专利名称：生物传感器的制备方法
技术领域：
本发明属于一种生物传感器的制备方法，具体的讲，本发明属于硅溶胶-凝胶膜固载血红蛋白第三代生物传感器的制备方法。
背景技术：
生物电传感器在工农业生产、医疗卫生、环境保护等领域具有广泛的应用。生物传感器是利用生物物质作为识别元件，将被测物质的浓度与可测量的电信号关联起来。生物传感器中研究最多的是酶传感器。根据酶与电极间电子转移的机理大致可将酶生物传感器分为三代在葡萄糖传感器中，采用酶的天然介体一氧的催化原理设计制作的酶传感器称为第一代生物传感器；第二代生物传感器将人工合成的媒介体掺入酶层中，减少了空间氧的干扰；第三代生物传感器是指在无媒介体存在下，利用酶与电极间的直接电子传递制作的酶传感器。近年来，第三代生物传感器的研究十分活跃，但大多数都集中在以天然酶(如辣根过氧化物酶HRP)作为识别元件。然而，天然酶基的第三代生物传感器最大的缺点是使用寿命短、价格昂贵。
由于血红蛋白具有和HRP相同的铁卟啉辅基而可望代替HRP作为生物传感器的识别元件，这方面的研究吸引了大量化学工作者的兴趣。然而，由于血红蛋白分子庞大，活性中心深埋于折叠的肽链之中。所以，要使血红蛋白成为第三代生物传感器的识别元件，需要克服的困难就是实现其直接的电子转移。也就是既要有效的固载血红蛋白于电极表面，又要防止由于固载而使其变性失活，还要实现血红蛋白与电极之间的直接电子转移。硅溶胶-凝胶过程条件温和，化学惰性，包埋于溶胶-凝胶中的生物活性物质可以保持其结构、活性和功能，而且小分子可通过溶胶-凝胶的孔道与生物活性物质接触。基于此，硅溶胶-凝胶已经广泛的用于电极表面固载生物酶而研制葡萄糖、H2O2传感器等。
发明内容
本发明的目的是提供一种硅溶胶-凝胶膜固载血红蛋白第三代生物传感器的制备方法。
我们的发明思想是用硅溶胶-凝胶储备液涂于已修饰了血红蛋白的碳糊电极表面，使其在室温下现场碱催化聚合成膜而使血红蛋白固载，从而制成硅溶胶-凝胶膜固载血红蛋白第三代生物传感器。制成的传感器具有较强的过氧化物酶的催化特性，能够对H2O2、O2、亚硝酸盐、三氯乙酸等选择性的电催化还原。该传感器达到平衡的时间短、响应快、制作简单、价格低廉、使用寿命长。
一种生物传感器的制备方法，其特征在于该方法将含有15-20mg/mL血红蛋白的磷酸盐溶液涂于碳糊电极表面，室温干燥生成血红蛋白膜；再在血红蛋白膜表面均匀涂布由硅烷、醇、氢氧化钠溶液组成的硅溶胶-凝胶液，经过室温碱催化聚合生成硅溶胶-凝胶膜固载血红蛋白生物传感器。
本发明所用的硅烷选自四乙氧基硅烷或四甲氧基硅烷。
本发明所用的醇选自乙醇或甲醇。
由于本发明固载血红蛋白使用硅溶胶-凝胶膜，并且采用了现场碱催化成膜，从而避免了强酸作催化剂而导致的血红蛋白的变性。实验证明固载于碳糊电极表面的血红蛋白保持了其原始的结构状态，因而显示了较强的过氧化物酶的催化活性。另外，硅的溶胶-凝胶膜存在有大量的羟基基团可以和蛋白质形成氢键，可以防止血红蛋白从电极表面脱落；加上血红蛋白本身比HRP稳定，从而使得本发明制得的第三代生物传感器具有比生物酶有较强的操作稳定性和较长的使用寿命。
由于本发明采用的基底电极是碳糊电极、识别元件是血红蛋白、固载血红蛋白使用硅溶胶-凝胶膜。材料得来容易，制作简单，价格低廉。
本发明制备的生物传感器具有较好的酸碱适应性，能够在pH4-9的范围内均显示出较好的催化活性和稳定性。
具体实施例方式
实施例1将5g石墨粉与3mL液体石蜡混合均匀后，取适量填入玻璃管[4.5mm(i.d.)；5.5mm(o.d.)]的一端约5mm的高度，另一端插进一根铜线构成碳糊电极。电极的表面在称量纸上磨光滑。
将600μL乙醇、50μL四乙氧基硅烷(TEOS)、10μL 5mmol/L的NaOH溶液以及60μLH2O于一支小试管中快速混合后得到硅溶胶-凝胶液，置于4℃冰箱中保存备用。
将5μL 15mg/mL血红蛋白的磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)滴到碳糊电极的表面，用一端封口的毛细管涂布均匀；室温凉干1h。然后，将10μL硅溶胶-凝胶储备液滴到已被Hb修饰的电极表面并涂布均匀，使其在室温下聚合1小时。最后，将制备好的电极(即硅溶胶-凝胶膜固载血红蛋白第三代生物传感器)浸于pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中置于4℃冰箱保存。该传感器具有良好的响应性能达到平衡时间短，不大于10分钟；响应快，约0.5-1分钟；使用寿命长，10周以上。
实施例2硅溶胶-凝胶液的组成为600μL甲醇、50μL四甲氧基硅烷(TMOS)、10μL 5mmol/L的NaOH溶液以及60μLH2O。其它操作步骤同实施例1。
实施例1和实施例2制备的传感器的性能传感器用于水溶液中过氧化氢的测定过氧化氢响应灵敏度为64.8μA/mmol/L。
检出限为8.6×10-7mol/L测量线性范围为1×10-6-2.8×10-4mol/L。
传感器用于水溶液中亚硝酸盐的测定检出限为3×10-7mol/L。
测量线性范围为0-8.6×10-4mol/L。
传感器用于水溶液中三氯乙酸的测定检出限为3×10-6mol/L。
测量线性范围为2.3×10-5-8.6×10-3mol/L。
传感器在22℃的室温条件下用于水溶液中溶解氧的测定检出限为5.2×10-6mol/L测量线性范围为7.8×10-6-1×10-3mol/L。
权利要求
1.一种生物传感器的制备方法，其特征在于该方法将含有15-20mg/mL血红蛋白的磷酸盐溶液涂于碳糊电极表面，室温干燥生成血红蛋白膜；再在血红蛋白膜表面均匀涂布由硅烷、醇、氢氧化钠溶液组成的硅溶胶-凝胶液，经过室温碱催化聚合生成硅溶胶-凝胶膜固载血红蛋白生物传感器。
2.如权利要求1所说的方法，其特征在于硅烷选自四乙氧基硅烷或四甲氧基硅烷。
3.如权利要求1所说的方法，其特征在于醇选自乙醇或甲醇。
全文摘要
本发明属于硅溶胶－凝胶膜固载血红蛋白传感器的制备方法。本发明采用硅烷在碱性条件下现场水解聚合形成薄膜，用该薄膜固载血红蛋白于碳糊电极表面而制成生物传感器。该传感器对于过氧化氢、氧气、亚硝酸盐、三氯乙酸等具有催化电流响应，其优点在于平衡时间短、响应快、灵敏度高、使用寿命长、制作简单、价格低廉。
文档编号G01N27/327GK1635370SQ200310117748
公开日2005年7月6日 申请日期2003年12月30日 优先权日2003年12月30日
发明者吕功煊, 王全林 申请人:中国科学院兰州化学物理研究所