专利名称：一种新型的自动恶性肿瘤辅助诊断仪的制作方法
技术领域：
本发明涉及恶性肿瘤的诊断仪器，具体地说是一种新型的自动恶性肿瘤辅助诊断仪。
背景技术：
恶性肿瘤(癌)是常见的恶性疾病之一，金世界每年大约有600万新诊断的病例，占各种疾病死亡率第二位；在我国1990～1992年间每10万人中有108.26人死于恶性肿瘤，占总死亡人数的17.94％；至1994年，这一数字已上升到22.05％，同时这种趋势并未得到有效的抑制；现在，我国每年大约有160万新生肿瘤。根据现代的医学水平，恶性肿瘤不是治不了，而是很难早期发现，如果能够实现早期诊断，60～90％以上的病人可以被治愈。
癌症是一个非常复杂的疾病，它由多基因引起，并由多步骤控制，单靠一二种标记物很难做到早期发现、准确检测，必须同时研究多种肿瘤标记物。目前临床应用的肿瘤标记物分析仪，主要是基于免疫化学的方法，以分析血清中的某些蛋白质类肿瘤标记物来辅助癌症诊断，一次只能分析一种肿瘤标记物；并且迄今为止，仍然没有一种已临床应用的肿瘤标记物完全满足“理想肿瘤标记物”的要求，大多数肿瘤标记物的浓度仅在肿瘤扩散时才发生明显变化，肿瘤标记物的特异性也有待解决。
尿中修饰核苷已被作为癌症(文献1.Tamura S.，Fujii J.，Nakano T.，Hada T.，Higashino K.Clin Chim Acta，1986，154125；文献2.Xu G.，Di Stefano C.，LiebichH.M.，Zhang Y.，Lu P.J.Chromatogr B，1999，732307；文献3.Liebich H.M.，XuG.W.，Di Stefanoc C.，Lehmann R.J.，Chromatogr A，1998，793341；文献4.许国旺，路鑫，张玉奎，卢佩章，Di Stefanoc C.，Lehmann R.Liebich H M色谱，1999，17(2)97；文献5.Zhao R.H.，Xu G.W.，Yue B.F.，Liebich H.M.，Zhang Y.J.，Chromatogr A，1998，828489；文献6.Xu G.，Liebich H.M.American，Clin.Lab.2001，20，22)和艾滋病(文献7.Nakano K.，Nakao T.，Schram K.H.，HammargrenW.M.，McClure T.D.，Katz M.，Petersen E.，Clin Chim Acta，1993，218169；文献8.Borek E.，Sharma O.K.，Buschman F.L.，Cohn D.L.，Penley K.A.，Judson F.N.，Dobozin B.S.，Horsburgh C.R.Jr，Kirkpatrick C.H.，Cancer Res，1986，462557；文献9.Prankel B H，Clemens P C，Burmester J G.Clin Chim Acta，1995，234181)的潜在诊断标记物进行研究。核糖核酸(RNA)特别是转运核糖核酸(tRNA)中除含有四种正常核苷腺嘌呤核苷(A)、鸟嘌呤核苷(G)、胞嘧啶核苷(C)、尿嘧啶核苷(U)外，还有大量修饰核苷，现已发现有90多种修饰核苷，其中tRNA中已发现79种，其他来自于mRNA和rRNA中；所有修饰核苷是在大量高度特异性的修饰酶的作用下，尤其是甲基转移酶和连接酶的作用下，RNA链上特定位置的核苷被修饰如碱基甲基化、碳氮键发生重排、尿苷移位形成假尿苷等，转录修饰完成之后，RNA分子在核酸酶作用下释放出各种核苷；血中正常的未被修饰的核苷可以在酶的作用下，被磷酸酯化后再利用形成新的RNA，或降解为尿酸和β-丙胺酸；而修饰核苷十分稳定，既不易代谢也不能被磷酸酯化再利用，因此在尿中被定量排放；所以，在尿中，修饰核苷的含量相对来说比正常核苷的含量会稍高一些；但对正常的成年人来说，个体间排放浓度差异较小，分布在一个较窄的范围；当人体的某一部分发生癌变时，核糖核酸周转加快，导致尿液或血液中修饰核苷的含量急剧增加。根据以上的机理，人们可以通过尿液或血液中修饰核苷浓度的增加程度，对癌症的发病进行早期诊断(参见文献2、3、4及6)。
尽管毛细管电泳法(参见文献3～6；文献10.Liebich H.M.，Xu G.W.，Stefano C.Di，Lehmann R.，Haring H.U.，Lu P.，Zhang Y.，Chromatographia，1997，45396；文献11.郑育芳，张云，刘大渔，郭小亮，梅素容，熊建辉，孔宏伟，张朝，许国旺，高等学校化学学报，2001，22(6)912；文献12.许国旺，郑育芳，路鑫，刘大渔，孔宏伟，一种尿液中核苷的测定方法及在恶性肿瘤诊断仪的应用(中国专利00134302.5)；文献13.Yu-Fang Zheng，Guo-Wang Xu，Da-Yu Liu，Jian-Hui Xiong，Pu-Dun Zhang，Chao Zhang，Qing Yang，Shen Lv.Electrophoresis，2002，23(24)，4104)和免疫分析法(文献14.Masuda M.，Nishihira T.，Itoh K.Mizugaki M.，Ishida N.，MoriS.，Cancer，1993，723571)都能分离和定量尿中核苷，反相高效液相色谱法(RP-HPLC)(文献15.Gehrke C.W.，Kuo K.C.，Waalkes T.P.，Borek E.，CancerRes，1979，391150；文献16.Gehrke C.W.，Kuo K.C.，Davis G.E.，Suits R.D.，Waalkes T.P.，Borek E.J.，Chromatogr A，1978，150455；文献17.GehrkeC.，Kuo K.J.，Chromatography A，1989，4713；文献18.Liebich H.M.，Stefano C.Di，Wixforth A.，Schmid H.R.，J.Chromatogr A，1997，763193；文献19.Xu G.，Schmid H.R.，Lu X.，Liebich H.M.，Lu P.Biomed.Chromatogr，2000，14459.；文献20.许国旺，路鑫，郑育芳，洪群发，孔宏伟，用多变量分类基于体液中核苷诊断癌症的方法(中国专利00134311.4)；文献21.郑育芳，陈英杰，逄涛，石先哲，孔宏伟，吕申，杨青，许国旺，色谱，2002，20(6)498)仍然是文献报道中最常用的方法。由于样品基质的复杂性，RP-HPLC法分析尿中核苷涉及繁琐、耗时的离线样品预处理过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的自动恶性肿瘤辅助诊断仪，通过一次分离测定尿液中多个核苷类肿瘤标记物(含量的高低)，再结合各种多变量数据统计方法(因子分析、模式识别、人工神经元网络技术)对所获结果进行综合处理，达到辅助诊断癌症(区分正常人和癌症患者)的目的。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种新型的自动恶性肿瘤辅助诊断仪，主要由高压泵A(1)、高压泵B(2)、高压泵C(3)、自动进样器(4)、六通阀(5)、亲和色谱柱(6)、混合器(7)、分析柱(8)和紫外-可见检测器(9)组成；六通阀的⑥位通过自动进样器与高压泵A连接，六通阀的①位和④位分别接亲和色谱柱两端，六通阀的⑤位接废液排出管路，六通阀的③位与混合器出口相连，高压泵B和高压泵C与混合器入口相连，六通阀的②位与分析柱一端相连，分析柱的另一端通过紫外-可见检测器与废液排出管路相连。
自动恶性肿瘤辅助诊断仪的控制，是通过对尿液中核苷的标定辅助诊断恶性肿瘤，具体工作流程如下，1)取尿液样品用氨水调节pH为8～8.5，离心除蛋白后，取上层清液加入内标(例如Br8G，IsoG等)，得分析样品，即可直接上样分析；2)将分析样品通过自动进样器直接上样，六通阀处于“LOAD”位置，选用碱性缓冲液A(PH＝8～9)(例如MH4Ac)淋洗亲和色谱柱(例如苯基硼酸亲和色谱柱)，使得尿中核苷的组分键合到色谱柱的亲合链上；3)继续用缓冲液A冲洗亲和色谱柱，尿样中残存的一些杂质经过亲和色谱柱流入废液排出管路；4)六通阀处于“INJECT”位置以酸性的缓冲液B(其PH＝2～5)(例如KH2PO4、K2HPO4)作流动相，尿中核苷组分与亲和色谱柱的键合链被打开，从柱上洗脱下来形成一条狭窄的流出带，经过六通阀的3-4-1-2位置，到达色谱分析柱(例如烷基键合相色谱柱C18，C8等)的最上端，完成柱间在线传递全过程；5)六通阀重新回到“LOAD”位置，在分析柱上实行缓冲液B和缓冲液C(例如CH3OH/H2O，体积比范围为10∶1～1∶10)的梯度淋洗程序，达到分离测定核苷组分的目的；6)按照上述步骤对正常人和恶性肿瘤患者的尿中核苷浓度进行测定后，再将其换算成核苷与肌酐的摩尔比作为指标[由于尿液数量受饮食等影响，上述分析最好用24h尿；然而收集24hr尿样十分不便，为解决这一问题，Gehrke et al.(参见文献15)和Borek(文献22.Borek E.Tumour Biol.1984，5，1-14.)作了详细的研究考察修饰核苷的排放是否与随机尿样的肌酐(creatinine)相对值相关，从他们的研究中发现，核苷浓度与肌酐浓度的比值在24hr尿和随机尿样中相同；在本发明中，我们借用Gehrke等的做法，以核苷与肌酐的摩尔比(单位为nmol/μmol)作为指标来衡量；尿中肌酐浓度用毛细管区带法测定(参见文献11)，以上述多种正常核苷和修饰核苷的浓度作数据矢量，用模式识别数据分类法处理数据，给出可视化的诊断结果，达到区分正常人、恶性肿瘤患者和从高危病人中筛选出恶性肿瘤患者的目的。
进行数据分类时，矢量的选择可以是只选修饰核苷，也可以是包括正常核苷或传统的肿瘤标记物CEA，CA 153，PAS，AFP，CA 125，CA199等的数据；变量的选择方法可以是较高级的逐步判别法，或基于经验，甚至包括恶性肿瘤诊断仪的分离谱图中的所有能正确测定的峰。
本发明具有如下优点1.本发明利用柱切换技术，研制了一种新型的自动恶性肿瘤诊断仪。该仪器分离分析尿中核苷实现了从样品预处理、核苷分析、数据处理等步骤全程的自动化；繁琐、耗时的样品预处理步骤被避免，提高了分析结果的精密度。
2.该仪器分析尿中核苷，所需样品量少，且分析时间被大大缩减。
3.多变量的数据统计方法(因子分析、模式识别、人工神经元网络技术)用于正常人和恶性肿瘤患者的分类研究。
4.模式识别数据矢量的选择灵活机动，既可包括正常的修饰核苷含量数据，也可包括传统的肿瘤标记物数据。
5.根据本发明组装的全自动恶性肿瘤诊断仪，配上特定的缓冲液、分析方法及其数据处理软件(参见CN1357762A及CN1357763A)，可实现对样品的自动预处理、自动进样、自动的分离、定量和结果的自动评价五大功能，成为癌症辅助诊断的专用分析仪器。可以用于区分正常人和恶性肿瘤患者，也可以从高危病人中筛选出恶性肿瘤患者，如白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌、食道癌、乳腺癌、鼻咽癌、脑癌、支气管癌、结肠癌、卵巢癌等；它提供了一个不“侵入”的方法诊断恶性肿瘤的全套设备和技术，该发明特别适用于急性肿瘤的诊断，检出率大于70％。
6.由于肿瘤机理的复杂性，单用一种肿瘤标记物很难满足临床诊断的灵敏性和特异性的要求；本发明的全自动恶性肿瘤诊断仪给利用多个修饰核苷作为肿瘤标记物提供了必要的条件，同时结合了各种多变量数据统计方法(因子分析、模式识别、人工神经元网络技术)对所获结果进行处理，以多个修饰核苷的浓度作数据矢量，对正常人和恶性肿瘤患者进行分类研究，给出一个综合多个修饰核苷信息的分类结果。
7.所有操作用一台PC计算机控制。
图1为全自动恶性肿瘤诊断仪的流程示意图。
图2为全自动恶性肿瘤诊断仪中六通阀处于“LOAD”切换位置示意图。
图3为全自动恶性肿瘤诊断仪中六通阀处于“INJECT”切换位置示意图。
图4为核苷标样在全自动恶性肿瘤诊断仪上的分离谱图。
图5为健康人尿中核苷在全自动恶性肿瘤诊断仪上的分离谱图。
图6为恶性肿瘤患者尿中核苷在全自动恶性肿瘤诊断仪上的分离谱图。
图7为正常人(+)和癌症病人(o)的模式识别图。
具体实施例方式
该仪器包括以下几个组件三个高压泵、自动进样器、紫外-可见检测器、六通阀、和采集数据的色谱工作站(亲和色谱柱和分析柱)，其流程如图1。
由于尿中多达上万种化学物质，核苷的含量很低，其它成分的干扰太多，无法直接对样品进行分析；文献多采用苯基硼酸亲和色谱法预分离和富集尿中核苷(参见文献2)，此步骤繁琐、耗时且易出错。本发明的样品预处理过程只需要将收集到的尿样用氨水调节pH，离心除蛋白后，取上层清液加入内标Br8G，即可直接上样分析。
根据本发明组装的癌症诊断专用分析仪上，可实现尿样的自动预处理、自动进样和核苷组分的自动分离和定量；它主要通过五个连续的步骤来完成；取收集到的尿样用氨水调节pH＝8～9，离心除蛋白后，取上层清液加入内标Br8G，即可直接上样分析。
1)仪器的六通阀处于图2中“LOAD”位置时，通过自动进样器直接上样，选用缓冲液A(NH4Ac；PH＝8～9，浓度为1～5M)淋洗苯基硼酸亲和色谱柱，使得尿中核苷的组分键合到色谱柱的亲合链上；2)继续使用缓冲液A冲洗亲和色谱柱，使尿样中残存的一些杂质经过亲和色谱柱流入废液瓶中；3)六通阀处于“INJECT”位置时，以缓冲液B(KH2PO4；PH＝2～5，浓度在1～50mM)作流动相，尿中核苷组分与亲和色谱柱的键合链被打开，从亲和色谱柱洗脱下来形成一条狭窄的流出带，经过六通阀的3-4-1-2位置，到达键合相分析柱的最上端，完成从亲和色谱柱到分析柱(C18或C8，柱长150～250mm，柱内径1～4mm)的在线传递；4)六通阀重新回到“LOAD”位置，在色谱分析柱上实行缓冲液B和缓冲液C(CH3OH/H2O；体积比1∶10～10∶1)的线形梯度淋洗程序，达到分离测定核苷组分的目的；5)用缓冲液A重新活化亲和色谱柱，为下一轮的尿样分析作准备。
所用检测器为紫外或二极管阵列，所用波长在195～300nm之间。
所有上述5步操作通过一个PC计算机来控制，实现自动化。
在根据本发明组装的全自动恶性肿瘤诊断仪上，对14种核苷标样进行分离，结果如图4所示进样量150μL；检测波长260nm；峰识别1.假尿嘧啶核苷，2.胞嘧啶核苷，3.尿嘧啶核苷，4.1-甲基腺苷，5.次黄嘌呤核苷，6.3-甲基尿苷+5-甲基尿苷，7.鸟嘌呤核苷，8.1-甲基次黄嘌呤核苷，9.1-甲基鸟苷，10.N4-乙酰胞苷，11.2-甲基鸟苷，12.腺嘌呤核苷，13.2，2-二甲基鸟苷，14.8-溴化鸟苷，15.6-甲基腺苷。
在根据本发明组装的全自动恶性肿瘤诊断仪上，对正常人和恶性肿瘤患者的尿中核苷进行测定，结果如图5所示峰识别1.假尿嘧啶核苷，2.胞嘧啶核苷，3.尿嘧啶核苷，4.1-甲基腺苷，5.次黄嘌呤核苷，6.3-甲基尿苷+5-甲基尿苷，7.鸟嘌呤核苷，8.1-甲基次黄嘌呤核苷，9.1-甲基鸟苷，10.N4-乙酰胞苷，11.2-甲基鸟苷，12.腺嘌呤核苷，13.2，2-二甲基鸟苷，14.8-溴化鸟苷，15.6-甲基腺苷(其它条件见图3)；结果如图5所示峰识别1.假尿嘧啶核苷，2.胞嘧啶核苷，3.尿嘧啶核苷，4.1-甲基腺苷，5.次黄嘌呤核苷，6.3-甲基尿苷+5-甲基尿苷，7.鸟嘌呤核苷，8.1-甲基次黄嘌呤核苷，9.1-甲基鸟苷，10.N4-乙酰胞苷，11.2-甲基鸟苷，12.腺嘌呤核苷，13.2，2-二甲基鸟苷；14.8-溴化鸟苷，15.6-甲基腺苷(其它条件见图4)。
在根据本发明组装的全自动恶性肿瘤诊断仪上，对20个正常人和20个癌症病人尿中核苷排放浓度进行了测定；这些数据可用于构造模式识别基图(图6模式识别基图通过分析20个正常人和20个癌症病人的尿样获得；数据矢量为尿中14种核苷浓度，14种核苷为Pseu，C，U，mlA，I，m3U+m5U，G，mlI，mlG，ac4C，m2G，A，m22G，m6A)；以此为基础，可对未知病人进行诊断如果未知病人的尿中核苷排放模式与正常人类似，则视为未发现恶性肿瘤，否则视为阳性，建议其去医院做更深入的体检。
由图6可知，正常人和癌症病人各有一个较明显的分布区域；正常人分布在一个较窄的范围，而癌症病人则较分散；大约有20％的病人(点)进入到正常人的区域，也即80％左右的癌症病人可用本发明的仪器识别。
权利要求
1.一种新型的自动恶性肿瘤辅助诊断仪，其特征在于主要由高压泵A(1)、高压泵B(2)、高压泵C(3)、自动进样器(4)、六通阀(5)、亲和色谱柱(6)、混合器(7)、分析柱(8)和紫外-可见检测器(9)组成；六通阀(5)的⑥位通过自动进样器(4)与高压泵A(1)连接，六通阀(5)的①位和④位分别接亲和色谱柱(6)两端，六通阀(5)的⑤位接废液排出管路，六通阀(5)的③位与混合器(7)出口相连，高压泵B(2)和高压泵C(3)与混合器(7)入口相连，六通阀(5)的②位与分析柱(8)一端相连，分析柱(8)的另一端通过紫外-可见检测器(9)与废液排出管路相连。
2.一种新型的自动恶性肿瘤辅助诊断仪的应用，其特征在于通过对尿液中核苷的标定辅助诊断恶性肿瘤，具体步骤如下，1)取尿液样品用氨水调节pH为8～8.5，离心除蛋白后，取上层清液加入内标，得分析样品，即可直接上样分析；2)将分析样品通过自动进样器直接上样，六通阀处于“LOAD”位置，选用碱性缓冲液A淋洗苯基硼酸亲和色谱柱，使得尿中核苷的组分键合到色谱柱的亲合链上；3)继续用缓冲液A冲洗亲和色谱柱，尿样中残存的一些杂质经过亲和色谱柱流入废液排出管路；4)六通阀处于“INJECT”位置以酸性的缓冲液B作流动相，尿中核苷组分与亲和色谱柱的键合链被打开，从柱上洗脱下来形成一条狭窄的流出带，经过六通阀到达键合相色谱分析柱的最上端，完成柱间在线传递全过程；5)六通阀重新回到“LOAD”位置，在分析柱上实行缓冲液B和缓冲液C的梯度淋洗程序，达到分离测定核苷组分的目的；6)按照上述步骤对正常人和恶性肿瘤患者的尿中核苷浓度进行测定后，再将其换算成核苷与肌酐的摩尔比作为指标，以上述多种正常核苷和修饰核苷的浓度作数据矢量，用模式识别数据分类法处理数据，给出可视化的诊断结果，达到区分正常人、恶性肿瘤患者和从高危病人中筛选出恶性肿瘤患者的目的。
3.按照权利要求2所述新型的自动恶性肿瘤辅助诊断仪的应用，其特征在于进行数据分类时，矢量的选择可以是只选修饰核苷，也可以是包括正常核苷或传统的肿瘤标记物CEA，CA153，PAS，AFP，CA125，CA199的数据；变量的选择方法可以是较高级的逐步判别法，或基于经验，甚至包括恶性肿瘤诊断仪的分离谱图中的所有能正确测定的峰。
4.按照权利要求2所述新型的自动恶性肿瘤辅助诊断仪的应用，其特征在于其中所述亲和色谱柱(6)为苯基硼酸亲和柱；分析柱(8)为C8或C18；缓冲液A为PH＝8～9的NH4AC，浓度为1～5M；缓冲液B为PH＝1～5的KH2PO4，浓度在1～50mM；缓冲液C为MeOH/H2O，体积比为1∶10～10∶1；所用检测器为紫外或二极管阵列，所用波长在195～300nm之间。
全文摘要
一种新型的自动恶性肿瘤辅助诊断仪，由高压泵A、高压泵B、高压泵C、自动进样器、六通阀、亲和色谱柱、混合器、分析柱和紫外－可见检测器组成；六通阀的⑥位通过自动进样器与高压泵A连接，六通阀的①位和④位分别接亲和色谱柱两端，六通阀的⑤位接废液排出管路，六通阀的③位与混合器出口相连，高压泵B和高压泵C与混合器入口相连，六通阀的②位与分析柱一端相连，分析柱的另一端通过紫外－可见检测器与废液排出管路相连。该仪器分离分析尿中核苷实现了从样品预处理、核苷分析、数据处理等步骤全程的自动化，提高了分析结果的精密度；并且所需样品量少，分析时间大大缩减；可采用多变量的数据统计方法用于正常人和恶性肿瘤患者的分类研究。
文档编号G01N30/36GK1534291SQ0311131
公开日2004年10月6日 申请日期2003年3月28日 优先权日2003年3月28日
发明者许国旺, 郑育芳, 孔宏伟, 逄涛, 杨军 申请人:中国科学院大连化学物理研究所