专利名称：用于分析的方法和生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及分析方法。本发明还涉及用于进行所述方法的生物传感器。
背景技术：
对于帮助临床诊断和环境分析的简单、快速和易于使用的传感器的需求在不断增加。
在传统上，在临床实验室中已经通过放射免疫分析、固相酶免疫分析和荧光免疫分析方法来测定抗体与抗原之间非常特异和紧密的结合。抗体-抗原复合物的定量测定依赖于标记分子例如放射同位素、酶或荧光探针。在大多数情况下，只有在进行了几次培养、洗涤和分离步骤之后才能获得结果。
目前正在开发可借助于被固定的抗体来即时监测抗体浓度，并且不需要使用标记物的免疫传感器。然而，在使用常规固定方法时，对于抗体定向缺乏控制限制了可利用的结合位点的比例[Attili，B.；Suleiman，A.；Microchemical Journal 54(1996)174]。另一方面，位点特异性固定带来较高的活性。对于抗体的控制固定的选择包括抗体的Fc区与蛋白A或蛋白G的特异性结合，经由抗体Fab′-片段上的游离巯基共价连接到支持层上，和通过生物素/(链霉)抗生物素蛋白化学将生物素化的抗体偶联到表面上[Morgan，H.；Taylor，D.M.；Biosensors & Bioelectronics 7(1992)405；Vikholm，I.；Albers，W.M.；Langmuir 14(1998)3865；Fischer，B.；Heyn，S.P.；Egger，M.；Gaub，H.E.；Langmuir(9)(1993)136；Schnhoff，M.；Lsche，M.；Meyer，M.；Wilhelm，C.；Progr.Colloid Polym.Sci.(1992)243；Krull，U.J.；Brown，R.S.；Vandenberg，E.T.；Heckl，W.M.；J.，Electr.Microscopy Technique 18(1991)212；Heyn，S.P.；Egger，M.；Gaub，H.E.；J.Phys.Chem.94(1990)5073]。
仍然，最近已经表明，Fab′-片段可以以高表位密度直接吸附到金上[O′Brien，J.；Jones，V.；Porter，M.；Anal.Chem.72(2000)703]。金属表面的高表面能通常导致生物分子变性，从而使活性下降。已对该吸附机理进行了充分研究，并且其涉及材料的表面与生物分子表面上的疏水性膜片之间的疏水性相互作用。初始吸附之后，蛋白可变性，并解折叠以暴露出更多的疏水性基团，由此失去活性[Andrade，J.D.，Hlady，V.，Adv.Polym.Sci.79(1986)1-63]。
描述使用在表面上形成用于连接生物分子的单层的各种连接分子，来制备其中可通过表面胞质基因组共振来进行检测的生物传感器的专利文件包括US专利5242828与欧洲专利442922和485874。
能够以定向和可再现方式以最小解折叠连接到转导物介面上的受体分子可最佳地保持活性和特异性，并且可在需要高灵敏度的传感器应用中使用。这类受体分子的位点定向固定将保证最大结合效率。
在生物传感器应用中必须克服的另一个问题是非特异性结合。在如生化、生物、生物技术和健康护理的领域中，生物排斥表面已成为引起很大关注的主题，这是因为需要控制生物分子和细胞与各种表面的相互作用。蛋白排斥表面对于接触血液的植入装置、分离操作用膜、色谱载体、隐形眼镜和血液以及蛋白贮存装置非常重要。
生物分子排斥表面可通过将非离子亲水性聚合物例如聚(丙烯酰胺)、聚(N，N-二甲基丙烯基胺)、聚(乙烯醇)、乙烯-乙烯基醇共聚物、聚(羟基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(氧化乙烯)和聚(乙二醇)固定来制得[Kberle，P.；Laschewsky，A.；van den Boogaard，D.；Polymer 33(1992)4029；Saito，N.；Sugawara，T.；Matsuda，T.；Macromolecules 29(1996)313]。对蛋白吸附的抵抗性是基于生物排斥表面的柔性分子链与溶液生物分子的熵和流体动力排斥力大于组合吸引力。已通过物理包被(coating)、化学偶联或接枝共聚来将聚合物吸附。
对于生物传感器应用，已有人将提供低聚(乙二醇)的自我装配型(self-assembled)烷硫醇与其中可连接生物分子的具有适当连接基团的分子混合[E.Ostuni，L.Yan，G.Whitesides，Colloids和Surfaces BBiointerfaces 15(1999)3-30]。
发明概述本发明的目的是提供用于分析的方法和生物传感器，所述方法和生物传感器对于分析物具有高特异性结合。
可将在单体/聚合物骨架上具有合适的末端锚基团，或具有携带末端锚基团的亲水性单体/聚合物“刷”的生物分子排斥分子与连接在同一表面上的生物分子，尤其是免疫结合分子(受体)例如抗体片段一起化学接枝到固体例如Au、Ag、Cu、Al、Pd和GaAs上以形成单层。这些生物分子排斥分子直接接枝到与生物分子，尤其是免疫结合分子(受体)例如抗体片段相同的表面上，这样它们形成混合单层。生物分子排斥分子防止了在生物分子之间留下的空间中的分析物的非特异性结合。免疫反应可用技术例如表面胞质基因组共振、石英晶体微量天平，和阻抗来检测。固定操作可显著降低分析物的生物大分子的非特异性结合，因为在Fab′-片段之间的表面将是高亲水性和非离子性的，并且抗体片段的适当定向也将导致抗原的高度结合。
可将生物分子例如免疫结合分子(受体)以定向方式固定，以提供定量分析连接在生物分子上的分析物分子的适宜方法。O′Brien，J.；Jones，V.；Porter，M.；Anal.Chem.72(2000)703中描述了一种固定抗体片段的方法，该文献引入本文以供参考。
在分析中使用这样的测定方法，其与具有固体表面的基质相容，并且与所用的基质一起能够给出低的检测限(detection limit)。生物分子与对固体表面具有亲和力的基团一起直接结合在其上面的固体表面可以是这样的类型，其能够诱导信号改变，这种信号改变被发射到基质上，以与基质、固定的生物分子和结合的分析物的组合相互作用，随后检测作为基质固体表面上的物质增加(选择性地与固定在基质表面上的生物分子结合的分析物分子的蓄积)的指示的信号改变。
特别适于达到良好灵敏度和改善方法功效的检测方法是表面胞质基因组共振、厚度剪切模式、表面声波和电化学测定。
附图简述通过下列结合附图的描述，本发明的目的和特征可得到更好的理解，其中附
图1是传感器表面的图示表现，其中抗体Fab′-片段与生物分子排斥分子一起连接在表面上，并且传感器与抗原相互作用，附图2是附图1的表现，其表示的是，使用胶体/纳米颗粒来放大检测，附图3表示的是依据一个本发明实施方案的测定装置，附图4表示的是依据另一个本发明实施方案的测定装置，
附图5表示的是在将不同大分子连接在金薄膜上时SPR的改变，附图6表示的是用本发明传感器获得的SPR结合等温线，附图7表示的是在不同大分子结合到金薄膜上时SPR强度的总变化。
优选实施方案的详细描述将生物分子与官能团一起直接固定在基质固体表面上以形成用于分析的一层定向受体。生物分子可以是蛋白、肽、酶、抗体、抗体片段(例如Fab′)、抗原或抗原的一部分。为了进行分析，这些分子应当具有对待检测的分析物有特异性的结合位点，并且它们还可以是下文描述的结合分子或受体。
生物分子与连接在同一表面上的生物分子排斥单体/聚合物分子一起经由官能团直接连接在基质的固体表面上，这样生物分子在具有暴露的活性分析物选择性结合位点(例如抗原结合位点、表位等)的表面上自我装配，并且也自我装配的生物分子排斥分子将在生物分子之间留下的固体表面覆盖，以防止在生物分子的活性结合位点之间发生分析物分子的非特异性结合。生物分子和生物分子排斥单体/聚合物具有官能团，所述官能团对于基质的固体表面具有亲和力，并起末端锚基团的作用。例如，末端具有巯基的有机分子可通过在金属与硫原子之间形成共价键而化学吸附到金属例如Au、Ag、Cu、Al和Pd的表面上，并形成单层包被。以上述方式表现出自我装配的系统包括通过含有硫的官能团来自动化学吸附到金属表面上的硫醇、二硫化物和硫化物。
如果分析方法是SPR测定，则所用基质是SPR相容性材料例如金、银、铜、铝和钯的膜。然而，本发明不限于任何具体分析方法。
可通过将生物分子的结构部分转化成官能团，例如通过将前体基团还原成巯基来给生物分子提供官能团。或者，可将含有官能团或其前体的连接分子连接到生物分子上，以给其提供适于自我装配的官能团，然后将生物分子从溶液中化学吸附到表面上。由此在一个步骤中将具有官能团的生物分子直接吸附到基质的固体表面上，以形成其中生物分子以定向方式形成单层的生物传感器。通过化学吸附将生物分子排斥单体/聚合物分子连接在表面上，也以定向方式形成单层。可在同一步骤中或者在将生物分子固定之后将生物分子排斥分子连接在同一表面上。
可通过简单的化学吸附将生物分子排斥分子连接在表面上。优选通过在一个聚合物链末端上的合适的官能团(末端锚基团)例如硫化物、二硫化物或巯基将生物分子排斥分子共价连接在表面上。所用的生物分子排斥聚合物通常在另一端含有OH基团。表面与待排斥的生物分子的合并吸引力例如范德华力、静电力、熵力和氢键力应当小于由于固体表面上的柔性分子链与溶液中生物分子的热运动所带来的熵和流体动力排斥力。这样的表面可通过将中性亲水性聚合物，包括聚丙烯酰胺、聚-N，N-二甲基丙烯酰胺、聚乙烯基醇、乙烯-乙烯基醇共聚物、聚(羟基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(氧化乙烯)和聚(乙二醇)固定来制得。此外，对于其生物相容性，也使用了其它聚合物例如聚对苯二甲酸乙二酯、聚四氟乙烯、聚氨酯等。
在传感器应用中，根据附图1所示的一个本发明实施方案，作为受体3的Fab′-片段经由在该抗体的结合域对面的游离巯基连接，和/或具有暴露的游离巯基的抗体/受体直接连接在金属、半导体或(传导性)聚合物表面或这些表面的混合物，即基质1的表面上。产生亲水性生物分子排斥表面的聚合物分子5以定向方式连接到结合有受体的同一金属、半导体或(传导性)聚合物表面的生物分子之间的空余位置上，由此将基质表面屏蔽起来，使其不能与分析物分子非特异性结合。
在本文中，术语“生物分子排斥”是指将被分析的溶液中的生物分子排斥，以防止在受体生物分子之间发生非特异性结合。
聚合物分子5这样定向，其聚合物链从表面凸出来，在聚合物链末端的其官能团(例如巯基、硫化物或二硫化物)作为连接位点。生物分子排斥分子层在表面上的厚度优选比基质1表面上的生物分子的厚度L(生物分子高度)低一些。
作为受体3的生物分子和生物分子排斥聚合物分子5连接在其外表面上的固体基质1是具有适当厚度的由合适材料构成的膜，其可用于通过一种下文描述的方法检测在其表面上的增多的物质。在溶液中与基质1接触的分析物4(抗原)将与在基质1上的受体3(Fab′-片段)之间发生免疫反应。分析物的检测方法尤其包括基于表面胞质基因组共振，厚度剪切模式共振器技术的方法，其一个实例是石英晶体微量天平(OCM)，表面声波(SAM装置)和电化学测定。然而，使用生物分子排斥单体/聚合物分子来阻断生物分子的特异性结合位点之间的非特异性结合位点的本发明不限于任何具体分析检测方法。
上面已经提出了抗体片段作为可连接表面的生物分子的一个实例。也在本发明范围内的是，将完整抗体固定在基质表面上，例如经由在其Fc区中提供的游离巯基来固定在基质表面上。
根据另一个本发明实施方案，以类似方式使用受体3/Fab′-片段来包被分隔的颗粒2，例如由上述相同材料构成的胶体和纳米颗粒，这是通过将其经由游离巯基连接在颗粒2上来实现的。当必须检测相对较小分子和较低浓度的分析物时，使用这些颗粒来放大检测信号(附图2)。在溶液中的分析物4/抗原将与在基质表面上的受体3/Fab′-片段之间发生免疫反应，另一方面，分析物4/抗原将与连接有结合性生物分子的颗粒2例如受体/Fab′-片段包被的胶体/纳米颗粒相互作用。按照与上述类似的方式，在基质表面上的受体3之间使用生物分子排斥聚合物分子5。由此形成了将信号放大的胶体/纳米颗粒网络。附图2表明了包被的颗粒2是如何经由分析物4(抗原)与在基质表面上的受体3结合的。其中受体3可以经由游离巯基与之结合的这样的颗粒2的一个实例是金颗粒。
附图3显示了在实施例1中使用的SPR测定的原理，并且也是依据一个本发明实施方案的生物传感器的实例。至于SPR测定的原理和SPR相容性材料的性质，可参见例如欧洲专利537252和相应的US专利5322798，二者引入本文以供参考。Sadowski等人在Opt.Eng.34(1995)2581-2586中更详细描述了所用SPR的结构，该文献引入本文以供参考。将发自He-Ne激光器的波长为632.8nm的线性p-偏振光经由棱镜照射到用金薄膜包被的载物片上，其中载物片的位置是依据众所周知的Kretschmann结构确定的。测定在特定角度随着时间而改变的光强度。光水平的非常小的改变可用两个锁定放大器来测定，这两个放大器以不同截断频率监测从棱镜发出的光(样本光束)和从激光器发出的光(参照光束)。虽然在这种情况下SPR检测的动力学范围是有限的，但是该方法特别适于在其中共振峰相当宽的液体中测定。通过指数匹配的油将具有直接连接的Fab′-片段和生物分子排斥聚合物的Au基质附着在棱镜上。将流动池放在膜的测定区域的上面，给其填充缓冲液。将蛋白溶液泵到该池中，在合适的入射角下测定约10-15mm的光强度改变。
附图4显示了QCM测定的原理，该测定使用厚度剪切模式共振器原理，并且也可以应用于本发明传感器。该测定的原理可参见Vikholm，I.；Albers，W.M.；Langmuir 14(1998)3865中的描述，该文献引入本文以供参考。该检测方法的一般原理是观测共振频率的下降，由于分析物与一个电极的表面上的生物分子结合而导致共振器质量的改变与共振频率的下降成正比。石英晶体微量天平具有由在共振器晶体C两侧上的导电层1组成的电极。生物分子3和生物分子排斥聚合物分子5以例如附图1所示方式固定在一个电极的表面上(导电层1)，并且该电极表面与含有待测定分析物的溶液接触。共振器的边缘覆盖着硅酮橡胶以保护导线和电接触部件。通过电共振测定进行该检测，并且可使用与计算机连接的光谱/网络分析仪来测定共振频率。
其它可行的检测方法包括使用表面声波装置或电化学石英晶体微量天平。
因此，依据本发明，可将生物分子排斥分子与抗体Fab′-片段共价接枝到金属表面上以生成对于特异性抗原的反应性的表面。一起使用亲水性聚合物和Fab′-片段使得表面具有低的非特异性结合，由此改善了免疫测定的敏感性和选择性。此外，该技术可易于在通过表面光学构图来进行的多阵列筛选中使用。
下面描述某些试验来举例说明本发明，它们不限定本发明的范围。
实施例1模型抗体是多克隆山羊抗-人F(ab′)2(Jackson ImmunoResearch，色谱纯化的)，该抗体与牛、马、和小鼠血清蛋白具有最小的交叉反应。抗原是色谱纯化的人IgG(Jackson ImmunoResearch)。在使用之前，如下所述用二硫苏糖醇(DTT，Merck)将F(ab′)2裂解成Fab′-片段在微透析管中将浓度为1.2-1.3mg/ml(100ul)的F(ab′)2与50μlHEPES/EDTA缓冲液(150mM NaCl，10mM HEPES，5mM EDTA，pH＝6.0)和10μl 0.1M DTT在HEPES/EDTA缓冲液中的溶液混合。将透析管浸泡在250ml氩气吹扫的HEPES/EDTA缓冲液中，在室温于氩气氛下透析约18小时。将Fab′-片段保持在氩气氛下，并立即用于连接。
Fab′-片段在抗体结合域的对面具有非常易于反应的巯基。
使用表面胞质基因组共振装置SPRDEVI来进行测定(VTT，Tampere)。通过真空蒸发给所用的载玻片包被上肽(4nm，用以提高金的粘着性)和金(37nm)薄膜。在临使用之前，将载玻片在1∶1∶5 H2O2∶NH4OH∶H2O的热溶液中清洗，用水洗涤。将载玻片经由指数匹配油附着在SPR棱镜上，将流动池装配在棱镜上，让10mM HEPES，150mM NaCl，pH7.2流经该池。使用得自Milli-Q系统(Millipore Co.，Bedford，USA)的高纯度水(18.2MΩcm)制备缓冲溶液。记录SPR强度曲线，在相当于SPR曲线的最陡点的固定角进行原地测定。生物分子排斥聚合物单层是基于N-[三(羟基甲基)甲基]丙烯酰胺单体，并经由二硫化物锚以0.12mg/ml的浓度接枝到金表面上。将Fab′片段固定在该表面上，然后将生物分子排斥分子接枝到同一表面上。
附图5是典型的SPR传感器图，其表明了在表面上将不同大分子连接时SPR强度的改变。上面的曲线代表受体3(Fab′-片段)与生物分子排斥聚合物分子5的复合单层的形成和特性，下面的曲线代表仅由生物分子排斥聚合物分子5组成的单层。连接上Fab′-片段与生物分子排斥聚合物分子的时间分别用字母a和c表示。加入牛血清白蛋白(BSA)的时间用字母d表示。
该传感器图表明，在将Fab′-片段或生物分子排斥聚合物接枝到金上时，SPR强度首先迅速增加，带来平台值，然后在洗涤期(用缓冲液洗涤以b表示)将可逆结合的Fab′-片段或聚合物缓慢地解吸。此外，生物分子排斥聚合物可接枝到已经连接上Fab′-片段的表面上(上面曲线中的点c)。推测，聚合物在结合的Fab′-片段之间连接，由此将金表面屏蔽，从而防止了生物分子的非特异性结合。BSA不吸附到纯聚合物层上，并且对于吸附BSA的抗体/聚合物层(点d)，SPR强度仅有少量增加。某些BSA分子可能与抗体紧密吸附。将hIgG注射到Fab′/聚合物层上后(在上面曲线上的点e)，SPR强度有很大增加，但是如果抗体不包括在纯聚合物层上(下面曲线中的点e)，可观察到强度没有任何改变。此外，可用HCl-甘氨酸溶液将抗体层再生，这表明已发生了免疫反应(上面曲线中的点f)。
在1pg/ml-10μg/ml的浓度范围内测定了在Fab′-片段与生物分子排斥聚合物的复合单层上的hIgG的SPR结合等温线(附图6)。在附图7中，由抗体Fab′-片段、生物分子排斥分子、BSA和hIgG引起的SPR强度变化表明了Fab′-片段的浓度与随后金薄膜上的抗体Fab′-片段、生物分子排斥分子、BSA和hIgG的结合有关。随着结合的抗体片段的量，接枝的生物分子排斥分子的量减少。BSA的非特异性结合几乎与抗体浓度无关。在所试验的Fab′-片段浓度，hIgG的结合达到平台值。
权利要求
1.分析方法，其中使用连接在基质(1)的固体表面上的生物分子(3)通过分析物与生物分子的结合来检测样本中存在的分析物(4)，其特征在于，生物分子(3)与生物分子排斥分子(5)一起直接连接在基质的表面上，生物分子排斥分子覆盖生物分子(3)之间的表面以防止分析物(4)与其它生物分子的非特异性结合。
2.权利要求1的方法，其特征在于，生物分子排斥分子(5)经由官能团例如硫化物、二硫化物或巯基共价连接在基质(1)的表面上。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述基质是能够诱导信号改变的传感器基质，该信号改变是与在基质表面上的生物分子(3)结合的分析物(4)增加的指示，信号被施加到基质(1)上，检测改变的信号，并通过检测的信号来测定与在基质(1)表面上的生物分子(3)结合的分析物(4)的量。
4.权利要求1-3任一项的方法，其特征在于，除了直接连接在基质(1)表面上的生物分子(3)和生物分子排斥分子(5)以外，还使用含有被固定的生物分子的分隔的颗粒(2)，所述颗粒经由与在基质(1)上的所述生物分子(3)结合的分析物(4)连接在所述基质上。
5.前述权利要求任一项的方法，其特征在于，所述生物分子(3)是蛋白、肽、酶、抗体、抗体片段、抗原或抗原的一部分，并且所述生物分子经由巯基、二硫化物或硫化物基团连接在基质(1)和/或颗粒(2)的表面上。
6.前述权利要求任一项的方法，其特征在于，所述生物分子排斥分子(5)是聚合物，尤其是亲水性聚合物。
7.权利要求3-6任一项的方法，其特征在于，基质(1)是能够提供表面胞质基因组共振(SPR)现象的基质，并且分析是通过SPR测定来进行的。
8.权利要求3-6任一项的方法，其特征在于，分析是通过厚度剪切模式共振器例如石英晶体微量天平(QCM)进行的。
9.前述权利要求任一项的方法，其特征在于，基质(1)是金属、半导体或导电性聚合物。
10.前述权利要求任一项的方法，其特征在于，生物分子(3)是免疫结合分子例如抗体或其免疫活性片段，并且所述分析是免疫分析。
11.用于分析的生物传感器，其中包括基质和连接在基质(1)上的生物分子(3)，其特征在于，生物分子(3)与生物分子排斥分子(5)一起直接连接在基质上，生物分子排斥分子覆盖生物分子(3)之间的表面以防止分析物(4)与其它生物分子的非特异性结合。
12.权利要求11的生物传感器，其特征在于，生物分子排斥分子(5)经由官能团例如硫化物、二硫化物或巯基共价连接在基质上。
13.权利要求11或12的生物传感器，其特征在于，所述生物分子排斥分子(5)是聚合物，尤其是亲水性聚合物。
14.权利要求11-13任一项的生物传感器，其特征在于，所述生物分子排斥分子(5)在表面上自我装配。
15.权利要求11-14任一项的生物传感器，其特征在于，所述基质是这样的类型，其能够诱导信号改变，该信号改变是与在基质表面上的生物分子(3)结合的分析物(4)增加的指示，所述传感器还包括用于将信号发向基质(1)的部件，和用于检测由于和基质(1)相互作用而导致的信号改变的部件。
16.权利要求15的生物传感器，其特征在于，所述基质(1)是表面胞质基因组共振(SPR)相容性材料，用于发射信号的部件是光发射部件，用于检测信号的部件是一个或多个用于检测从基质与电介质材料之间的界面上反射的信号的光检测器。
17.权利要求15的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器是厚度剪切模式共振器传感器例如石英晶体微量天平(QCM)传感器。
全文摘要
在分析方法中，使用连接在基质(1)的固体表面上的生物分子(3)通过分析物与生物分子的结合来检测样本中存在的分析物(4)。生物分子(3)与生物分子排斥分子(5)一起直接连接在基质的表面上，生物分子排斥分子覆盖生物分子(3)之间的表面以防止分析物(4)与其它生物分子的非特异性结合。本发明还涉及生物传感器，其中生物分子(3)与生物分子排斥分子(5)一起直接连接在基质的表面上，生物分子排斥分子覆盖生物分子(3)之间的表面以防止分析物(4)与其它生物分子的非特异性结合。生物分子排斥分子(5)可以是自我装配的亲水性聚合物。使用本发明的一个实例是使用表面胞质基因组共振(SPR)的免疫分析。
文档编号G01N21/27GK1589406SQ02823282
公开日2005年3月2日 申请日期2002年9月24日 优先权日2001年9月24日
发明者I·维克霍姆, J·萨多夫斯基 申请人:拜奥方斯有限公司