专利名称：使用生物传感器的测定方法
技术领域：
本发明涉及使用生物传感器的测定方法。更详细的，本发明涉及在同一生物传感器上进行生理活性物质对生物传感器基板的固定量的测定和该生理活性物质的生物学活性的测定。
背景技术：
现在在临床检查等中大多利用免疫反应等分子间相互作用来进行测定，但是因为采用现有的方法必须复杂的操作和标记物质，要求使用不需要标记物质、可以高敏感度地检测测定物质的结合量变化的几个技术。例如有表面等离子体激元共振(SPR)测定技术、晶体振荡器微量天平(QCM)测定技术、使用从金的胶体颗粒到超微颗粒的功能化表面的测定技术。SPR测定技术是通过测定反射光波长的峰位移和一定波长的反射光量的变化来求出和芯片金属膜接触的有机功能膜附近的折射率变化，由此检测在表面附近引起的吸附或脱附的方法。QCM测定技术是根据晶体振荡器的金电极(装置)上的物质的吸脱附引起的发射器的频率变化，可以检测ng水平上的吸脱附质量的技术。并且，通过将金超微细颗粒(nm水平)表面功能化，在其上固定生理活性物质，进行生理活性物质间的特殊认识反应，可以检测从金微细颗粒的沉淀、排列产生的生物体关联物质。
对于表面等离子体共振(SPR)分析中一般使用的测定芯片是由透明基板(例如玻璃)、蒸镀的金属膜和具有能在其上固定生理活性物质的官能团薄膜制得，在引入该官能团的金属表面上固定生理活性物质。通过测定该生理活性物质和检测体物质间的特殊结合反应来分析生物体分子间的相互作用。作为具有可以固定生理活性物质的官能团的薄膜使用具有和金属结合的官能团、链长的原子数为10个以上的连接剂和能和生理活性物质结合的官能团的化合物，有报导说用于固定生理活性物质的测定芯片上(参加专利文献1)。并且，有报导公开了由金属膜、在该金属膜上形成的等离子体聚合膜制得的测定芯片(参加专利文献2)。
由上所述，在现有的表面等离子体激元共振(SPR)测定中，可以进行与在测定芯片上固定的生理活性物质相互作用的物质的检测或测定，但是因为没有进行固定在测定芯片上的该生理活性物质的生物学活性的测定，不一定能在维持本来要观察的活性的状态下进行对生理活性物质的相互作用的测定。
第2815120号专利[专利文献2]特开平9-264843号发明内容发明要解决的问题本发明是要消除上述现有技术问题的解决课题。即，本发明通过在同一生物传感器上进行生理活性物质在生物传感器基板上的固定量测定和该生理活性物质的生物学活性的测定，提供一种分析对保持活性的生理活性物质的相互作用的方法作为要解决的课题。
解决课题的手段本发明人为了解决上述课题进行了反复的研究，结果发现通过在同一生物传感器上进行生理活性物质在生物传感器基板上的固定量测定和该生理活性物质的生物学活性的测定，可以解决上述课题，从而完成本发明。
即，根据本发明，可以提供一种测定方法，其特征在于在使用生物传感器的测定方法中，可以在同一生物传感器基板上进行生理活性物质在上的固定量测定和在该基板上固定的生理活性物质的生物学活性的测定。
优选生理活性物质是蛋白质。更优选生理活性物质是酶。
优选通过表面等离子体激元共振分析来测定生理活性物质在基板上的固定量。
优选所述表面等离子体激元共振分析是通过生物传感器用于表面等离子体激元共振测定装置，该装置包含电介质块、在该电介质块一侧形成的金属膜、产生的光束的光源和允许光线进入上述电介质块使在该电介质块和金属膜界面获得全反射状态和各种不同入射角度的成分而入射的光学系统，以及测定在所述界面全反射光束强度来检测表面等离子体激元共振状态的检测装置；其中，所述的生物传感器是由上述的电介质块和金属膜构成，所述的上述电介质块包含上述光束的入射面、出射面和上述金属膜被形成的一面的全部作为一块被形成，在该电介质块上金属膜被一体化。
优选通过光谱测定来进行对生理活性物质的生物学活性测定。
本发明的测定方法优选包括(1)根据在同一生物传感器基板中测定的生理活性物质在基板上的固定量和在该基板上固定的生理活性物质的生物学活性值确认下式1表示的固定的每单位量的生理活性物质的生物学活性值的步骤；式1每单位量固定的生理活性物质的生物学活性值＝(在基板上固定的生理活性物质的生物学的活性值)/(生理活性物质在基板上的固定量)
(2)使用通过上述步骤(1)中确认的固定方法固定了生理活性物质的基板，检测或测定生理活性物质和被检物质的相互作用的步骤。
本发明的测定方法优选包括(1)根据在同一生物传感器基板中测定的生理活性物质在基板上的固定量和在该基板上固定的生理活性物质的生物学活性值，以下式1表示的固定的每单位量生理活性物质的生物学活性值为指标，使生理活性物质在该生物传感器基板上以最合适的方法固定的步骤；式1每单位量固定的生理活性物质的生物学活性值＝(在基板上固定的生理活性物质的生物学的活性值)/(生理活性物质在基板上的固定量)(2)使用通过上述步骤(1)中最合适的固定方法固定了生理活性物质的基板，检测或测定生理活性物质和被检物质的相互作用的步骤。
优选在同一生物传感器基板上进行步骤(1)中的测定在基板上的生理活性物质的固定化量和在该基板上固定的生理活性物质的生物学活性值和步骤(2)中的检测或测定生理活性物质和被检物质的相互作用。
发明效果根据本发明的测定方法，可以测定要测定的蛋白质的固定量和生物学活性。而且，通过进行维持由本测定方法决定的活性的固定化蛋白质和化合物的相互作用的测定，可以确实地分析对蛋白质起相互作用的化合物。
实施发明的最佳形态以下说明本发明的实施形态。
本发明的方法特征在于在使用在基板上固定了生理活性物质的生物传感器的测定方法中，在上述同一生物传感器中进行该生理活性物质的固定量和该生理活性物质的生物学活性的测定。本发明中，因为通过在上述同一生物传感器中进行生理活性物质的固定量和该生理活性物质的生物学活性的测定，可以在测定该生理活性物质和被检测物质的相互作用前固定最理想状态下的该生理活性物质，因此可以确实地进行该生理活性物质和被检测物质的相互作用。
本发明中所称的生物传感器是指最广义解释的将生物体分子间的相互作用转换成电信号等信号，测定、检出作为对象的物质的传感器。通常的生物传感器由辨认作为检测对象的化学物质的接受部位、将这里发生的物理变化或化学变化转换成电信号的传感器部位构成。作为在生物体内相互有亲合性的物质有酶/基质、酶/辅酶、抗原/抗体、激素/受体等。生物传感器是利用通过将有亲合性的物质中的一方固定在基板上作为分子辨认物质，来选择性地测量对应的另一方的物质的原理。
本发明中使用的生物传感器可以使用金属表面或金属膜作为基板。作为构成金属表面或金属膜的金属，例如在考虑用于表面等离子体激元共振生物传感器的情况下，只要是可以产生表面等离子体激元共振，没有特别限制。优选列举有金、银、铜、铝、铂等有自由电子的金属，特别优选金。这些金属可以单独使用，也可以结合使用。并且，考虑对上述基板的附着性，可以在基板和由金属制得的层之间设置铬等制得的插层。
金属膜的膜厚是任意的，但是例如考虑用于表面等离子体激元共振生物传感器的情况下，优选0.1nm以上500nm以下，特别优选1nm以上200nm以下。超过500nm的话，不能充分检出介质表面的等离子体激元现象。并且在设置由铬等制得的插层的情况下，该插层的厚度优选为0.1nm以上10nm以下。
金属膜的形成可以通过常规方法进行，例如可以通过溅镀法、蒸镀法、离子电镀法、电镀法、无电解电镀法等来进行。
金属膜优选设置在基板上。这里“设置在基板上”是指除了金属膜直接在基板上接触设置的情况，还包括金属膜不直接在基板上接触，而插入其他层的情况。作为可以在本发明中使用的基板例如在考虑用于表面等离子体激元共振生物传感器的情况下，一般可以使用BK7等光学玻璃、或者合成树脂，具体来说是聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二酸乙二醇酯、聚碳酸酯、环烯烃聚合物等对激光透明的材料制得的基板。这样的基板优选是对偏振光不显示各向异性且加工性优良的材料。
本发明中优选的基板有用疏水性高分子化合物或亲水性高分子化合物涂覆的金属表面或金属膜，或者具有自组织化膜的金属表面或金属膜。以下说明疏水性高分子化合物、亲水性高分子化合物和自组织化膜。
本发明中使用的疏水性高分子化合物是没有吸水性的高分子化合物，对水的溶解度(25℃)在10％以下，更优选在1％以下，最优选在0.1％以下。
作为形成疏水性高分子化合物的疏水性单体可以从乙烯酯类、丙烯酸酯类、甲基丙烯酸酯类、烯烃类、苯乙烯类、丁烯酸酯类、衣康酸二酯类、马来酸二酯类、富马酸二酯类、烯丙基化合物类、乙烯基醚类、乙烯基酮类等中任意选择。作为疏水性高分子化合物可以是由一种单体制得的均聚物，也可以是由2种以上的单体制得的共聚物。
作为本发明中优选使用的疏水性高分子化合物能列举有聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚对苯二酸乙二醇酯、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚酯、尼龙等。
向疏水性高分子化合物的基板上涂覆可以通过常规方法来进行，例如旋转涂布、气刀涂布、棒涂布、刮刀涂布、滑板涂布、帘涂布、以及喷涂法、蒸镀法、铸膜法、浸渍法等来进行。
浸渍法是将基板与疏水性高分子化合物溶液接触后，再使其与不含上述疏水性高分子化合物溶液的液体接触的方法来进行涂布。优选疏水性高分子化合物溶液的溶剂和不含疏水性高分子化合物的液体的溶剂是同一种溶剂。
浸渍法是通过适当选择疏水性高分子化合物的涂布用溶剂，不依赖于基板的凹凸、曲率、形状等，在基板表面上形成均匀涂布厚度的疏水性高分子化合物层。
浸渍法的涂布用溶剂没有特别限制，只要可以溶解疏水性高分子化合物的一部分的任何溶剂都可以使用。例如可以使用N，N-二甲基甲酰胺等甲酰胺系溶剂、乙脲等腈系溶剂、苯氧基乙醇等醇系溶剂、2-丁酮等酮系溶剂、甲苯等苯系溶剂等，但是不限于这些。
与基板接触的疏水性高分子化合物的溶液可以是完全溶解疏水性高分子化合物的，可以是含有疏水性高分子化合物的不溶解成分的悬浮液。液体温度只要是处于部分溶解疏水性高分子化合物的液体状态就可以，没有特别限制，优选-20℃以上100℃以下。基板和疏水性高分子化合物溶液接触时可以改变液体温度。溶液的疏水性高分子化合物的浓度没有特别限制，优选0.01％以上30％以下，更优选0.1％以上10％以下。
固体基板和疏水性高分子化合物溶液的接触时间没有特别限制，优选在1秒以上24小时以下，更优选在3秒以上1小时以下。
作为不含有疏水性高分子化合物的液体优选溶剂本身的SP值(单位(J/cm3)1/2)和疏水性高分子化合物SP值之差为1以上20以下，更优选3以上15以下。SP值是用分子间的凝聚能密度的平方根来表示的，也称为溶解度参数。本发明中，SP值δ通过下式算出。各官能团的凝聚能Ecoh和摩尔容积V是使用Fedors规定的值(R.F.Fedors，Polym.Eng.Sci.，14(2)，P147、P472(1974))。
δ＝(∑ecoh/∑V)1/2作为例子列举疏水性高分子化合物和溶解的SP值的话，对于聚甲基丙烯酸甲酯-聚苯乙烯共聚物(1∶1)为21.0，溶剂2-苯氧基乙醇为25.3，对聚甲基丙烯酸甲酯为20.3，溶剂乙脲为22.9，对聚苯乙烯为21.6，溶剂甲苯为18.7。
基板和不含疏水性高分子化合物的液体的接触时间没有特别限制，优选1秒以上24小时以下，更优选3秒以上1小时以下。液体温度只要使溶剂处于液体状态，没有特别限制，优选-20℃以上100℃以下。基板和溶剂接触时可以改变液体温度。使用难挥发的溶剂时，为了去除溶剂，在和该溶剂接触后，可以用相互溶解的挥发性溶剂置换。
疏水性高分子化合物的涂布厚度没有特别限制，优选0.1nm以上500nm以下，特别优选1nm以上300nm以下。
作为本发明中使用的亲水性高分子化合物能列举有例如多羟基高分子化合物，具体是多糖类(例如琼脂糖、葡聚糖、角叉菜胶、海藻酸、淀粉、纤维素)或合成高分子化合物(例如聚乙烯醇)等。本发明中优选使用多糖类，最优选是葡聚糖。
本发明中优选使用平均分子量在1万以上200万以下的多羟基高分子化合物。可以优选使用2万以上200万以下，更优选3万以上100万以下，最优选20万以上80万以下的多羟基高分子化合物。
多羟基高分子化合物例如可以在碱性条件下通过和溴代乙酸反应来羧基化。通过控制反应条件，多羟基化合物在初期状态下含有的羟基可以一定比例地羧基化。本发明中例如可以使1～90％的羟基羧基化。另外，对于用任意的多羟基高分子化合物覆盖表面的表面例如可以通过下面的方法计算出羧基化率。使用二叔丁基碳化二亚胺/吡啶催化剂在三氟乙醇中50℃下气相修饰膜表面16小时，用ESCA(electronspectroscopy forchemical analysis)测定来自三氟乙醇的氟含量，由此算出和膜表面的氧含量的比例(下面称为F/O值)。以全部羟基被羧基化时的理论F/O值作为100％的羧基化，测定在任意条件下羧基化时的F/O值，可以算出此时的羧基化率。
多羟基高分子化合物可以粘附在混入了有机分子X1-R1-Y1的金属膜上。下面详细说明有机分子X1-R1-Y1。
X1是对金属膜有结合性的基团。具体来说，优选使用非对称或对称的硫化物(-SSR11Y11、-SSR1Y1)、硫化物(-SR11Y11、-SR1Y1)、二硒化物(-SeSeR11Y11、-SeSeR1Y1)、硒化物(SeR11Y11、-SeR1Y1)、硫醇基(-SH)、腈基(-CN)、异腈基、硝基(-NO2)、硒醇基(-SeH)、3价磷化物、异硫氰酸酯、黄原酸酯、硫代氨基甲酸酯、膦、硫代酸或二硫代酸(-COSH、-CSSH)。
R1(和R11)可以根据情况插入杂原子，优选是适当密集填充的直链(没有分枝)，根据情况包含双键和/或三键的烃链。链长超过10个原子是优选的。碳链可以根据情况过氟化。
Y1和Y11是用于结合多羟基高分子化合物的基团。Y1和Y11优选相同，具有直接或活性化后结合到多羟基高分子化合物上的性质。具体来说，可以使用羟基、羧基、氨基、醛基、酰肼、羰基、环氧基或乙烯基等。
作为有机分子X1-R1-Y1的具体例子能列举有10-羧基-1-癸烷硫醇、4，4’-二硫代二丁酸、11-羟基-1-十一碳烷硫醇、16-羟基-1-十六碳烷硫醇、11-氨基-1-十一碳烷硫醇等。
硫醇和二硫化物类等硫化物能在金等贵金属基板上自发吸附，形成单分子的超薄膜。并且其结合体因为显示出依赖于基板的晶格和吸附分子的分子结构的排列，被称之为自组织化膜。本发明中例如可以使用7-羧基-1-庚烷硫醇、10-羧基-1-癸烷硫醇、4，4’-二硫代二丁酸、11-羟基-1-十一碳烷硫醇、11-氨基-1-十一碳烷硫醇等作为自组织化化合物。
本发明中使用的基板还可以具有用于在基板上结合通式(A)表示的化合物的链合剂。
本发明中使用的链合剂的具体例子能列举有下式(4)表示的化合物。
X20-L20-Y20(4)(式中，X20表示能和疏水性高分子化合物、多羟基高分子化合物或自组织化膜上的官能团反应的基团，L20表示2价连接基团，Y20表示可以和通式(A)表示的化合物反应形成共价键的基团。)式(4)中，X20表示能和疏水性高分子化合物、多羟基高分子化合物或自组织化膜上的官能团反应的基团，优选是由卤素原子、氨基或保护基团保护的氨基、羧基或具有脱离基团的羰基、羟基、由保护基团保护的羟基、醛基、-NHNH2、-N＝C＝O、-N＝C＝S、环氧基或乙烯基。
这里所称的保护基团是指在反应体系内能起到脱保护形成官能团的基团，例如作为氨基的保护基团能列举有叔丁基氧基羰基(Boc)、9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)、硝基苯基亚磺酰基(Nps)、二硫代琥珀酰基(Dts)等。
并且，作为羟基的保护基团能列举有酰基等。
这里所称的脱离基团能列举有卤素原子、烷氧基、芳氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、卤代烷基羰基氧基、烷基磺酰基氧基、卤代烷基磺酰基氧基、芳基磺酰基氧基等。
并且，作为脱离基团还优选使用羧酸和己知的脱水缩合试剂(例如碳化二亚胺类)和N-羟基化合物组合生成的酯基。
式(4)中，L20表示2价连接基团，L的总原子数优选为2～1000。进而，优选取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷撑基氧基、取代或未取代的芳撑基氧基、或者式(4)的X20和其他分子的Y20结合、结构连续的2价联接基团。
式(4)中，Y20表示和通式(A)表示的化合物反应形成共价键的基团，优选为由卤素原子、氨基或保护基团保护的氨基、羧基或具有脱离基团的羰基、羟基、由保护基团保护的羟基、醛基、-NHN2、-N＝C＝0、-N＝C＝S、环氧基或乙烯基。保护基团、脱离基团可以使用和上述相同的基团。
以下示出式(4)化合物的具体例子，但是本发明中使用的式(4)的化合物不限于此。
化1
本发明中的生物传感器优选在基板的最外表面上具有能固定生物活性物质的官能团。这里所称的“基板的最外表面”是指离基板最远的一侧，更具体是指离在基板上涂覆了疏水性高分子化合物中的基板最远的一侧。
由上述方法得到的传感器用基板通过共价键合插入了上述通式(A)中的官能团Y的生理活性物质，可以在金属表面或金属膜上固定生理活性物质。
作为在生物传感器上固定的生理活性物质只要是和测定对象能相互作用，且其本身是具有任何生理活性的物质，没有特别限制，例如能列举有免疫蛋白质、酶、微生物、核酸、低分子有机化合物、非免疫蛋白质、免疫球蛋白结合性蛋白质、糖结合性蛋白质、辨认糖的糖链、脂肪酸或脂肪酸酯或具有配体结合能的多肽或低聚肽等。其中优选蛋白质，特别优选酶。
作为免疫蛋白质能列举有以测定对象为抗原的抗体和半抗原等。作为抗体能使用各种免疫球蛋白即IgG、IgM、IgA、IgE、IgD。具体来说，测定对象为人血清白蛋白的话，抗体使用抗人血清白蛋白抗体。而且，以农药、杀虫剂、耐二甲氧基苯青霉素的黄色葡萄球菌、抗生素、麻药、可卡因、海洛因、克拉克等作为抗原时，例如能使用抗阿特拉津抗体、抗卡那霉素抗体、抗脱氧麻黄碘抗体或病原性大肠杆菌中的0抗原26、86、55、111、157等的抗体等。
作为酶只要是对由测定对象或测定对象代谢产生的物质显示活性的物质，没有特别限制，可以使用各种酶例如氧化还原酶、水解酶、异构化酶、解吸酶、合成酶等。具体来说，测定对象是葡萄糖的话，可以使用葡萄糖氧化酶，测定对象是胆固醇的话，可以使用胆固醇氧化酶。而且，以农药、杀虫剂、耐二甲氧基苯青霉素的黄色葡萄球菌、抗生素、麻药、可卡因、海洛因、克拉克等作为测定对象时，可以使用和它们代谢产生的物质显示出特殊(优异)的反应的例如乙酰基胆碱酯化酶、儿茶酚胺酯化酶、降肾上腺素酯化酶、多巴胺酯化酶等酶。
作为微生物没有特别限制，可以使用以大肠杆菌为代表的各种微生物。
作为核酸，可以使用以核酸为测定对象的相符的杂交产品。核酸可以使用DNA(包括cDNA)、RNA的任何一种。DNA的种类没有特别限制，可以是天然的DNA、通过基因重组技术制备的重组DNA或化学合成的DNA的任何一种。
作为低分子有机化合物可以列举由通常的有机化学合成方法合成的任意化合物。
作为非免疫蛋白质没有特别限制，例如可以使用抗生物素蛋白(抗生蛋白链菌素)、维生素H或受体等。
作为免疫球蛋白结合性蛋白质例如可以使用蛋白质A或蛋白质G、类风湿因子(RF)等。
作为糖结合性蛋白质能列举有植物凝血素等。
作为脂肪酸或脂肪酸酯能列举有硬脂酸、花生酸、正二十二碳酸、硬脂酸乙酯、花生酸乙酯、正二十二碳酸乙酯等。
如上述方式固定了生理活性物质的生物传感器可以用于检测和/或测定和该生理活性物质相互作用的物质。
本发明中，优选通过非电化学的方法检测和/或测定生理活性物质的固定量和在传感器用基板上固定的生理活性物质与被检测物质的相互作用。作为非电化学的方法能列举有表面等离子体激元共振(SPR)测定技术、晶体振荡器微量天平(QCM)测定技术、使用从金的胶体颗粒到超微细颗粒的功能化表面的测定技术等。
根据本发明的优选形态，生物传感器可以使用特征在于在透明基板上安装金属膜的表面等离子体激元共振用生物传感器。
表面等离子体激元共振用生物传感器是指在表面等离子体激元共振用生物传感器中使用的生物传感器，包括透过和反射由该传感器照射的光的部分和固定生理活性物质的部分，可以是固定了该传感器本身的制品，也可以是能脱离其本身的制品。
表面等离子体激元共振现象是指由玻璃等光学透明的物质和金属薄膜层界面反射的单色光的强度依赖于金属出射侧的样品折射率的现象，因而，通过测定反射的单色光强度可以分析样品。
作为表面等离子体激元测定装置是利用光波激发的表面等离子体激元现象，分析被测定物质的特性的装置，能列举有使用Kretschmann配置的体系(例如参见特开平6-167443号公报)。使用上述体系的表面等离子体激元测定装置基本上带有例如形成棱镜状的电介质块、在该电介质块一面上形成的和样品液体等被测定物质接触的金属膜、产生光束的光源、相对于电介质块在该电介质块和金属膜的界面以全反射条件这样的方式以各种角度入射上述光束的光学体系、通过测定上述界面上全反射的光束强度来检测表面等离子体激元共振状态、以及全反射衰减状态的光检测技术。
另外为了获得上述的各种入射角，可以改变入射角在上述界面上入射比较细的光束，或者以含有各种角度入射光束的成分的形式在上述界面上以收缩光状态或发散光状态入射比较大的光束。前者是用和上述反射角的改变同步移动小距离的光检测器检测由于入射光束的入射角变化而改变了反射角的光束，可以通过沿反射角变化方向延伸的位置感应器检测。另一方面后者可以通过沿着呈各种反射角反射的各个光束能全被接收的方向延伸的位置感应器来检测。
上述构成的表面等离子激元测定装置中，光束对金属膜以全反射角以上的特定入射角入射的话，与该金属膜接触的被测定物质中产生具有电场分布的消减波，由该消减波激发金属膜和被测定物质界面上的表面等离子体激元。消减光的波数矢量和表面等离子体激元的波数全都成立波数匹配时，两者形成共振状态，光能量向表面等离子体激元迁移，因而电介质块和金属膜界面上全反射的光强度锐减。该光强度的降低通过一般的上述光检测技术检出为暗线。另外，上述共振在入射光束只在p偏振时产生。因而，必须预先设定入射的光束为p偏振光。
根据产生该全反射衰减(ATR)的入射角即全反射衰减角(θSP)能获得表面等离子体激元的波数的话，由此可以求出被测定物质的介质常数。对于此种表面等离子体激元测定装置，为了精度优良且大动态范围地测定全反射衰减角(θSP)，如特开平11-326194号公报中所述，认为是使用了阵列状的光检测技术。该光检测技术是以规定方法设置多个接受光元件，相对于上述界面上以各种反射角全反射的光束分别设置不同的接受光元件与之相对。
这种情况下，多是采用沿该接受光元件的配置方向微分输出的光检测信号的微分手段，设置上述阵列状进行光检测的各个接受光元件，所述微分技术是基于输出的微分值，特定化全反射衰减角(θSP)，求出与被测定物质折射率相关联的特性。
而且，作为利用全反射衰减(ATR)的类似测定装置公知的还有例如“分光研究”第47卷第1号(1998)的第21～23页和第26～27页记载的泄漏模式的测定装置。该泄漏模式测定装置基本上带有例如形成棱镜状的电介质块、在该电介质块一面上形成的包覆层、在该包覆层上形成的与试样接触的光导波层、产生光束的光源、相对于电介质块在该电介质块和包覆层的界面以全反射条件这样的方式以各种角度入射上述光束的光学体系、通过测定上述界面上全反射的光束强度来检测导波模式的激发状态、以及全反射衰减状态的光检测技术。
对于上述结构的泄漏模式测定装置，以通过电介质块、对包覆层在全反射角以上的入射角入射光束的话，对于透过该包覆层后的光导波层，只有某特定波数的特定入射角的光以导波模式传播。这样激发导波模式的话，因为入射光几乎被光导波层吸收，在上述界面全反射的光强度锐减，产生全反射衰减。接着，因为导波光的波数依赖于光导波层上的被测定物质的折射率，知道了产生全反射衰减的上述特定入射角，就可以分析被测定物质的折射率和与此关联被测定物质的特性。
另外在该泄漏模式测定装置中，因为由全反射衰减产生的反射光也在暗线位置检出，可以使用上述阵列状的光检测技术，还有与之结合适用上述的微分技术也较多。
并且，上述表面等离子体激元测定装置和泄漏模式测定装置在创药研究领域等中有用于显出在期望感应物质上结合的特定物质的随机屏蔽，此时在上述薄膜层(表面等离子体激元测定装置时有金属膜，泄漏模式测定装置时是包覆层和光导波层)上固定作为上述被测定物质的感应物质，在该感应物质上添加溶解于溶剂中的各种被检测物的试样，每过一定时间测定上述全反射衰减角(θSP)的角度。
试样中的被检测物只要是和感应物质结合的物质，通过该结合感应物质的折射率会伴随时间而变化。因而，测定每经过规定时间的上述全反射衰减角(θSP)，通过测定该全反射衰减角(θSP)的角度产生变化与否，测定被检测物和感应物质的结合状态，基于该结果可以判断被检测物是否有与感应物质结合的特定物质。作为这样的特定物质和感应物质的组合能列举有抗原和抗体或者抗体和抗原。具体来说，以兔子抗人类IgG抗体作为感应物质固定在薄膜层的表面，可以使用人IgG抗体作为特定物质。
另外，为了测定被检测物和感应物质的结合状态，未必一定要检测全反射衰减(θSP)的角度。例如也可以在感应物质中添加试样，然后测定全反射衰减角(θSP)的角度的变化量，基于该角度变化量的大小测定结合状态。在利用全反射衰减的测定装置中适用上述阵列状的光检测技术和微分技术时，因为微分值的变化量反映全反射衰减角(θSP)的角度变化量，基于微分值的变化量可以测定感应物质和被检测物的结合状态(可参见本申请人的特愿2000-398309号公报)。对于利用这样的全反射衰减的测定方法和装置，在预先形成于底面上的薄膜层上固定了感应物质的杯状或碟状的测定芯片上滴加供给由溶剂和被检测物制得的试样溶液，进行上述全反射衰减角(θSP)的角度变化量的测定。
进而，通过在转台等上搭载的多个测定芯片依次进行测定，可以在短时间内进行多个样品的测定，这样的利用全反射衰减的测定装置记载在特开2001-330560号公报中。
本发明中试样的生物传感器在表面等离子体激元共振分析中使用时，可以作为上述各种表面等离子体激元测定装置的一部分来使用。
本发明的测定方法可以在通过上述的表面等离子体激元共振分析等手段检测或测定与生理活性物质相互作用的物质之前进行该生理活性物质是否在有生物学活性的状态下固定的确认。没有生物学活性的情况优选是以显示生物学活性的方式来进行最合适的固定化方法。具体来说，对于同一生物传感器基板，使用生物传感器测定该生理活性物质的固定量，测定在基板上固定的生物学活性值，能算出下式1表示的每单位量固定的生理活性物质的生物学活性值。
式1每单位量固定的生理活性物质的生物学活性值＝(在基板上固定的生理活性物质的生物学活性值)/(生物活性物质向基板的固定量)本发明中，可以在确认式1表示的生物学活性值或最适化后进行生理活性物质和被检测物质相互作用的检测或测定。
作为生理活性物质的具体例子列举蛋白质时，在传感器基板上固定时生物学活性降低，其原因认为有(1)固定化缓冲液的pH值，(2)蛋白固定化膜的电荷，(3)固定密度，(4)由蛋白固定化膜的官能团荷蛋白质形成共价键等的影响带来的蛋白质立体结构的变化。因而，为了提高生理活性物质的生物学活性，以(式1)表示的生物学活性值为指标，根据这些原因(1)～(4)，根据实验的问题决定固定的方法。
蛋白质的立体结构变化而失去生物学活性的状态(变性)下，进行相对于该蛋白质的化合物相互作用的测定时没有检出特效的结合，另一方面检出的非特效的结合较多。实际上，将固定的蛋白质的100％维持在生物学活性的状态下固定是有困难的，但是优选50％以上的蛋白质具有生物学活性，更优选80％以上具有生物学活性。
本发明所称生物学活性有酶活性、抗体活性、受体活性等。酶是指以食物消化为代表的、在体内产生的使各种化学反应顺畅进行的、具有催化剂作用的蛋白质的总称。催化剂是指为了使一般的化学反应更有效率地进行的、具有媒介作用的物质。
酶活性的测定原理记载于蛋白质、酶的基础实验法(堀尾武一、山下仁平)第IV章中。而且，作为检测方法有(1)分光学的测定法，(2)荧光法，(3)电极法，(4)发光法等，还可以使用例如新生化学实验讲座蛋白质V、酶免疫测定法第3版，酶免疫检测法生物化学实验法等中记载的方法等。
例如通过荧光法测定酶活性时，酶上特效的基质(只由酶产生的分解物才发出荧光的基质)发生反应，通过进行分解物的荧光测定可以测定酶活性。
通过分光学的测定法测定酶活性时，利用基质荷生成物之间在分光学性质上有差异，测定其时间的变化，求出酶反应的初速度，可以测定酶活性。
通过电极法测定酶活性时，利用自动滴定装置的方法，由电信号检测伴随包括酶反应的化学反应产生的酸或碱引起的试样溶液的pH变化，可以测定酶活性。
通过发光法测定酶活性时，对抗体乃至抗原进行酶标记，抗原抗体反应后，酶上特效的化学发光基质(只由酶产生的分解物才化学发光的基质)发生反应，通过进行分解物的化学发光测定可以测定酶活性。
例如用ELISA用塑料盘测定抗体活性时，在塑料盘的各个洞内壁结合目标抗原，加入含有这里要测定的抗体的被检测物，进行反应。抗体结合在固相的抗原上。被检测物的抗体量越多，抗体结合量越多。进而，用酶标记抗免疫免疫球蛋白抗体。标记抗体结合在以固相结合的抗体上。抗体越多标记抗体的结合量越多。除去未反应的标记抗体，加入受酶作用而变色的基质。基质因为是根据酶的量而显色，结合的酶标记抗体越多会呈现越强的色调。通过比色计测定该溶液的颜色强度，可以知道被检测物的抗体量。分别对阶段稀释已知量的抗体的制品进行测定，和其值比较，可以定量化被检测物中的抗体量。
测定受体活性时，和在支撑体上固定的包含1种以上的受体或配体和抗原标记的配体或受体的试样接触后，使在支撑体上固定的1种以上受体或配体上结合的抗原标记的配体或受体和与该抗原相对的抗体(例如为了检测用酶标记的抗体等)接触，进行抗原抗体反应，通过检测由此结合的抗体的存在，可以检测出试样中的配体或受体。
图1表示表面等离子体激元共振测定装置。
图2表示电介质块。
符号说明10测定单元11电介质块12金属膜13试样保持箱14感应物质31激光光源32聚光镜40光检测器S40输出信号400导管
401滑块402精密螺钉403脉冲马达404电动机控制器410单元连接体411连接部件具体实施方式
以下通过实施例来更具体地说明本发明，但是本发明的范围不限于这些实施例。
(1)表面等离子体激元共振测定装置和电介质块下面的实验是使用特开2001-330560号公报的图22中记载的装置(下面称为本发明的表面等离子体激元共振测定装置)(在本说明书中的图1中示出)和同一公报的图23中记载的电介质块(以下称为本发明的电介质块)(在本说明书中的图2中示出)来进行。
图1所示的表面等离子体激元共振测定装置是作为支撑测定单元的支撑体使用在相互平行设置的2个导管400、400上能自由移动地连接起来，沿着它们在图中箭头Y方向上直线自由移动的滑块401。接着在该滑块401上螺合与上述导管400、400平行配置的精密螺钉402，该精密螺钉402是通过与其一起构成支撑体驱动手段的脉冲马达403来进行正反旋转的。
另外该脉冲马达403的驱动通过电动机控制器404来控制。即，将检测在内部组装滑块401内的导管400、400长度方向上该滑块401位置的线性编码器(图中未示出)的输出信号S40输入电动机控制器404中，电动机控制器404基于该信号S40控制脉冲马达403的驱动。
并且在导管400、400的下侧，将沿其移动的滑块401分别从左右相夹成形，安装激光光源31和聚光镜32、光检测器40。聚光镜32使光束30会聚。并且安装光检测器40。
这里的本实施形态中，作为一个例子使用连接固定8个测定单元10的棍状单元连接体410，测定单元10是8个连成一列设置在滑块401上的。
图2详细示出了该单元连接体410的结构。这里示出的单元连接体410是通过连接部件411连接8个测定单元的。
该测定单元10是由例如透明树脂等的电介质块11和样品保持箱13一体成形获得的，构成可对转台交换的测定芯片。为了能交换，例如可以在形成在转台上的贯通孔中向前保持测定单元10等。另外，本实施例中在金属膜12上固定感应物质14。
(2)测定芯片以下实验中使用特开2005-98770号公报中记载的测定芯片(用水凝胶包覆的芯片)。具体根据下面的顺序制备水凝胶包覆的测定芯片。
蒸镀上50nm的金作为金属膜的本发明电介质块用Model-208UV-臭氧清除体系(TECHNOVISION INC.)处理30分钟后，通过在金属膜上接触的方式添加用乙醇/水(80/20)溶解的16-羟基-1-十六烷硫醇的5.0mM溶液，在25℃下进行18小时的表面处理。然后用乙醇清洗5次，用乙醇/水混合溶剂清洗1次，用水清洗5次。
接着，在用16-羟基-1-十六烷硫醇包覆的表面上接触10重量％的环氧氯丙烷溶液(溶剂0.4M氢氧化钠和二乙二醇二甲醚的1∶1混合溶液)，在25℃振荡的恒温器中进行反应4小时。然后用乙醇清洗2次表面，用水清洗5次。接着，在40.58ml的25重量％葡聚糖(T500，Pharmacia)水溶液中添加4.5ml的1M氢氧化钠，其溶液在环氧氯丙烷处理的表面上接触。接着在振荡的恒温器中在25℃下恒温20小时。表面用50℃的水清洗10次。接着将在27g的2M氢氧化钠溶液中溶解3.5g溴乙酸的混合物在上述葡聚糖处理的表面上接触，在28℃的振荡恒温器内恒温16小时。用水清洗表面，然后重复上述步骤1次。用水凝胶包覆该样品制备测定芯片。
而且，用疏水性聚合物包覆的生物传感器用芯片(PMMA测定芯片)通过下述步骤来制备。
(i)用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的生物传感器用芯片的制备在1cm的覆盖玻璃上蒸镀金以使金属膜厚为50nm，用Model-208UV-臭氧清除体系(TECHNOVISIONINC.)处理30分钟后，安装在旋涂机(MODEL ASS-303，ABLE制造)上以1000rpm的转速旋转，在镀金的覆盖玻璃中央滴加50μl的聚甲基丙烯酸甲酯的甲乙酮溶液(2mg/ml)，旋转2分钟后停止。通过椭圆偏振光法(原位椭圆偏光计MAUS-101，Five Lab制造)测定膜厚，聚甲基丙烯酸甲酯膜厚为20nm。该样品称为PMMA表面芯片。
(ii)向PMMA表面引入COOH基团涂覆了由上制备的聚甲基丙烯酸甲酯的覆盖玻璃在40℃的NaOH水溶液(1N)中浸渍16小时后，用水清洗3次。该样品称为PMMA/COOH表面芯片。
(iii)有连接的表面的制备在2ml的1-乙基-2，3二甲基氨基丙基碳化二亚胺(400mM)和N-羟基琥珀酸亚胺(100mM)的混合溶液中浸渍上述(ii)制备的PMMA/COOH表面芯片60分钟后，在2ml的α-氨基-聚氧化乙烯-ω-羧酸(平均分子量5000)的水溶液(10mM)中浸渍16小时。最后用水清洗5次。该样品称为PMMA/PEO-C表面芯片。
实施例1在上述(2)中制备的水凝胶覆盖的测定芯片上固定胰蛋白酶(Worthington公司制造)，测定使用上述(1)中记载的表面等离子体激元共振测定装置来进行。
(1)胰蛋白酶的固定在表1记载组成的溶液中溶解10μM用于防止胰蛋白酶自消化的阻碍剂亮肽素(ICN公司制造)，制备胰蛋白酶溶液。
在水凝胶包覆的芯片上添加1-乙基-2，3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺(400mM)和N-羟基琥珀酸亚胺(100mM)的混合液，静置20分钟后，用10mM磷酸缓冲液清洗。接着添加上述胰蛋白酶溶液，静置表1记载的的时间后，用10mM磷酸缓冲液清洗一次后，用表1记载的清洗液清洗二次，其后再用10mM磷酸缓冲液清洗。并且，用10mM的NaOH进行二次清洗的话，非特效吸附的蛋白质被清洗掉，相互作用测定时的基线漂移明显地稳定化了。
进而，在测定芯片上添加乙醇胺·HCl溶液(1M，pH8.5)后，通过用10mM磷酸缓冲液清洗，阻隔了未和胰蛋白酶反应而残存的COOH基团。
通过以上操作，在测定芯片表面上以共价键固定了胰蛋白酶。胰蛋白酶添加前和清洗后的共振信号(RU值)变化量作为胰蛋白酶的固定量(RU值)。胰蛋白酶的固定量示于表1中。
(2)胰蛋白酶的生物学活性的测定使用上述(1)中固定化胰蛋白酶的芯片，进行胰蛋白酶的酶活性测定。本实施例的芯片因为具有图2所示的井状结构，可以容易地进行酶活性测定。具体来说，对在胰蛋白酶上的特效基质(苯甲酰-L-精氨酸-4-甲基香豆素-7酰胺，以下表示为Bz-Arg-MCA；Peptide Institute Inc(株)ペルチド研究所)的反应分解物进行荧光测定。
(3)Bz-Arg-MCA的反应取出测定芯片内的10mM磷酸缓冲液，添加0.1mM的Bz-Arg-MCA，反应120分钟。
(4)荧光测定使用BMGLabTechnologies FLUOstar测定装置(激发波长380nm，发射波长460nm)在各个时间段进行荧光测定。测定结果示于表1中。
(5)化合物和胰蛋白酶的相互作用的测定用10mM磷酸缓冲液清洗后，在本实施例的表面等离子体激元共振测定装置中设置测定芯片，添加亮肽素(0.01mM，磷酸缓冲液pH7.4)和下述的激活酶抑制剂、两亲性化合物(0.01mM，磷酸缓冲液pH7.4)，以静置3分钟后的共振信号(RU值)变化量为化合物结合量。测定结果示于表1中。
激活酶抑制剂 [化2] 两亲性化合物 [化3]
表1
作为如何确定目前的固定化方法有以下两种方法。
(1)确定为蛋白固定量最多的方法(2)确定为特效结合的化合物结合量最多的方法。
相对于这次的结果，使用方法(1)的话，选择实验No4的方法，使用方法(2)的话，选择实验No1的方法。但是从表1的酶活性值可以看出，实验No1、No4的方法其酶活性显著降低。从激活酶抑制剂和两亲性化合物的结合量可以看出，实验No1、No4的表面是疏水的化合物容易呈非特效吸附的状态，对亮肽素的结合有非特效结合的可能性据称也较高。本实验中结合特效的阻碍剂亮肽素，可以得出结论，另一方面不具有阻碍能的化合物没有结合的实验№2的方法具有在测定和化合物相互作用中最合适的表面。
实施例2在本实施例的PMMA测定芯片上固定胰蛋白酶(Worthington公司制造)，测定是使用Biacore3000(Biacore ビァコァ公司制造)来进行的。
(1)胰蛋白酶的固定在Biacore 3000上设置PMMA测定芯片，在和实施例1相同的条件下固定胰蛋白酶。
(2)胰蛋白酶的生物学活性的测定使用上述(1)中固定化胰蛋白酶的芯片，通过以下方法进行胰蛋白酶的酶活性测定。芯片设置在SurfacePrepUnit(Biacore ビァコァ公司制造)上面，用10mM磷酸缓冲液清洗3次芯片表面后，注入2μl的0.1mM Bz-Arg-MCA，放置120分钟后回收。
(3)荧光测定使用BMGLabTechnologies FLUOstar测定装置(激发波长380nm，发射波长460nm)在各个时间段进行荧光测定。
(4)化合物和胰蛋白酶的相互作用的测定添加亮肽素溶液(0.002mM，HBS-N缓冲液)，反应10分钟后，以共振信号(RU值)变化量作为亮肽素(ICN公司制造)对胰蛋白酶的结合量。
用10mM磷酸缓冲液清洗测定芯片后，设置在Biacore 3000中，注入亮肽素(0.01mM，磷酸缓冲液pH7.4)和下述的激活酶抑制剂、两亲性化合物(0.01mM，磷酸缓冲液pH7.4)，以静置3分钟后的共振信号(RU值)作为化合物的结合量。
(5)测定结果得出和实施例1同样的结论。
权利要求
1.一种使用生物传感器基板的测定方法，其特征在于在该测定方法中对同一个生物传感器基板进行对生理活性物质的基板固定量的测定和对该基板上固定的生理活性物质的生物学活性的测定。
2.如权利要求1中记载的测定方法，其特征在于生理活性物质为蛋白质。
3.如权利要求1中记载的测定方法，其特征在于生理活性物质为酶。
4.如权利要求1～3的任何一项中记载的测定方法，其特征在于对生理活性物质的基板的固定量的测定通过表面等离子体激元共振分析来进行。
5.如权利要求4中记载的测定方法，其特征在于所述表面等离子体激元共振分析是通过生物传感器用于表面等离子体激元共振测定装置，该装置包含电介质块、在该电介质块一侧形成的金属膜、产生的光束的光源和允许光线进入上述电介质块使在该电介质块和金属膜界面获得全反射状态和各种不同入射角度的成分而入射的光学系统，以及测定在所述界面全反射光束强度来检测表面等离子体激元共振状态的检测装置；其中，所述的生物传感器是由上述的电介质块和金属膜构成，所述的上述电介质块包含上述光束的入射面、出射面和上述金属膜被形成的一面的全部作为一块被形成，在该电介质块上金属膜被一体化。
6.含有权利要求1～5的任何一项中记载的测定方法，其中通过光谱测定来进行对生理活性物质的生物学活性测定。
7.如权利要求1～6的任何一项记载的测定方法，其包括(1)根据在同一生物传感器基板中测定的生理活性物质在基板上的固定量和在该基板上固定的生理活性物质的生物学活性值确认下式1表示的固定的每单位量的生理活性物质的生物学活性值的步骤；式1每单位量固定的生理活性物质的生物学活性值＝(在基板上固定的生理活性物质的生物学的活性值)/(生理活性物质在基板上的固定量)(2)使用通过上述步骤(1)中确认的固定方法固定了生理活性物质的基板，检测或测定生理活性物质和被检物质的相互作用的步骤。
8.如权利要求1～6的任何一项记载的测定方法，其包括(1)根据在同一生物传感器基板中测定的生理活性物质在基板上的固定量和在该基板上固定的生理活性物质的生物学活性值，以下式1表示的固定的每单位量生理活性物质的生物学活性值为指标，使生理活性物质在该生物传感器基板上以最合适的方法固定的步骤；式1每单位量固定的生理活性物质的生物学活性值＝(在基板上固定的生理活性物质的生物学的活性值)/(生理活性物质在基板上的固定量)(2)使用通过上述步骤(1)中最合适的固定方法固定了生理活性物质的基板，检测或测定生理活性物质和被检物质的相互作用的步骤。
9.如权利要求7或8中记载的测定方法，其特征在于在同一生物传感器基板上进行步骤(1)中的测定在基板上的生理活性物质的固定化量和在该基板上固定的生理活性物质的生物学活性值和步骤(2)中的检测或测定生理活性物质和被检物质的相互作用。
全文摘要
提供一种通过在同一生物传感器中进行生理活性物质在生物传感器基板上的固定量的测定和该生物活性物质的生物学活性的测定，来分析相对于维持活性的生理活性物质的相互作用的方法。该测定方法的特征在于在使用生物传感器基板的测定方法中，生理活性物质在基板上的固定量的测定和在该基板上固定的生物活性物质的生物学活性的测定在同一生物传感器基板上进行。
文档编号G01N21/27GK1892218SQ20061009078
公开日2007年1月10日 申请日期2006年6月30日 优先权日2005年6月30日
发明者江副利秀, 来马浩二 申请人:富士胶片株式会社