施例1CD34+细胞表达CD163来源于冷冻保存的成人骨髓(ABM)的CD34+细胞，利用Cytofix/Cytoperm溶液(Pharmingen Transduction Laboratories，adivision of BD BioSciences；Becton，Dickson and Company)4℃渗透30分钟，洗涤后与荧光标记的同型对照抗体(IgG1-FITC)或荧光标记的Mac-158小鼠抗人CD163单克隆抗体(MBS；Mac158-FITC)温育。在平行实验中，来自相同骨髓样品的细胞也用荧光标记的抗CD34(HPCA-2-PE)和抗CD45(H130-FITC)进行细胞外染色。利用EPICSXL流式细胞仪(Beckman Coulter，Inc)分析样品。结果如表1所示，表明超过95％的骨髓细胞是CD34/CD45+，这些细胞大部分也可用抗CD163抗体染色。表1CD34+骨髓细胞的流式细胞术分析
实施例2Western印迹可检测CD34+细胞表达的CD163在含有蛋白酶抑制剂混合物的CHAPS缓冲液(0.5％CHAPS、10mMTris、1mM MgCl2、1mM EDTA和10％甘油)中重悬来源于成人骨髓的CD34+细胞来制备细胞裂解物。重悬细胞冰浴30分钟。离心裂解物，将上清液转到新管中。在非还原性SDS载样缓冲液中重悬上清液供Western印迹分析。然后样品通过8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转到尼龙膜。用包含脱脂奶粉的溶液封闭尼龙膜，然后先用Mac-158抗人CD163抗体、继之以偶联辣根过氧化物酶(BIO-RAD Laboratories，Inc.)的山羊抗小鼠抗体进行检测。利用Amersham plc的增强化学发光试剂盒检测结合的二抗。
如图1表明，在从CD34+细胞制备的细胞裂解物中检测出CD163免疫反应性。
实施例3在CD34+细胞的细胞表面表达CD163利用流式细胞术分析冷冻保存的来源于成人骨髓和脐带血(UCB)低密度单核细胞(LDMNC)的CD34+细胞确定CD34+细胞胞外表达的CD163水平。细胞用荧光标记的抗CD34(HPCA-2-PE)和抗CD163(Mac158-FITC)抗体染色，然后利用EPICS XL流式细胞仪分析。结果如表2所示。表2CD163和CD34的共表达
n＝样本数大部分CD163+细胞可用抗CD34抗体共同染色，表明CD34+细胞表达CD163。人CD163受体先前描述为只在单核/巨噬细胞样细胞上表达的受体。这些资料表明人造血干细胞群也表达CD163。实施例4刺激CD163受体导致红细胞系细胞生长利用集落形成试验，在支持红细胞系祖细胞集落(BFU-E)的条件下，检测小鼠抗人抗CD163单克隆抗体(EDHu-1，Serotec)的影响。由单个原始的红细胞系祖细胞在半固体培养基中形成这些集落相对较大，且是多丛的。培养12-16天后，集落内的细胞一般血红蛋白化。将脐带血(UCB)富集的CD34+细胞，或者来源于成人骨髓(ABM)的CD34+细胞在有或无50ug/mL抗CD163抗体存在的情况下接种到含10ng/mL白细胞介素-3(IL-3)和2U/mL红细胞生成素(Epo)的甲基纤维素中。评价该抗体对红细胞系祖细胞数目的影响，结果如表3所示表3由抗CD163抗体(Ab)刺激的CFA中的ABM或UCB的CD34+细胞
*相对增加倍数50ug/ml抗CD163抗体比相应的对照平板产生更多的BFU-E。利用不同的抗CD163抗体(Mac158)刺激CD163也得到类似结果。通过CD163受体刺激CD34+细胞可增强脐血或成人骨髓中红细胞系祖细胞的增殖。
实施例5刺激CD163增强红细胞系细胞的增殖和分化利用集落形成试验，在支持红细胞系祖细胞集落形成的条件下，检测活化的抗CD163抗体的影响。将从脐血LDMNC富集的CD34+细胞在存在同型对照抗体(50ug/mL)或抗CD163抗体(EDHu-1；50ug/mL)的情况下接种到含10ng/mL IL-3和2.0U/mL Epo的甲基纤维素中(1,000细胞/mL)。在湿润的恒温箱中于5％CO2、37℃温育甲基纤维素平板。14天后计数集落(BFU-E)，评价其形态学。除实施例4表明的红细胞系集落数目增加以外，与同型对照相比，抗CD163抗体也增加红细胞系祖细胞集落的大小和红色(图2)。利用不同的抗CD163抗体(Mac158)刺激CD163也得到类似结果。利用来源于成人骨髓的CD34+细胞也得到类似结果。这些资料提示刺激CD163增强BFU-E集落中红细胞系细胞的增殖(增加集落大小)和分化(增加血红蛋白的生成，并因而产生较红的集落)。
实施例6红细胞系细髓表达CD163将成人骨髓CD34+细胞接种到含10ng/mL IL-3以及0.5或2.0U/mL Epo甲基纤维素(1,000细胞/mL)中。在湿润的恒温箱中于5％CO2、37℃温育甲基纤维素平板。14天后，从平板收集BFU-E集落的细胞，洗涤、计数并沉淀。细胞沉淀-80℃冷冻。从等量细胞制备细胞裂解物，如实施例3所述，将等体积裂解物进行Western印迹分析。
如图3所示，在从BFU-E集落制备的细胞裂解物中很容易检测出CD163免疫反应性。此外，在降低Epo浓度的条件下，CD163的免疫反应性水平提高，提示Epo可调节CD163的表达。
实施例7CD163刺激补偿最适度下的EPO浓度也用无血清集落形成试验检测CD163抗体的影响。将成人外周血低密度单核细胞(APB LDMNC)细胞在有或无两种不同的抗CD163抗体EDHu-1或Mac158的情况下接种到含1％BSA、10ug/mL胰岛素、200ug/mL人转铁蛋白、10ng/mL IL-3和0.2或2.0U/mL Epo的甲基纤维素中(1×105细胞/mL)。平板在37℃、5％CO2下温育14天，然后计数红细胞系祖细胞集落。如表4表明，与未处理细胞相比，抗CD163抗体处理的细胞检测到更多的BFU-E集落。此外，在抗CD163抗体存在下形成的集落与没有该抗体的情况下相比更大并更红。因而CD163活化导致红细胞系祖细胞的增殖增强，并对于有血清和无血清集落形成试验中的BFU-E集落红细胞系细胞的增殖和分化增强。在减少EPO的条件下，用EDHu-1或Mac158刺激CD163导致红细胞系祖细胞集落的数目增加(表4)。这些集落也比对照平板的集落大并红。利用从成人骨髓或脐带血分离的CD34+细胞得到类似结果。在含血清集落形成试验中也得到类似结果。缺少Epo时，不论是否存在抗CD163抗体，集落形成试验均未发现红细胞系集落。
这些资料提示刺激CD163增强红细胞系祖细胞的增殖，并且对于EPO浓度降低的有血清和无血清分析增强其红细胞系细胞的增殖和分化。然而，在红细胞系集落的形成中，刺激CD163不能完全取代EPO。表4高和低浓度的EPO、有或没有抗CD163抗体(Ab)的情况下在无血清CFA中刺激BFU-E
*相对增加倍数实施例8刺激CD163增强CFU-GM祖细胞的增殖在针对髓细胞系祖细胞(CFU-GM)集落生长优化的条件下(50ng/mlSCF、4pg/ml IL-1β、6.25ng/ml IL-6)，利用集落形成试验检测交联的抗CD163抗体(EDHu-1)的影响。在有或没有50ug/mL抗CD163抗体的情况下，将来源于脐带血的CD34+按2×103细胞/ml的浓度接种甲基纤维素。37℃培养14天后，评价抗CD163抗体对CFU-GM数目的影响，如表5所示。表5抗CD163抗体刺激CFU-GM增殖CFU-GM/2×103细胞对照130+50ug/ml EDHu-1 21950ug/ml时，与对照样品相比，EDHu-1抗体使CFU-GM数目增加1.7倍。这提示早期髓细胞系祖细胞表达CD163受体，刺激该受体可增强这些细胞的增殖。
实施例9CFU-GM集落中的骨髓细胞表达CD163，其表达不限于CD14+细胞在针对髓细胞系祖细胞(CFU-GM)集落生长优化的条件下(50ng/ml SCF、4pg/ml IL-1b、6.25ng/ml IL-6)，将来源于脐带血细胞的CD34+按2×103细胞/ml接种甲基纤维素，于37℃、5％CO2下湿润的恒温箱中培养。14天后，从产生的集落中收集细胞，洗涤、计数，并分别利用TUK4和Mac158荧光标记抗体，通过流式细胞术检测CD14和CD163的表达。结果如表6所示。表6CFU-GM集落细胞上CD163和CD14的表达
已经参考目前认为优选的实施例描述了本发明，但应当理解本发明不局限于公开的实施例。相反，本发明意在涵盖所附权利要求书精神和范围内包括的各种修改及等效方案。
所有出版物、专利和专利申请等全文在此引入以供参考，如同明确而逐一指明全文引入各个出版物、专利或专利申请以供参考。
权利要求
1.有效量的可活化CD163的物质用于刺激干细胞生长、增殖、分化和/或动员的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中干细胞是CD34阳性细胞。
3.根据权利要求1或2的用途，用于刺激血细胞生成。
4.根据权利要求1的用途，用于刺激红细胞生成。
5.根据权利要求4的用途，用于治疗贫血症。
6.根据权利要求4或5的用途，其进一步包含给予一种或多种造血生长因子。
7.根据权利要求6的用途，其中造血生长因子是红细胞生成素。
8.根据权利要求1的用途，用于刺激髓细胞生成。
9.根据权利要求书8的用途，用于治疗中性粒细胞减少症。
10.根据权利要求8或9的用途，其进一步包含给予一种或多种造血生长因子。
11.根据权利要求10的用途，其中造血生长因子是G-CSF或GM-CSF。
12.根据权利要求1-11中任何一项的用途，其中所述的物质结合CD163。
13.根据权利要求12的用途，其中所述的物质是结合CD163的抗体。
14.用于增强干细胞或祖细胞生长、增殖、分化和/或动员的细胞培养添加剂，其包含有效量的可活化CD163的物质。
15.根据权利要求14的细胞培养添加剂，其中不含血清。
16.根据权利要求14的细胞培养添加剂，其中包含血清。
17.根据权利要求14-16的细胞培养添加剂，用于增强红细胞系祖细胞生长、增殖、分化和/或动员。
18.根据权利要求书17的细胞培养添加剂，其进一步包含红细胞生成素。
19.根据权利要求14-16的细胞培养添加剂，用于增强髓细胞系祖细胞生长、增殖、分化和/或动员。
20.根据权利要求14-16的细胞培养添加剂，用于增强造血祖细胞或干细胞生长、增殖、分化和/或动员。
21.选择样品中造血干或祖细胞的方法，其包含(a)用可结合CD163的物质接触样品，以及(b)选择与该物质结合的细胞。
22.根据权利要求19的方法，其中干或祖细胞是CD34阳性细胞。
23.选择能够形成红细胞系和髓细胞系集落的细胞的方法，其包含(a)用可结合CD163的物质接触样品，以及(b)选择与该物质结合的细胞。
24.选择能够利用髓细胞系和红细胞系细胞再增殖生物体的细胞的方法，其包含(a)用可结合CD163的物质接触样品，以及(b)选择与该物质结合的细胞。
25.选择样品中干或祖细胞的方法，其包含(a)用可结合CD163的物质接触样品，以及(b)从样品中去除与该物质结合的细胞。
26.根据权利要求21-25中任何一项的方法，其中可结合CD163的物质是抗体。
全文摘要
本发明描述了刺激干细胞和/或祖细胞生长、增殖、分化和/或动员的方法和组合物。该方法涉及给予有效量的可活化CD163血红蛋白清除剂受体信号转导途径的物质。该方法和组合物用于刺激血细胞生成，并治疗多种疾病，包括血细胞减少症、贫血症，以及用于制备供移植的细胞。
文档编号G01N33/50GK1462192SQ02801429
公开日2003年12月17日 申请日期2002年3月26日 优先权日2001年3月26日
发明者S·G·米勒, D·贝尔, K·E·马修斯 申请人:赫姆索尔公司