增强皮内隔室中的免疫反应的方法和其中使用的化合物的制作方法

专利名称：增强皮内隔室中的免疫反应的方法和其中使用的化合物的制作方法
本申请要求2003年12月5日提交的美国临时申请号60/527,999的优先权利益，其在这里整体引作参考。
1.发明领域本发明涉及免疫原性组合物，其用于与一种或多种赋形剂相组合的抗原性或免疫原性试剂的皮肤输送。本发明的免疫原性组合物包含抗原性或免疫原性试剂和至少一种赋形剂，一旦输送到受试者皮肤的皮肤隔室中，无论是皮内的还是表皮的，该赋形剂能起佐剂作用，即增强对所述抗原性或免疫原性试剂的免疫反应。本发明的免疫原性组合物包含一种赋形剂，当根据本发明施用给皮肤的皮内隔室时，其能表现出佐剂活性。或者，本发明的免疫原性组合物包含一种赋形剂，当根据本发明施用给皮肤的表皮隔室时，其能表现出佐剂活性。本发明的免疫原性组合物具有增强的功效，因为组合物的赋形剂会造成无症状的皮肤刺激，并将抗原呈递细胞召集到皮肤隔室中，从而增强抗原性或免疫原性试剂向抗原呈递细胞的呈递和/或可用性。使用比常规使用更低剂量的抗原性或免疫原性试剂，且不需要加强免疫，在单次皮肤给药后，本发明的免疫原性组合物的增强的功效可以导致治疗上和/或预防上有效的免疫反应。
2.发明背景药物剂型含有活性成分和称作赋形剂的无活性成分。剂型的性质取决于工艺参数以及各种赋形剂和它们对活性成分的影响之间的相互关系。因此，使用赋形剂来实现各种特征，后者能改善剂型的性质，以实现更好的功效。例如，在药物制剂中使用赋形剂，以实现更高的稳定性，更好的对生物或化学降解的抗性，更高的溶解度和/或减少的表面张力，以容易输送。
佐剂是能增强免疫原性制剂(例如，疫苗)的功效和保护性免疫反应的试剂。传统地，通过将佐剂包含在制剂中，来提高疫苗制剂的免疫原性。最初，Ramon(1924，Ann.Inst.Pasteur，381)将免疫佐剂描述为“与特定抗原组合使用的物质，其能产生比单独的抗原更强的免疫反应”。佐剂不同于常规的赋形剂，因为它们能直接增强免疫原性制剂中的活性成分的功效，即免疫原性。
已经将各种各样的(生物的和合成的)物质用作佐剂。但是，尽管在许多年中广泛地评价了大量的候选物，目前被美国食品和药品管理局批准的唯一的佐剂是基于铝的矿物质(类名为明矾(Alum))。明矾具有可争议的安全记录(见，例如，Malakoff，2000，Science，2881323)，且对比研究证实，它是对于蛋白亚基的抗体诱导的弱佐剂，和是细胞介导的免疫的差佐剂。此外，明矾佐剂可以诱导IgE抗体应答，且已经在一些受试者中与过敏反应相关联(见，例如，Gupta等，1998，Drug Deliv.Rev.32155-72；Relyveld等，1998，Vaccine 161016-23)。自从明矾的开发以来，许多实验佐剂已经发展到临床实验阶段，且有些已经表现出高效力，但是也已经证实对人类中的治疗用途存在太大的毒性。
此外，佐剂的功效随用于输送疫苗的受试者中的靶隔室而变，因而必须根据疫苗的预期的靶隔室来证实每种佐剂。尽管已经针对皮内隔室以外的空间，例如，肌肉内、皮下，发现并证实了数百种佐剂或潜在佐剂，但是在本发明之前，仅仅存在有限数目的能表现出在皮内隔室中的前途的传统佐剂，特别是没有报道具有在皮内隔室中的佐剂活性的赋形剂。因此，仍然需要能有效地增强由皮内施用的免疫原触发的免疫反应的佐剂。
3.发明简述本发明部分地基于发明人的意外发现，即皮内输送抗原性或免疫原性试剂和一种或多种预选的赋形剂，会产生增强的对该抗原性或免疫原性试剂的免疫反应。优选地，在本发明的方法和免疫原性组合物中使用的赋形剂以前没有与佐剂活性相关联。最优选地，在本发明的方法和免疫原性组合物中使用的赋形剂以前没有与皮内空间中的佐剂活性相关联。尽管不希望受特定作用机理的约束，当以根据本发明的方法的浓度和输送途径施用本发明的赋形剂时，它们会表现出非特异性的佐剂活性，即不通过特定的细胞受体，但是可能通过促进机械损伤，温和刺激，或皮肤伸展。本发明的皮内疫苗制剂的增强的功效部分地基于发明人的评价和认可，即皮内隔室能提供理想的免疫空间以便抗原性或免疫原性试剂能直接接近其中存在的免疫细胞。实际上，很少有效地靶向皮内隔室，作为抗原性或免疫原性试剂的输送位点，至少部分地是由于特异性地且可再现地输送抗原性或免疫原性试剂的困难，即准确地将针头置于皮内空间中和合适的输送压力。
本发明的优点也适用于其它的皮肤隔室中，包括但不限于皮肤的表皮隔室。尽管不希望受任何特定作用机理的约束，皮肤代表着有吸引力的用于输送疫苗和基因治疗剂的靶位点。在(基因的和常规的)疫苗的情况下，皮肤是有吸引力的输送位点，这是由于在该组织中发现的高浓度的抗原呈递细胞(APC)和APC前体，尤其是表皮朗氏细胞(LC)和皮内隔室中的免疫细胞。
利用皮肤疫苗制剂，包括用于皮内和表皮输送的制剂，可以实现本发明的制剂的增强的功效。在有些实施方案中，本发明的皮肤疫苗制剂(包括表皮和皮内制剂)包含抗原性或免疫原性试剂，和至少一种赋形剂，其能增强抗原性或免疫原性试剂向免疫细胞的呈递和/或可用性，免疫细胞例如为皮内隔室的免疫细胞(例如抗原呈递细胞)或表皮隔室的免疫细胞(例如表皮朗氏细胞(LC))，从而产生增强的免疫反应，优选保护性的免疫反应。在一个具体的实施方案中，该分子起延长抗原性或免疫原性试剂向皮肤隔室的免疫细胞的暴露的作用，所述免疫细胞例如为抗原呈递细胞，表皮朗氏细胞(LC)，从而产生增强的保护性的免疫反应。
本发明包括用于皮肤输送(包括皮内和表皮输送)的免疫原性组合物，其包含抗原性或免疫原性试剂和至少一种赋形剂，后者能增强针对该抗原性或免疫原性试剂的免疫反应，从而产生增强的免疫反应。在有些实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂通过将抗原呈递细胞召集到注射位点，允许将抗原性或免疫原性试剂暴露于皮内隔室的免疫细胞，产生增强的对该抗原性或免疫原性试剂的免疫反应。
与其它常规的免疫原性组合物的输送方式(包括肌肉内的和皮下的输送)相比，本发明的方法和组合物不但能提供增强的免疫反应，增强的治疗和/或预防功效，而且能在注射位点提供减少的刺激，增强的平均滴度抗体生产，如使用熟练的技术人员已知的和本文示例的方法所测量的；增强的中间抗体滴度，如使用熟练的技术人员已知的和本文示例的方法所测量的；增强的血清保护率和增强的血清转化率，如使用熟练的技术人员已知的和本文示例的方法所测量的。本发明的制剂能减少，优选避免溶血作用，如使用熟练的技术人员已知的和本文示例的方法所测量的。本发明的制剂也能避免胶凝作用和与改变的粘度相关的其它并发现象，其可以妨碍贮藏、制备和施用。
可以在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂包括但不限于，稳定剂，防腐剂，溶剂，表面活性剂或去污剂，悬浮剂，张力剂，载体和生长培养基的成分。可以在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂的非限制性的列表是，醋酸，柠檬酸，富马酸，盐酸，硝酸，醋酸钠，纤维素，木炭，明胶，氨溶液，碳酸铵，单-、二-或三-乙醇胺，氢氧化钾，硼酸钠，碳酸钠，氢氧化钠，三乙醇胺，氮气，抗坏血酸，棕榈酸抗坏血酸酯，丁基化羟基茴香醚，丁基化羟基甲苯，次磷酸，一硫代甘油，没食子酸丙酯，抗坏血酸钠，亚硫酸氢钠，甲醛合次硫酸氢钠，偏亚硫酸氢钠，亚硫酸钠，甘氨酸，偏磷酸钾，磷酸钾，一碱价醋酸钠，无水或二水合柠檬酸钠，乙二胺四乙酸二钠，乙二胺四乙酸，甘油，丙二醇和山梨醇，两性霉素B，苯甲酸，对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯或丁酯，苯甲酸钠和丙酸钠，氨普立糖，苯扎氯铵、苯索氯铵，苄醇，β丙醇酸内酯，鲸蜡基氯化吡啶，氯代丁醇，金霉素，EDTA，甲醛，庆大霉素，卡那霉素，新霉素，酚，苯氧基乙醇，苯乙醇，硝酸苯汞，多粘菌素B，链霉素，硫柳汞，磷酸三正丁酯，制霉菌素，水，醇，尤其是乙醇，玉米油，棉籽油，甘油，异丙醇，矿物油，油酸，花生油，纯化水，注射用水，无菌的注射用水，苯扎氯铵，硬脂酸镁，壬苯醇醚10，oxtoxynol 9(Triton N-101)，泊洛沙姆例如泊洛沙姆124、188(Lutrol F-68)、237、388、403(P123)或407(Lutrol F-127)，聚山梨酯20(吐温TM20)，聚山梨酯80(吐温TM80)，月桂基硫酸钠，失水山梨糖醇单棕榈酸酯，琼脂，膨润土，卡波姆(例如，卡波普)，羧甲基纤维素钠，明胶，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，高岭土，甲基纤维素，黄芪胶，veegum，羧甲基纤维素钠，明胶或甲基纤维素，右旋糖，葡萄糖，氯化钠，玉米油，矿物油，花生油，芝麻油，抑菌的氯化钠，抑菌的水，氨基酸，细菌用蛋白胨(bactopeptone)，牛白蛋白，牛血清，卵蛋白，人血清白蛋白，小鼠血清蛋白，MRC-5细胞蛋白，卵白蛋白，维生素，酵母蛋白，脱铁运铁蛋白，抑蛋白酶肽，消泡剂例如polydimethyl silozone，硅，胎球蛋白(一种血清蛋白)，羟基乙酸(一种皮肤片状剥落物(skinexfoliate))，过氧化氢(一种解毒剂)，乳糖(一种填充剂)，甘露糖和尿素。
本发明还包括其它的化合物或试剂，其以前没有与任何组织空间中的佐剂活性相关联，当与免疫原性或抗原性试剂皮内地共同施用时，其能增强由免疫原性或抗原性试剂触发的免疫反应。本发明特别地包括以前没有与皮内隔室中的佐剂活性相关联的化合物或试剂。
在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂的浓度取决于使用的具体赋形剂。在有些实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂的浓度可以是0.000002％-58％(w/v)和0.05％-10％(v/v)。在其它实施方案中，使用的赋形剂的浓度可以是至少10％(w/v)，至少15％(w/v)，至少20％(w/v)，至少25％(w/v)，或至少30％(w/v)。在其它实施方案中，赋形剂的浓度大于约30％(w/v)。在其它实施方案中，赋形剂的浓度是至少0.1％(w/v)，至少0.5％(w/v)，至少1％(w/v)，至少5％(w/v)，或至少10％(w/v)。许多前述的赋形剂可以用于制备和生产免疫原性组合物。在这样的情况下，可以在最后的免疫原性组合物中发现从组合物的生产或制备留下的赋形剂的残留浓度。但是，这样的残留浓度太低，不会产生用本发明的免疫原性组合物观察到的佐剂活性。
可以在本发明的免疫原性组合物中使用的抗原性或免疫原性试剂包括来自动物、植物、细菌、原生动物、寄生物、病毒或其组合的抗原。抗原性或免疫原性试剂可以是源自病毒的任意的病毒的肽、蛋白质、多肽或其片段，包括但不限于，RSV-病毒蛋白，例如RSV F糖蛋白、RSV G糖蛋白，流感病毒蛋白，例如流感病毒神经氨酸酶、流感病毒血凝素，单纯疱疹病毒蛋白，例如单纯疱疹病毒糖蛋白，包括例如gB、gC、gD和gE。在本发明的组合物中使用的抗原性或免疫原性试剂可以是致病病毒的抗原，例如，下述病毒的抗原腺病毒科(例如，哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属)，疱疹病毒科(例如，单纯疱疹病毒1，单纯疱疹病毒2，单纯疱疹病毒5，和单纯疱疹病毒6)，轻小病毒科(例如，轻小病毒属，肠细菌phase MS2，allolevirus)，痘病毒科(例如，脊椎动物痘病毒亚科，副痘病毒属，禽痘病毒属，山羊痘病毒属，野兔痘病毒属，猪痘病毒属，软体动物痘病毒属，和昆虫痘病毒属)，乳头多瘤空泡病毒科(例如多瘤病毒属和乳头状瘤病毒属)，副粘病毒科(例如，副粘病毒属，副流感病毒1，麻疹病毒属(例如，麻疹病毒)，德国麻疹病毒属(rubulavirus)(例如，腮腺炎病毒)，pneumonovirinae(例如肺病毒属，人呼吸道合胞病毒)，metapneumovirus(例如，禽肺病毒和人metapneumovirus)，小RNA病毒科(例如肠道病毒属，鼻病毒属，肝病毒属(例如人甲型肝炎病毒)，心病毒属，和口蹄疫病毒属(apthovirus)，呼肠孤病毒科(例如，正呼肠孤病毒属(orthoreovirus)，环状病毒属，轮状病毒属，质型多角体病毒属，斐济病毒属，植物呼肠孤病毒属，和水稻病毒属(oryzavirus))，反转录病毒科(例如哺乳动物B型反转录病毒，哺乳动物C型反转录病毒，禽C型反转录病毒，D型反转录病毒组，BLV-HTLV反转录病毒)，慢病毒属(例如人免疫缺陷病毒1和人免疫缺陷病毒2)，泡沫病毒属，黄病毒科(例如，丙型肝炎病毒)，嗜肝DNA病毒科(例如，乙型肝炎病毒)，披膜病毒科(例如，甲病毒属(例如，新培斯病毒)和风疹病毒属(例如，风疹病毒))，弹状病毒科(例如，水泡病毒属，狂犬病病毒属，短时热病毒属(ephemerovirus)，胞质弹状病毒属(cytorhabdovirus)，和胞核弹状病毒属(necleorhabdovirus))，沙粒病毒科(例如，沙粒病毒属，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，Ippy virus，和拉萨病毒)，和冠状病毒科(例如，冠状病毒属和曲状病毒属(torovirus))。本发明的制剂也可以提高针对流感，HIV，脊髓灰质炎，登革热，Streppneumo，百日咳(Pertusis)，疱疹，和衣原体疾病的预防。
可选择地，本发明的免疫原性组合物中的抗原性或免疫原性试剂可以是癌症或肿瘤抗原，包括但不限于，KS 1/4胰腺癌抗原，卵巢癌抗原(CA125)，磷酸前列腺酸酯，前列腺特异性的抗原，黑素瘤相关抗原p97，黑素瘤抗原gp75，高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)，前列腺特异性的膜抗原，癌胚抗原(CEA)，多形上皮粘蛋白抗原，人乳脂肪球抗原，结肠直肠肿瘤相关抗原，例如CEA，TAG-72，CO17-1A；GICA19-9，CTA-1和LEA，伯基特氏淋巴瘤抗原-38.13，CD19，人B-淋巴瘤抗原-CD20，CD33，黑素瘤特异性的抗原，例如神经节苷脂GD2，神经节苷脂GD3，神经节苷脂GM2，神经节苷脂GM3，肿瘤特异性的移植类型的细胞表面抗原(TSTA)，例如病毒诱导的肿瘤抗原，包括DNA肿瘤病毒的T-抗原和RNA肿瘤病毒的包膜抗原，瘤胚抗原-α-胎蛋白，例如结肠的CEA，膀胱肿瘤瘤胚抗原，分化抗原，例如人肺癌抗原L6、L20，纤维肉瘤的抗原，人白血病T细胞抗原-Gp37，新糖蛋白，鞘脂，乳腺癌抗原例如EGFR(表皮生长因子受体)，HER2抗原(p185HER2)，多形上皮粘蛋白(PEM)，恶性人淋巴细胞抗原-APO-1，分化抗原例如在胎红细胞、原内胚层中发现的I抗原，在成年红细胞、植入前的胚胎中发现的I抗原，在胃腺癌中发现的I(Ma)，在乳腺上皮中发现的M18、M39，在骨髓细胞中发现的SSEA-1，在结肠直肠癌中发现的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22，在结肠腺癌中发现的TRA-1-85(血型H)、C14，在肺腺癌中发现的F3，在胃癌中发现的AH6，在胚胎癌性细胞中发现的Y半抗原、Ley，在A431细胞中发现的TL5(血型A)、EGF受体，在胰腺癌中发现的E1系列(血型B)，在胚胎癌性细胞中发现的FC10.2，在腺癌中发现的胃腺癌抗原、CO-514(血型Lea)，在腺癌中发现的NS-10，在A431细胞的EGF受体中发现的CO-43(血型Leb)、G49，在结肠腺癌中发现的MH2(血型ALeb/Ley)，在结肠癌中发现的19.9，在骨髓细胞中发现的胃癌粘蛋白、T5A7，在黑素瘤中发现的R24，在胚胎癌性细胞中发现的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1:22:25:8，和在4至8-细胞阶段胚胎中发现的SSEA-3和SSEA-4，和来自皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体衍生肽。
用于本发明的免疫原性组合物中的抗原性或免疫原性试剂可以是能在合适的条件下在受试者中产生免疫反应的任何物质，包括但不限于，多肽，肽，蛋白质，糖蛋白，脂类，核酸和多糖。使用本领域技术人员已知的标准方法，可以确定本发明的免疫原性组合物中的抗原性或免疫原性试剂的浓度，其取决于抗原性或免疫原性试剂的效力和性质。在本发明的增强的输送系统下，抗原性或免疫原性试剂的浓度优选地低于当使用可选择的给药途径和可选择的组合物时使用的常规量。在本发明的组合物中使用的免疫原性试剂也可以是破碎的病毒粒子。
在形成针对抗原性或免疫原性试剂(需要针对它们的免疫反应)的迅速且高水平的免疫性时，本发明的免疫原性组合物是特别有利的。本发明的免疫原性组合物利用低剂量的抗原性或免疫原性试剂，可以实现保护水平的全身免疫性。在有些实施方案中，本发明的免疫原性组合物利用剂量是为了得到有效的免疫反应而常规使用的抗原性或免疫原性试剂剂量的60％、优选50％、更优选40％的抗原性或免疫原性试剂，产生增强的免疫反应，因而转化为剂量的减少。在其它实施方案中，本发明的免疫原性组合物利用剂量比为了得到有效的免疫反应而常规使用的抗原性或免疫原性试剂剂量小至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍的抗原性或免疫原性试剂，产生增强的免疫反应。
在优选的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含剂量低于使用常规的输送模式，例如肌肉内和皮下，和常规的组合物，即在没有本发明的赋形剂的情况下，在本领域中使用的常规剂量(例如，Physician′s Desk Reference中推荐的剂量)的抗原性或免疫原性试剂。优选地，本发明的免疫原性组合物在单次皮内给药后，会产生治疗上或预防上有效的免疫反应。对于每年的免疫，可以皮内地施用本发明的免疫原性组合物。
与目前可以得到的制剂相比，本发明的免疫原性组合物具有增强的治疗功效、安全性和毒性特性。本发明的免疫原性组合物赋予的益处和优点部分地是由于特殊的制剂和它们在靶向皮肤的皮内隔室中的效用。优选地，本发明的免疫原性组合物可以提供更大的和更持久的保护，特别是对于不能较好地对免疫作出响应的高危群体(例如，老年人，婴儿，无免疫应答的人)。
用于本发明的方法和组合物中的、在皮内空间中具有佐剂性质的赋形剂具有需要的免疫增强和组织相容性属性，如使用本领域已知的和本文公开的标准方法所测得的。本发明的优选的赋形剂具有由大于0.125的斜率(m)值定义的皮内空间中的通常工作特性(profile)。图35描绘了用于确定最佳工作特性的一个示例性的方案。斜率代表相对于皮内隔室中的组织深度的最大工作浓度的变化。具体地，如图35所示，从第一和第二赋形剂浓度和皮内隔室中的第一和第二组织深度，衍生出斜率值。皮内空间中的第一参考点是更浅的输送，其中赋形剂表现出免疫增强性质，其draize得分为2或更小。第一参考点的赋形剂浓度是在最浅输送深度的最高浓度，其允许draize得分为2或更小。皮内空间中的第二参考点是最深的输送，其中赋形剂表现出免疫增强性质，其draize得分为2或更小。第二参考点的赋形剂浓度是在最深输送深度的最高浓度，其允许draize得分为2或更小。例如，第一和第二输送深度之间的距离可以是相隔2mm，具体地，1mm和3mm输送。下式可以描述工作斜率(m)
C2-C1D2-D1=m]]>其中C2等于在D2的C无穷；其中C1等于在D1的最大赋形剂浓度，draize得分为2或更小；其中Dn表示输送深度。
尽管斜率标准具有许多应用，但当选择用于疫苗输送的赋形剂时，它具有特别的效用。例如，初步地和优先地在1.0-1.5mm的浅深度筛选赋形剂，其中通过水泡可以容易地证实ID输送。具有靶斜率值作为清楚的目标，可以减少后续的在更深的组织深度的筛选，减少实验、时间和成本。更重要地，斜率值允许制剂科学家鉴别具有更大的免疫增强潜力的赋形剂。
本发明包括用于施用给受试者皮肤的皮内隔室的组合物，其包含赋形剂，从而当输送给皮内隔室时，该组合物会表现出佐剂活性和等于或小于2的draize得分。
本发明还包括用于施用给受试者皮肤的皮内隔室的组合物，其包含赋形剂，其中组合物的活性可以表征为，当以具有佐剂活性和小于或等于2的Draize得分的浓度施用该组合物时，等于或大于0.125的斜率值，其中斜率值源自在受试者皮肤的皮内隔室中的第一和第二组织深度处的第一和第二赋形剂浓度，其中第一和第二组织深度相隔至少2mm。
在有些实施方案中，本发明的赋形剂具有狭窄的工作范围，即它们在该范围内具有皮内隔室中的佐剂活性，同时具有等于或小于2的draize得分。在其它实施方案中，本发明的赋形剂具有宽的工作范围，即它们在该范围内具有皮内隔室中的佐剂活性，同时具有等于或小于2的draize得分。
本发明包括在受试者，优选动物，更优选人中引起增强的对抗原性或免疫原性组合物的免疫反应的方法，包括将免疫原性组合物输送进受试者皮肤的皮内隔室，其中免疫原性组合物包含抗原性或免疫原性试剂和赋形剂。在一个具体的实施方案中，免疫原性组合物是疫苗。
本发明还包括鉴定能增强对免疫原性或抗原性试剂的免疫反应的化合物的方法。在一个实施方案中，鉴定能增强对抗原性或免疫原性试剂的免疫反应的化合物的方法包括将免疫原性组合物输送进受试者皮肤的皮内隔室，测量免疫反应的水平，其中免疫原性组合物包含免疫原性或抗原性试剂和该化合物，且其中免疫反应针对该抗原性或免疫原性试剂。本发明包括使用本领域技术人员已知的和本文公开的方法，通过测定体液的和/或细胞-介导的免疫反应，来测量免疫反应的水平。一旦确定了免疫反应的水平，将其与标准水平相比较，其中测量的水平升高表明该化合物是佐剂。
本发明还包括试剂盒，其包含本文所述的本发明的皮内施用装置和免疫原性组合物。在有些实施方案中，本发明提供了包含本发明的免疫原性组合物的药物包或试剂盒。在一个具体的实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含一个或多个装有一种或多种本发明的免疫原性组合物组分例如(抗原性或免疫原性试剂、赋形剂)的容器。在另一个具体的实施方案中，试剂盒包含2个容器，一个含有抗原性或免疫原性试剂，另一个含有赋形剂。这样的容器可以伴有由规范药品或生物产品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的公告，该公告反映了由生产、使用或销售的管理机构对于人类施用所作出的批准。
本发明还涉及试剂盒，其包含如本文所述的本发明的皮内施用装置和皮内疫苗制剂。本发明还涉及试剂盒，其包含皮肤施用装置和如本文所述的本发明的皮肤疫苗制剂。本发明还涉及试剂盒，其包含表皮施用装置和如本文所述的本发明的表皮疫苗制剂。
3.1定义如本文使用的，除非另有说明，术语″赋形剂″指药物组合物中的成分或添加剂，其自身不具有组合物所要达到的药理学或生物学活性，且在本发明之前，不知其在根据本发明施用到皮肤的皮内隔室时，能直接增强或改变这样的药理学或生物学活性。在本发明的方法中使用的赋形剂是预选的赋形剂。如本文使用的，″预选的″赋形剂包括传统的、非传统的赋形剂，和当根据本发明的方法输送给受试者皮肤的皮内隔室时，具有佐剂活性的所有其它赋形剂。
如本文使用的，″传统的″赋形剂是添加到组合物中作为稀释剂或载体的或多或少具有惰性的物质。或者，可以使用传统的赋形剂，为组合物提供形状或稠度。这样的传统赋形剂的实例是本领域的技术人员已知的，且包含在本发明中，见，例如，Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Pub.Co.，N.J.，现行版；它们都在本文中整体引作参考。
如本文使用的，″传统的″佐剂是添加到组合物中增强组合物中的活性成分的抗原性的物质，例如，矿物质悬浮液，其上面吸收着抗原性或免疫原性试剂，或油包水乳液，其中抗原性试剂乳化在矿物油中(例如，弗氏不完全佐剂)，有时包含杀死的分枝杆菌，以进一步增强抗原性试剂的抗原性。
将血清转化率定义为，对于每种疫苗菌株，血清血凝素抑制(HI)滴度在疫苗接种后具有至少4-倍增加的受者的百分比。将转化系数定义为，对于每种疫苗株系，血清HI几何平均滴度在疫苗接种后的倍数增加。将保护率或血清保护率定义为，在疫苗接种后血清HI滴度等于或大于1∶40的受者的百分比，且一般接受为指示性保护。
如本文使用的，术语“佐剂”指能辅助或改善试剂的作用的任何化合物，包括但不限于免疫学佐剂，其能增加或多样化对抗原的免疫反应。该术语也包括，当添加到免疫原性或抗原性试剂时，在暴露于混合物后，能非特异性地增强对受者宿主中的试剂的免疫反应的化合物。佐剂包括能“免疫调控”细胞因子网络，从而上调免疫反应的化合物。与该免疫调控相伴的是，还要选择哪种T-细胞，Th1或Th2，会主导该免疫反应。Th1反应会引起补体结合性抗体和强烈的迟发型过敏反应(其与IL-2和γ-干扰素相关联)。CTL反应的诱导，似乎与Th1反应相关联。Th2反应与高水平的IgE和细胞因子IL-4、IL-5、IL-6和IL-10相关联。术语佐剂包括这样的化合物，即当施用给个体或体外测试时，其能增强施用了抗原的受试者中的对抗原的免疫反应，或增强来自免疫系统的细胞的某些活性。一些抗原在单独施用时是弱免疫原性的，或在能引起受试者中有用的免疫反应的浓度下对受试者是有毒性的。通过使抗原具有更强的免疫原性，佐剂可以增强受试者针对抗原的免疫反应。佐剂效应也可以产生施用较低剂量的抗原在受试者中达到有用的免疫反应的能力。
如本文使用的，术语″抗原″指含有一个或多个表位的分子，当根据本发明呈递抗原时，所述表位能刺激宿主的免疫系统，产生细胞抗原特异性免疫反应，或体液抗体反应。抗原单独地或当与另一种分子一起存在时，可以引起细胞的或体液的反应。一般地，表位会包含约3-15、优选约5-15和更优选约7-15个氨基酸。使用本领域众所周知的许多表位作图技术，可以鉴定出给定蛋白质的表位。见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66(Glenn E.Morris，Ed.，1996)Humana Press，Totowa，N.J.。例如，通过在固体支持物上同时合成大量的肽，所述肽对应着蛋白质分子的部分，并使肽与抗体反应，同时使肽仍然结合在支持物上，可以确定线性表位。这样的技术是本领域已知的，且记载在如下文献中，例如，美国专利号4,708,871；Geysen等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002；Geysen等(1986)Molec.Immunol.23709-715，它们都在这里整体引作参考。同样地，通过确定氨基酸的空间构象，例如通过x-射线晶体学和2-维核磁共振，可以容易地鉴定出构象表位。见，例如Epitope Mapping Protocols，同上。如本文使用的，术语″抗原″指两种亚组抗原，即从抗原天然伴随的完整生物分离和分开的抗原，以及杀死的、减毒的、破碎的或灭活的细菌、病毒、寄生物或其它微生物。同样地，能体内表达治疗性或免疫原性蛋白质或抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸，例如在基因治疗和核酸免疫应用中，也包含在本文的抗原定义中。而且，为了本发明的目的，抗原可以源自若干种已知的病毒、细菌、寄生物和真菌中的任意，以及各种肿瘤抗原中的任意。而且，为了本发明的目的，“抗原”指蛋白质，其包含对天然序列的修饰，例如缺失、添加和取代(通常在性质上是保守的)，只要蛋白质能维持引起免疫学反应的能力。这些修饰可以是故意的，例如通过定位诱变，或可以是偶然的，例如通过能产生抗原的宿主的突变。
如本文使用的，对抗原或组合物的“免疫学反应”或“免疫反应”这一术语，是受试者对存在于目标组合物中的分子的体液和/或细胞免疫反应的形成。为了本发明的目的，“体液免疫反应”指由抗体分子介导的免疫反应，而“细胞免疫反应”是由T-淋巴细胞和/或其它的白细胞介导的免疫反应。细胞免疫的一个重要的方面包含溶细胞性T-细胞(″CTL″)的抗原特异性反应。CTL具有对与由主要组织相容性复合物(MHC)编码、且表达在细胞表面上的蛋白一起呈递的肽抗原的特异性。CTL能辅助诱导和促进细胞内微生物的胞内破坏，或感染了这样的微生物的细胞的裂解。细胞免疫的另一个方面包含辅助T-细胞的抗原特异性反应。辅助T-细胞的作用是辅助刺激功能，和聚集非特异性的效应细胞针对能在它们的表面上与MHC分子相关联地显示肽抗原的细胞的活性。“细胞免疫反应”也指内源性细胞因子、趋化因子和由活化的T-细胞和/或其它白细胞生产的其它这样的分子的产生，包括源自CD4+和CD8+T-细胞的那些。
如本文使用的，除非另有说明，术语“增强的免疫反应”指，当将本发明的抗原性或免疫原性试剂与一种或多种本发明的佐剂共同施用时，与单独施用相同量的抗原性或免疫原性试剂的受试者相比，在接受这样的施用的受试者中，存在增强的抗体形成，如使用本领域已知的和下面5.4部分所述的标准方法所测得的。优选地，增强的免疫反应指抗体形成的约10％、20％、30％、50％、70％、或100％或更大的增加。
或者，如本文使用的，术语“增强的免疫反应”指，当将本发明的抗原性或免疫原性试剂与一种或多种本发明的佐剂化合物共同施用时，与单独施用抗原性或免疫原性试剂的受试者相比，可以使用更小量的抗原性或免疫原性试剂，在受试者中达到相同水平的抗体形成。优选地，当与本发明的佐剂化合物一起施用时，可以以没有本发明的佐剂化合物时施用的相同试剂的量的约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％或更小这样的量来施用抗原性或免疫原性化合物，在受试者中达到相同水平的抗体形成。
4.附图简述

图1.血清反应。对Flu抗原外壳的血清反应(1∶123Dil)接受Flu疫苗的Balb/c小鼠vs.具有佐剂的Flu疫苗和非免疫(吐温80和氨普立糖实施例)图2.血清反应。对Flu抗原外壳的血清反应(1∶123Dil)接受Flu疫苗的Balb/c小鼠vs.具有佐剂的Flu疫苗和非免疫(细菌用蛋白胨和亚硫酸钠)(都ID输送)图3.血清反应。对Flu抗原外壳的血清反应(1∶123Dil)接受Flu疫苗的Balb/c小鼠vs.具有佐剂的Flu疫苗和非免疫(TritonX-100)(都ID输送)图4A.血清反应。对Flu抗原外壳的血清反应(1∶123Dil)接受Flu疫苗的Balb/c小鼠vs.具有佐剂的Flu疫苗和非免疫(山梨醇和两性霉素B)(都ID输送)图4B.六个点ELISA测定，证实了山梨醇能使Fluzone三价疫苗增加3倍。
图5.血清反应。对Flu抗原外壳的血清反应(1∶123Dil)接受Flu疫苗的Balb/c小鼠vs.具有佐剂的Flu疫苗和非免疫(尿素和Triton N-101)(都ID输送)图6.血清反应。对Flu抗原的血清反应Flu pDNA免疫原vs.补充了胎球蛋白的pDNA(2ndTB，1∶123稀释度)图7.血清反应。对Flu抗原的血清反应Flu pDNA免疫原vs.补充了甲基纤维素、明胶、细菌用蛋白胨和磷酸三正丁酯的pDNA(1stTB，1∶370稀释度)图8.血清反应。对Flu抗原的血清反应Flu pDNA免疫原vs.补充了明胶、尿素和抑蛋白酶肽的pDNA(1stTB，1∶123稀释度)图9.血清反应。对Flu抗原的血清反应Flu pDNA免疫原vs.补充了ETOH和山梨醇的pDNA(1stTB，1∶123稀释度)图10.血清反应。对Flu抗原的血清反应Flu pDNA免疫原vs.补充了亚硫酸钠的pDNA(1stTB，1∶370稀释度)图11.血清反应。对Flu抗原的血清反应Flu pDNA免疫原vs.补充了甘露糖、脱铁运铁蛋白、羟基乙酸和吐温2O的pDNA(1stTB，1∶370稀释度)图12.针装置。根据本发明设计的针组合件的分解透视图。
图13.针装置。图12的实施方案的部分剖面视图。
图14.针装置。连接到注射器体上而形成注射装置的图13的实施方案。
图15A-B.微磨蚀器装置。
A.优选的实施方案的手柄端的俯视图B.微磨蚀器的优选的实施方案的侧视16A-B.微磨蚀器装置。
A.15A和15B的微磨蚀器装置的透明透视图B.图15B的微磨蚀器装置的剖面视17.微磨蚀器装置。在受试者皮肤上的图15A、15B、16A和16B的微磨蚀器装置的磨蚀表面的侧视图。
图18.微磨蚀器装置。
A.图17的实施方案的磨蚀表面的透视图。
B.磨蚀器表面的剖面侧视图。
图19.微磨蚀器装置图17的实施方案的磨蚀器表面的底视图。
图20.微磨蚀器装置经磨蚀的皮肤凹痕(furrow)的部分剖面的透视图。
图21.ID空间中的吐温(Tween)80的佐剂性质。在一项研究中，5％的吐温80导致100％血清转化。
图22.在注射位点的DRAIZE打分。在猪皮肤刺激研究中，在ID空间中，能较好地耐受5％吐温80。
图23.ID和IM输送流感疫苗的比较(鼠科动物模型)。与IM输送的市售三价疫苗相比，和三价疫苗一起ID输送的吐温80(0.9％V/V)能产生更高的平均滴度、更高的中间滴度和更高的血清转化。
图24.吐温80和山梨醇的比较。不能较好地耐受10％W/V的吐温80。相反地，能较好地耐受10％W/V山梨醇。
图25.随针深度而变的皮肤相容性变化特性。施用后20-24小时的猪数据证实了，当用1.0mm、1.5mm、2.0mm和3.0mm针输送时，如何耐受2％吐温80溶液。皮肤反应随深度而提高。更深的组织是更耐受的。具有更大佐剂强度的更高浓度的吐温80可以用于更深的组织。
图26.补充了明胶的FLUZONE的免疫原性IM输送对ID输送。ID输送补充了明胶的Fluzone三价配方，并IM输送原样的Fluzone。0.45％w/v的明胶能增强血清转化和中间滴度。
图27.皮肤相容性研究如通过Draize得分分析揭示的，猪能耐受每次给药高达600ng/100ul或1200ng/200ul总两性霉素。施用后1小时，测定Draize得分。
图28.补充了脱氧胆酸盐的FLUZONE的免疫反应ID对IM输送(ID+/-脱氧胆酸盐)。当输送到ID空间时，脱氧胆酸盐具有免疫增强特征。在IM输送中，5只动物中只有1只在免疫后21天发生血清转化。但是，在ID输送中，5只动物中有5只发生血清转化。ID输送能产生最好的中间滴度。
图29.随针深度而变的皮肤相容性变化特性。在1.5mm深度，不能耐受0.5％w/v和更高浓度的脱氧胆酸盐。施用后1小时，测定Draize得分。
图30.细菌用蛋白胨的皮肤相容性变化特性。最后一次注射后，立即进行皮肤呈现。赋形剂，细菌用蛋白胨，具有平息(calming)作用。
图31.用5.0％V/V吐温80增强的豚鼠模型中的FLUZONE免疫原性。对比在有或没有吐温80的情况下，Fluzone的IM和ID输送。在用三价抗原(New Caledonia，Panama，B-Hong Kong)进行的HAI测定中，补充了吐温80的Fluzone的ID输送胜过没有补充物的ID输送的Fluzone和没有补充物的IM输送的Fluzone。
图32.用0.1％W/V脱氧胆酸钠增强的豚鼠模型中的FLUZONE免疫原性。对比在有或没有脱氧胆酸盐的情况下，Fluzone的IM和ID输送。在用三价抗原(New Caledonia，Panama，B-Hong Kong)进行的HAI测定中，补充了脱氧胆酸钠的Fluzone的ID输送胜过没有补充物的ID输送的Fluzone和没有补充物的IM输送的Fluzone。
图33.各种不同的赋形剂在Hartley豚鼠中的DRAIZE打分。在豚鼠中，能较好地耐受在指定浓度测试的赋形剂。
图34.各种不同的赋形剂在Yorkshire猪中的DRAIZE打分。在猪中，能较好地耐受在指定浓度测试的赋形剂。
图35.理想的赋形剂性质。赋形剂A具有需要的特性。通过施用给更深的皮内组织，从而具有得到进一步的免疫益处的潜力，可以实质上增加在1mm深度耐受的最大浓度。具有大于或等于0.125的斜率(最大可接受的浓度/组织深度)的赋形剂是优选的。
5.发明详述本发明包括用于皮内输送的免疫原性组合物，其包含抗原性或免疫原性试剂，和至少一种赋形剂，后者能增强对抗原性或免疫原性试剂的免疫反应，从而产生增强的免疫反应。在有些实施方案中，免疫原性组合物会产生增强的免疫反应。尽管不希望受特定作用机理的约束，当以根据本发明的方法的浓度和输送途径施用本发明的赋形剂时，它们会表现出非特异性的佐剂活性，即不通过特定的细胞受体，但是可能通过促进机械损伤，温和刺激，或皮肤伸展。或者，尽管不希望受特定作用机理的约束，赋形剂一旦被输送至受试者皮肤的皮内隔室，它们可以起皮肤刺激剂的作用，导致将抗原呈递细胞召集到注射位点的皮内隔室中，从而起佐剂的作用，即增强对免疫原性组合物的免疫反应。优选地，在本发明的方法和免疫原性组合物中使用的赋形剂以前没有与佐剂活性相关联。最优选地，在本发明的方法和免疫原性组合物中使用的赋形剂以前没有与皮内空间中的佐剂活性相关联。
与其它常规的输送免疫原性组合物的方式(包括肌肉内的和皮下的输送)相比，本发明的方法和组合物不但能提供增强的免疫反应，增强的治疗和/或预防功效，而且能在注射位点提供减少的刺激，增强的平均滴度抗体生产，如使用熟练的技术人员已知的和本文示例的方法所测量的；增强的中间抗体滴度，如使用熟练的技术人员已知的和本文示例的方法所测量的；增强的血清转化率和血清保护率，如使用熟练的技术人员已知的和本文示例的方法所测量的；减少的溶血作用，如使用熟练的技术人员已知的和本文示例的方法所测量的，减少的在贮藏和制备过程中的胶凝。
可以在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂包括但不限于，稳定剂，防腐剂，溶剂，表面活性剂或去污剂，悬浮剂，张力剂，载体和生长培养基的成分。可以在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂的非限制性的列表是，醋酸，柠檬酸，富马酸，盐酸，硝酸，醋酸钠，纤维素，木炭，明胶，氨溶液，碳酸铵，单-、二-或三-乙醇胺，氢氧化钾，硼酸钠，碳酸钠，氢氧化钠，三乙醇胺，氮气，抗坏血酸，棕榈酸抗坏血酸酯，丁基化羟基茴香醚，丁基化羟基甲苯，次磷酸，一硫代甘油，没食子酸丙酯，抗坏血酸钠，亚硫酸氢钠，甲醛合次硫酸氢钠，偏亚硫酸氢钠和亚硫酸钠，甘氨酸，偏磷酸钾，磷酸钾，一碱价醋酸钠，无水或二水合柠檬酸钠，乙二胺四乙酸二钠，乙二胺四乙酸，甘油，丙二醇，山梨醇，两性霉素B，苯甲酸，对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯或丁酯，苯甲酸钠和丙酸钠，氨普立糖，苯扎氯铵、苯索氯铵，苄醇，β丙醇酸内酯，鲸蜡基氯化吡啶，氯代丁醇，金霉素，EDTA，甲醛，庆大霉素，卡那霉素，新霉素，酚，苯氧基乙醇，苯乙醇，硝酸苯汞，多粘菌素B，链霉素，硫柳汞，磷酸三正丁酯，制霉菌素，水，醇，尤其是乙醇，玉米油，棉籽油，甘油，异丙醇，矿物油，油酸，花生油，纯化水，注射用水，无菌的注射用水，苯扎氯铵，硬脂酸镁，壬苯醇醚10，oxtoxynol 9(Triton N-101)，泊洛沙姆例如泊洛沙姆124、188(Lutrol F-68)、237、388或407(Lutrol F-127)，聚山梨酯20(吐温TM20)，聚山梨酯80(吐温TM80)，月桂基硫酸钠，失水山梨糖醇单棕榈酸酯，琼脂，膨润土，卡波姆(例如，卡波普)，羧甲基纤维素钠，明胶，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，高岭土，甲基纤维素，黄芪胶和veegum，羧甲基纤维素钠，明胶或甲基纤维素，右旋糖，葡萄糖，氯化钠，玉米油，矿物油，花生油，芝麻油，抑菌的氯化钠，抑菌的水，氨基酸，细菌用蛋白胨，牛白蛋白，牛血清，卵蛋白，人血清白蛋白，小鼠血清蛋白，MRC-5细胞蛋白，卵白蛋白，维生素，酵母蛋白，脱铁运铁蛋白，抑蛋白酶肽，消泡剂例如polydimethyl silozone，硅，胎球蛋白(一种血清蛋白)，羟基乙酸(一种皮肤片状剥落物(skin exfoliate))，过氧化氢(一种解毒剂)，乳糖(一种填充剂)，甘露糖和尿素。
在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂的浓度取决于使用的具体赋形剂。在有些实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂的浓度可以是0.000002％-58％(w/v)和0.05％-10.0％(v/v)。在其它实施方案中，使用的赋形剂的浓度可以是至少10％(w/v)，至少15％(w/v)，至少20％(w/v)，至少25％(w/v)，或至少30％(w/v)。在其它实施方案中，赋形剂的浓度大于约30％(w/v)。在其它实施方案中，赋形剂的浓度是至少0.1％(w/v)，至少0.5％(w/v)，至少1％(w/v)，至少5％(w/v)，或至少10％(w/v)。赋形剂可以用于制备和生产免疫原性组合物。在这样的情况下，可以在最后的免疫原性组合物中发现从组合物的生产或制备留下的赋形剂的残留浓度。这样的残留浓度太低，不会产生用本发明的免疫原性组合物观察到的佐剂活性。
用于本发明的方法和组合物中的、在皮内空间中具有佐剂性质的赋形剂具有需要的免疫增强和组织相容性属性，如使用本领域已知的和本文公开的标准方法所测得的。本发明的优选的赋形剂具有由大于0.125的斜率(m)值定义的皮内空间中的通常工作特性(profile)。图35描绘了用于确定最佳工作特性的一个示例性的方案。斜率代表相对于皮内隔室中的组织深度的最大工作浓度的变化。具体地，如图35所示，从第一和第二赋形剂浓度和皮内隔室中的第一和第二组织深度，衍生出斜率值。皮内空间中的第一参考点是更浅的输送，其中赋形剂表现出免疫增强性质，其draize得分为2或更小。第一参考点的赋形剂浓度是在最浅输送深度的最高浓度，其允许draize得分为2或更小。皮内空间中的第二参考点是最深的输送，其中赋形剂表现出免疫增强性质，其draize得分为2或更小。第二参考点的赋形剂浓度是在最深输送深度的最高浓度，其允许draize得分为2或更小。例如，第一和第二输送深度之间的距离可以是相隔2mm，具体地，1mm和3mm输送。下式可以描述工作斜率(m)C2-C1D2-D1=m]]>其中C2等于在D2的C无穷；其中C1等于在D1的最大赋形剂浓度，draize得分为2或更小；其中Dn表示输送深度。
本发明包括用于施用给受试者皮肤的皮内隔室的组合物，其包含赋形剂，从而当输送给皮内隔室时，该组合物会表现出佐剂活性和等于或小于2的draize得分。
本发明还包括用于施用给受试者皮肤的皮内隔室的组合物，其包含赋形剂，其中组合物的活性可以表征为，当以具有佐剂活性和小于或等于2的Draize得分的浓度施用该组合物时，等于或大于0.125的斜率值，其中斜率值源自在受试者皮肤的皮内隔室中的第一和第二组织深度处的第一和第二赋形剂浓度，其中第一和第二组织深度相隔至少2mm。
在有些实施方案中，本发明的赋形剂具有狭窄的工作范围，即它们在该范围内具有皮内隔室中的佐剂活性，同时具有等于或小于2的draize得分。在其它实施方案中，本发明的赋形剂具有宽的工作范围，即它们在该范围内具有皮内隔室中的佐剂活性，同时具有等于或小于2的draize得分。
可以在本发明的免疫原性组合物中使用的抗原性或免疫原性试剂包括来自动物、植物、细菌、原生动物、寄生物、病毒或其组合的抗原。抗原性或免疫原性试剂可以是源自病毒的任意的病毒的肽、蛋白质、多肽或其片段，包括但不限于，RSV-病毒蛋白，例如RSV F糖蛋白、RSV G糖蛋白，流感病毒蛋白，例如流感病毒神经氨酸酶、流感病毒血凝素，单纯疱疹病毒蛋白，例如单纯疱疹病毒糖蛋白，包括例如gB、gC、gD和gE。在本发明的组合物中使用的抗原性或免疫原性试剂可以是致病病毒的抗原，例如，下述病毒的抗原腺病毒科(例如，哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属)，疱疹病毒科(例如，单纯疱疹病毒1，单纯疱疹病毒2，单纯疱疹病毒5，和单纯疱疹病毒6)，轻小病毒科(例如，轻小病毒属，肠细菌phase MS2，allolevirus)，痘病毒科(例如，脊椎动物痘病毒亚科，副痘病毒属，禽痘病毒属，山羊痘病毒属，野兔痘病毒属，猪痘病毒属，软体动物痘病毒属，和昆虫痘病毒属)，乳头多瘤空泡病毒科(例如多瘤病毒属和乳头状瘤病毒属)，副粘病毒科(例如，副粘病毒属，副流感病毒1，麻疹病毒属(例如，麻疹病毒)，德国麻疹病毒属(rubulavirus)(例如，腮腺炎病毒)，pneumonovirinae(例如肺病毒属，人呼吸道合胞病毒)，metapneumovirus(例如，禽肺病毒和人metapneumovirus)，小RNA病毒科(例如肠道病毒属，鼻病毒属，肝病毒属(例如人甲型肝炎病毒)，心病毒属，和口蹄疫病毒属(apthovirus)，呼肠孤病毒科(例如，正呼肠孤病毒属(orthoreovirus)，环状病毒属，轮状病毒属，质型多角体病毒属，斐济病毒属，植物呼肠孤病毒属，和水稻病毒属(oryzavirus))，反转录病毒科(例如哺乳动物B型反转录病毒，哺乳动物C型反转录病毒，禽C型反转录病毒，D型反转录病毒组，BLV-HTLV反转录病毒)，慢病毒属(例如人免疫缺陷病毒1和人免疫缺陷病毒2)，泡沫病毒属，黄病毒科(例如，丙型肝炎病毒)，嗜肝DNA病毒科(例如，乙型肝炎病毒)，披膜病毒科(例如，甲病毒属(例如，新培斯病毒)和风疹病毒属(例如，风疹病毒))，弹状病毒科(例如，水泡病毒属，狂犬病病毒属，短时热病毒属(ephemerovirus)，胞质弹状病毒属(cytorhabdovirus)，和胞核弹状病毒属(necleorhabdovirus))，沙粒病毒科(例如，沙粒病毒属，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，Ippy virus，和拉萨病毒)，和冠状病毒科(例如，冠状病毒属和曲状病毒属(torovirus))。
可选择地，本发明的免疫原性组合物中的抗原性或免疫原性试剂可以是癌症或肿瘤抗原，包括但不限于，KS 1/4胰腺癌抗原，卵巢癌抗原(CA125)，磷酸前列腺酸酯，前列腺特异性的抗原，黑素瘤相关抗原p97，黑素瘤抗原gp75，高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)，前列腺特异性的膜抗原，癌胚抗原(CEA)，多形上皮粘蛋白抗原，人乳脂肪球抗原，结肠直肠肿瘤相关抗原，例如CEA，TAG-72，CO17-1A；GICA19-9，CTA-1和LEA，伯基特氏淋巴瘤抗原-38.13，CD19，人B-淋巴瘤抗原-CD20，CD33，黑素瘤特异性的抗原，例如神经节苷脂GD2，神经节苷脂GD3，神经节苷脂GM2，神经节苷脂GM3，肿瘤特异性的移植类型的细胞表面抗原(TSTA)，例如病毒诱导的肿瘤抗原，包括DNA肿瘤病毒的T-抗原和RNA肿瘤病毒的包膜抗原，瘤胚抗原-α-胎蛋白，例如结肠的CEA，膀胱肿瘤瘤胚抗原，分化抗原，例如人肺癌抗原L6、L20，纤维肉瘤的抗原，人白血病T细胞抗原-Gp37，新糖蛋白，鞘脂，乳腺癌抗原例如EGFR(表皮生长因子受体)，HER2抗原(p185HER2)，多形上皮粘蛋白(PEM)，恶性人淋巴细胞抗原-APO-1，分化抗原例如在胎红细胞、原内胚层中发现的I抗原，在成年红细胞、植入前的胚胎中发现的I抗原，在胃腺癌中发现的I(Ma)，在乳腺上皮中发现的M18、M39，在骨髓细胞中发现的SSEA-1，在结肠直肠癌中发现的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22，在结肠腺癌中发现的TRA-1-85(血型H)、C14，在肺腺癌中发现的F3，在胃癌中发现的AH6，在胚胎癌性细胞中发现的Y半抗原、Ley，在A431细胞中发现的TL5(血型A)、EGF受体，在胰腺癌中发现的E1系列(血型B)，在胚胎癌性细胞中发现的FC10.2，在腺癌中发现的胃腺癌抗原、CO-514(血型Lea)，在腺癌中发现的NS-10，在A431细胞的EGF受体中发现的CO-43(血型Leb)、G49，在结肠腺癌中发现的MH2(血型ALeb/Ley)，在结肠癌中发现的19.9，在骨髓细胞中发现的胃癌粘蛋白、T5A7，在黑素瘤中发现的R24，在胚胎癌性细胞中发现的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1:22:25:8，和在4至8-细胞阶段胚胎中发现的SSEA-3和SSEA-4，和来自皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体衍生肽。
用于本发明的免疫原性组合物中的抗原性或免疫原性试剂可以是能在合适的条件下在受试者中产生免疫反应的任何物质，包括但不限于，多肽，肽，蛋白质，糖蛋白，脂类，核酸和多糖。使用本领域技术人员已知的标准方法，可以确定本发明的免疫原性组合物中的抗原性或免疫原性试剂的浓度，其取决于抗原性或免疫原性试剂的效力和性质。在本发明的增强的输送系统下，抗原性或免疫原性试剂的浓度优选地低于当使用可选择的给药途径和可选择的组合物时使用的常规量。
本发明还包括其它的化合物或试剂，其以前没有与任何组织空间中的佐剂活性相关联，当与免疫原性或抗原性试剂皮内地共同施用时，其能增强由该免疫原性或抗原性试剂触发的免疫反应。本发明特别地包括以前没有与皮内隔室中的佐剂活性相关联的化合物或试剂。
本发明包括向受试者皮肤的皮内隔室中皮内输送本文所述的和示例的本发明的免疫原性组合物的方法，优选地通过直接地和选择性地靶向皮内隔室。使用在1999年10月14日提交的美国专利申请号09/417,671；2000年6月29日提交的09/606,909；2001年6月29日提交的09/893,746；2001年12月28日提交的10/028,989；2001年12月28日提交的10/028,988；或2001年4月18日公布的国际公开号EP 10922 444；2002年1月10日公布的WO 01/02178和2002年1月10日公布的WO 02/02179(它们都在这里整体引作参考)中公开的任一种皮内装置和方法，施用本发明的免疫原性组合物。
本发明的免疫原性组合物靶向皮内空间的实际方法不是至关重要的，只要它能穿透受试者的皮肤达到皮内空间内的所需要的目标深度，而不透过它。实际的最佳穿透深度随受试者皮肤的厚度而变。在大多数情况下，穿透皮肤到约0.5-2mm的深度。无论具体的皮内装置和输送方法如何，皮内输送优选地将本发明的免疫原性组合物靶向至至少0.3mm、更优选至少0.5mm的深度，到不超过2.0mm、更优选不超过1.7mm的深度。在某些情况下，将免疫原性组合物输送到刚好在角质层下且包括表皮和上部真皮(upper dermis)的目标深度，例如约0.025mm至约2.5mm。为了靶向皮肤内的特异细胞，优选的靶深度取决于被靶向的特定细胞和特定受试者的皮肤厚度。例如，为了靶向人皮肤的皮肤空间中的朗氏细胞，输送需要至少部分地包括通常为约0.025mm至约0.2mm的人表皮组织深度。
本发明提供了治疗和预防的方法，其包括向受试者，优选哺乳动物，最优选人，施用本发明的免疫原性组合物，以治疗、控制或改善与疾病或病症有关的症状，尤其是传染性的疾病或癌症。受试者优选地是哺乳动物，例如非灵长类动物，例如奶牛、猪、马、猫、狗、大鼠、小鼠，和灵长类动物，例如，猴例如猕猴(Cynomolgous monkey)和人。在一个优选的实施方案中，受试者是人。优选地，本发明的免疫原性组合物是疫苗组合物。
本发明包括免疫和/或刺激受试者中的免疫反应的方法，包括给受试者，优选人，皮内输送单剂量的本发明的组合物。在有些实施方案中，本发明包括一次或多次加强免疫。本发明的免疫原性组合物能特别有效地刺激和/或上调抗体反应至大于在常规的免疫原性组合物(例如疫苗)和给药方案中看到的水平。本发明的免疫原性组合物能特别有利地用于形成针对抗原性或免疫原性试剂(需要对其产生免疫反应)的迅速且高水平的免疫性。本发明的免疫原性组合物利用低剂量的抗原性或免疫原性试剂，可以达到保护水平的全身免疫性。在有些实施方案中，本发明的免疫原性组合物利用剂量是为了得到有效的免疫反应而常规使用的抗原性或免疫原性试剂剂量的60％、优选50％、更优选40％的抗原性或免疫原性试剂，产生增强的免疫反应。在优选的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含剂量低于使用常规的输送模式，例如肌肉内和皮下，和常规的组合物，即在没有本发明的赋形剂的情况下，在本领域中使用的常规剂量(例如，Physician′s Desk Reference中推荐的剂量)的抗原性或免疫原性试剂。优选地，本发明的免疫原性组合物在单次皮内给药后，会产生治疗上或预防上有效的免疫反应。对于每年的免疫，可以皮内地施用本发明的免疫原性组合物。
与目前可以得到的制剂相比，本发明的免疫原性组合物具有增强的治疗功效、安全性和毒性特性。本发明的免疫原性组合物赋予的益处和优点部分地是由于特殊的制剂和它们在靶向皮肤的皮内隔室中的效用。优选地，本发明的免疫原性组合物可以提供更大的和更持久的保护，特别是对于不能较好地对免疫作出响应的高危群体。
本发明包括使用本领域已知的或本文所述的标准方法，测定本发明的免疫原性组合物的功效的方法。确定本发明的免疫原性组合物的功效的测定法，可以是基于体外的测定法或基于体内的测定法，包括基于动物的测定法。在有些实施方案中，本发明包括检测和/或定量从已经被施用了本发明的免疫原性组合物的受试者得到的样品(例如，血清)中的针对本发明的组合物的抗原性或免疫原性试剂的体液免疫反应。优选地，将本发明的免疫原性组合物的体液免疫反应与从已经被施用了对照制剂(例如，仅仅包含抗原性或免疫原性试剂的制剂)的相同受试者得到的对照样品进行比较。
在其它的实施方案中，本发明包括通过测量细胞介导的免疫反应，来确定本发明的组合物的功效的方法。测量细胞介导的免疫反应的方法是本领域的技术人员已知的，且包含在本发明中。在有些实施方案中，可以测量T细胞免疫反应，以定量受试者中的免疫反应，例如通过使用本领域的技术人员已知的普通方法，包括但不限于来自组织培养物上清液的ELISA，离体的或体外培养一段时间后的细胞的基于流式细胞术的细胞内细胞因子染色，和基于细胞因子小珠阵列流式细胞术(cytokine bead array flow cytometry)的测定法，来测量细胞因子生产。在其它实施方案中，本发明包括使用本领域已知的普通方法，包括但不限于基于铬的释放测定法，使用已知的CTL表位的基于流式细胞术的四聚体或二聚体染色测定法，来测量T细胞特异性的反应。
本发明还包括鉴定能增强对免疫原性或抗原性试剂的免疫反应的化合物的方法。在一个实施方案中，鉴定能增强对抗原性或免疫原性试剂的免疫反应的化合物的方法包括将免疫原性组合物输送进受试者皮肤的皮内隔室，测量免疫反应的水平，其中免疫原性组合物包含免疫原性或抗原性试剂和该化合物，且其中免疫反应针对该抗原性或免疫原性试剂。本发明包括使用本领域技术人员已知的和本文公开的方法，通过确定体液的和/或细胞-介导的免疫反应，来测量免疫反应的水平。一旦确定了免疫反应的水平，将其与标准水平相比较，其中测量的水平升高表明该化合物是佐剂。
在一个具体的实施方案中，鉴别能增强免疫原性或抗原性试剂的免疫原性的化合物的方法包括(a)将免疫原性组合物输送进第一个受试者的皮肤的皮内隔室，其中免疫原性组合物包含免疫原性或抗原性试剂和该化合物；(b)测量从第一个受试者的血清得到的样品中的抗体反应；(c)将免疫原性组合物输送进第二个受试者的皮肤的皮内隔室，其中免疫原性组合物包含没有该化合物的免疫原性或抗原性试剂，且其中第一个和第二个受试者是相同的物种；(d)测量从第二个受试者的血清得到的样品中的抗体反应；(e)确定从第一个受试者得到的反应是否大于从第二个受试者得到的反应。如果从第一个受试者得到的样品中的反应大于第二个受试者，则将该化合物表征为可以用于本发明的组合物中的赋形剂，(f)证明候选制剂会穿过显微针，和(g)证实能提供佐剂性质的试剂的浓度是能产生可接受的draize分数的浓度。当与抗原性或免疫原性试剂共同施用进受试者皮肤的皮内隔室时，通过本发明的筛选方法鉴定出的化合物可以用于引起增强的针对该抗原性或免疫原性试剂的免疫反应。具体地，这些化合物可以用于疫苗组合物中。
本发明还包括试剂盒，其包含本文所述的本发明的皮内施用装置和免疫原性组合物。在有些实施方案中，本发明提供了包含本发明的免疫原性组合物的药物包或试剂盒。在一个具体的实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含一个或多个装有一种或多种本发明的免疫原性组合物组分(例如抗原性或免疫原性试剂、赋形剂)的容器。在另一个具体的实施方案中，试剂盒包含2个容器，一个含有抗原性或免疫原性试剂，另一个含有赋形剂。这样的容器可以伴有由规范药品或生物产品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的公告，该公告反映了由生产、使用或销售的管理机构对于人类施用所作出的批准。
5.1免疫原性组合物本发明的免疫原性组合物设计用于靶向输送抗原性或免疫原性试剂(优选，选择性地和特异地)到受试者皮肤的皮内隔室中。在有些实施方案中，本发明的免疫原性组合物直接靶向皮肤的皮内隔室。本发明的免疫原性组合物包含抗原性或免疫原性试剂和至少一种赋形剂，后者能增强抗原性或免疫原性试剂向免疫细胞(例如皮内隔室的免疫细胞)的呈递和/或可用性，产生增强的免疫反应。本发明的免疫原性组合物可以增强细胞介导的和/或体液介导的免疫反应。可以由本发明的皮内疫苗制剂调控的细胞介导的免疫反应包括，例如，Th1或Th2 CD4+T-辅助细胞介导的或CD8+细胞毒性T-淋巴细胞介导的反应。
可以用于本发明的免疫原性组合物中的赋形剂包括但不限于，稳定剂，防腐剂，溶剂，表面活性剂或去污剂，悬浮剂，张力剂，载体和生长培养基的成分。可以在本发明的组合物和方法中使用的赋形剂的实例，在本文中公开在5.1.1部分，且示例在实施例6.1-6.3中。在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂的浓度取决于使用的具体赋形剂(见5.1.1部分和实施例6.1-6.3)。在有些实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂的浓度可以是0.000002％-58％(w/v)和0.05％-10.0％(v/v)。在其它实施方案中，使用的赋形剂的浓度可以是至少10％(w/v)，至少15％(w/v)，至少20％(w/v)，至少25％(w/v)，或至少30％(w/v)。在其它实施方案中，赋形剂的浓度大于约30％(w/v)。在其它实施方案中，赋形剂的浓度是至少0.1％(w/v)，至少0.5％(w/v)，至少1％(w/v)，至少5％(w/v)，或至少10％(w/v)。赋形剂可以用于制备和生产免疫原性组合物。在这样的情况下，可以在最后的免疫原性组合物中发现从组合物的生产或制备留下的赋形剂的残留浓度。但是，这样的残留浓度太低，不会产生用本发明的免疫原性组合物观察到的佐剂活性。
在有些实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含一种或多种添加剂，包括但不限于，传统的佐剂，传统的赋形剂，稳定剂，渗透促进剂，和粘膜或生物粘附剂。传统的赋形剂是添加到组合物中作为稀释剂或载体的或多或少具有惰性的物质。或者，可以使用传统的赋形剂，从而为组合物提供形状或稠度。这样的传统赋形剂的实例是本领域的技术人员已知的，且包含在本发明中，见，例如，Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.，现行版；它们都在本文中整体引作参考。传统的佐剂是添加到组合物中增强组合物中的活性成分的抗原性的物质，例如，矿物质悬浮液，其上面吸收着抗原性或免疫原性试剂，或油包水乳液，其中抗原性试剂乳化在矿物油中(例如，弗氏不完全佐剂)，有时包含杀死的分枝杆菌，以进一步增强抗原性试剂的抗原性。
在其它的实施方案中，本发明的免疫原性组合物还可以包含一种或多种其它的药学上可接受的载体，包括任何合适的稀释剂或赋形剂。优选地，药学上可接受的载体自身不能诱导生理反应，例如免疫反应。最优选地，药学上可接受的载体不能产生任何负面的或不希望的副作用，和/或不能产生不适当的毒性。用于本发明的免疫原性组合物中的药学上可接受的载体包括但不限于，盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌的等渗含水缓冲液和其组合。Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.，现行版；它们都在本文中整体引作参考)提供了药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的其它实例。
在特殊的实施方案中，本发明的免疫原性组合物也可以含有湿润剂，乳化剂，或pH缓冲剂。本发明的免疫原性组合物可以是固体，例如适用于重配的冻干的粉末，液体溶液，悬浮液，片剂，丸剂，胶囊，持续释放制剂，或粉末。
本发明的免疫原性组合物可以是适于皮内输送的任何形式。优选地，本发明的免疫原性组合物是稳定的制剂，其经历最低的至没有可检测水平的抗原性或免疫原性试剂的降解和/或聚集，且可以贮藏延长的一段时间，而不损失生物活性，例如，抗原性试剂的抗原性或免疫原性。
5.1.1赋形剂本发明部分地基于发明人的意外发现，即皮内输送与一种或多种赋形剂相组合的抗原性或免疫原性试剂，会导致增强的对该抗原性或免疫原性试剂的免疫反应。如本文使用的，除非另有说明，“赋形剂”是指药物组合物中的成分或添加剂，其自身不具有组合物所要达到的药理学或生物学活性，且在本发明之前，不知其在根据本发明施用到皮肤的皮内隔室时，能直接增强或改变这样的药理学或生物学活性。在本发明的方法中使用的赋形剂是预选的赋形剂。如本文使用的，″预选的″赋形剂包括传统的、非传统的赋形剂，和当根据本发明的方法输送给受试者皮肤的皮内隔室时，具有佐剂活性的所有其它赋形剂。已经意外地发现，这些赋形剂当与抗原性或免疫原性试剂共同施用给皮内隔室时，会起佐剂的作用，即与接受没有赋形剂的组合物的受试者相比，增强接受这样的组合物的受试者中的对抗原性或免疫原性试剂的免疫反应。优选地，在本发明的免疫原性组合物和方法中使用的赋形剂以前没有与佐剂活性相关联。最优选地，在本发明的免疫原性组合物和方法中使用的赋形剂以前没有与皮内隔室中的佐剂活性相关联。
本发明的免疫原性组合物尤其会产生这样的优点，即与传统的输送模式(包括IM)相比，更高的平均血清抗体反应、更高的抗体滴度、更高的血清转化率和血清保护率。这样的参数的测量，在本领域的技术水平内，且本文示例了这样的方法。
尽管不希望受特定作用机理的约束，当以根据本发明的方法的浓度和输送途径施用本发明的赋形剂时，它们会表现出非特异性的佐剂活性，即不通过特定的细胞受体，但是可能通过促进机械损伤，温和刺激，或皮肤伸展。或者，尽管不希望受特定作用机理的约束，赋形剂一旦根据本发明以一定的浓度被输送至受试者皮肤的皮内隔室，它们可以起皮肤刺激剂的作用，导致将抗原呈递细胞召集到注射位点的皮内隔室中，从而起佐剂的作用，即增强对免疫原性组合物的免疫反应。
如本文使用的，当赋形剂起刺激剂的作用时，它会通过在接触位点的化学作用，对皮肤组织造成可逆的无症状的炎性效应，但不是腐蚀性的。在注射位点的炎性效应包括注射位点的血液流入，且可以具有肿胀、发红、热和/或疼痛的特征。本领域的技术人员使用例如Codeof Federal Regulation(标题16，第2卷；6CFR 1500.41，其在本文中整体引作参考)公开的方法，可以确定赋形剂是否是皮肤刺激剂。根据6CFR 1500.41，如果当通过16CFR 1500.41的方法暴露4小时，或通过其它适当的技术，在白化兔的完整皮肤上进行测试时，会产生5或更大的实验得分，则化学药品是皮肤刺激剂。优选地，在本发明的方法中使用的赋形剂具有5或更小的得分，更优选4或更小的得分，和最优选3或更小的得分。当将本发明的赋形剂表征为皮肤刺激剂时，可以在免疫原性组合物中使用不是皮肤刺激剂的一种或多种其它的赋形剂，以减少皮肤刺激。在一个具体的实施方案中，为了确定一旦将免疫原性组合物(例如，疫苗)输送到受试者(例如，动物)皮肤的皮内隔室时，本发明的免疫原性组合物是否会产生皮肤刺激，在免疫1小时内、24小时和21天时，以视觉检查注射位点。记录下除了在数小时内消退的最初的“水泡”以外的所有观察。在一个具体的实施方案中，当将DNA免疫原剂(例如，pDNA-HA)输送到受试者皮肤的皮内隔室时，在免疫(初次或加强)的1小时内、此后24小时、即将加强前的第21天、加强后24小时和加强后21天(实际上是方案的第42天)，检查注射位点。
根据它们的功能，通常将赋形剂分成亚类。在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂可以具有一种或多种功能。几个亚类的赋形剂是本领域已知的，且包含在本发明中。见，例如，Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery System，第6版，第110-133页，Williams & Wilkins(1995)，其在本文中整体引作参考。例如，可以将赋形剂归类成稳定剂，防腐剂，溶剂，表面活性剂或去污剂，悬浮剂，张力剂或载体。在疫苗的情况下，经常将用于促进或维持免疫原的生长的生长培养基成分用作赋形剂。一些赋形剂具有不止一个功能，且可以用于多个目的。本领域的普通技术人员能明白，这些亚类并非所有可得到的赋形剂的穷尽列表，因而也可以根据本发明的免疫原性组合物和方法使用其它类型的赋形剂。Handbookof Pharmaceutical Excipients，2003(第4版，AmericanPharmaceutical Association，London)(其整体引作参考)中提供了赋形剂的其它类别和实例。
在有些实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂是稳定剂。如本文使用的，稳定剂是能提高药物组合物的稳定性的化学试剂。如本文使用的，稳定的组合物指能经历最低的至没有可检测水平的抗原性或免疫原性试剂的降解和/或聚集的组合物，且其可以贮藏延长的一段时间，而不损失生物活性，例如，抗原性试剂的抗原性或免疫原性。优选地，本发明的免疫原性组合物能在2℃-8℃的温度范围，优选4℃表现出稳定性至少2年，如通过高效尺寸排阻层析(HPSEC)所评定的。优选地，本发明的免疫原性组合物在贮藏经过上述的确定的时间后，具有低的至不可检测的水平的抗原性或免疫原性试剂的聚集和/或降解。优选地，如通过HPSEC测量的，在贮藏经过上述的确定的时间后，不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％、和最优选地不超过0.5％的抗原性或免疫原性分子形成聚集体或降解。在最优选的实施方案中，如通过本领域已知的标准方法所评定的，在上述条件下的长期贮藏过程中，本发明的免疫原性组合物会表现出几乎没有损失抗原性或免疫原性试剂的生物活性。在贮藏经过上述时间后，本发明的免疫原性组合物能保留超过80％，超过85％，超过90％，超过95％，超过98％，超过99％，或超过99.5％的贮藏之前的初始生物活性。
根据赋形剂稳定组合物的机理，可以将稳定剂进一步分类成酸化剂或碱化剂、吸附剂、空气排代剂、抗氧化剂、缓冲剂、螯合剂或润湿剂，它们都包含在本发明中。如本文使用的酸化剂能通过为组合物中的活性成分(即否则在碱性条件下不稳定的抗原性或免疫原性试剂)提供酸性介质，来稳定药物组合物。酸化剂的实例包括但不限于，醋酸，柠檬酸，富马酸，盐酸，硝酸和醋酸钠。碱化剂能通过为组合物中的活性成分(即在酸性环境中不稳定的抗原性或免疫原性试剂)提供碱性介质，来稳定组合物。碱化剂的实例包括但不限于，氨溶液，碳酸铵，单-、二-或三-乙醇胺，氢氧化钾，硼酸钠，碳酸钠，氢氧化钠和三乙醇胺。
在一个具体的实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂是吸附剂。如本文所使用的吸附剂是能通过物理的和/或化学的手段将其它分子粘附或吸附到它的表面上的试剂。吸附剂的实例包括但不限于，纤维素、木炭和明胶。在一个更具体的实施方案中，本发明的赋形剂是明胶。优选地，以约0.01-约2％(重量/体积组合物)的浓度施用明胶，且更优选地，以约0.03-约0.6％(重量/体积组合物)。在另一个具体的实施方案中，以约0.0-0.225％(重量/体积)的浓度施用明胶。
在有些实施方案中，本发明包括是抗氧化剂的赋形剂。尽管不希望受具体的作用机理的约束，抗氧化剂能通过抑制氧化，从而防止组合物被氧化过程破坏，来稳定药物组合物。在本发明的免疫原性组合物中使用的抗氧化剂的实例包括但不限于，抗坏血酸，棕榈酸抗坏血酸酯，丁基化羟基茴香醚，丁基化羟基甲苯，次磷酸，一硫代甘油，没食子酸丙酯，抗坏血酸钠，亚硫酸氢钠，甲醛合次硫酸氢钠，偏亚硫酸氢钠和亚硫酸钠。
在一个具体的实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂是抗氧化剂。在一个更具体的实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂是亚硫酸氢钠。优选地，以约0.1-约8.0％(重量/体积组合物)和更优选约0.3-约3.0％(重量/体积组合物)的浓度，使用亚硫酸氢钠。
本发明还包括是缓冲剂的赋形剂。尽管不希望受具体的作用机理的约束，缓冲剂能通过提供对pH改变的抗性，例如，依靠稀释或添加酸或碱，来稳定药物组合物。可以在本发明的免疫原性组合物中使用的缓冲剂的实例包括但不限于，甘氨酸，偏磷酸钾，磷酸钾，一碱价醋酸钠，和无水或二水合柠檬酸钠。
本发明还包括用于本发明的免疫原性组合物中的螯合剂。尽管不希望受特定作用机理的约束，螯合剂能通过与一种或多种金属(例如重金属)形成稳定的水溶性的复合物，来稳定药物组合物。通常，重金属对于蛋白酶的酶促活性是至关重要的，因而螯合剂会通过螯合它们的酶促活性所必需的金属而限制了蛋白酶的活性。可以用于本发明的组合物中的螯合剂的实例包括但不限于，乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸。
在有些实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂是润湿剂。润湿剂是能通过保持水分来预防制品变干的试剂。可以在本发明的免疫原性组合物中使用的润湿剂的实例包括但不限于，甘油、丙二醇和山梨醇。在一个具体的实施方案中，本发明的赋形剂是润湿剂。在一个更具体的实施方案中，本发明的赋形剂是山梨醇。优选地，以约1-约100％(重量/体积组合物)、更优选约2.5-约70％(重量/体积组合物)、更优选约5-约20％(重量/体积组合物)的浓度，施用山梨醇。
本发明还包括是防腐剂的赋形剂。尽管不希望受具体的作用机理的约束，防腐剂是能阻止药物组合物中的外来生物的生长的物质。防腐剂包括例如，抗真菌剂，即能阻止真菌的生长的试剂，和抗微生物剂，即能阻止微生物(包括病毒)的生长的试剂。可以在本发明的免疫原性组合物和方法中使用的抗真菌剂的实例包括但不限于，两性霉素B，苯甲酸，对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯或丁酯，苯甲酸钠和丙酸钠。在对羟基苯甲酸酯的情况下，众所周知当组合使用它们时，通常会提高有效性。可以在本发明的免疫原性组合物和方法中使用的抗微生物剂的实例包括但不限于，氨普立糖，苯扎氯铵，苯索氯铵，苄醇，β丙醇酸内酯，鲸蜡基氯化吡啶，氯代丁醇，金霉素，EDTA，甲醛，庆大霉素，卡那霉素，新霉素，酚，苯氧基乙醇，苯乙醇，硝酸苯汞，多粘菌素B，链霉素，硫柳汞，磷酸三正丁酯。
在一个具体的实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂是抗真菌剂。在一个更具体的实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂是两性霉素B。优选地，以约0.5-约600ng/mL、更优选约30-约100ng/mL的浓度，使用两性霉素B。在其它实施方案中，以约0.1ng/200uL-1200ng/200uL的浓度，使用两性霉素B。在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂可以是兼性的或多烯的(polyenic)抗菌素。可以在本发明的免疫原性组合物中使用的兼性抗生素的实例包括但不限于两性霉素B和制霉菌素。
在另一个具体的实施方案中，在本发明的组合物中使用的赋形剂是抗微生物剂。在一个更具体的实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂是氨普立糖或磷酸三正丁酯。优选地，以0.1-约0.9％w/v的浓度，使用氨普立糖。优选地，以0.04-约0.325％w/v的浓度，使用磷酸三正丁酯。
本发明包括是溶剂的赋形剂，即用于将另一种药物物质溶解到本发明的组合物制品中的试剂。可以使用溶剂来溶解抗原性或免疫原性试剂。在本发明的免疫原性组合物中使用的溶剂可以是水性的或非水性的。在一些实施方案中，在本发明的组合物中使用共溶剂，例如，水和醇。为了制备可注射的组合物，优选地使用无菌溶剂。可以在本发明的免疫原性组合物中使用的溶剂的实例包括但不限于，醇，尤其是乙醇，玉米油，棉籽油，甘油，异丙醇，矿物油，油酸，花生油，纯化水，注射用水，和无菌的注射用水。
在一个具体的实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂是溶剂。在一个更具体的实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂是乙醇。在其它具体的实施方案中，以约0.01-约2.0％(体积/体积组合物)、优选约0.05-约0.45％(体积/体积组合物)的浓度，使用乙醇。在一些具体的实施方案中，在较深的皮内深度，例如在大于1mm的深度，乙醇浓度可以是2.0％v/v。
本发明还包括作为用于本发明的免疫原性组合物中的赋形剂的表面活性剂，即表面活性的试剂。尽管不希望受具体的作用机理的约束，表面活性剂能聚集到表面或界面上，并减小表面或界面张力。表面活性剂可以用作湿润剂、去污剂或乳化剂。
可以在本发明的组合物中使用的表面活性剂的实例包括但不限于，苯扎氯铵，硬脂酸镁，壬苯醇醚10，oxtoxynol 9(Triton N-101)，泊洛沙姆例如泊洛沙姆124、188(Lutrol F 68)、237、388或407(Lutrol F 127)，聚山梨酯20(吐温20)，聚山梨酯80(吐温80)，月桂基硫酸钠，失水山梨糖醇单棕榈酸酯和Triton X-100。
在一个具体的实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂是表面活性剂。在一个更具体的实施方案中，本发明的赋形剂是Lutrol F 127，Triton N-101，Triton X-100，吐温20或吐温80。
本发明包括非离子型表面活性剂赋形剂，当根据本发明的方法输送到ID隔室时，其会起佐剂的作用。尽管不希望受特定作用机理的约束，能在皮内隔室中产生佐剂性质的这样的去污剂的浓度范围是狭窄的，这与其中这样的去污剂已经用于一般的疫苗生产目的的文献所报道的宽范围相反。优选的工作浓度随针深度(1.00mm vs.1.5mm vs.2.0mm vs.3.00mm)而变。本发明包括使用非离子型表面活性剂赋形剂，其在使用范围内能表现出佐剂性质，同时避免或最少化组织刺激，对组织没有毒性或损伤。在最优选的实施方案中，当将这样的赋形剂输送到ID隔室时，存在增强的免疫反应，如例如通过增强的血清转化、增强的平均抗体滴度或增强的中间抗体滴度所测量的(使用熟练的技术人员已知的和本文示例的方法)。商业上，经常将非离子型表面活性剂作为浓缩的液体储液提供。Sigma-Aldrich Company products；Cat.T-6878，Cat.303135，Cat.P-8074，Cat.P7949或类似浓度和纯度的产品可以用于实现本发明。
在一个具体的优选的实施方案中，使用的Triton N-101的浓度是约0.05-约5％(重量/体积组合物)、更优选约0.1-约1.5％(重量/体积组合物)。本发明包括在较深的皮内深度(例如，在大于2.5mm的深度)使用浓度高达5％的Triton N-101。
在一个具体的优选的实施方案中，使用的Triton X-100的浓度是约0.00003-约5％(重量/体积组合物)、更优选约0.0001-约0.0009％(重量/体积组合物)。本发明包括在较深的皮内深度(例如，在大于2.5mm的深度)使用浓度高达5％的Triton X-100。
在一个具体的优选的实施方案中，使用的吐温80的浓度是约0.03-约3％(重量/体积组合物)(w/v)，或约0.03-约5％w/v，0.01-约10％w/v，更优选约0.1-约0.9％(重量/体积组合物)。在另一个优选的具体的实施方案中，当将制剂输送到皮肤的皮内隔室中2mm或更小的深度时，以约1.1-2.0％v/v的浓度使用吐温80。在另一个优选的具体的实施方案中，当将制剂输送到皮肤的皮内隔室中2mm或更大的深度时，以约1.1-5.0％v/v的浓度使用吐温80。更具体地，在1.0-1.5mm深度以1.1-2.5％V/V，在1.6-2mm深度以1.1-5.0％V/V，在2.1-2.5mm深度以1.1-7.5％V/V，在2.6-3mm深度以1.1-10.0％V/V，使用吐温。
在一个具体的优选的实施方案中，以约0.003-0.03％w/v、约0.003-0.3％w/v和0.003-3.0％w/v的浓度，使用吐温20。在一个优选的实施方案中，表达为V/V，以约0.003-0.03％v/v、约0.003-0.3％v/v和0.003-3.0％v/v的浓度，使用吐温20。
在另一个具体的实施方案中，当将制剂输送到皮肤的皮内隔室中2mm或更小的深度时，以约2.0-10％w/v的浓度使用山梨醇。在另一个优选的具体的实施方案中，当将制剂输送到皮肤的皮内隔室中2mm或更大的深度时，以约2-20％w/v的浓度使用山梨醇。通常，将表面活性剂用于制备和生产免疫原性组合物，尤其是疫苗。在这样的情况下，可以在最后的免疫原性组合物中发现从组合物的制备和生产留下的表面活性剂的残留浓度。这样的残留浓度太低，不会产生用本发明的免疫原性组合物观察到的佐剂活性。这样的表面活性剂的实例是辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，TritonTM系列)，聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(例如，吐温TM系列)，和聚氧乙烯酯或醚；辛基苯氧基聚氧乙醇和聚氧乙烯山梨糖醇酐酯包括叔辛基苯氧基聚氧乙醇；和聚氧乙烯山梨糖醇酐酯包括聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯；Triton X-45，TritonX-102，Triton X-114，Triton X-165，Triton X-205，Triton X-305，Triton N-57，Triton N-101，Triton N-128，Breij 35，Laureth-9，Steareth-9，吐温80TM(关于表面活性剂的列表，见，例如，Surfactant Systems，Attwood和Florence编，1983，Chapman andHall，其在本文中整体引作参考)。
本发明包括用于本发明的免疫原性组合物中的赋形剂，其是悬浮剂。尽管不希望受特定作用机理的约束，悬浮剂能通过例如减小分散在它们不溶的载体中的颗粒的沉降速度，来增加组合物的粘度。可以在本发明的组合物中使用的悬浮剂的实例包括但不限于，琼脂，膨润土，卡波姆(例如，卡波普)，羧甲基纤维素钠，明胶，羟乙基纤维素羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，高岭土，甲基纤维素，黄芪胶和veegum。
在一个实施方案中，本发明的赋形剂是悬浮剂。在一个更具体的实施方案中，本发明的赋形剂是明胶或甲基纤维素。优选地，使用的甲基纤维素的浓度是约0.02-约0.5％(重量/体积组合物)、更优选约0.06-约0.18％(重量/体积组合物)。
本发明包括张力剂，其作为用于本发明的组合物中的赋形剂。在本发明的免疫原性组合物中特别需要张力剂，因为它们能为溶液提供类似于生理流体的渗透特征，因而对于本发明的可注射的组合物是最佳的。可以在本发明的免疫原性组合物中使用的张力剂的实例包括但不限于，右旋糖，葡萄糖和氯化钠。
本发明还包括是载体的赋形剂。如本文使用的，载体是药物组合物中的物质的承载物质。载体经常用于配制各种经口和肠胃外施用的组合物。用于本发明的方法和免疫原性组合物中的载体可以是水性的或油性的载体。可以在本发明的免疫原性组合物中使用的载体的实例包括但不限于，玉米油，矿物油，花生油，芝麻油，抑菌的氯化钠注射液和抑菌的水。
生长培养基成分可以用作本发明的免疫原性组合物中的赋形剂。当组合物是疫苗时，生长培养基成分是特别有用的。可以在本发明的免疫原性组合物和方法中使用的生长培养基成分的实例包括但不限于，氨基酸，细菌用蛋白胨，牛白蛋白，牛血清，卵蛋白，人血清白蛋白，小鼠血清蛋白，MRC-5细胞蛋白，卵白蛋白，维生素和酵母蛋白。
在一个具体的实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂是生长培养基成分。在一个更具体的实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中的赋形剂是细菌用蛋白胨。优选地，以约0.03-约3％(重量/体积组合物)、更优选约0.1-约1.5％(重量/体积组合物)的浓度，使用细菌用蛋白胨。
本发明包括尚不知道具有佐剂活性(尤其是在皮内隔室中)的其它的化合物或试剂。这些化合物的实例包括但不限于，血清蛋白(例如脱铁运铁蛋白，胎球蛋白)，抑蛋白酶肽，羟基乙酸(一种皮肤片状剥落物)，甘露糖和尿素。当根据本发明的方法使用并输送到皮肤的皮内隔室时，任何补充的蛋白质可以具有佐剂活性。补充的蛋白质特别可用作DNA免疫原的佐剂。根据本发明，预期与尿素有关的化合物(例如尿酸)也能适用。
在一个具体的实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂是脱铁运铁蛋白，抑蛋白酶肽，胎球蛋白，羟基乙酸，甘露糖或尿素。优选地，使用的尿素的浓度是约0.02-约40％(重量/体积组合物)、更优选约0.2-约20％(重量/体积组合物)。优选地，使用的脱铁运铁蛋白的浓度是约20μg/mL-约1,800μg/mL组合物、更优选约60μg/mL-约600μg/mL组合物。优选地，使用的抑蛋白酶肽的浓度是约1μg/mL-约180μg/mL组合物、更优选约5μg/mL-约60μg/mL组合物。优选地，使用的胎球蛋白的浓度是约0.05μg/mL-约7.5μg/mL组合物、更优选约0.2μg/mL-约2.4μg/mL组合物。优选地，使用的甘露糖的浓度是约20μg/mL-约1,800μg/mL组合物、更优选约60μg/mL-约600ug/mL组合物。优选地，使用的羟基乙酸的浓度是约0.05-约3.0％(重量/体积组合物)、更优选约0.1-约1.0％(重量/体积组合物)。
在另一个具体的实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂是胆汁酸或其衍生物，包括但不限于脱氧胆酸盐(DOC)，胆酸，鹅脱氧胆酸，石胆酸，猪脱氧胆酸和熊脱氧胆酸。在另一个具体的实施方案中，当将制剂输送到皮肤的皮内隔室中2mm或更小的深度时，使用的脱氧胆酸盐的浓度是约0.07-0.15％w/v，或0.01-0.3％w/v。在另一个优选的具体的实施方案中，当将制剂输送到皮肤的皮内隔室中2mm或更大的深度时，使用的脱氧胆酸盐的浓度是约0.07-0.15％w/v，或0.01-0.6％w/v。更具体地，1mm-1.5mm深度时DOC的优选范围是0.07-0.15％w/v，1.6mm-2.0mm深度时DOC的优选范围是0.07-0.3％w/v，2.1mm-2.5mm深度时DOC的优选范围是0.07-0.45％w/v，2.6mm-3.0mm深度时DOC的优选范围是0.07-0.6％w/v。
本发明包括制剂，其包含与需要的工作特性相匹配的任意的赋形剂，如本文定义的和图35示例的，具有大于或等于0.125的斜率。
在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂可以以液体或固体形式存在。而且，本领域的普通技术人员能容易地明白，可以单独地或与其它赋形剂组合地使用这些赋形剂。具体地，可以组合使用2种或更多种赋形剂，以达到额外的或协同的效应。赋形剂在本发明的免疫原性组合物中的浓度不包括在根据本发明的方法制备免疫原性组合物之前，可能由于组合物的制备或生产而存在的赋形剂的残留浓度。
5.1.2免疫原性或抗原性试剂可以在本发明的免疫原性组合物中使用的抗原性或免疫原性试剂包括来自动物、植物、细菌、原生动物、寄生物、病毒或其组合的抗原。用于本发明的免疫原性组合物的抗原性或免疫原性试剂可以是能在合适的条件下在受试者中产生免疫反应的任意物质，包括但不限于，多肽，肽，蛋白质，糖蛋白，脂类，核酸和多糖。
本发明的免疫原性组合物可以包含一种或多种抗原性或免疫原性试剂。在本发明的组合物中使用的抗原性或免疫原性试剂的量可以随抗原性或免疫原性试剂的化学性质和效力而改变。通常，本发明的组合物中的抗原性或免疫原性试剂的起始浓度是使用常规的给药方式(例如，肌肉内注射)常规地用于引起需要的免疫反应的量。然后，通过例如使用稀释剂进行稀释，来调节本发明的组合物中的抗原性或免疫原性试剂的浓度，从而实现有效的保护性的免疫反应，如使用本领域已知的和本文所述的标准方法所评定的。
抗原性或免疫原性试剂可以是源自病毒的任意的病毒的肽、蛋白质、多肽或其片段，包括但不限于，RSV-病毒蛋白，例如，RSV F糖蛋白、RSV G糖蛋白，流感病毒蛋白，例如，流感病毒神经氨酸酶、流感病毒血凝素，单纯疱疹病毒蛋白，例如，单纯疱疹病毒糖蛋白，包括例如gB、gC、gD和gE。
在本发明的免疫原性组合物中使用的抗原性或免疫原性试剂可以是致病病毒的抗原，作为实例包括但不限于腺病毒科(例如，哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属)，疱疹病毒科(例如，单纯疱疹病毒1，单纯疱疹病毒2，单纯疱疹病毒5，和单纯疱疹病毒6)，轻小病毒科(例如，轻小病毒属，肠细菌phase MS2，allolevirus)，痘病毒科(例如，脊椎动物痘病毒亚科，副痘病毒属，禽痘病毒属，山羊痘病毒属，野兔痘病毒属，猪痘病毒属，软体动物痘病毒属，和昆虫痘病毒属)，乳头多瘤空泡病毒科(例如多瘤病毒属和乳头状瘤病毒属)，副粘病毒科(例如，副粘病毒属，副流感病毒1，麻疹病毒属(例如，麻疹病毒)，德国麻疹病毒属(rubulavirus)(例如，腮腺炎病毒)，pneumonovirinae(例如肺病毒属，人呼吸道合胞病毒)，和metapneumovirus(例如，禽肺病毒和人metapneumovirus)，小RNA病毒科(例如肠道病毒属，鼻病毒属，肝病毒属(例如人甲型肝炎病毒)，心病毒属，和口蹄疫病毒属(apthovirus)，呼肠孤病毒科(例如，正呼肠孤病毒属(orthoreovirus)，环状病毒属，轮状病毒属，质型多角体病毒属，斐济病毒属，植物呼肠孤病毒属，和水稻病毒属(oryzavirus))，反转录病毒科(例如哺乳动物B型反转录病毒，哺乳动物C型反转录病毒，禽C型反转录病毒，D型反转录病毒组，BLV-HTLV反转录病毒)，慢病毒属(例如人免疫缺陷病毒1和人免疫缺陷病毒2)，泡沫病毒属，黄病毒科(例如，丙型肝炎病毒)，嗜肝DNA病毒科(例如，乙型肝炎病毒)，披膜病毒科(例如，甲病毒属(例如，新培斯病毒)和风疹病毒属(例如，风疹病毒))，弹状病毒科(例如，水泡病毒属，狂犬病病毒属，短时热病毒属(ephemerovirus)，胞质弹状病毒属(cytorhabdovirus)，和胞核弹状病毒属(necleorhabdovirus))，沙粒病毒科(例如，沙粒病毒属，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，Ippyvirus，和拉萨病毒)，和冠状病毒科(例如，冠状病毒属和曲状病毒属(torovirus))。
在本发明的免疫原性组合物中使用的抗原性或免疫原性试剂可以是传染病试剂，包括但不限于，流感病毒血凝素(Genbank登记号JO2132；Air，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 787639-7643；Newton等，1983，Virology 128495-501)，人呼吸道合胞病毒G糖蛋白(Genbank登记号Z33429；Garcia等1994，J.Virol.；Collins等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 817683)，登革热病毒的核心蛋白、基质蛋白或任何其它蛋白(Genbank登记号M19197；Hahn等1988，Virology 162167-180)，麻疹病毒血凝素(Genbank登记号M81899；Rota等，1992，Virology 188135-142)，单纯疱疹病毒2型糖蛋白gB(Genbank登记号M14923；Bzik等，1986，Virology 155322-333)，脊髓灰质炎病毒I VP1(Emini等，1983，Nature 304699)，HIV I的包膜糖蛋白(Putney等，1986，Science2341392-1395)，乙型肝炎表面抗原(Itoh等，1986，Nature 30819；Neurath等，1986，Vaccine 434)，白喉毒素(Audibert等，1981Nature 289543)，链球菌24M表位(Beachey，1985，Adv.Exp.Med.Biol.185193)，淋球菌菌毛蛋白(Rothbard和Schoolnik，1985，Adv.Exp.Med.Biol.185247)，假狂犬病病毒g50(gpD)，假狂犬病病毒II(gpB)，假狂犬病病毒gIII(gpC)，假狂犬病病毒糖蛋白H假狂犬病病毒糖蛋白E，传染性胃肠炎糖蛋白195，传染性胃肠炎基质蛋白，猪轮状病毒糖蛋白38，猪细小病毒衣壳蛋白，猪痢疾小蛇菌(Serpulina hydodysenteriae)保护性抗原，牛病毒性腹泻糖蛋白55，新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶，猪流感血凝素，猪流感神经氨酸酶，口蹄疫病毒，猪瘟病毒，猪流感病毒，非洲猪瘟病毒，猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)，传染性牛鼻气管炎病毒(例如，传染性牛鼻气管炎病毒糖蛋白E或糖蛋白G)，或传染性喉气管炎病毒(例如，传染性喉气管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I)，LaCrosse病毒的糖蛋白(Gonzales-Scarano等，1982，Virology 12042)，初生小牛腹泻病毒(Matsuno和Inouye，1983，Infection andImmunity 39155)，委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(Mathews和Roehrig，1982，Immunol.1292763)，punta toro病毒(Dalrymple等，1981，Replication of Negative Strand Viruses，Bishop和Compans(编)，Elsevier，NY，p.167)，鼠白血病病毒(Steeves等，1974，J.Virol.14187)，小鼠乳腺瘤病毒(Massey和Schochetman，1981，Virology11520)，乙型肝炎病毒核心蛋白和/或乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或衍生物(见，例如，1980年6月4日公开的英国专利公开号GB2034323A；Ganem和Varmus，1987，Ann.Rev.Biochem.56651-693；Tiollais等，1985，Nature 317489-495)，马流感病毒或马疱疹病毒的抗原(例如，马流感病毒A/Alaska 91型神经氨酸酶，马流感病毒A/Miami 63型神经氨酸酶，马流感病毒A/Kentucky 81型神经氨酸酶，马疱疹病毒1型糖蛋白B，和马疱疹病毒1型糖蛋白D，牛呼吸道合胞病毒或牛副流感病毒的抗原(例如，牛呼吸道合胞病毒附着蛋白(BRSV G)，牛呼吸道合胞病毒融合蛋白(BRSV F)，牛呼吸道合胞病毒核壳蛋白(BRSV N)，牛副流感病毒3型融合蛋白，和牛副流感病毒3型血凝素神经氨酸酶)，牛病毒性腹泻病毒糖蛋白48或糖蛋白53。
本发明的免疫原性组合物中的抗原性或免疫原性试剂也可以是癌抗原或肿瘤抗原。根据本发明的免疫原性组合物，可以使用本领域的技术人员已知的任意的癌症或肿瘤抗原，包括但不限于，KS 1/4胰腺癌抗原(Perez和Walker，1990，J.Immunol.1423662-3667；Bumal，1988，Hybridoma 7(4)407-415)，卵巢癌抗原(CA125)(Yu等，1991，Cancer Res.51(2)468-475)，磷酸前列腺酸酯(Tailor等，1990，Nucl.Acids Res.18(16)4928)，前列腺特异性的抗原(Henttu和Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160(2)903-910；Israeli等，1993，Cancer Res.53227-230)，黑素瘤相关抗原p97(Estin等，1989，J.Natl.Cancer Instit.81(6)445-446)，黑素瘤抗原gp75(Vijayasardahl等，1990，J.Exp.Med.171(4)1375-1380)，高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali等，1987，Cancer5955-63；Mittelman等，1990，J.Clin.Invest.862136-2144)，前列腺特异性的膜抗原，癌胚抗原(CEA)(Foon等，1994，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.13294)，多形上皮粘蛋白抗原，人乳脂肪球抗原，结肠直肠肿瘤相关抗原，例如CEA，TAG-72(Yokata等，1992，Cancer Res.523402-3408)，CO17-lA(Ragnhammar等，1993，Int.J.Cancer 53751-758)；GICA 19-9(Herlyn等，1982，J.Clin.Immunol.2135)，CTA-1和LEA，伯基特氏淋巴瘤抗原-38.13，CD19(Ghetie等，1994，Blood 831329-1336)，人B-淋巴瘤抗原-CD20(Reff等，1994，Blood 83435-445)，CD33(Sgouros等，1993，J.Nucl.Med.34422-430)，黑素瘤特异性的抗原，例如神经节苷脂GD2(Saleh等，1993，J.Immunol.，151，3390-3398)，神经节苷脂GD3(Shitara等，1993，Cancer Immunol.Immunother.，36373-380)，神经节苷脂GM2(Livingston等，1994，J.Clin.Oncol.121036-1044)，神经节苷脂GM3(Hoon等，1993，Cancer Res.535244-5250)，肿瘤特异性的移植类型的细胞表面抗原(TSTA)，例如病毒诱导的肿瘤抗原，包括DNA肿瘤病毒的T-抗原和RNA肿瘤病毒的包膜抗原，瘤胚抗原-α-胎蛋白，例如结肠的CEA，膀胱肿瘤瘤胚抗原(Hellstrom等，1985，Cancer.Res.452210-2188)，分化抗原，例如人肺癌抗原L6、L20(Hellstrom等，1986，Cancer Res.463917-3923)，纤维肉瘤的抗原，人白血病T细胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee等，1988J.of Immunospecifically.1411398-1403)，新糖蛋白，鞘脂，乳腺癌抗原例如EGFR(表皮生长因子受体)，HER2抗原(p185HER2)，多形上皮粘蛋白(PEM)(Hilkens等，1992，Trends in Bio.Chem.Sci.17359)，恶性人淋巴细胞抗原-APO-1(Bernhard等，1989，Science 245301-304)，分化抗原(Feizi，1985，Nature 31453-57)，例如在胎儿红细胞、原内胚层中发现的I抗原，在成年红细胞、植入前的胚胎中发现的I抗原，在胃腺癌中发现的I(Ma)，在乳腺上皮中发现的M18、M39，在骨髓细胞中发现的SSEA-1，在结肠直肠癌中发现的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22，在结肠腺癌中发现的TRA-1-85(血型H)、C14，在肺腺癌中发现的F3，在胃癌中发现的AH6，在胚胎癌性细胞中发现的Y半抗原、Ley，在A431细胞中发现的TL5(血型A)、EGF受体，在胰腺癌中发现的E1系列(血型B)，在胚胎癌性细胞中发现的FC10.2，在腺癌中发现的胃腺癌抗原、CO-514(血型Lea)，在腺癌中发现的NS-10，在A431细胞的EGF受体中发现的CO-43(血型Leb)、G49，在结肠腺癌中发现的MH2(血型ALeb/Ley)，在结肠癌中发现的19.9，在骨髓细胞中发现的胃癌粘蛋白、T5A7，在黑素瘤中发现的R24，在胚胎癌性细胞中发现的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1:22:25:8，和在4至8-细胞阶段胚胎中发现的SSEA-3和SSEA-4。在一个实施方案中，抗原是来自皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体衍生肽(见，Edelson，1998，TheCancer Journal 462)。
在本发明的免疫原性组合物中的抗原性或免疫原性试剂可以包含需要针对它产生免疫反应的病毒。在某些情况下，本发明的免疫原性组合物包含重组的或嵌合的病毒。在其它情况下，本发明的免疫原性组合物包含减毒的病毒。使用本领域的技术人员已知的标准方法，可以进行重组的、嵌合的和减毒的病毒的生产。本发明也包括要根据本发明进行配制的活的重组病毒疫苗或灭活的重组病毒疫苗。活疫苗可以是优选的，因为在宿主中的增殖会导致与自然感染时发生的类似类型和量级的延长的刺激，因此提供实质的持久的免疫。使用常规的方法，包括在细胞培养物或鸡胚胎的尿囊中繁殖病毒，然后纯化，可以实现这样的活重组病毒疫苗制剂的生产。
重组的病毒对于其要施用至的受试者可以是非致病的。在这点上，用于疫苗目的的基因工程改造的病毒的使用可能需要在这些株系中存在减毒特征。将合适的突变(例如，缺失)导入用于转染的模板中，可以提供具有减毒特征的新病毒。例如，可以在缺失突变中产生与温度敏感性或冷适应性有关的特定错义突变。这些突变应当比与冷或温度敏感的突变体有关的点突变更稳定，且回复频率极低。
或者，对于在本发明的组合物中的使用，可以构建具有“自杀”特征的嵌合病毒。这样的病毒在宿主中仅仅经历一个或几个回合的复制。当用作疫苗时，该重组病毒会经历有限的复制循环，并诱导足够水平的免疫反应，但是它不会进一步在人宿主中存活和造成疾病。
或者，可以根据本发明配制灭活的(杀死的)病毒。使用常规的技术来“杀死”嵌合病毒，可以制备出灭活的疫苗制剂。灭活的疫苗是“死的”，其含义是它们的感染性已经被破坏。理想地，病毒的感染性被破坏，而未影响它的免疫原性。为了制备灭活的疫苗，可以使嵌合病毒在细胞培养物或鸡胚胎的尿囊中生长，通过区带超速离心进行纯化，用甲醛或β-丙醇酸内酯灭活，并收集。
完全外来的表位，包括源自其它病毒或非病毒病原体的抗原，也可以构建进用于本发明的组合物中的病毒之中。例如，无关病毒例如HIV的抗原(gp160，gp120，gp41)，寄生物抗原(例如，疟疾)，细菌或真菌抗原或者肿瘤抗原可以构建进减毒的株系中。生产和制备疫苗的方法是本领域的技术人员已知的，且包含在本发明中。通常，这样的方法包括接种含胚卵，收获尿囊液，浓缩、纯化和分离完整的病毒，以多种组合使用例如区带离心、超速离心、超滤和色谱法。这样的方法包括使用各种化学药品，例如裂解试剂(例如非离子型表面活性剂，胆汁酸和其衍生物，烷基糖苷和其衍生物，酰基糖)，稳定剂，溶剂，等。在这样的情况下，可以在最后的免疫原性组合物中发现从疫苗组合物的生产和制备留下的这些化学药品的残留浓度。但是，这样的残留浓度不足以在将疫苗组合物输送到受试者皮肤的皮内隔室时导致疫苗组合物的佐剂活性。应当指出，本文所述的本发明的赋形剂的浓度大于在制备和生产疫苗组合物的过程中可能存在的这样的化学药品的残留浓度。
实际上，可以将任意的异源基因序列构建进用于本发明的免疫原性组合物的嵌合病毒中。优选地，异源基因序列是能起生物反应调节物作用的部分和肽。优选地，能诱导对各种病原体中的任一种的保护性免疫反应的表位，或能结合中和抗体的抗原，可以由嵌合病毒表达，或作为其一部分。例如，可以构建进嵌合病毒中的异源基因序列包括但不限于，流感和副流感血凝素神经氨酸酶和融合糖蛋白，例如人PIV3的HN和F基因。另外，可以构建进嵌合病毒中的异源基因序列包括能编码具有免疫调节活性的蛋白质的那些。免疫调节蛋白的实例包括但不限于，细胞因子，1型干扰素，γ干扰素，集落刺激因子，白介素-1、-2、-4、-5、-6、-12，和这些试剂的拮抗剂。
其它异源序列可以源自肿瘤抗原，且得到的嵌合病毒可以用于产生针对肿瘤细胞的免疫反应，导致体内的肿瘤退化。根据本发明，可以构建重组的病毒，以表达肿瘤相关抗原(TAA)，包括但不限于，由T细胞识别的人肿瘤抗原(Robbins和Kawakami，1996，Curr.Opin.Immunol.8628-636，其在这里整体引作参考)；黑素细胞系蛋白，包括gp100，MART-1/MelanA，TRP-1(gp75)和酪氨酸酶；肿瘤特异性的广泛共享的抗原，例如MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-1，N-乙酰葡糖胺基转移酶V和p15；肿瘤特异性的突变的抗原，例如β-连环蛋白，MUM-1和CDK4；乳腺、卵巢、子宫颈和胰腺癌的非黑素瘤抗原，HER-2/neu，人乳头状瘤病毒-E6、-E7，MUC-1。
用于本发明的免疫原性组合物的抗原性或免疫原性试剂可以包含一种或多种选择试剂和毒素，其由疾病控制中心(Center for DiseaseControl)鉴定。在某些情况下，用于本发明的免疫原性组合物的选择试剂可以包含一种或多种来自如下的抗原葡萄球菌肠毒素B，肉毒杆菌毒素，对于炭疽的保护性抗原和鼠疫耶尔森氏杆菌。表I列出了用于本发明的免疫原性组合物的选择试剂和毒素的非限制性的实例表I选择试剂
5.1.3流感病毒抗原用于皮内输送的本发明的优选的疫苗输送系统是流感病毒疫苗，其可以包含一种或多种流感病毒抗原。优选地，在本发明的皮内疫苗制剂中使用的流感病毒抗原是表面抗原，包括但不限于，血凝素和神经氨酸酶抗原或其组合。流感病毒抗原可以形成完整的流感疫苗制剂的一部分。或者，流感病毒抗原可以作为纯的或基本上纯的抗原存在。用于分离和纯化流感病毒抗原的技术是本领域的技术人员已知的，且包含在本发明中。适合用于本发明的组合物中的血凝素/神经氨酸酶制品的一个实例是Evans Medical Limited of Speke，Merseyside，United Kingdom生产和销售的“Fluvirin”产品，也可参见S.Renfrey和A.Watts，1994 Vaccine，12(8)747-752；其在本文中整体引作参考。
在本发明的皮内疫苗制剂中使用的流感疫苗可以是任意的市场上可买到的流感疫苗，优选三价亚单位疫苗，例如，FLUZONETM减毒的流感疫苗(Aventis Pasteur，Inc.Swiftwater，PA)。在优选的实施方案中，通过以低于肌肉内输送流感疫苗而使用的常规剂量，将流感疫苗输送到皮内隔室中，来达到等同的治疗效果。本发明的流感疫苗制剂包含一种如本文公开的或通过本发明的方法鉴定出的赋形剂。当将这样的制剂输送到皮内隔室时，它们会产生比常规的给药方式或没有赋形剂的情况更高的抗体滴度。在有些实施方案中，与常规的给药方式或没有赋形剂的情况相比，本发明的流感疫苗制剂能使抗体滴度增加2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一个具体的实施方案中，当与等量的输送到皮内隔室的Fluzone相比较时，添加了山梨醇的Fluzone会使血清滴度成为当施用没有山梨醇的Fluzone时的3倍(见图12)。尽管不希望受任何作用机理的约束，这样的由佐剂驱动的增强能提供减少免疫原的浓度的选择，因此，通过增强免疫反应，可以减少免疫原的量。在有些实施方案中，免疫原的量减少了至少20％，至少30％，至少40％，或至少50％。
在本发明中使用的流感疫苗可以是使用本领域已知的普通方法制备的非活流感抗原制品，优选裂解的流感或亚单位抗原制品。最优选地，根据本发明使用的流感疫苗是三价疫苗。本发明包括流感疫苗制剂，其包含从活病毒制备的非活流感抗原制品，优选裂解的流感制品或亚单位抗原制品。最优选地，流感抗原制品是裂解的流感抗原制品。
本发明的流感疫苗制剂可以含有来自单个病毒株或多个病毒株的流感病毒抗原。例如，流感疫苗制剂可以含有取自高达3种或更多种病毒株的抗原。纯粹作为实例，流感疫苗制剂可以含有来自一个或多个流感A的株系的抗原以及来自一个或多个流感B的株系的抗原。流感株系的实例是流感A/Texas/36/91，A/Nanchang/933/95和B/Harbin/7/94的株系。
在一个最优选的实施方案中，本发明的流感疫苗制剂包含市场上可买到的流感疫苗，FLUZONETM，它是减毒的流感疫苗(ConnaughtLaboratories，Swiftwater，Pa.)。FLUZONETM是三价亚病毒粒子疫苗，其包含15μg/剂的来自流感A/Texas/36/91(NINI)、A/Beijing/32/92(H3N2)和B/Panama，45/90病毒的每种HA。
优选地，本发明的流感疫苗制剂具有比常规疫苗更少量的血凝素，且以更少的体积施用。在有些实施方案中，每株流感的血凝素量是约1-7.5μg，更优选约3μg或约5μg，其分别是在肌肉内施用的常规疫苗中使用的血凝素剂量的约1/5或1/3。
根据本发明的流感疫苗制剂的每剂的体积是0.025mL-1.0mL、更优选约0.05mL或约0.25mL。在一个具体的实施方案中，本发明包括100μl的流感疫苗每剂体积。0.1mL剂量是常规的肌肉内流感疫苗每剂体积的约1/5。可以皮内施用的液体的体积部分地取决于注射位点。例如，对于三角肌区中的注射，0.1mL是最优选的体积，而在腰部，可以施用大体积例如约0.2mL。
国际上使用标准来测量流感疫苗的功效。下表说明了关于针对流感的有效疫苗的欧盟官方标准。理论上，为了满足欧盟的要求，并从而获准在欧盟销售，对于包含在疫苗中的所有流感株系，流感疫苗必须满足下表中的标准之一。但是，在实际上，对于所有株系，尤其是对于投放市场的新疫苗，需要满足至少2项或更多项，可能是所有3项标准。在有些情况下，2项标准可能足够。例如，可以接受所有株系满足3项标准中的2项，一些而不是所有株系(例如，3个株系中的2个)满足第三项标准。对于成年群体(18-60岁)和老年群体(＞60岁)，要求是不同的。
表II关于有效的流感疫苗的欧盟标准
血清转化率定义为，对于每种疫苗菌株，在疫苗接种后血清血凝素抑制(HI)滴度增加了至少4-倍的受者的百分比。转化系数定义为，对于每种疫苗株系，在疫苗接种后血清HI几何平均滴度的倍数增加。保护率或血清保护率定义为，在疫苗接种后血清HI滴度等于或大于1∶40的受者的百分比，且一般接受为指示性保护。
本发明的流感疫苗制剂能满足如上所述的流感疫苗的欧盟标准中的一些或全部，所以该疫苗在欧洲可以被批准。优选地，对于存在于疫苗中的流感株系或所有流感株系，能满足3项欧盟标准中的至少2项。更优选地，所有株系能满足至少2项标准，且所有株系或至少除了一个株系以外的所有株系能满足第3项标准。更优选地，存在的所有株系能满足所有3项标准。优选地，本发明的流感疫苗制剂还满足关于当前的流感疫苗的联邦药品管理局(Federal DrugAdministration)和/或USPHS要求的一些或全部标准。
5.2免疫原性组合物的制备5.2.1皮内免疫原性组合物的制备通过任意的能产生稳定的、无菌的、可注射的制剂的方法，可以制备出本发明的免疫原性组合物。优选地，制备本发明的免疫原性组合物的方法包括提供赋形剂的溶液；提供抗原性或免疫原性试剂的溶液；和合并赋形剂的溶液和抗原性或免疫原性试剂的溶液，形成接种物，例如，要注射进皮内隔室中的溶液。
在一个实施方案中，可以将微粒形式的赋形剂溶于抗原性或免疫原性试剂的溶液中，从而形成稳定的、无菌的、可注射的制剂。或者，抗原性或免疫原性试剂可以是微粒，且溶解在赋形剂溶液中，从而形成稳定的、无菌的、可注射的制剂。为了增强本发明的免疫原性组合物的性能，抗原性或免疫原性试剂应当均匀地分散在组合物中。
在一个实施方案中，在施用给受试者之前，混合赋形剂和抗原性或免疫原性试剂。或者，可以在施用过程中，在输送装置中混合赋形剂和抗原性或免疫原性试剂。
在本发明的免疫原性组合物中使用的抗原性或免疫原性试剂的量可以随使用的抗原性或免疫原性试剂和特定的赋形剂的化学性质和效力而异。通常，在本发明的组合物中的抗原性或免疫原性试剂的起始浓度是使用常规的给药方式(例如肌肉内注射)常规地用于引起需要的免疫反应的量。然后，通过例如使用稀释剂进行稀释，来调节本发明的皮内疫苗制剂中的抗原性或免疫原性试剂的浓度，从而实现有效的保护性的免疫反应，如使用本领域已知的和本文所述的标准方法所评定的。
在本发明的免疫原性组合物中使用的赋形剂的量可以随使用的赋形剂和特定的抗原性或免疫原性试剂的化学性质而异。某些优选浓度的上面5.1.1部分所述的赋形剂通常可以与许多抗原性或免疫原性试剂一起有效地使用。但是，本领域的普通技术人员能够明白，根据各赋形剂和抗原性或免疫原性试剂，使用基本上等同于上面公开的用于确定抗原性或免疫原性试剂的有效量的方法，以及本领域常规地已知的其它方法，可以调节赋形剂的量。
可以将本发明的免疫原性组合物制备成单位剂型。每小瓶的单位剂量可以含有0.1mL-1mL、优选0.1-0.5mL制剂。在有些实施方案中，本发明的免疫原性组合物的单位剂型可以含有50μL-100μL，150μL-200μL，或250μL-500μL制剂。如果需要，通过向每个小瓶中加入无菌的稀释剂，可以将这些制品调节至需要的浓度。本发明的免疫原性组合物能更有效地引起需要的免疫反应，因而皮内输送的总体积可以小于常规使用的体积。
在有些实施方案中，将本发明的免疫原性组合物的组分，例如抗原性或免疫原性试剂和赋形剂，分开地或一起混合地提供在单位剂型中，例如，作为在标明了活性试剂(例如抗原性或免疫原性试剂)的量的密闭容器(例如，安瓿或小袋)中的冻干的粉末或无水的浓缩物。在其它实施方案中，可以提供一安瓿的无菌稀释剂，以便可以在施用前混合组分。在一个具体的实施方案中，可以在即将施用前，将赋形剂与抗原性或免疫原性试剂混合。在另一个具体的实施方案中，可以在施用过程中，将赋形剂与抗原性或免疫原性试剂在皮内输送装置中混合。
本发明还提供了免疫原性组合物，其包装在标明了组分的量的密闭容器例如安瓿或小袋中。在一个实施方案中，将免疫原性组合物提供为液体，在另一个实施方案中，作为密闭容器中的干燥的、灭菌的、冻干的粉末或无水的浓缩物，可以用例如水或盐水重配至用于施用给受试者的合适的浓度。在一个可选择的实施方案中，将免疫原性组合物提供为在标明了组分的量和浓度的密闭容器中的液体形式。通过能产生稳定的、无菌的、可注射的制剂的任意的方法，可以制备出本发明的免疫原性组合物。
本发明的免疫原性组合物特别适用于将抗原性或免疫原性试剂皮内输送到受试者皮肤的皮内隔室。优选地，使用在1999年10月14日提交的美国专利申请号09/417,671；2000年6月29日提交的09/606,909；2001年6月29日提交的09/893,746；2001年12月28日提交的10/028,989；2001年12月28日提交的10/028,988；或2001年4月18日公布的国际公开号EP 10922 444；2002年1月10日公布的WO 01/02178；和2002年1月10日公布的WO 02/02179(它们都在这里整体引作参考)中公开的皮内装置和方法之中的任一种，施用本发明的免疫原性组合物。
将本发明的免疫原性组合物施用给受试者皮肤的皮内隔室，从而渗透入而不穿过受试者皮肤的皮内空间。优选地，将免疫原性组合物施用给约1.0-3.0mm深度、最优选1.0-2.0mm深度的皮内空间。与疫苗制剂的常规给药方式(例如，肌肉内)相比，用于皮内输送的本发明的免疫原性组合物能提供无痛的且侵入性更低的给药方式，因此是更有利的，例如在受试者的顺从性方面。
在有些实施方案中，在制备之后，例如从冻干的粉末重配之后，在12小时内，优选6小时内，5小时内，3小时内，或1小时内，施用本发明的免疫原性组合物。在一个优选的实施方案中，在即将皮内施用前，制备用于皮内施用给受试者的本发明的免疫原性组合物，也就是将抗原性或免疫原性试剂与赋形剂混合。
当根据本发明的方法施用时，本发明的免疫原性组合物具有较少的或没有短期和/或长期毒性。在有些实施方案中，当皮内地施用时，本发明的免疫原性组合物在注射位点具有不希望的反应，例如皮肤刺激、肿胀、皮疹、坏死、皮肤敏感化。在这些具体的实施方案中，除了已经使用的赋形剂以外，在本发明的免疫原性组合物中使用一种或多种其它的赋形剂，其能导致消除或减少注射位点的不希望的反应。在其它实施方案中，当皮内地施用时，本发明的免疫原性组合物在注射位点没有不希望的反应。
5.2.2表皮的免疫原性组合物的制备通过任意的能产生稳定的、无菌的制剂的方法，例如本领域已知的和在分别于2001年10月29日、2001年11月27日、2000年5月22日和2002年10月29日提交的美国临时专利申请号60/330,713,60/333,162和美国申请系列号09/576,643，美国申请系列号10/282,231(它们都在这里整体引作参考)中公开的方法，可以制备本发明的表皮的免疫原性组合物。尤其是，可以将它们以干粉、凝胶、溶液、悬浮液和乳膏的形式输送。
可以将表皮的免疫原性组合物以任意的药学上可接受的形式输送进皮肤的表皮隔室中。在一个实施方案中，将表皮的免疫原性组合物应用于皮肤，然后在皮肤和物质上来回地移动或摩擦磨蚀装置。优选地，使用最小量的磨蚀，以产生需要的结果。确定用于所选择的组合物的适当量的磨蚀，在本领域的普通知识范围内。在另一个实施方案中，可以在应用前，将免疫原性组合物以干燥的形式施加至输送装置的磨蚀表面。在该实施方案中，将重配液体应用于输送位点的皮肤，并将裹覆了制剂的磨蚀装置应用于重配液体的位点处的皮肤。然后，在皮肤上来回地移动或摩擦它，使免疫原性组合物溶解于皮肤表面上的重配液体中，并在磨蚀的同时进行输送。或者，可以将重配液体包含在磨蚀装置中，并在将装置应用于皮肤以进行磨蚀时，释放出来从而溶解免疫原性组合物。已经发现某些疫苗制剂也可以以凝胶形式包被在磨蚀装置上。
5.3免疫原性组合物的施用5.3.1皮内施用方法本发明包括将本文所述和示例的本发明的免疫原性组合物皮内输送到受试者皮肤的皮内隔室的方法，优选地通过直接地和选择性地靶向皮内隔室。一旦根据上面5.2部分所述的方法制备了免疫原性组合物，通常将接种物转移到用于皮内输送的注射装置，例如注射器中。优选地，在制备1小时内，将接种物施用给受试者皮肤的皮内隔室。使用在1999年10月14日提交的美国专利申请号09/417,671；2000年6月29日提交的09/606,909；2001年6月29日提交的09/893,746；2001年12月28日提交的10/028,989；2001年12月28日提交的10/028,988；或2001年4月18日公布的国际公开号EP 10922 444；2002年1月10日公布的WO 01/02178；2002年1月10日公布的WO02/02179(它们都在这里整体引作参考)中公开的皮内装置和方法之中的任一种，施用本发明的免疫原性组合物。示例装置显示在图12-14。
在一个具体的实施方案中，本发明包括图12-14公开的药物输送装置。图12-14图示了可以用于实现本发明的方法的药物输送装置的一个实例，以进行图12-14所示的皮内注射。在图12-14中图示的装置10包含针组合件20，其可以连接到注射器筒60上。可以使用其它形式的输送装置，包括美国专利号5,279,586，美国专利申请系列号09/027,607和PCT申请号WO 00/09135(其内容在这里整体引作参考)公开的类型的笔。针组合件20包含针座22，其支撑着针套管24。限制器26容纳针座22的至少一部分，从而限制器26通常围绕着针套管24，如在图13中最佳地观察到的。
针座22的一端30能固定到注射器的接收器32上。可以将设计的针组合件与多种注射器类型一起使用，所述注射器类型用于含有要根据本发明进行皮内输送的物质，下面给出了几个实例。针座22的另一端优选地包括延伸段34，其容纳在限制器26内的邻接表面36上。优选地，在限制器26上提供了多个肋骨38，以提供结构完整性，并有利于操纵针组合件20。通过适当地设计组成部件的大小，可以严格地控制针24的前端或顶端40和限制器26上的皮肤接合表面42之间的距离″d″。距离″d″的范围优选地是约0.5mm至约3.0mm，最优选地约1.5mm±0.2mm至0.3mm。当针套管24的前端40延伸而超过皮肤接合表面42的距离位于该范围内时，可以确保皮内注射，因为针不能进一步穿透动物的典型的真皮层。通常，外面的皮肤层，即表皮，具有50-200微米的厚度，而真皮，即内部的且更厚的皮肤层，具有1.5-3.5mm的厚度。真皮层下面依次是皮下组织(有时也称作皮下层)和肌肉组织。
如从图13可以最好地看出的，限制器26包含孔44，针套管24的前端40从其中伸出。根据特定情形的要求，可以控制孔44和前端40之间的空间关系。在该图示的实施方案中，皮肤接合表面42通常是平面的或平坦的且连续的，以使针组合件20稳定地放置在动物皮肤上。尽管未具体地图解说明，它可以有利地具有通常平面的皮肤接合表面42，包括肋骨形式的凸起部分或槽形式的凹陷部分，以增强稳定性或促进针护罩向针顶端40的附着。另外，沿着限制器26的侧面的肋骨38可以延伸超出皮肤接合表面42的平面。
无论皮肤接合表面42的形状或轮廓如何，优选的实施方案包含足够的能接触皮肤的通常为平面的或平坦的表面区域，以有利于相对于受试者皮肤来稳定注射器。在最优选的布置中，皮肤接合表面42有利于将注射器维持在相对于皮肤表面通常垂直的方向上，和有利于在注射过程中对皮肤施加压力。因而，在优选的实施方案中，限制器具有至少5mm的尺寸或外径。主要尺寸取决于用途和包装限制，但是方便的直径是小于15mm或更优选11-12mm。
重要的是注意到，尽管图12和13图示了两件式组合件，其中使针座22与限制器26分离，但是根据本发明使用的装置不限于这样的布置。从单块塑料完整地形成针座22和限制器26，是图12和13所示的实施例的替代方案。另外，可以以图12所述的位置，将针座22粘附或固定到限制器26上，装配后使针组合件20变成单件单元。
具有针座22和限制器26，可以提供使得皮内针能实际用于生产的优点。优选的针大小是小规格皮下针，通常称作30号或31号针。具有这样的小直径针，代表着使针足够短以预防不适当地穿透动物的直皮层的挑战。限制器26和针座22有利于使用针24，其具有远远大于针的有效长度的总长度，其在注射过程中能穿透个体的组织。利用根据本文设计的针组合件，可以提高生产，因为在生产和装配过程中，可以操纵更大长度的针，同时仍然得到用于完成皮内注射目的的短针的优点。
图13图示了针组合件20，其固定到药物容器例如注射器60上，以形成装置10。通常为圆柱形的注射器体62可以由塑料或玻璃制成，如本领域已知的。注射器体62能提供储存室64，用于容纳要在注射过程中施用的物质。柱塞杆66在一端具有用手作用的凸缘68，在另一端具有塞子70，如本领域已知的。根据需要，用手使柱塞杆66通过储存室64运动，迫使储存室64内的物质排出针的末端40。
针座22可以以多种已知的方式固定到注射器体62上。在一个实施例中，在针座22的内部和注射器体62的出口部分72的外部之间提供干涉配合。在另一个实施例中，提供了常规的Luer配合布置，以将针座22固定到注射器60的一端。如从图14可以看出的，这样设计的针组合件能容易地适用于各种各样的常规注射器类型。
本发明通过特异地和选择性地、优选直接地靶向皮内空间，提高了本文所述的免疫原性组合物的临床应用性和治疗功效。本发明的免疫原性组合物可以作为推注(bolus)或通过灌注而输送到皮内空间。除了用本发明的赋形剂增强本发明的组合物的免疫原性外，通过选择性地靶向受试者皮肤的皮内隔室来输送本发明的免疫原性组合物，可以提高免疫原性或抗原性试剂向驻留在皮肤中的免疫细胞(例如，抗原呈递细胞)的可用性，以实现针对该免疫原性组合物的抗原特异性的免疫反应。优选地，本发明的方法允许通过皮内途径施用更小剂量的免疫原性组合物。
皮内施用方法包括基于显微针的注射和灌注系统或能准确靶向皮内空间的任何其它手段。皮内施用方法不仅包括基于显微装置的注射方式，还包括其它输送方法，例如将流体或粉末无针地或没有针地弹道注射进皮内空间，Mantoux型皮内注射，增强的通过显微装置的离子电渗疗法，和将流体、固体或其它给药形式直接储存进皮肤中。
使用Mantoux型皮内注射，可以将本发明的免疫原性组合物施用到受试者皮肤的皮内隔室中，见，例如，Flynn等，1994，Chest 1061463-5，其在本文中整体引作参考。具体地，使用下面的示例性方法，可以将免疫原性组合物输送到受试者皮肤的皮内隔室中。在一个具体的实施方案中，将根据上面5.3部分公开的方法制备的本发明的免疫原性组合物抽入注射器，例如，1mL无胶乳的具有20号针头的注射器；装载注射器后，将其替换为用于皮内施用的30号针头。针尖斜面朝上，以最浅的可能的角度，接近受试者(例如，小鼠)的皮肤，且拉紧皮肤。然后，经5-10秒，缓慢地推进注射体积，形成典型的“水泡(bleb)”，随后缓慢地移出针头。优选地，仅仅使用一个注射位点。更优选地，注射体积不超过100μL，这部分地由于下述事实，即较大的注射体积可能增加向周围组织空间(例如，皮下空间)的溢出。
本发明包括使用所有已知类型的常规的注射针头、导管或显微针，其单独地或以多针阵列使用。在优选的实施方案中，针阵列用于将较大的体积输送到皮内隔室。例如可以经几个位点同时地分开较大的注射体积，例如500μL，从而允许导入更大的体积，而不超过皮内隔室。如本文使用的，术语″针″和″针头″意在包括所有这样的针状结构。如本文使用的，术语“显微针”意在包括小于约30号的结构，当这样的结构在性质上是圆柱形时，通常为约31-50号。因此，由术语显微针所包括的非圆柱形结构具有相当的直径，且包括棱锥体形的、矩形的、八角形的、楔形的和其它的几何形状。
本发明的免疫原性组合物的皮内输送可以使用弹道流体注射装置，粉末喷射输送装置，压电的、电动的、电磁的辅助输送装置，气体-辅助的输送装置，其能直接穿透皮肤以将本发明的疫苗制剂直接输送到皮肤空间内的靶位置。
本发明的免疫原性组合物靶向皮内空间的实际方法不是至关重要的，只要它能穿透受试者的皮肤达到皮内空间内的所需要的目标深度，而不透过它。实际的最佳穿透深度随受试者皮肤的厚度而变。在大多数情况下，穿透皮肤到约0.5-2mm的深度。无论具体的皮内装置和输送方法如何，皮内输送优选地将本发明的免疫原性组合物靶向至至少0.3mm、更优选至少0.5mm的深度，到不超过2.0mm、更优选不超过1.7mm的深度。
在某些情况下，将免疫原性组合物输送到刚好在角质层下且包括表皮和上部真皮的目标深度，例如约0.025mm至约2.5mm。为了靶向皮肤内的特定细胞，优选的靶深度取决于被靶向的特定细胞和特定受试者的皮肤厚度。例如，为了靶向人皮肤的皮肤空间中的朗氏细胞，输送需要至少部分地包括通常为约0.025mm至约0.2mm的人表皮组织深度。
在免疫原性组合物需要全身循环的情况下，优选的靶深度是至少约0.4mm、和最优选地至少约0.5mm，至不超过约2.5mm、更优选地不超过约2.0mm、和最优选地不超过约1.7mm的深度。
用于实现本发明的皮内施用方法包括向受试者，优选哺乳动物，最优选人，推注和灌注输送免疫原性组合物。推注剂量是经相对较短的时间段，通常小于约10分钟，在单个体积单位中输送的单剂量。灌注施用包括，经相对更长的时间段，通常大于约10分钟，以恒定的或变化的选定的速度施用流体。
免疫原性组合物向皮内空间中的皮内输送，可以被动地进行，无需向待输送的疫苗制剂施加外部压力或其它的驱动手段，和/或主动地进行，施加压力或其它驱动手段。优选的压力产生手段的实例包括泵，注射器，弹性体膜，气体压力，压电的、电动的、电磁的泵吸，或盘形弹簧或垫圈或其组合。如果需要，通过压力产生手段，可以变化地控制本发明的免疫原性组合物的输送速度。
根据本发明输送或施用的免疫原性组合物包括其在药学上可接受的稀释剂或溶剂中的溶液，悬浮液，凝胶，悬浮的或分散的微粒，例如微米和纳米颗粒，以及它们的原位形成的载体。
本发明也包括改变本发明的免疫原性组合物的目标输送深度。操作人员可以手工地控制免疫原性组合物的目标输送深度，用或不用指示器辅助以指示何时达到需要的深度。但是，优选地，根据本发明使用的装置具有用于控制皮肤穿透到皮内空间中的需要深度的结构工具。使用1999年10月14日提交的美国专利申请号09/417,671；2000年6月29日提交的09/606,909；2001年6月29日提交的09/893,746；2001年12月28日提交的10/028,989；2001年12月28日提交的10/028,988；或2001年4月18日公布的国际公开号EP 10922 444；2002年1月10日公布的WO 01/02178；和2002年1月10日公布的WO 02/02179(它们都在这里整体引作参考)所述的方法中的任一种，可以改变目标输送深度。
本发明的免疫原性组合物的剂量取决于组合物中的抗原性或免疫原性试剂。使用本领域已知的标准的免疫学方法，例如通过首先鉴定能有效地引起预防或治疗性免疫反应的剂量，例如，通过测量相对于对照制剂(例如，仅由抗原性或免疫原性试剂组成的制剂，其没有本文公开的赋形剂)的抗原特异性的免疫球蛋白的血清滴度，可以确定免疫原性组合物的剂量。优选地，在用于人之前，在动物模型中确定有效剂量。最优选地，在其皮肤厚度非常接近人皮肤的动物(例如，猪)中，确定最佳剂量。
也可以按照给药时间表施用本发明的免疫原性组合物，例如，最初施用免疫原性组合物，随后进行加强施用。在某些情况下，在初次施用后大概2周至1年、优选1-6个月中的任意时间，施用第二剂免疫原性组合物。另外，可以在第二次给药后，和在初次施用后3个月至2年或更长，优选4 6个月，或6个月至1年，施用第三次。在某些情况下，不需要加强免疫。
5.3.2表皮施用表皮施用方法包括本领域已知的用于准确靶向表皮隔室的任何方法和装置，例如分别在2001年10月29日、2001年11月27日、2000年5月22日和2002年10月29日提交的美国临时专利申请号60/330,713,60/333,162和美国申请系列号09/576,643，美国申请系列号10/282,231中公开的那些，它们都在这里整体引作参考。本发明包括用于准确地靶向表皮空间的微磨蚀装置。这些装置可以具有实心的或中空的微突起。微突起可以具有高达约500微米的长度。合适的微突起具有约50至500微米的长度。优选地，微突起具有约50至300微米的长度，更优选地在约150至250微米的范围内，180-220微米是最优选的。
可以在本发明的方法中使用的微磨蚀器装置优选地是能磨蚀皮肤的装置，例如在图15-20中示例的那些。在优选的实施方案中，该装置能磨蚀皮肤，从而穿透角质层而不刺穿角质层。
在此使用时，“穿透”指进入角质层，且未完全地穿过角质层并进入相邻层。这并不是说，不能完全穿透角质层而显示皮肤的下层的界面。另一方面，刺穿指完全穿过角质层，并进入角质层下的相邻层。在此使用时，术语″磨蚀″指去除至少一部分角质层，以增加皮肤的渗透性，而不造成多余的皮肤刺激，或损害对感染因子的皮肤屏障。在此使用时，术语″磨蚀过程″指破坏皮肤的外层，例如通过刮削或摩擦，产生受损的角质层区域。这与“穿孔”不同，后者能产生透过角质层的离散孔，孔之间是未破坏的角质层区域。
优选地，根据本发明的方法用于表皮输送的装置能穿透而不刺穿角质层。在磨蚀前、磨蚀的同时或磨蚀后，可以将待使用本发明的方法进行施用的组合物应用到皮肤上。
在一个具体的实施方案中，本发明包括将免疫原性组合物输送进患者皮肤的方法，其包括以下步骤用制剂涂布患者的外皮层或微磨蚀器2(见图15B)，并使微磨蚀器2沿着患者皮肤移动以提供磨蚀，产生足以允许制剂进入患者的活表皮的凹痕。由于微磨蚀器2的结构设计，微磨蚀器2的前缘首先伸展患者的皮肤，然后微磨蚀器2的顶部表面磨蚀外部保护性皮肤层以使制剂进入患者。初步磨蚀外部保护性皮肤层后，微磨蚀器2的后缘和前缘可以摩擦经磨蚀的区域的表面，使制剂进入经磨蚀的皮肤区域，从而提高它的医学效果。如图15B、16A和16B所示，微磨蚀器2包含基板4，其上面可以安装磨蚀表面5。或者，磨蚀表面可以与基板构成整体，并制造成单一的2组分部件。优选地，基板4是实心的模铸件。在一个实施方案中，基板4具有蘑菇样的冠4b，其向上弯曲，且在顶部截短。基板4的顶部通常是平坦的，磨蚀表面5安装在其上面，或者与其构成整体。或者，截短的顶部可以具有用于容纳磨蚀表面5的凹进。在所有实施方案中，磨蚀表面5包含一个平台，其具有微突起阵列，该微突起阵列截短的顶部上延伸。在微磨蚀器的另一个实施方案中，手柄、基板和磨蚀表面可以彼此构成整体，且制成单一的三组分装置。通过用足够的压力使微磨蚀器2沿着受试者皮肤移动，来将微磨蚀器2应用到受试者上，以使磨蚀表面5能够打开受试者的外部保护性皮肤或角质层。施加到基板上的向内压力造成微磨蚀器2压进受试者皮肤中。因此，当使用微磨蚀器2时，倾斜的蘑菇样的冠4b的高度优选地足以阻止所应用的物质流出和流到小平面4c上。如下面将描述的，磨蚀表面5包含微突起阵列。
手柄6连接到基板4，或可以与基板4构成整体。如图16A所示，手柄的上端6a与基板4的内周侧壁4a之间可以是搭扣配合或摩擦配合。或者，如图15A和16A所示，手柄6可以粘(例如，用环氧树脂)到基板4的下侧4c。或者，手柄和基板可以制作(例如，注射模铸)到一起，成为单一的2组分部件。手柄的直径可以小于基板的直径，或可以与基板的直径类似。基板4的下侧4c可以与蘑菇样的冠4b齐平，或伸出蘑菇样的冠。手柄6的下端6b可以比手柄6的轴6c更宽，或可以与轴的直径类似。下端6b可以包括压痕6d，其用作施用物质和移动微磨蚀器2的人的拇指放置处。另外，突起8形成在手柄6的外侧，以便在将其在患者皮肤上或沿着皮肤移动时，辅助使用者牢固地抓紧手柄6。
如图16B中的图15B的剖面所示，下端6b可以是圆柱形的。微磨蚀器2可以由透明材料制成，如图16A所示。压痕6d排列在圆柱形下端6b的两侧，以辅助使用微磨蚀器2的人抓紧它。也就是说，可以由手或手指提供微磨蚀器2的运动。微磨蚀器的手柄6以及基板4优选地由塑料或类似的材料模铸成。优选地，廉价地生产微磨蚀器2，以便在一位患者上使用后，可以处置整个微磨蚀器和磨蚀表面。
将磨蚀表面5设计成，当微磨蚀器2沿着患者皮肤移动时，产生的磨蚀过程能穿透角质层。磨蚀表面5可以涂布有希望输送到患者的活表皮的制剂。
为了达到需要的磨蚀，微磨蚀器2应当在患者的皮肤上移动至少一次。可以以交替的方向来磨蚀患者的皮肤。根据本发明的微磨蚀器的结构设计，使制剂能更有效地被吸收，从而允许较少的制剂施加到患者的皮肤上或涂布磨蚀表面5。磨蚀表面5可以涂布有希望输送给患者的制剂。在一个实施方案中，制剂可以是置于磨蚀表面5上的粉末。在另一个实施方案中，可以在将微磨蚀器2施加到患者的皮肤上并移动之前，将待输送的制剂直接施加到患者的皮肤上。
参考图17，本发明的微磨蚀器装置10包括基本上平面的主体或磨蚀表面支持物12，后者具有许多从支持物的底表面伸出的微突起14。支持物通常具有足以允许表面附着到微磨蚀器装置的基板上、从而允许容易地操纵装置的厚度，如图15B、16A和16B所示。或者，可以将不同的手柄或抓紧装置连接到磨蚀表面支持物12的顶部表面上，或与后者构成整体。磨蚀表面支持物12的尺寸可以随微突起的长度、在给定区域中的微突起的数目和要施用给患者的制剂的量而变。通常，磨蚀表面支持物12具有约1-4cm2的表面积。在优选的实施方案中，磨蚀表面支持物12具有约1cm2的表面积。
如图17、18A和B和19所示，微突起14从磨蚀表面支持物12的表面伸出，且基本上与磨蚀表面支持物12的平面垂直。在图示说明的实施方案中的微突起以许多行和列的形式排列，且优选地间隔均匀的距离。微突起14具有通常的棱锥体形状，侧面16延伸到顶端18。当从剖面观看时，所示的侧面16具有通常为凹形的轮廓，且形成从磨蚀表面支持物12延伸至顶端18的弯曲表面。在图示说明的实施方案中，微突起由4个基本上相同形状和大小的侧面16形成。如图18B和19所示，微突起14的每个侧面16具有与相邻侧面连接的相对的侧缘，并形成从磨蚀表面支持物12向外延伸的刮削边22。刮削边22定义了通常为三角形或梯形的刮削表面，其与侧面16的形状相对应。在其它的实施方案中，可以用更少或更多的侧面形成微突起14。
优选地，微突起14在钝顶端18终止。通常，顶端18是基本上平的，且与支持物14平行。当顶端是平的时，微突起的总长度不能穿透皮肤；因而，微突起的长度大于所述微突起穿透所述皮肤的总深度。顶端18优选地形成边界明确的锐边20，它在此边缘处与侧面16相接。边缘20基本上与磨蚀表面支持物12平行地延伸，并定义了另一个刮削边缘。在其它的实施方案中，边缘20可以稍圆，形成从侧面16到顶端18的平滑过渡。优选地，微突起是截头圆锥体的或截头棱锥体的形状。
微磨蚀器装置10和微突起可以由与待施用的物质不反应的塑料制成。合适的塑料的非包括性的列表包括，例如，本领域已知的聚乙烯，聚丙烯，聚酰胺，聚苯乙烯，聚酯，和聚碳酸酯。或者，微突起可以由金属制成，例如不锈钢，钨钢，镍合金，钼，铬，钴，钛，和其合金，或其它材料例如硅，陶瓷和玻璃聚合物。如本领域已知的，使用类似于硅片的照相平版印刷蚀刻术的各种技术，或者使用采用金刚石缀尖的磨机的显微机械加工，可以生产金属微突起。使用本领域已知的标准技术，通过硅片的照相平版印刷蚀刻术，也可以生产微突起。通过注射模铸工艺，例如这里引作参考的2002年7月12日提交的美国申请系列号10/193,317所述，也可以用塑料生产它们。
基于待施用的具体物质和装置要应用的位置的角质层的厚度，选择微突起的长度和厚度。优选地，微突起能穿透角质层，而基本上不刺穿或穿过角质层。微突起可以具有至多约500微米的长度。合适的微突起具有约50至500微米的长度。优选地，微突起具有约50至约300微米的长度，更优选在约150至250微米的范围内，180-220微米是最优选的。在举例说明的实施方案中的微突起具有通常为棱锥体形的形状，且与装置的平面垂直。这些形状具有确保在需要的深度发生磨蚀的特别的优点。在优选的实施方案中，微突起是实心成员。在替代实施方案中，微突起可以是中空的。
如图16和18所示，微突起优选地以均匀间隔的行和列排列，形成在磨蚀过程中接触皮肤和穿透角质层的阵列。微突起之间的间隔可以随施用到皮肤表面或皮肤组织内的物质而变。通常，以一定距离排列微突起的行，以提供每毫米(mm)约2-约10个的密度。通常，以基本上等于阵列中的微突起的间隔的距离，排列行或列，以提供每mm2约4-约100个微突起的微突起密度。在另一个实施方案中，微突起可以排列成圆形图案。在另一个实施方案中，微突起可以排列成随机图案。当以列和行排列时，微突起的中心之间的距离优选地是微突起长度的至少2倍。在一个优选的实施方案中，微突起的中心之间的距离是微突起长度(110微米)的2倍。也包括更宽的间隔，高达微突起长度的3、4、5和更多倍。另外，如上所述，微突起的构型可以是这样的，即微突起的高度可以大于这些突起会穿透的皮肤深度。截头圆锥体形的或截头棱锥体形的微突起的平坦上表面通常宽10-100、优选30-70和最优选35-50微米。
制备皮肤上的输送位点的方法，将微磨蚀器置于在所需位置的患者皮肤28上。将微磨蚀器轻压到皮肤上，然后在皮肤上或沿皮肤移动。微磨蚀器冲程长度可以随需要的输送位点大小(由需要的输送区域定义)而变。选择输送位点的面积，以达到想要的结果，且可以随待输送的物质和其形式而变。例如，输送位点可以覆盖大区域以用于治疗皮疹或皮肤病。通常，将微磨蚀器移动约2-15厘米(cm)。在本发明的一些实施方案中，移动微磨蚀器，产生具有约4cm2-约300cm2的表面积的经磨蚀的位点。
然后，从皮肤抬起微磨蚀器，暴露经磨蚀的区域，并可以将合适的输送装置、贴剂或局部制剂应用到经磨蚀的区域。或者，可以在磨蚀之前或同时，将待施用的物质施加到皮肤表面。
在角质层上的磨蚀程度取决于在移动过程中施加的压力和微磨蚀器的重复次数。在一个实施方案中，在完成第一次移动后，从皮肤上抬起微磨蚀器，并以基本上相同的地方和位置，放回起始位置。然后，微磨蚀器以相同的方向和相同的距离移动第二次。在另一个实施方案中，微磨蚀器以交替的方向，重复移动经过相同的位点，在完成第一次移动后不从皮肤上抬起。通常，使用微磨蚀器移动2次或更多次。
在其它的实施方案中，微磨蚀器可以仅仅以同一方向，以网格样的图案、圆形图案或一些其它的图案，来回撞击足以磨蚀角质层至能增强所需物质的输送的合适深度的时间。微磨蚀器在皮肤28上的一个方向的线性移动，会去除一些组织，形成槽26，其被基本上与每行微突起相对应的在皮肤28中的峰27分开，如图16所示。微突起的边缘20、22和钝顶端18能提供刮削或磨蚀作用，以去除一部分角质层，在皮肤中形成槽或凹痕，而不是简单的切割作用。微突起14的钝头18的边缘20能刮削和去除槽26底部的一些组织，并使它们保持开口，从而允许物质进入槽中，以便由身体吸收。优选地，微突起14的长度足以穿透角质层和形成槽26，槽26的深度足以允许施加到经磨蚀的区域的物质的吸收，而不引起患者的疼痛或不必要的不适。优选地，槽26不会刺穿角质层，但是可以在其中延伸。棱锥体形状的微突起14的边缘22形成刮削边，其从磨蚀表面支持物12延伸到顶端18。邻近磨蚀表面支持物12的边缘22形成微突起之间的刮削表面，其能刮削和磨蚀由槽26之间的皮肤形成的峰27。在槽之间形成的峰27通常被轻微地磨蚀。
在本发明的方法中，可以使用本领域已知的用于通过磨蚀破坏角质层的任何装置。它们包括例如，具有短显微针或微突起的阵列的微机电(MEMS)装置、砂纸样装置、刮刀等。本发明的表皮疫苗制剂靶向表皮空间的实际方法不是至关重要的，只要它能穿透受试者的皮肤达到需要的目标深度。在此讨论的微磨蚀器最初将本发明的制剂存放在0.0-0.025mm的皮肤深度，优选地不超过角质层。
5.4治疗功效的测定本发明包括使用本领域已知的或本文所述的标准方法，测定本发明的免疫原性组合物的功效的方法。用于确定本发明的免疫原性组合物的功效的测定法，可以是基于体外的测定法或基于体内的测定法，包括基于动物的测定法。在有些实施方案中，本发明包括检测和/或定量从已经施用了本发明的免疫原性组合物的受试者得到的样品(例如，血清或粘膜洗液)中的针对本发明组合物的抗原性或免疫原性试剂的体液免疫反应。优选地，将本发明的免疫原性组合物的体液免疫反应与在施用本发明的制剂前或在已经给个体施用对照制剂(例如，仅仅包含抗原性或免疫原性试剂的制剂)后从相同受试者得到的对照样品相比较。
本发明的方法提供了基本原理和准则，由此可以确定将免疫原性组合物输送到皮肤隔室(包括表皮和皮内隔室)的最佳参数，其中与使用常规输送方式(包括肌肉内的和皮下的输送)来输送相同制剂时相比，赋形剂具有最佳的佐剂性质，且本发明的制剂具有增强的功效。本发明提供了方法，其中本发明的制剂已经被筛选成具有用于输送到皮内隔室的最佳深度的最佳浓度范围，从而它们具有佐剂性质，产生一种或多种下述的性质最小至没有皮肤刺激，如通过可视方法例如Draize打分(关于典型的draize打分分析，见下表)，以常规的皮肤反应分析方式所测定和评价的；最小至没有溶血作用，如使用本领域已知的标准方法测定的；和增强的免疫反应，如通过增强的血清转化和/或增强的抗体滴度测量的。
表ADraize打分
在有些实施方案中，本发明包括检测和/或定量从已经施用了本发明的免疫原性组合物的受试者得到的样品(例如，血清)中的针对本发明免疫原性组合物的抗原性或免疫原性试剂的体液免疫反应。将本发明的免疫原性组合物的体液免疫反应与从施用了对照制剂(例如，仅仅包含抗原性或免疫原性试剂的制剂)的相同受试者得到的对照样品相比较。
用于测量体液免疫反应的测定法是本领域众所周知的，例如，见，Coligan等，(编)，1997，Current Protocols in Immunology，JohnWiley and Sons，Inc.Section 2.1。使用本领域已知的标准方法，包括但不限于ELISA测定法，可以检测和/或定量体液免疫反应。通过检测和/或定量能特异性地识别已经用本发明的免疫原性组合物治疗的受试者血清中的抗原性或免疫原性试剂的抗体相对于未治疗的受试者中的抗体量的相对量，可以测量体液免疫反应。ELISA测定法可以用于测定从用本发明组合物治疗的受试者得到的样品中的总抗体滴度。在其它实施方案中，使用本领域已知的方法，可以使用ELISA测定法来测定对于中和表位的特异的抗体同种型和抗体的水平。
基于ELISA的测定法包括制备抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，添加含有抗原特异性抗体的测试和对照样品，添加与酶(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)缀合的对测试和对照样品中的抗体特异的检测抗体，并孵育一段时间，用产色底物检测抗原的存在。本领域的技术人员能认识到那些可以修改从而增强检测到的信号的参数以及本领域已知的ELISA的其它变量。关于ELISA的进一步讨论，见，例如，Ausubel等，编，1994，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，在11.2.1.
在免疫原性组合物包含流感抗原的情况下，用于检测和/或定量针对流感抗原的抗体反应的本领域已知的任何方法，都包含在本发明的方法中。用于检测针对流感抗原的抗体反应的一个示例性的方法可以包括用流感抗原包被微量滴定板(Nunc平板)；将来自用本发明的流感疫苗制剂处理的受试者的血清加入平板；将抗血清(含有第二抗体)加入平板，并孵育足够的时间，以允许形成复合物，即血清和抗血清中的抗体之间的复合物。然后，使用本领域的标准方法，检测复合物。关于用于测量流感特异性抗体反应的示例性测定法，见，例如，Newman等，1997，Mechanism of Aging & Development，93189-203；Katz等，2000，Vaccine，182177-87；Todd等，(Brown和Haaheim，编)，1998，Modulation of the Immune Response to Vaccine Antigens，Dev.Biol.Stand.Basel，Karger，92341-51；Kendal等，1982，Concepts and Procedures for Laboratory-based InfluenzaSurveillance，AtlantaCDC，B17-35；Rowe等，1999，J.Clin.Micro.37937-43；Todd等，1997，Vaccine 15564-70；WHO CollaboratingCenters for Reference and Research on Influenza，Coneepts andProcedures for Laboratory-based Influenza Surveillance，1982，p.B-23；它们都在这里整体引作参考。
此外，当疫苗制剂包含流感抗原时，本领域已知的用于检测和/或定量具有血凝活性的抗体的水平的任何方法，都包含在本发明内。血凝抑制测定法基于流感病毒的凝集红细胞的能力和特异的HA抗体的抑制凝集的能力。本领域已知的任何血凝抑制测定法，都包含在本发明的方法中，例如公开在这里整体引作参考的Newman等，1997，Mechanism of Aging & Development，93189-203；Kendal等，1982，Concepts and Procedures for Laboratory-based InfluenzaSurveillance，AtlantaCDC，B 17-35中的那些。
一个示例性的血凝抑制测定法包括将来自用本发明的流感疫苗制剂处理的受试者的血清加入微量滴定板；将含有8个HA单位的HI-抗原制品加入平板；通过轻柔地敲打平板来均匀混合该混合物，并在4℃孵育约1小时；将红细胞悬浮液(例如，0.5％鸡红细胞)加入微量滴定板，通过轻柔地敲打平板来均匀混合这些内容物；在4℃进一步孵育平板，直到细胞对照显示出正常沉淀的扣状体(对照仅仅含有PBS)。优选地，用抑制剂(例如神经氨酸酶或高碘酸钾)处理血清样品以防止血清因子对凝集的非特异性抑制。HI滴度定义为，能完全抑制血凝的最高稀释度的血清的稀释倍数。这可以通过倾斜平板并观察以与对照细胞相同的速度流动的泪珠状细胞流来确定。
本发明包括通过测量细胞介导的免疫反应，来测定本发明的组合物的功效的方法。测量细胞介导的免疫反应的方法是本领域的技术人员已知的，且包含在本发明中。在有些实施方案中，可以测量T细胞免疫反应，以定量受试者中的免疫反应，例如，通过使用本领域的技术人员已知的普通方法，包括但不限于来自组织培养物上清液的ELISA，离体或在体外培养一段时间后的细胞的基于流式细胞术的细胞内细胞因子染色，和基于细胞因子小珠阵列流式细胞术的测定法，来测量细胞因子产生。在其它实施方案中，本发明包括使用本领域已知的普通方法，包括但不限于基于铬的释放测定法，使用已知的CTL表位的基于流式细胞术的四聚体或二聚体染色测定法，来测量T细胞特异性的反应。
5.5预防和治疗应用本发明提供了治疗和预防方法，其包括将本发明的免疫原性组合物施用给受试者，优选哺乳动物，最优选人，以治疗、控制或改善与疾病或病症有关的症状，尤其是传染性的疾病或癌症。受试者优选地是哺乳动物，例如非灵长类动物，例如，奶牛、猪、马、猫、狗、大鼠、小鼠，和灵长类动物，例如，猴例如猕猴和人。在一个优选的实施方案中，受试者是人。优选地，本发明的免疫原性组合物是疫苗组合物。
本发明包括免疫和/或刺激受试者中的免疫反应的方法，包括给受试者，优选人，皮内输送单剂量的本发明的组合物。在有些实施方案中，本发明包括一次或多次加强免疫。本发明的免疫原性组合物能特别有效地刺激和/或上调抗体反应，至大于在常规的免疫原性组合物(例如疫苗)和给药方案中观察到的水平。例如，本发明的免疫原性组合物可以引起抗体反应，包含产生一种或多种抗体类型，例如IgM，IgG，和/或IgA。最优选地，包括疫苗制剂在内的本发明的免疫原性组合物能刺激全身免疫反应，其能保护受试者免受至少一种病原体的侵害。包括疫苗组合物在内的本发明的免疫原性组合物可以提供全身的、局部的或粘膜的免疫或其组合。
5.5.1目标疾病本发明包括皮内疫苗输送系统，以治疗和/或预防受试者(优选人)中的传染病。本发明的方法可以治疗或预防的传染病是由传染因子造成的，包括但不限于，病毒，细菌，真菌，原生动物，蠕虫，和寄生物。
已经在人类中发现且可以用本发明的疫苗输送系统治疗的病毒的实例包括但不限于，反转录病毒科(例如，人免疫缺陷病毒，例如HIV-1(也称作HTLV-III，LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III；和其它分离物，例如HIV-LP)；小RNA病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒，甲型肝炎病毒；肠道病毒属，人柯萨奇病毒，鼻病毒属，艾柯病毒)；嵌杯状病毒科(Calciviridae)(例如，会造成胃肠炎的株系)；披膜病毒科(例如，马脑炎病毒，风疹病毒)；黄病毒科(例如，登革热病毒，脑炎病毒，黄热病毒)；冠状病毒科(例如，冠状病毒属)；弹状病毒科(例如，水泡性口炎病毒，狂犬病病毒)；线状病毒科(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如，流感病毒)；Bungaviridae(例如，汉坦病毒，bunga病毒，白蛉热病毒属和内罗病毒属)；沙粒病毒科(例如，出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如，呼肠孤病毒属，环状病毒属和轮状病毒属)；双RNA病毒科；嗜肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)；小DNA病毒科(小DNA病毒属)；乳头多瘤空泡病毒科(乳头状瘤病毒属，多瘤病毒属)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2，水痘带状疱疹病毒，巨细胞病毒(CMV)，疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒，痘苗病毒，痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原因子，δ肝炎的因子(认为是乙型肝炎病毒的缺陷型卫星)，非甲型、非乙型肝炎的因子(1类＝内部传递；2类＝肠胃外传递，例如，丙型肝炎；诺沃克病毒和相关病毒，和星状病毒。
能在动物和人中产生传染病且可以用本发明的输送系统和方法治疗和/或预防的反转录病毒包括简单的反转录病毒和复杂的反转录病毒。简单的反转录病毒包括B-型反转录病毒、C-型反转录病毒和D-型反转录病毒的亚群。B-型反转录病毒的一个实例是小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)。C-型反转录病毒包括下列亚群，C-型A群(包括劳斯肉瘤病毒(RSV)，禽类白血病病毒(ALV)，和禽类成髓细胞性白血病病毒(AMV))和C-型B群(包括鼠白血病病毒(MLV)，猫白血病病毒(FeLY)，鼠肉瘤病毒(MSV)，长臂猿白血病病毒(GALV)，脾坏死病毒(SNV)，网状内皮组织增殖病毒(RV)和猿猴肉瘤病毒(SSV))。D-型反转录病毒包括摩-傅猴病毒(MPMV)和猿猴反转录病毒1型(SRV-1)。复杂的反转录病毒包括慢病毒属、T-细胞白血病病毒和泡沫病毒的亚群。慢病毒属包括HIV-1，但是也包括HIV-2，SIV，绵羊髓鞘脱落病毒，猫免疫缺陷病毒(FIV)，和马传染性贫血病毒(EIAV)。T-细胞白血病病毒包括HTLV-1，HTLV-II，猿猴T-细胞白血病病毒(STLV)，和牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)，猿猴泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)。
是脊椎动物中的抗原的RNA病毒的实例包括但不限于呼肠孤病毒科的成员，包括正呼肠孤病毒属(哺乳动物和禽类反转录病毒的多种血清型)，环状病毒属(蓝舌病病毒，Eugenangee病毒，克麦罗沃(Kemerovo)病毒，非洲马瘟病毒，和科罗拉多蜱传热病毒)，轮状病毒属(人轮状病毒，内布拉斯加小牛腹泻病毒，鼠轮状病毒，猿猴轮状病毒，牛或羊轮状病毒，禽轮状病毒)；小RNA病毒科，包括肠道病毒属(脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒A和B，人类肠道致细胞病变孤儿(ECHO)病毒，甲型肝炎病毒，猿猴肠道病毒，鼠脑脊髓炎(ME)病毒，鼠脊髓灰质炎病毒，牛肠道病毒，猪肠道病毒，心病毒属(脑心肌炎病毒(EMC)，曼哥病毒)，鼻病毒属(人鼻病毒，包括至少113种亚型；其它鼻病毒)，口蹄疫病毒属(口蹄疫病毒(FMDV)；嵌杯状病毒科，包括猪水疱疹病毒，圣米格尔海狮病毒，猫小RNA病毒和诺沃克病毒；披膜病毒科，包括甲病毒属(东方马脑炎病毒，塞姆利基森林病毒，新培斯病毒，基孔贡亚病毒，奥尼永尼永病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒)，黄病毒属(蚊传黄热病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，圣路易脑炎病毒，墨累山谷脑炎病毒，西尼罗病毒，库京(Kunjin)病毒，中欧蜱传病毒，远东蜱传病毒，库阿撒鲁尔森林病毒，跳跃III病毒，玻瓦散病毒，鄂木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪瘟病毒，边界病病毒)；布尼病毒科，包括布尼病毒属(布尼奥罗病毒和相关病毒，加利福尼亚脑炎组病毒)，白蛉热病毒属(白蛉热西西里岛病毒，立夫特山谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕绵羊病病毒)，和乌库病毒属(吴孔尼米蜱传病毒和相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(流感病毒A型，许多人亚型)；猪流感病毒，和禽和马流感病毒；流感B型(许多人亚型)，和流感C型(可能是分开的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(副流感病毒1型，仙台病毒，致血细胞吸附病毒，副流感病毒2-5型，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，犬瘟病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠的肺病毒)；森林病毒，新培斯病毒，基孔贡亚病毒，奥尼永尼永病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒)，黄病毒属(蚊传黄热病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，圣路易脑炎病毒，墨累山谷脑炎病毒，西尼罗病毒，库京病毒，中欧蜱传病毒，远东蜱传病毒，库阿撒鲁尔森林病毒，跳跃III病毒，玻瓦散病毒，鄂木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪瘟病毒，边界病病毒)；布尼病毒科，包括布尼病毒属(布尼奥罗病毒和相关病毒，加利福尼亚脑炎组病毒)，白蛉热病毒属(白蛉热西西里岛病毒，立夫特山谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕绵羊病病毒)，和乌库病毒属(吴孔尼米蜱传病毒和相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(流感病毒A型，许多人亚型)；猪流感病毒，和禽和马流感病毒；流感B型(许多人亚型)，和流感C型(可能是分开的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(副流感病毒1型，仙台病毒，致血细胞吸附病毒，副流感病毒2-5型，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，犬瘟病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠的肺病毒)；弹状病毒科，包括水泡病毒属(VSV)，钱德普病毒，Flanders-Hart Park病毒)，狂犬病病毒属(狂犬病病毒)，鱼弹状病毒，和2种可能的弹状病毒(马堡病毒和埃博拉病毒)；沙粒病毒科，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)，Tacaribe病毒复合物，和拉萨病毒；冠状病毒科，包括传染性支气管炎病毒(IBV)，小鼠肝炎病毒，人肠道冠状病毒，和猫传染性腹膜炎(猫冠状病毒)。
是脊椎动物中的抗原的示例性DNA病毒包括但不限于痘病毒科，包括正痘病毒属(大天花，类天花，猴痘痘苗，牛痘，水牛痘，兔痘，缺肢畸形)，野兔痘病毒属(粘液瘤，纤维瘤)，禽痘病毒属(禽痘，其它禽痘病毒)，山羊痘病毒属(绵羊痘，山羊痘)，猪痘病毒属(猪痘)，副痘病毒属(触染性postular皮炎病毒，假牛痘，牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲猪瘟病毒，蛙病毒2和3，鱼淋巴囊肿病病毒)；疱疹病毒科，包括α-疱疹病毒(单纯疱疹1和2型，水痘带状疱疹，马流产病毒，马疱疹病毒2和3，假狂犬病病毒，传染性牛角膜结膜炎病毒，传染性牛鼻气管炎病毒，猫鼻气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒)，β-疱疹病毒(人巨细胞病毒以及猪、猴和啮齿动物的巨细胞病毒)；γ-疱疹病毒(EB病毒(EBV)，马立克病病毒，松鼠猴疱疹，珠猴疱疹病毒，豚鼠疱疹病毒，Lucke瘤病毒)；腺病毒科，包括哺乳动物腺病毒属(人亚群A，B，C，D，E和未分群的；猿猴腺病毒(至少23种血清型)，传染性犬肝炎，和牛、猪、绵羊、蛙和许多其它物种的腺病毒)，禽腺病毒属(禽腺病毒)；和不可培养的腺病毒；Papoviridae科，包括乳头状瘤病毒属(人乳头状瘤病毒，牛乳头状瘤病毒，兔乳头状瘤病毒，和其它物种的各种病原性乳头状瘤病毒)，多瘤病毒属(多瘤病毒，猿猴空泡形成因子(SV-40)，兔空泡形成因子(RKV)，K病毒，BK病毒，JC病毒，和其它灵长类动物多瘤病毒例如淋巴营养性乳头状瘤病毒)；小DNA病毒科包括腺伴随病毒属，小DNA病毒属(猫泛白细胞减少症病毒，牛细小病毒，犬细小病毒，水貂阿留申病病毒，等)。最后，DNA病毒可以包含不能归入上述科的病毒，例如库鲁病和Creutzfeldt-Jacob病病毒和慢性传染性神经病因子。
可以通过本发明的方法治疗或预防的细菌感染或疾病是由细菌造成的，包括但不限于，在它的生命周期中具有细胞内阶段的细菌，例如分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis)，牛分枝杆菌(M.bovis)，鸟分枝杆菌(M.avium)，或非洲分枝杆菌(M.africanum))，立克次氏体，支原体，衣原体，和军团菌。所考虑的细菌感染的其它实例包括但不限于革兰氏阳性芽孢杆菌(例如李斯忒氏菌属(Listeria)，芽孢杆菌属(Bacillus)例如炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)，丹毒丝菌属(Erysipelothrix))造成的感染，革兰氏阴性芽孢杆菌(例如，巴尔通氏体属(Bartonella)，布鲁氏菌属(Brucella)，弯曲杆菌属(Campylobacter)，肠杆菌属(Enterobacter)，埃希氏菌属(Escherichia)，弗朗西丝氏菌属(Francisella)，嗜血菌属(Hemophilus)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，摩根氏菌属(Morganella)，变形菌属(Proteus)，普罗威登斯菌属(Providencia)，假单胞菌属(Pseudomonas)，沙门氏菌属(Salmonella)，沙雷氏菌属(Serratia)，志贺氏菌属(Shigella)，弧菌属(Vibrio)，和耶尔森氏菌属(Yersinia))，螺旋体细菌(例如，疏螺旋体属(Borrelia)，包括会造成莱姆病的布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))，厌氧细菌(例如，放线菌属(Actinomyces)和梭菌属(Clostridium))，革兰氏阳性和阴性的球菌，肠球菌属(Enterococcus)，链球菌属(Streptococcus)，肺炎球菌属(Pneumococcus)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，奈瑟氏球菌属(Neisseria)。传染性细菌的具体实例包括但不限于幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)，布氏疏螺旋体，嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)，结核分枝杆菌，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)，戈登分枝杆菌(M.gordonae)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，单核细胞增生李斯忒氏菌(Listeria monocytogenes)，化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(A群链球菌)，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B群链球菌)，绿色链球菌(Streptococcus viridans)，粪链球菌(Streptococcus faecalis)，牛链球菌(Streptococcus bovis)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)，炭疽芽孢杆菌，白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)，红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringers)，破伤风梭菌(Clostridiumtetani)，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)，具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)，念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)，苍白密螺旋体(Treponemapallidium)，极细密螺旋体(Treponema pertenue)，钩端螺旋体属(Leptospira)，立克次氏体属(Rickettsia)，和衣氏放线菌(Actinomyces israelli)。
可以通过本发明的方法治疗或预防的真菌疾病包括但不限于曲霉病(aspergilliosis)，隐球菌病，孢子丝菌病，球孢子菌病，副球孢子菌病，组织胞浆菌病，芽生菌病，接合菌病，和念珠菌病。
可以通过本发明的方法治疗或预防的寄生物病包括但不限于阿米巴病(amebiasis)，疟疾，利什曼原虫，球虫类，贾第虫病，隐孢子虫病，弓形体病，和锥虫病。也包括各种蠕虫引起的感染，例如但不限于蛔虫病，钩虫病，鞭虫病，类圆线虫病，弓蛔虫病(toxoccariasis)，旋毛虫病，盘尾丝虫病，丝虫，和恶丝虫病。也包括各种吸虫引起的感染，例如但不限于血吸虫病，肺吸虫病，和支睾吸虫病。基于它们是细胞内的还是细胞外的，可以将能造成这些疾病的寄生物分类。如本文所使用的，″细胞内的寄生物″是其整个生命周期都在细胞内的寄生物。人细胞内的寄生物的实例包括利什曼原虫属(Leishmania spp.)，疟原虫属(Plasmodiumspp.)，克鲁兹锥虫(Trypanosoma cruzi)，鼠弓浆虫(Toxoplasmagondii)，巴贝虫属(Babesia spp.)，和旋毛形线虫(Trichinellaspiralis)。如本文所使用的，″细胞外的寄生物″是其整个生命周期都在细胞外的寄生物。能感染人的细胞外的寄生物包括痢疾内变形虫(Entamoeba histolytica)，吸吮贾第虫(Giardia lamblia)，比氏肠胞虫(Enterocytozoon bieneusi)，纳氏虫属(Naegleria)和棘变形虫属(Acanthamoeba)以及大多数蠕虫。另一类寄生物定义为主要是细胞外的，但是在它们的生命周期的关键阶段具有专性的细胞内的存在。这样的寄生物在本文中称作″专性的细胞内的寄生物″。这些寄生物可以在它们生命的大部分或仅仅它们生命的小部分存在于细胞外环境中，但是它们都在它们的生命周期中具有至少一个专性的细胞内的阶段。该后一类寄生物包括罗德森锥虫(Trypanosoma rhodesiense)和冈比锥虫(Trypanosoma gambiense)，等孢子虫属(Isospora spp.)，隐孢子虫属(Cryptosporidium spp.)，艾美虫属(Eimeria spp.)，新孢子虫属(Neospora spp.)，肉孢子虫属(Sarcocystis spp.)，和血吸虫属(Schistosoma spp.)。
本发明也包括用于治疗和/或预防癌症的疫苗组合物，包括但不限于，新生物，肿瘤，转移，或特征在于失控的细胞生长的任何疾病或病症。使用本发明的疫苗组合物，可以治疗和/或预防例如但不限于与上面5.1.2部分列出的癌症和肿瘤抗原有关的癌症和肿瘤。
5.6鉴定赋形剂的筛选方法本发明还包括鉴定当输送到受试者皮肤的皮内隔室时，能增强免疫原性或抗原性试剂的免疫原性的化合物的方法。在有些实施方案中，鉴定当输送到受试者皮肤的皮内隔室时，能增强免疫原性或抗原性试剂的免疫原性的化合物的方法包括这样的化合物的稳定性测量。在一个具体的实施方案中，以不同的比例组合候选化合物或试剂和免疫原性或抗原性试剂，制备免疫原性组合物，并在实时和加速研究中，监视得到的组合物相对于单独的免疫原性或抗原性试剂的不稳定迹象。使用本领域的技术人员已知的和本文公开的方法，可以评价组合物的稳定性。
在其它的实施方案中，鉴定当输送到受试者皮肤的皮内隔室时，能增强免疫原性或抗原性试剂的免疫原性的化合物的方法包括将候选化合物输送到受试者皮肤的皮内隔室。在有些实施方案中，将候选化合物以不同的浓度输送到皮内隔室，并使用本领域的技术人员已知的标准方法，监视毒性的任何征候。然后，将在动物预实验中无助于免疫原性或抗原性试剂的降解和/或毒性的候选化合物的浓度与免疫原性或抗原性试剂相结合，并使用本文公开的和示例的方法，评价在受试者皮肤的皮内隔室中的佐剂性质。使用在5.4部分公开的任一种基于体液的或基于细胞的测定法，或本领域的技术人员已知的任何其它方法，可以测定佐剂性质。
在其它的实施方案中，为了鉴定这样的化合物，将免疫原性或抗原性试剂与候选化合物一起施用进受试者皮肤的皮内隔室；测量由施用产生的免疫反应；将没有候选化合物的相同免疫原性或抗原性试剂施用进第二个受试者(优选相同物种)的皮内隔室；使用本领域的技术人员已知的方法，测量由第二次施用产生的免疫反应；并对比第一次和第二次施用产生的免疫反应。如果第二次施用的免疫反应大于第一次施用，则将化合物表征为先导化合物，其中它具有佐剂活性。
使用本领域已知的任意方法或本文公开的方法，可以测定由施用免疫原性或抗原性试剂(有或没有候选化合物)产生的受试者中的免疫反应。用于检测免疫反应的测定法，可以是基于体外的测定法或基于体内的测定法，包括基于动物的测定法。本发明包括使用本领域的技术人员已知的标准方法和上面5.4部分所述的方法，测量基于体液的和基于细胞的免疫反应。优选地，以高通量的方式，进行本发明的筛选测定法。
在一个具体的实施方案中，鉴定能增强免疫原性或抗原性试剂的免疫原性的化合物的方法包括(a)将免疫原性组合物输送进第一个受试者的皮肤的皮内隔室，其中免疫原性组合物包含免疫原性或抗原性试剂和该化合物；(b)测量从第一个受试者的血清得到的样品中的抗体反应；(c)将免疫原性组合物输送进第二个受试者的皮肤的皮内隔室，其中免疫原性组合物包含没有该化合物的免疫原性或抗原性试剂，且其中第一个和第二个受试者是相同的物种；(d)测量从第二个受试者的血清得到的样品中的抗体反应；和(e)确定从第一个受试者得到的反应是否大于从第二个受试者得到的反应。如果从第一个受试者得到的样品中的反应大于第二个受试者，则将该化合物表征为可以用在本发明的组合物中的赋形剂。通过本发明的筛选方法鉴定出的化合物当与抗原性或免疫原性试剂共同施用到受试者皮肤的皮内隔室时，可以用于引起针对该抗原性或免疫原性试剂的增强的免疫反应。具体地，这些化合物可以用在疫苗组合物中。
在本文所述的测定法中使用的化合物可以是化合物文库的成员。在一个具体的实施方案中，化合物选自化合物的组合文库。在具体的实施方案中，化合物选自包含核酸、脂类、糖类的有机聚合物的组合文库，其中具体的非限制性的实例是杂合分子的肽，例如糖蛋白。本发明也包括非有机的文库和方法，象在WO 01/07642(其内容在本文中整体引作参考)中公开的那些，可以用于管理大量的候选化合物。在某些实施方案中，集中筛选化合物。一旦鉴定出了阳性库，则分别测试该库中的各个化合物。在某些实施方案中，库大小是至少2，至少5，至少10，至少25，至少50，至少75，至少100，至少150，至少200，至少250，或至少500种化合物。
5.7试剂盒本发明还包括试剂盒，其包含如本文所述的本发明的皮内施用装置和免疫原性组合物。在有些实施方案中，本发明还提供了药物包或试剂盒，其包含本发明的免疫原性组合物。在一个具体的实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含一个或多个装有一种或多种本发明的免疫原性组合物组分(例如抗原性或免疫原性试剂、赋形剂)的容器。在另一个实施方案中，预填充的容器还包含皮内输送装置。在另一个具体的实施方案中，试剂盒包含2个容器，一个含有抗原性或免疫原性试剂，另一个含有赋形剂。这样的容器可以伴有由规范药品或生物产品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的公告，该公告反映了由的生产、使用或销售的管理机构对于人类施用所作出的批准。
6.实施例下面的非限制性的实施例解释了本发明的方面。
6.1施用FLUZONETM引起的免疫反应6.1.1FLUZONETM接种物的制备在制备各种制剂之前，检查所有赋形剂储液的pH为中性pH，即，7.0-7.4。如果需要，使用稀HCl或NaOH，调节溶液的pH至中性。通过0.2微米Gelman Acrodisc PF注射器过滤器#4187，无菌过滤所有赋形剂储液。
对于鼠科动物研究，通过添加175μL Aventis FluzoneTMYR 02/03和表1所示的终浓度的赋形剂，来制备接种物。使用Hanks缓冲盐水溶液(HBSS)，使终体积到700μL。通过向175μL FluzoneTM添加HBSS，达到700μL终体积，来制备对照接种物。使用100μL制备的接种物，接种每只动物。对于非免疫对照，在免疫前从动物预抽血。当每只小鼠接受25μl市售疫苗/接种物体积时，豚鼠接受50μl，大鼠接受10μl和100μl体积的市售疫苗/总接种物体积。
表1.在FLUZONE接种物中使用的赋形剂的一些浓度(免疫原性和组织相容性试验)
6.1.2施用在制备后1小时内，将接种物注射进Balb/c小鼠。从CharlesRiver Laboratories得到用于接种的4-8周龄的小鼠。在即将注射前，使用Conair电动剃须刀，将小鼠干燥剃毛。在接种前约15分钟，每只小鼠接受腹膜内注射氯胺酮/赛拉嗪/乙酰丙嗪混合物，进行镇静。下至中的背部用于注射。大鼠是Brown Norway品系，豚鼠是Hartley品系。二者通常为200g和更大。
将每种鼠接种物抽入1mL无胶乳的注射器(BD目录309628)，其固定有20G针(BD目录305179)。装载注射器后，将20G针替换为用于皮内(ID)施用的30G针。最初使用ID施用的Mantoux方法，从而拉紧皮肤，斜面朝上，以最浅的可能的角度，将针接近。经5-10秒，缓慢地推进注射体积，形成典型的“水泡”，随后缓慢地移出针。为了防止接种物溢出到周围组织空间，仅仅使用一个注射位点，且每个位点的注射体积保持在100μL。在后面的研究中，有时增加注射体积。在更大的啮齿动物研究中，动物接受更大的总接种物体积，以允许更高的市售疫苗百分比，但是，每个位点的注射体积不超过100μL。在后面的鼠科动物研究中，使用更有效的使用1.0mm×34g针的ID输送，每个位点的最大注射体积是50μl。还使用1.0mm×34g针进行豚鼠和大鼠施用，最大注射位点体积是50μl。对于所有的研究，仅仅进行一次免疫。21天后，进行单次测试抽血。在施用后立即、接种后24小时、和当3周后收集血样时，监视动物的局部和全身的毒性征候。在具有1.0-3mm输送范围的小鼠、大鼠、豚鼠和猪中，监视施用位点毒性。在动物中没有观察到局部的或全身的毒性迹象。
6.1.3ELISA测定法通过用流感抗原(纯化的/灭活的流感APR834，2mg/mL，获自Charles River SPAFAS，或者来自Biodesign Inc.的New Caledonia，Panama，或B-Hong Kong裂解物)包被微量滴定板(具有MaxiSorp表面的96-孔Nunc Immuno-Plate)，测量对FluzoneTM的抗体反应。包被溶液是在碳酸盐缓冲液(Sigma Chemical Co.目录C3041)中的约3.8μg/mL流感蛋白质。在37℃，将包被抗原暴露于Nunc平板1小时。抛弃包被溶液，并替换为封闭溶液(含有吐温20的磷酸盐缓冲盐水(PBS-TW20)；Sigma Chemical Co.目录P-3563)和5％w/v脱脂奶粉。在37℃，将封闭溶液暴露于平板表面2小时。随后，抛弃封闭溶液。
用PBS-TW20洗涤平板表面2次，加入来自对照组的血清。可以单个地或集中地测定来自特定组中的所有动物的血清。
将初始抗体在包被且封闭的平板上孵育1小时，此后用PBS-TW20洗涤平板3次。加入抗小鼠辣根过氧化物酶缀合物库的混合物，其由Sigma A4416，Southern Biotech 1090-05，Southern Biotech 1070-05，Southern Biotech 1080-05和Southern Biotech 1100-05组成。在最终的混合物中，所有缀合物都以1∶15,000稀释度存在。在37℃，将辣根过氧化物酶第二抗体混合物在平板上孵育1小时。然后，用PBS-TW20洗涤平板3次。
为了显色，加入Sigma T-8665(一种TMB底物)，在黑暗中显色30分钟。通过加入0.5摩尔硫酸，终止显色，在TECAN SUNRISE平板阅读仪上，在450nm阅读平板。
6.1.4结果如图1-5，21，23，26，28，31和32所示，与含有单独的FluzoneTM的接种物或非免疫对照(预抽血)相比，含有本文列出的任一种赋形剂的接种物能产生更大的免疫反应。该结果清楚地表明，当与抗原性或免疫原性试剂一起施用进受试者的皮内隔室时，这些赋形剂可以作为佐剂。
6.2施用包含编码FLU血凝素的序列的质粒DNA引起的免疫反应6.2.1接种物的制备在制备各种制剂之前，检查所有赋形剂储液的pH为中性pH，即，7.0-7.4。如果需要，使用稀HCl或NaOH，调节溶液的pH至中性。通过0.2微米Gelman Acrodisc PF注射器过滤器#4187，无菌过滤所有赋形剂储液。
通过添加350μg包含能编码flu血凝素的序列的质粒DNA(pDNA-HA)和如表2所示的终浓度的赋形剂，来制备接种物。使用HBSS，使终体积到700μL。通过向350μg pDNA-HA添HBSS，达到700μL终体积，来制备对照接种物。使用100μL制备的接种物，接种每只动物。对于非免疫对照，在免疫前从动物取血样(预抽血)。仅仅在Balb/c小鼠中，进行pDNA免疫原研究。
表2.在用于DNA免疫原研究的接种物中使用的赋形剂的一些浓度
6.2.2施用在制备后1小时内，将接种物注射进Balb/c小鼠。从CharlesRiver Laboratories得到用于接种的4-8周龄的小鼠。在即将注射前，使用Conair电动剃须刀，将小鼠干燥剃毛。在接种前约15分钟，每只小鼠接受腹膜内注射氯胺酮/赛拉嗪/乙酰丙嗪混合物，进行镇静。下至中的背部用于注射。
将每种接种物抽入1mL无胶乳的注射器(BD目录309628)，其固定有20G针(BD目录305179)。装载注射器后，将20G针替换为用于皮内(ID)施用的30G针。使用ID施用的Mantoux方法，从而拉紧皮肤，斜面朝上，以最浅的可能的角度，将针接近。经5-10秒，缓慢地推进注射体积，形成典型的“水疱”，随后缓慢地移出针。为了防止接种物溢出到周围组织空间，仅仅使用一个注射位点，注射体积保持在100μL。
分别在第一次(最初)施用后立即、最初接种后24小时、分别在第21天施用和收集的加强和首次测试抽血后24小时，监视动物的局部和全身的毒性征候。在加强后3周，第42天，当进行第二次和最后一次测试抽血时，再次监视动物。在动物中没有观察到局部的或全身的毒性迹象。
6.2.3用于DNA免疫原研究的ELISA测定法通过用流感抗原(纯化的/灭活的流感APR834，2mg/mL，获自Charles River SPAFAS)包被微量滴定板(具有MaxiSorp表面的96-孔Nunc Immuno-Plate)，测量对包含pDNA-HA的各种接种物的抗体反应。包被溶液是在碳酸盐缓冲液(Sigma Chemical Co.目录C3041)中的3.8μg/mL流感蛋白。在37℃，将包被抗原暴露于Nunc平板1小时。抛弃包被溶液，并替换为封闭溶液(PBS-TW20)和5％w/v脱脂奶粉。在37℃，将封闭溶液暴露于平板表面2小时。随后，抛弃封闭溶液。
用PBS-TW20洗涤平板表面2次，加入来自测试/对照组的血清。合并来自特定组中的所有小鼠的血清。在1∶123和1∶370稀释度，测定合并的血清。
将初始抗体在包被且封闭的平板上孵育1小时，此后用PBS-TW20洗涤平板3次。加入抗小鼠辣根过氧化物酶缀合物库的混合物，其由Sigma A4416，Southern Biotech 1090-05，Southern Biotech 1070-05，Southern Biotech 1080-05和Southern Biotech 1100-05组成。在最终的混合物中，所有缀合物都以1∶15,000稀释度存在。在37℃，将辣根过氧化物酶第二抗体混合物在平板上孵育1小时。然后，用PBS-TW20洗涤平板3次。
为了显色，加入Sigma T-8665(一种TMB底物)，在黑暗中显色30分钟。通过加入0.5摩尔硫酸，终止显色，在TECAN SUNRISE平板阅读仪上，在450nm阅读平板。
6.2.4结果如图6-11所示，与含有单独的pDNA-HA的接种物或非免疫对照(预抽血)相比，含有本文列出的任一种赋形剂的所有接种物能在动物中引起增强的免疫反应。这些结果清楚地表明，当与抗原性或免疫原性试剂一起施用进皮内隔室时，这些赋形剂可以作为佐剂。在分析首次测试抽血后，将一些试剂标记为具有佐剂活性，且在分析第二次测试抽血后，标记其它试剂。
6.3在小鼠中进行的寻找初始范围的研究使用基本上等同于上面的6.1.1-2部分所述的方法，制备了含有FluzoneTM和各种赋形剂的接种物，并皮内地施用进动物中。以能使每种接种物含有不同量的FluzoneTM和赋形剂的方式，制备接种物。使用基本上等同于上面的6.1.3部分所述的方法，测量免疫反应。结果显示在表3中。
表3.免疫反应vs.赋形剂浓度
6.3.1.1在小鼠、大鼠和豚鼠研究中使用的血凝素抑制测定法鸡红细胞的制备鸡红细胞(cRBC，5ml包装)获自Charles RiverLaboratories(目录#S8776)。将cRBC等量地分装进4个FlaconBlue Max 50ml聚乙烯圆锥形管，在4℃，在1500rpm离心5-7分钟。从cRBC去除运载缓冲液。以5ml增量，将氯化钠溶液(0.9％)加入cRBC沉淀中，重新悬浮沉淀。合并来自2批第一次洗涤的重新悬浮的沉淀，用氯化钠溶液(0.9％)将体积调节到45ml。在4℃，在1500rpm离心混合物5-7分钟，抛弃上清液。再次，以5ml增量，将氯化钠溶液(0.9％)加入cRBC沉淀中，重新悬浮沉淀。合并来自2批第二次洗涤的重新悬浮的沉淀，用氯化钠溶液(0.9％)将体积调节到45ml。在4℃，在1500rpm离心混合物5-7分钟，抛弃上清液。通过将最终的沉淀重新悬浮到10倍原始体积中，制备10％cRBC溶液。
流感抗原工作储液的滴定，以证实HA含量在进行HA抑制测定法之前，必须验证病毒裂解物工作储液的HA滴度。工作储液应当是8HA/50μl。每天制备新鲜的0.5％cRBC试剂。进行病毒裂解物的预定稀释，以产生推测的8HA工作储液。用氯化钠溶液(0.9％)，制备稀释液。
将氯化钠溶液(0.9％，50μl)分配到Falcon非组织培养物处理的平板的孔中，96-孔，U-底，具有低蒸发性的盖子。将推定的8HA/50μl工作储液(100μl)分配进单行或单列的“起始孔”中。将半体积(50μl)储液从起始孔转移到第二孔中，形成1∶2稀释液。使用1∶2稀释液，重复该过程，直到完成稀释度系列。完整的稀释度组具有含有0.0625HA-8HA的孔。将cRBC试剂(0.5％，50μl)分配进每个含有一定水平的HA的孔中，在室温，孵育测定物45分钟，并确保平板不贴在一起。
解释如果在稀释液中存在太少的病毒裂解物HA来保证血凝反应，cRBC会沉积在孔中。cRBC向孔底部部分地或全部地沉积的任何孔都是阴性的。cRBC彻底悬浮在溶液中的最后孔是病毒裂解物储液的HA滴度。如果储液确实是8HA/50μl储液，那么然后依靠重新滴定，最后的阳性孔含有1HA。
通过HAI测量HA特异性的抗体滴度收集并使用血清作为测试样品。
每天制备新鲜的cRBC试剂。将氯化钠溶液(0.9％)加入Falcon非组织培养物处理的平板的孔中，96-孔，U-，具有低蒸发性的盖子。将病毒裂解物储液(8HA/50μl)加入孔中。将将适当体积的测试血清加入单行或单列的“起始孔”中，通过将50μl血清稀释液从起始孔转移到相邻孔中，形成1∶2稀释液，来进行系列稀释。当结束时，孔含有系列血清稀释液和恒定量的病毒裂解物抗原，是4HA/孔。将cRBC试剂(0.5％，50μl)加入每个孔中，包括不含有HA的阴性对照孔。在室温，孵育测定物45分钟，并确保平板不贴在一起。为了检测，以70度的角度倾斜平板5分钟，并在点亮的盒上观察。
用A-New Caledonia(H1N1)，A-Panama(H3N2)和B-Hong Kong抗原作为单一测试抗原和三价库，进行HAI测定法。
6.4用吐温鉴定工作浓度和益处(有关的化合物)这些研究的目的是，确定将包含非离子型表面活性剂去污剂和有关的化合物的疫苗制剂输送到皮内隔室中的最佳浓度范围。这些研究表明，当根据本发明的方法输送到ID隔室中时，非离子型表面活性剂赋形剂能起佐剂的作用。工作浓度随针深度而变(1.00mm vs.1.5mmvs.2.0mm vs.3.00mm)。每种表面活性剂具有不同的工作范围，其中能证实佐剂性质，并避免或最小化组织刺激(≤2的Draize得分)。在文献中对于这样的试剂而引用的许多浓度范围可以用于生产目的。当输送到ID隔室中时，这样的试剂的生产浓度实际上对组织是有毒的和有损害的。在其它情况下，浓度太低而不能具有佐剂样的作用。在此，吐温80和其它的表面活性剂显示出能增加血清转化、平均滴度，并避免不可逆的组织损伤。
6.4.1结果吐温80能增加血清转化使用上面已经描述的方法，5％吐温80能导致图21中的100％血清转化。该研究使用Balb/c小鼠。采用使用PR8测试抗原的ELISA测定法，观察到血清转化的增加。通过ID途径，给动物施用Fluzone+吐温80，并同时作为比较未补充地IM施用Fluzone。ID组优于IM组。
吐温80能增加平均滴度如图21所示，ID输送的补充了5％吐温80的Fluzone能产生1∶1395的平均滴度，而IM输送的未补充的Fluzone具有1∶605的平均滴度。应用t-检验，并指定小于0.05的p-值，表明具有显著变化。ID输送ID接种物——使用标准注射器和针的Mantoux。讨论的所有免疫反应数据都是在Balb/c小鼠中产生。
吐温80皮肤相容性用31号1.5mm长度的微型医学针(micromedica needle)，进行猪皮肤相容性研究。吐温80在ID空间被较好地耐受(图22)。在该实验中，猪接受单独的5％V/V吐温80和补充了5％V/V吐温80的Fluzone。在施用后1小时，所有draize得分都是可接受的(≤2)。
吐温80能提高ID输送的性能超过IM与IM输送的市售三价疫苗相比，与三价疫苗一起ID输送的吐温80(0.9％V/V)能产生更高的平均滴度、更高的中间滴度和更高的血清转化(图23)。虽然0.9％V/V吐温80在免疫增强方面能相当好地表现，但该浓度可能偶而失效。用于产生图23中的ID数据的微型医学针是34g×1mm针。使用鼠科动物模型。
吐温80工作浓度vs.其它表面活性剂山梨醇和山梨醇衍生物例如吐温80具有不同的皮肤相容性特性，尤其是在ID空间中。因此，必须分别确定每种试剂的功能范围。例如，如该研究中所说明的，尽管当输送到1-2mm深度时，10％W/V吐温80不能良好地被耐受；但是10％W/V山梨醇能良好地被耐受(图24)。在施用后20-24小时，10％W/V吐温80具有中等至严重的跨越初始水泡的红斑，10％W/V山梨醇在针穿透位点仅仅造成轻微的红斑。在Yorkshire猪中进行该研究。
吐温80工作范围随组织深度而变化在该实验中，吐温80表现出随针深度而变的不同的皮肤相容性特性。具体地，在施用后20-24小时的Yorkshire猪数据表明，当以1.0mm，1.5mm，2.0mm和3.0mm针输送时，如何耐受2％吐温80溶液(图25)。在施用后约20-24小时，3.0mm输送产生了良好的皮肤结果，draize得分为0.0。特定浓度的吐温80的皮肤反应随深度而提高。这些研究表明，随着注射变浅，可视的刺激水平增加。
吐温80优选的浓度能避免溶血表面活性剂/去污剂可以裂解RBC。从接受6×200μl剂量(含有5.0％吐温80)的Yorkshire猪收集血液。在全身循环立即采取的血液中，没有观察到溶血。在该研究中，使用31g×1.5mm针。
吐温80能增强ID输送的剂量节约特征，增强血清保护和血清转化。当通过显微针ID输送时，赋形剂吐温80向市售疫苗制剂中的添加，能提供佐剂样的性能。
使用显微针(插入3.5″长的导管中的34号针，暴露1.0mm的针长度)，通过ID输送，免疫雌性Brown Norway(BN)大鼠(n＝10/组)。通过显微针的ID输送，由2次手工快速浓注100μl到大鼠下背部的任一侧并持续约10秒(每次快速浓注)组成，使用连接的1cc注射器。用2种不同剂量的2003/2004季的Fluzone(Ayentis Pasteur，Swiftwater，PA)中的任一种，免疫大鼠，每只大鼠共9μg(高剂量)或0.9μg(低剂量)血凝素(HA)，疫苗中的每个流感株系为3μg或0.3μg HA(A/New Caledonia/20/99 H1N1，A/Panama/2007/99 H3N2，和B/Hong Kong/1434/2002)。
免疫后21天，给大鼠抽血，并使用血凝抑制(HAI)测定法，分析它们的血清的中和抗体滴度，并通过ELISA分析流感特异性抗体滴度。针对Fluzone制剂中的H3N2流感株系，进行这2种测定，以表征免疫反应。
表4通过使用显微针以ID输送低和高剂量的Fluzone进行免疫后，针对流感A/Panama/2007/99(H3N2)而测定的Brown Norway大鼠中的免疫反应。
1HAI滴度≥402HAI滴度≥10当通过显微针进行ID输送时，赋形剂吐温80向Fluzone中的添加，能提供佐剂样的作用。当针对H3N2株系进行测定时，与ID输送单独的Fluzone达到的结果相比，5％吐温80向低或高剂量的ID施用的Fluzone中的添加，能使平均HAI滴度增加5倍，平均ELISA滴度增加高达15倍(表4)。而且，吐温80的添加，能使ID低剂量组的血清保护率从30％增加到90％，使ID高剂量组从90％增加到100％。同样地，低剂量ID组的血清转化率从90％升高到100％，高剂量ID组保持在100％不变(表4)。这样的ID输送和吐温80的组合，对于通常不能对流感疫苗强烈地反应的人群是特别有益的，例如，老年人、婴儿和无免疫应答的人。
吐温80能增加对三价测试抗原的血凝素特异性滴度在使用Hartley豚鼠的研究中，ID输送补充了5.0％V/V吐温80的Fluzone接种物。经补充的皮内制剂优于ID输送的Fluzone(单独的)和IM输送的Fluzone(单独的)。通过前面所述的HAI方法，测定血清样品。三价测试抗原由New Caledonia、Panama和B-Hong Kong抗原组成。三价测试抗原用等部分的HA构建。结果显示在图31中。在该研究中，使用34g×1.0mm针。
吐温80具备优选的赋形剂特性。图35说明了根据本发明的为皮内组织而选择的赋形剂。吐温80具有类似于图中的″赋形剂-A″的特性，具有大于0.125的斜率。由此，吐温80的5％v/v溶液在1.0mm深度是处于最大工作浓度，在3mm深度可以成功地使用10％v/v。
脱氧胆酸盐DOC能增加对三价测试抗原的血凝素特异性滴度在使用Hartley豚鼠的研究中，ID输送补充了0.1％w/v脱氧胆酸钠的Fluzone接种物。经补充的ID制剂优于ID输送的Fluzone(单独的)和IM输送的Fluzone(单独的)。通过前面所述的HAI方法，测定血清样品。三价测试抗原由New Caledonia、Panama和B-Hong Kong抗原组成。三价测试抗原用等部分的HA构建。结果显示在图32中。在该研究中，使用34g×1.0mm针。
DOC能增强血清转化。当将脱氧胆酸盐(一种病毒分裂剂)输送到ID空间时，它表现出了免疫增强特征，如图28所示。在这里，IM输送三价疫苗(Fluzone)，没有DOC，在免疫后21天，5只动物中仅有1只发生血清转化。但是，同一图表明，通过ID途径接受补充了DOC的Fluzone的5只动物中有5只发生血清转化。含有0.1％脱氧胆酸钠的ID制剂给出了最好的中等滴度。该研究在Balb/c小鼠中进行。
DOC工作范围随组织深度而变。在Yorkshire猪中，评价了含有三价疫苗和不同浓度的脱氧胆酸盐的接种物的皮肤相容性。含有0.05和0.1％+/-三价疫苗的接种物在1.5mm深度表现较好(图29)。在以前的研究(未显示数据)中，在1.5mm深度不能耐受0.5％W/V和更高浓度的脱氧胆酸盐。在这一点上，预期1.5mm输送的优选范围是0.07-0.15％W/V，其次最好的范围是0.01-0.3％w/v。如关于吐温所述的，上限浓度可以随更深的注射而增加。例如，3mm施用可以耐受高达0.6％w/v或更高的脱氧胆酸盐。
鉴定其它赋形剂的工作浓度和益处。
这些研究的目的是，确定用于输送包含赋形剂的疫苗制剂的最佳参数，包括浓度范围，所述赋形剂传统地用于生产工艺中，例如稳定剂和防腐剂，其实例有明胶和两性霉素-B，细菌用蛋白胨(培养基的一种组分)和磷酸三丁酯(与分裂剂一起使用的稀释剂)。有时，残余量的这些试剂可以带进最终的疫苗制剂中，且可以具有意外的性质。
6.4.2明胶具有佐剂性质和良好流动特征的明胶制剂测定优选的明胶范围是0.01-0.225W/V。在室温，尤其是在冷冻温度，更高浓度的明胶会形成固体。使用国家处方级的明胶(猪来源)，进行这些观察。0.225％w/v明胶能容易地穿过34号针，且能在1-3mm组织深度较好地被耐受。
明胶能增强血清转化和中值在0.45W/V使用的明胶能增强目标抗原的免疫原性。图26表明，含有明胶的皮内制剂优于肌肉内的制剂。ID输送补充了明胶的Fluzone三价制剂，并IM输送原样的Fluzone。使用ELISA测定法，测试抗原是PR8。动物模型是Balb/c，针是34g×1mm。
6.4.3两性霉素-BAmp-B皮肤相容性。在Yorkshire猪研究中，动物能耐受600ng/100ul或1200ng/200ul总剂量。如Draize分数分析所证实的(图27)，当单独地和作为与Fluzone疫苗的混合物进行评价时，能较好地耐受Amp-B。在1.5mm深度进行分析。
6.4.4细菌用蛋白胨蛋白胨能减少可视的刺激。另一个意外的结果是能平息由疫苗自身和稀释剂造成的刺激的赋形剂。已经证实，细菌用蛋白胨赋形剂能遮蔽在施用位点经常看到的刺激。如图30所示，单独的Hanks缓冲盐水(稀释剂)有时会造成轻微刺激。当加入细菌用蛋白胨赋形剂时，其具有平息作用，能减少draize得分。当在1.5％w/v使用细菌用蛋白胨时，该积极属性特别明显。在Yorkshire猪中进行实验，组织深度是1.5mm。
6.5各种赋形剂的DRAIZE打分使用上面5.4部分所述的方法，确定各种赋形剂的红斑Draize得分。在一个研究中，使用34号1.0mm针，给Hartley豚鼠施用吐温80(5％)、脱氧胆酸盐(0.1％)、D-山梨醇(5％)或Lutrol(15％)(每次注射50μl)，没有抗原。如图33所示，在指定的浓度，在豚鼠中相当好地耐受了所有赋形剂，除了DOC以外，它产生了刚好超过可接受的draize得分的皮肤反应。为了在该浓度可靠地使用脱氧胆酸盐，必需更深地施用。从左向右依次是，施用后立即读数、1-小时读数和24-小时读数。
在另一个研究中，使用31号1.5mm针，给Yorkshire猪施用吐温80(5％)、脱氧胆酸盐(0.1％)、D-山梨醇(5％)或Lutrol(15％)(每次注射200μl)，没有抗原。如图34所示，在指定的浓度，在猪中也相当好地耐受了所有赋形剂，除了DOC以外，它产生了刚好超过可接受的draize分数的皮肤反应。为了在该浓度可靠地使用脱氧胆酸盐，必需更深地施用。1-小时读数(左)和24-小时读数(右)。
尽管已经参考具体的实施方案描述了本发明，但本领域的技术人员能明白，可以进行各种变化和改进，而不背离所附权利要求书阐明的本发明的精神和范围。
权利要求
1.引起免疫原性组合物在受试者中的增强的免疫反应的方法，包括将免疫原性组合物输送进受试者皮肤的皮内隔室，其中免疫原性组合物包含免疫原性或抗原性试剂和预选的赋形剂。
2.权利要求1的方法，其中免疫原性组合物是疫苗。
3.权利要求1的方法，其中赋形剂是吸收剂。
4.权利要求3的方法，其中吸收剂是明胶。
5.权利要求4的方法，其中明胶的浓度以重量/体积组合物计是约0.01-约2％。
6.权利要求5的方法，其中明胶的浓度是以重量/体积组合物计约0.03-约0.6％。
7.权利要求1的方法，其中赋形剂是抗氧化剂。
8.权利要求7的方法，其中抗氧化剂是亚硫酸氢钠。
9.权利要求8的方法，其中亚硫酸氢钠的浓度以重量/体积组合物计是约0.1-约8％。
10.权利要求9的方法，其中亚硫酸氢钠的浓度以重量/体积组合物计是约0.3-约3％。
11.权利要求1的方法，其中赋形剂是润湿剂。
12.权利要求11的方法，其中润湿剂是山梨醇。
13.权利要求12的方法，其中山梨醇的浓度以重量/体积组合物计是约1-约100％。
14.权利要求13的方法，其中山梨醇的浓度以重量/体积组合物计是约2.5-约70％。
15.权利要求1的方法，其中赋形剂是抗真菌剂。
16.权利要求15的方法，其中抗真菌剂是两性霉素B。
17.权利要求16的方法，其中两性霉素B的浓度是约0.5-约600ng/mL。
18.权利要求17的方法，其中两性霉素B的浓度是约30-约100ng/mL。
19.权利要求1的方法，其中赋形剂是溶剂。
20.权利要求19的方法，其中溶剂是乙醇。
21.权利要求20的方法，其中乙醇的浓度以体积/体积组合物计是约0.01-约2％。
22.权利要求21的方法，其中乙醇的浓度以体积/体积组合物计是约0.05-约0.45％。
23.权利要求1的方法，其中赋形剂是表面活性剂。
24.权利要求23的方法，其中表面活性剂是Lutrol F 127，TritonN-101，Triton X-100，吐温20或吐温80。
25.权利要求24的方法，其中Triton N-101的浓度以重量/体积组合物计是约0.05-约5％。
26.权利要求24的方法，其中Triton N-101的浓度以重量/体积组合物计是约0.1-约1.5％。
27.权利要求24的方法，其中Triton X-100的浓度以重量/体积组合物计是约0.00003-约0.0027％。
28.权利要求24的方法，其中Triton X-100的浓度以重量/体积组合物计是约0.0001-约0.0009％。
29.权利要求24的方法，其中吐温80的浓度以重量/体积组合物计是约0.03-约5％。
30.权利要求24的方法，其中吐温80的浓度以重量/体积组合物计是约0.1-约10.0％。
31.权利要求24的方法，其中吐温20的浓度以重量/体积组合物计是约0.003-约0.03％。
32.权利要求1的方法，其中赋形剂是悬浮剂。
33.权利要求32的方法，其中悬浮剂是明胶或甲基纤维素。
34.权利要求33的方法，其中甲基纤维素的浓度以重量/体积组合物计是约0.02-约0.5％。
35.权利要求33的方法，其中甲基纤维素的浓度以重量/体积组合物计是约0.06-约0.18％。
36.权利要求1的方法，其中赋形剂是生长培养基的成分。
37.权利要求36的方法，其中生长培养基的成分是细菌用蛋白胨。
38.权利要求37的方法，其中细菌用蛋白胨的浓度以重量/体积组合物计是约0.03-约3％。
39.权利要求37的方法，其中细菌用蛋白胨的浓度以重量/体积组合物计是约0.1-约1.5％。
40.权利要求1的方法，其中赋形剂是抗微生物剂。
41.权利要求40的方法，其中抗微生物剂是氨普立糖或磷酸三正丁酯。
42.权利要求41的方法，其中氨普立糖的浓度以重量/体积组合物计是约0.1-约0.9％。
43.权利要求41的方法，其中磷酸三正丁酯的浓度以重量/体积组合物计是约0.04-约0.325％。
44.权利要求1的方法，其中赋形剂是脱铁运铁蛋白，抑蛋白酶肽，胎球蛋白，羟基乙酸，甘露糖或尿素。
45.权利要求44的方法，其中尿素的浓度以重量/体积组合物计是约0.02-约40％。
46.权利要求44的方法，其中尿素的浓度以重量/体积组合物计是约0.2-约20％。
47.权利要求44的方法，其中脱铁运铁蛋白的浓度是约20μg/mL-约1,800μg/mL组合物，更优选地脱铁运铁蛋白的浓度是约60μg/mL-600μg/mL。
48.权利要求44的方法，其中抑蛋白酶肽的浓度是约1μg/mL-约180μg/mL组合物，更优选地抑蛋白酶肽的浓度是约5μg/mL-约60μg/mL。
49.权利要求44的方法，其中胎球蛋白的浓度是约0.05μg/mL-约7.5μg/mL组合物，更优选地胎球蛋白的浓度是约0.2μg/mL-约2.4μg/mL。
50.权利要求44的方法，其中甘露糖的浓度是约20μg/mL-约1,800μg/mL组合物、更优选地甘露糖的浓度是约60μg/mL-约600μg/mL。
51.权利要求44的方法，其中羟基乙酸的浓度以重量/体积组合物计是约0.05-约3％，更优选地羟基乙酸的浓度以重量/体积组合物计是约0.1-约1.0％。
52.权利要求1的方法，其中在施用前，将免疫原性或抗原性试剂与赋形剂相混合。
53.权利要求1的方法，其中在施用过程中，将免疫原性或抗原性试剂与赋形剂在输送装置中相混合。
54.权利要求52或53的方法，其中在混合前，免疫原性或抗原性试剂和赋形剂都是液体。
55.权利要求52或53的方法，其中在混合前，免疫原性试剂或赋形剂是粉末形式。
56.权利要求1的方法，其中免疫原性组合物包含两种或更多种赋形剂。
57.鉴定能增强免疫原性或抗原性试剂的免疫原性的化合物的方法，所述方法包括a.将免疫原性组合物输送进第一个受试者的皮肤的皮内隔室，其中免疫原性组合物包含免疫原性或抗原性试剂和该化合物；b.测量从第一个受试者的血清或组织或组织洗液得到的样品中的抗体反应；c.将免疫原性组合物输送进第二个受试者的皮肤的皮内隔室，其中免疫原性组合物包含没有该化合物的免疫原性或抗原性试剂，且其中第一个和第二个受试者是相同的物种；d.测量从第二个受试者的血清得到的样品中的抗体反应；和e.确定从第一个受试者得到的反应是否大于从第二个受试者得到的反应，其中如果在第一个受试者中的反应测量值大于在第二个受试者中测得的反应，则该化合物是皮内隔室中的佐剂。
58.引起免疫原性组合物在受试者中的增强的免疫反应的方法，包括将免疫原性组合物输送进受试者皮肤的皮内隔室，其中免疫原性组合物包含免疫原性试剂和通过权利要求57的方法鉴定出的化合物。
59.权利要求57的方法，其中所述化合物是氨普立糖，两性霉素B，脱铁运铁蛋白，抑蛋白酶肽，细菌用蛋白胨，乙醇，胎球蛋白，明胶，羟基乙酸，Lutrol F 127，甘露糖，甲基纤维素，亚硫酸氢钠，山梨醇，磷酸三正丁酯，Triton N-101，Triton X-100，吐温20，吐温80或尿素。
60.权利要求59的方法，其中免疫原性组合物是疫苗。
61.权利要求59的方法，其中组合使用两种或更多种化合物。
62.权利要求1-56中的任一项的方法，其中受试者是人。
63.鉴定能增强对于抗原性或免疫原性试剂的免疫反应的化合物的方法，所述方法包括a.将免疫原性组合物输送进受试者皮肤的皮内隔室；和b.测量免疫反应的水平；其中免疫原性组合物包含免疫原性或抗原性试剂和该化合物；且其中抗体反应针对所述抗原性或免疫原性试剂。
60.权利要求63的方法，其中步骤(b)包括，将在步骤(b)中测得的水平与标准水平相比较，其中测得的水平相对于标准水平有所升高表明该化合物是佐剂。
61.权利要求63的方法，其中在步骤(b)中测得的水平包含测量体液免疫反应。
62.权利要求63的方法，其中在步骤(b)中测得的水平包含测量细胞介导的免疫反应。
63.权利要求1的方法，其中赋形剂是吐温80，且其中当将制剂输送到皮肤的皮内隔室中2mm或更小的深度时，吐温80的浓度是约1.1-2.0％v/v。
64.权利要求1的方法，其中赋形剂是吐温80，且其中当将制剂输送到皮肤的皮内隔室中2mm或更大的深度时，吐温80的浓度是约1.1-5.0％v/v。
65.权利要求1的方法，其中赋形剂是山梨醇，且其中当将制剂输送到皮肤的皮内隔室中2mm或更小的深度时，山梨醇的浓度是约2-10％w/v。
66.权利要求1的方法，其中赋形剂是山梨醇，且其中当将制剂输送到皮肤的皮内隔室中2mm或更大的深度时，山梨醇的浓度是约2-20％w/v。
67.权利要求1的方法，其中赋形剂是胆汁盐。
68.权利要求1的方法，其中胆汁盐赋形剂是脱氧胆酸盐，且其中当将制剂输送到皮肤的皮内隔室中2mm或更小的深度时，脱氧胆酸盐的浓度是约0.07％-0.15％w/v。
69.权利要求1的方法，其中赋形剂是脱氧胆酸盐，且其中当将制剂输送到皮肤的皮内隔室中2mm或更大的深度时，脱氧胆酸盐的浓度是约0.07％-0.15％w/v。
70.用于施用到受试者皮肤的皮内隔室的包含赋形剂的组合物，从而当施用到皮内隔室时，组合物会表现出佐剂活性和等于或小于2的draize得分。
71.用于施用到受试者皮肤的皮内隔室的包含赋形剂的组合物，其中组合物的活性可以表征为，当以具有佐剂活性和小于或等于2的Draize得分的浓度施用组合物时，等于或大于0.125的斜率值，其中斜率值源自在受试者皮肤的皮内隔室中的第一和第二组织深度处的第一和第二赋形剂浓度，其中第一和第二组织深度相隔至少2mm。
72.用于施用到受试者皮肤的皮内隔室的组合物，其包含免疫原性或抗原性试剂和预选的赋形剂。
73.权利要求72的组合物，其中免疫原性组合物是疫苗。
74.权利要求72的组合物，其中赋形剂是吸收剂。
75.权利要求74的组合物，其中吸收剂是明胶。
76.权利要求75的组合物，其中明胶的浓度以重量/体积组合物计是约0.01-约2％。
77.权利要求76的组合物，其中明胶的浓度以重量/体积组合物计是约0.03-约0.6％。
78.权利要求72的组合物，其中赋形剂是抗氧化剂。
79.权利要求78的组合物，其中抗氧化剂是亚硫酸氢钠。
80.权利要求79的组合物，其中亚硫酸氢钠的浓度以重量/体积组合物计是约0.1-约8％。
81.权利要求80的组合物，其中亚硫酸氢钠的浓度以重量/体积组合物计是约0.3-约3％。
82.权利要求72的组合物，其中赋形剂是润湿剂。
83.权利要求82的组合物，其中润湿剂是山梨醇。
84.权利要求83的组合物，其中山梨醇的浓度以重量/体积组合物计是约1-约100％。
85.权利要求84的组合物，其中山梨醇的浓度以重量/体积组合物计是约2.5-约70％。
86.权利要求72的组合物，其中赋形剂是抗真菌剂。
87.权利要求86的组合物，其中抗真菌剂是两性霉素B。
88.权利要求87的组合物，其中两性霉素B的浓度是约0.5-约600ng/mL。
89.权利要求88的组合物，其中两性霉素B的浓度是约30-约100ng/mL。
90.权利要求72的组合物，其中赋形剂是溶剂。
91.权利要求90的组合物，其中溶剂是乙醇。
92.权利要求91的组合物，其中乙醇的浓度以体积/体积组合物计是约0.01-约2％。
93.权利要求92的组合物，其中乙醇的浓度以体积/体积组合物计是约0.05-约0.45％。
94.权利要求72的组合物，其中赋形剂是表面活性剂。
95.权利要求94的组合物，其中表面活性剂是Lutrol F 127，Triton N-101，Triton X-100，吐温20或吐温80。
96.权利要求95的组合物，其中Triton N-101的浓度以重量/体积组合物计是约0.05-约5％。
97.权利要求95的组合物，其中Triton N-101的浓度以重量/体积组合物计是约0.1-约1.5％。
98.权利要求95的组合物，其中Triton X-100的浓度以重量/体积组合物计是约0.00003-约0.0027％。
99.权利要求95的组合物，其中Triton X-100的浓度以重量/体积组合物计是约0.0001-约0.0009％。
100.权利要求95的组合物，其中吐温80的浓度以重量/体积组合物计是约0.03-约5％。
101.权利要求95的组合物，其中吐温80的浓度以重量/体积组合物计是约0.1-约10％。
102.权利要求95的组合物，其中吐温20的浓度以重量/体积组合物计是约0.003-约0.03％。
103.权利要求72的组合物，其中赋形剂是悬浮剂。
104.权利要求103的组合物，其中悬浮剂是明胶或甲基纤维素。
105.权利要求104的组合物，其中甲基纤维素的浓度以重量/体积组合物计是约0.02-约0.5％。
106.权利要求104的组合物，其中甲基纤维素的浓度以重量/体积组合物计是约0.06-约0.18％。
107.权利要求72的组合物，其中赋形剂是生长培养基的成分。
108.权利要求107的组合物，其中生长培养基的成分是细菌用蛋白胨。
109.权利要求108的组合物，其中细菌用蛋白胨的浓度以重量/体积组合物计是约0.03-约3％。
110.权利要求108的组合物，其中细菌用蛋白胨的浓度以重量/体积组合物计是约0.1-约1.5％。
111.权利要求72的组合物，其中赋形剂是抗微生物剂。
112.权利要求111的组合物，其中抗微生物剂是氨普立糖或磷酸三正丁酯。
113.权利要求112的组合物，其中氨普立糖的浓度以重量/体积组合物计是约0.1-约0.9％。
114.权利要求112的组合物，其中磷酸三正丁酯的浓度以重量/体积组合物计是约0.04-约0.325％。
115.权利要求72的组合物，其中赋形剂是脱铁运铁蛋白，抑蛋白酶肽，胎球蛋白，羟基乙酸，甘露糖或尿素。
116.权利要求115的组合物，其中尿素的浓度以重量/体积组合物计是约0.02-约40％。
117.权利要求115的组合物，其中尿素的浓度以重量/体积组合物计是约0.2-约20％。
118.权利要求115的组合物，其中脱铁运铁蛋白的浓度是约20μg/mL-约1,800μg/mL组合物，更优选地脱铁运铁蛋白的浓度是约60μg/mL-600μg/mL。
119.权利要求115的组合物，其中抑蛋白酶肽的浓度是约1μg/mL-约180μg/mL组合物，更优选地抑蛋白酶肽的浓度是约5μg/mL-约60μg/mL。
120.权利要求115的组合物，其中胎球蛋白的浓度是约0.05μg/mL-约7.5μg/mL组合物，更优选地胎球蛋白的浓度是约0.2μg/mL-约2.4μg/mL。
121.权利要求115的组合物，其中甘露糖的浓度是约20μg/mL-约1,800μg/mL组合物，更优选地甘露糖的浓度是约60μg/mL-约600μg/mL。
122.权利要求115的组合物，其中羟基乙酸的浓度以重量/体积组合物计是约0.05-约3％，更优选地羟基乙酸的浓度以重量/体积组合物计是约0.1-约1.0％。
123.权利要求72的组合物，其中赋形剂是胆汁盐。
124.权利要求72的组合物，其中胆汁盐赋形剂是脱氧胆酸盐。
125.权利要求72的组合物，其中脱氧胆酸盐的浓度以重量/体积组合物计是0.07-约0.15％。
126.权利要求72的组合物，其中脱氧胆酸盐的浓度以重量/体积组合物计是0.07-约0.60％。
全文摘要
本发明涉及免疫原性组合物，其用于皮内输送与一种或多种赋形剂相组合的抗原性或免疫原性试剂。本发明的免疫原性组合物包含抗原性或免疫原性试剂和至少一种赋形剂，一旦输送到受试者皮肤的皮内隔室中，该赋形剂能起佐剂作用，即增强对抗原性或免疫原性试剂的免疫反应。本发明的免疫原性组合物包含赋形剂，当根据本发明施用给皮肤的皮内隔室时，其能表现出佐剂活性。本发明的免疫原性组合物具有增强的功效，因为组合物的赋形剂会造成无症状的皮肤刺激，并将抗原呈递细胞召集到皮内隔室中，从而增强抗原性或免疫原性试剂向抗原呈递细胞的呈递和/或可用性。使用比常规使用更低剂量的抗原性或免疫原性试剂，且不需要加强免疫，在单次皮内给药后，本发明的免疫原性组合物的增强的功效可以导致治疗上有效的免疫反应。
文档编号G01N33/53GK1905896SQ200480040762
公开日2007年1月31日 申请日期2004年12月6日 优先权日2003年12月5日
发明者R·卡姆贝尔, K·G·多兰, J·阿拉肯, W·D·伍德雷, J·米克斯塔 申请人:贝克顿·迪金森公司