传感工具的制作方法

专利名称：传感工具的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种使用直径为纳米尺寸的粒子的生物传感工具(biosensing tool)及传感方法，其中所述粒子的特征为含有脂质膜和“具有形成粒子能力的蛋白质”且为中空结构。
背景技术：
近年，人们正在积极地从事通过标记特定分子或利用只有此分子具有的特异活性，使该分子与其他分子相区别，从而选择性地传感检测(sensing)此分子的研究。特别是，在疾病的早期诊断或环境激素的测定等医学或环境、食品检查、生命科学领域等中，迫切要求能够特异地且高灵敏地传感检测生物体内或环境中存在的极微量的蛋白质或核酸或化合物等，因此，人们正积极地从事物质的特异性标记方法或提高测定灵敏度的研究。
作为微量物质的高灵敏度传感方法，大致包括利用荧光或发光等标记目标物质进行传感的方法，或利用高灵敏度地检测与物质的结合的表面等离振子共振技术(SPRSurface Plasmon Resonance)或石英晶体微量天平(QCMQuartz Crystal Microbalance)等进行传感的方法，通过采用上述方法，能够传感检测ng至pg单位的物质。采用荧光或发光等标记的传感方法，是一种通过用产生荧光或发光等强信号的物质(例如作为绿色发光蛋白质的绿色荧光蛋白质(green fluorescentprotein)或作为发光酶的荧光素酶(luciferase)等)特异地标记想要检测的物质，并传感检测此标记物质来提高灵敏度的方法(参见非专利文献1)。近年，为了提高通过上述方法进行传感的灵敏度，人们正在积极地从事应用纳米大小的粒子的研究。例如，已经设计出以下方法将标记物质(特别是HRP等酶)包埋于由脂质构成的直径为200～500nm的脂质体中，在交联剂等作用下使抗体等生物识别分子与脂质体表面共价结合的方法(专利文献1)，或在被称为“量子点(quantum dot)”的直径为10～15nm的荧光粒子表面上固定抗体或生物素或链霉亲和素标记(streptavidin tag)等，通过荧光进行检测的方法(专利文献2、非专利文献2)。此外还设计出以下方法利用由聚合物构成的微粒的方法，或在由微生物产生的直径为100nm左右的磁性粒子表面通过某些方法固定二级抗体，以粒子具有的磁性作为检测的标记物质进行检测的方法(非专利文献3)或利用胶体金(colloidalgold)的方法(非专利文献4)等。另外，在测定的迅速且简便化方面，开发了利用SBA(Suspension Beads Array)方法、可同时测定最多100种抗原的自动系统(非专利文献5)。SPR是通过利用表面等离振子(plasmon)测定物质结合时金属表面的电荷密度波的变化，测定物质的结合力或量的方法，其中所述表面等离振子为局部存在于金属(衍生物)界面，并沿着该界面传播的电磁波(参见非专利文献6，7)。QCM是利用基本振动频率与吸附到电极上的质量成比例地减少，在纳克水平测定物质结合量或结合和解离的速度的方法(参见非专利文献7，8)。
并且，人们也正在积极从事将蛋白质等呈递(present)到细胞表面用于生物传感检测的研究。具体而言，人们正在尝试将功能蛋白质或肽等呈递到酵母等活细胞或病毒表面的方法(参见非专利文献9～11、专利文献3、4)。
非专利文献1大岛等著，Post-Sequence Protein Experimentation2，东京化学同人，2002年，p130-146非专利文献2Ozkan，M.，Drug Discovery Today，2004年，第9卷，p1065-1071非专利文献3田中 刚·松永是著，日本应用磁学会志，2004年，第28卷，p675-679非专利文献4Penn，S.et al.，Current Opinion in ChemicalBiology，2003年，第7卷，p609-615
非专利文献5Nolan，J.，Mandy，F.，Cell and Molecular Biology，2001年，第47卷，p1241-1256非专利文献6冈本隆之·山口一郎著，表面等离振子共振和其在激光显微镜中的应用，激光研究，激光学会，1996年，24卷，10号，p1051-1053非专利文献7大岛等著，Post-Sequence Protein Experimentation3，东京化学同人，2002年，p115-137非专利文献8冈 惠雄·古泽宏幸著，先端化学系列III，丸善株式会社，2003年，p67-73非专利文献9Szardenings M，J.，Recept Signal Transduct Res.，2003年，23，p307-49非专利文献10植田充美，生物科学与工业，(财)生物产业协会，1997年，55，p253-254非专利文献11植田充美·村井稔幸，生物工程学，日本生物工程学会，1998年，76，p506-510专利文献1特开2003-149246号公报专利文献2美国专利6274323号专利文献3特开2001-316298号公报专利文献4特表2003-504506号公报发明内容在生物体内或环境中含有大量以pg以下超微量级存在、但具有非常重要的生理活性的分子。由于只用以上述方法为代表的传感方法难于测定这些超微量存在的分子，因此需要通过浓缩或纯化等放大传感信号的工序。但是，这些工序十分繁琐，并且由于非特异地附着在浓缩·纯化时的装置上，导致试样损失，或试样中大量存在的分子产生掩蔽效应等，特别是试样中目标物质的含量越微量，其传感检测就越困难。所以，为了能够传感检测生物体内或环境中以超微量存在的分子，人们期待确立一种能够放大传感信号的方法。并且，还期望此放大技术易于与目前的传感技术(量子点、SPR、QCM等)合用，由此实现目前传感方法灵敏度的提高。另外，在以DNA芯片或蛋白质芯片为代表的生物芯片之类的要求使用微量试样进行定量且高灵敏度传感检测的情况下，传感信号的放大技术是必不可少的技术。
作为提高上述生物传感灵敏度的有效方法，考虑在易于传感的结构体表面结合能够特异地检测目标物质的生物识别分子，通过传感检测与目标分子结合的该结构体，放大传感信号。作为易于传感的结构体，包括量子点、脂质体、聚合物、磁性粒子、胶体金等粒子或酵母等活细胞、病毒等。
但是，由于量子点的识别物质仅限于荧光，所以其通用性受到制约，即不能利用在使用抗体作为生物识别分子的免疫学检测方法等中最普遍的HRP(辣根过氧化物酶(Horse Radish Peroxidase))或AP(碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase))等酶作为识别物质。因此，为了能够检测量子点的荧光必须使用昂贵的检测装置。而且也存在量子点自身价格非常高的问题。另外，利用脂质体的方法，能够使用灵敏度比荧光高的HRP或AP等酶，但必须将其包埋于粒子内，因此，必须进行高温或涡流、超声波之类易于使蛋白质变性的苛刻处理。由于该方法必须另外合成·纯化并添加作为标记物质的酶，所以与量子点相同，生产成本高。并且，脂质体还存在物理学稳定性低的问题。另外，磁性粒子或胶体金不仅标记方法受限而且检测灵敏度不充分。在由聚合物或金属构成的微粒中自身发出荧光的材料较多，使用光学检测器的荧光或发光等的传感易于产生较高背景，从该方面考虑在材料的选择中也存在较多的限制。如上所述，在现有的检测信号放大技术(传感技术)中存在灵敏度、通用性、生产成本、需要高价检测装置等妨碍其实用化的种种课题。
除上述课题外，作为现存检测信号放大技术中共同的重大课题，可以举出，抗体等生物识别分子与粒子结合时，由于在使生物识别分子方向一致的状态下与粒子表面结合是非常困难的，因此以随机方向与粒子结合的生物识别分子所致的非特异结合增加。上述非特异结合的增加可导致检测精度降低。特别是，试样中目标物质浓度越微量非特异结合的问题越大。为了防止上述非特异结合，考虑用脂质等覆盖与目标物质结合的反应部位以外的部位。例如，通过使用由人工的、或来自生物的脂质膜构成的粒子来避免非特异结合，但人工的脂质颗粒(脂质体)除上述问题外，还存在生物识别分子的呈递量少，及生物识别分子难于排列(align)等问题。
此外，在上述现存的检测信号放大技术中共同存在的另一课题为，必须分别配制粒子、标记物质和生物识别分子，通过交联结合等人工地使之结合。因此，存在质量难于控制、批量生产的质量参差不齐等生产率方面的问题。另外，在上述现存的检测信号放大技术所用粒子的生产中，多使用有机溶剂等，也会让人担心对环境产生影响。如上所述，现存的检测信号放大技术还存在检测特异性或精度、生产率、环境安全性等问题。
另外，虽然可以通过基因工程方法等将生物识别分子呈递并排列在活细胞或病毒的膜表面(参见微生物学和分子生物学评论，1171-1190，1998)，但是，在其应用中，在感染或对环境的影响等安全性方面受到诸多限制。并且，当使用活细胞时内源性酶或化合物能够引起背景增加或阻碍传感反应等。另外，目标物质以外的物质与表面(特别是细胞壁)结构非特异性结合，易于产生较高背景。
如特开2001-316298号公报中记载，“具有形成粒子的能力的蛋白质”在细胞内通过自我组织化引入(incorporate)细胞内的脂质双层膜，同时形成纳米尺寸的中空纳米粒子，自我组织化形成的“具有形成粒子的能力的蛋白质”高密度地排列在该中空纳米粒子表面。
但是，目前为止，尚无通过使用该粒子来放大传感信号·提高灵敏度的应用例，仅用于通过检测该粒子鉴定有无病毒感染，或用于脏器特异性地转运药物的DDS研究等。
因此，鉴于上述现状，本发明提供一种能够解决现有技术的问题、并能够高精度且高灵敏度地传感检测目标物质(基因、蛋白质、化合物等)的通用工具及使用该工具的传感方法。
本发明人等经潜心研究，结果发现，通过使用该中空纳米粒子能够彻底解决关于现存的高灵敏度传感技术的上述课题，从而完成本发明。
即，此“具有形成粒子的能力的蛋白质”通过采用基因工程方法等实施改变·修饰，在粒子表面能够高密度地结合·排列抗体等生物识别分子或标记物质，因此显著地提高该粒子的检测灵敏度。
此外，作为本发明的中空纳米粒子的最重要的特征，可以举出，由于其结构为脂质双层膜包围在自我组织化的“具有形成粒子的能力的蛋白质”的周围，从而使与目标物质结合的反应部位以外的部位被脂质包覆，所以不易引发非特异性结合，因此，显著地提高了检测的特异性和精度。
此外，不仅多种生物识别分子可与粒子表面结合，而且能够使用荧光体、酶、放射性同位素等作为粒子的标记物质，因此通用性广泛。并且，当由细胞生产中空纳米粒子时，不仅可以通过基因工程方法同时生产抗体等生物识别分子或作为标记物质的酶等，且可以通过克隆化稳定地生产均一质量的中空纳米粒子，另外能够采用易于处理的酵母等作为本粒子的生产体系，因此在生产率或生产成本方面具有优异的效果。由于能够采用酶等作为标记物质，所以不一定需要使用昂贵的检测装置。此外，由于本粒子由细胞生产，其生产过程中不需要使用有机溶剂等，且该粒子为由蛋白质和脂质构成的可生物降解的粒子，因此具有优异的环境安全性。此外，从不使用活体细胞或病毒的方面看，没有感染等危险性，同时也能避免由内源性酶或化合物所致的检测阻碍或背景的问题。并且，该粒子具有下述特征，即自身无荧光，物理性质非常稳定，即使在热或存在表面活性剂或者8M尿素的条件下等，仍然能够维持其形态等。
为解决上述课题，本申请的第1项发明提供一种由生物识别分子与具有引入脂质双层膜形成纳米大小的粒子的能力的蛋白质结合形成的传感工具。
本申请的第2项发明提供前述第1项发明中所述的传感工具，其中，蛋白质为病毒表面抗原蛋白质。
本申请的第3项发明提供前述第1或第2项发明中所述的传感工具，其中，选自荧光分子、发光分子、吸光分子、或具有放射性同位素的分子中的一种以上分子与中空纳米粒子的脂质双层膜、具有形成粒子能力的蛋白质、或生物识别分子结合，或者包埋于中空纳米粒子中。
本申请的第4项发明提供一种使用平面膜状生物识别分子排列体的传感工具，所述排列体由前述第1至第3项发明中的中空纳米粒子在基板上排列形成。
本申请的第5项发明提供一种使用前述第1至第4项发明中任一项所述的传感工具的生物传感方法。
本发明提供一种利用呈递了生物识别分子的中空纳米粒子、有效地传感检测生物体内或环境中极微量成分的通用工具及使用该工具的传感方法。该工具及方法，由于利用基因工程方法等，改变·修饰“具有形成粒子的能力的蛋白质”，在粒子表面高密度地结合·排列抗体等生物识别分子或标记物质，因此显著地提高了该粒子的检测灵敏度。
作为本发明的中空纳米粒子的最重要的特征，可以举出，由于其结构为脂质双层膜包围在自我组织化后的“具有形成粒子的能力的蛋白质”的周围，且用脂质包覆与目标物质结合的反应部位之外的部位，难以引起非特异结合，因此显著地提高了检测的特异性和精度。
多种生物识别分子能够与粒子表面结合，除此之外，能够使用荧光体、酶、放射性同位素等作为粒子的标记物质，因此通用性广泛。此外，当由细胞生产该中空纳米粒子时，由于不仅可以通过基因工程方法同时生产抗体等生物识别分子或作为标记物的酶等，而且可以通过克隆化稳定地生产质量均一的中空纳米粒子，另外能够使用易于处理的酵母等作为本粒子的生产体系，因此在生产率或生产成本方面都很优异。并且，由于能够使用酶等作为标记物质，所以不一定需要昂贵的检测装置。此外，由于本粒子由细胞生产，所以在其生产过程中不需使用有机溶剂等，并且本粒子为由蛋白质和脂质构成的可生物降解的粒子，因此具有优异的环境安全性。从不使用活细胞或病毒的方面看，无感染等危险性，也能够避免由内源性酶或化合物所致的检测阻碍或背景问题。此外，具有自身无荧光、物理性质非常稳定等特征。而且，该工具及方法能够在SPR、QCM、量子点等现有的物质测定技术中直接应用等，因此，产业上的利用性也很高。


图1为表示本发明实施例中HBsAg基因的各蛋白质区域的模式简图。1～8表示表面抗原的各部位的作用。
图2为举例说明本发明实施例中使用基因重组酵母的HBsAg粒子的表达及纯化操作的简图。(a)基因重组酵母的制作，(b)在High-Pi培养基中培养，(c)在8S5N-P400培养基中培养，(d)破碎，(e)密度梯度离心分离，(f)HBsAg粒子。
图3表示本发明实施例中HBsAg粒子产生的SPR信号放大效果。X轴表示反应时间(sec)，Y轴表示信号大小。
图4为本发明实施例中pGLDLIIP39-RcT GFP的模式简图。His6-GFP插入限制酶NotI部位之外的部分如图1所示。
图5为表示用SPR测定本发明实施例中GFP融合粒子的传感信号放大效果的结果的图。X轴表示反应时间(sec)，Y轴表示信号大小。
图6为表示本发明实施例中由GFP融合粒子形成的平面膜状生物识别分子排列体的非特异结合抑制效果和生物识别分子的排列效果的图。X轴表示反应时间(sec)，Y轴表示信号大小。
图中符号说明1、释放抑制2、受体3、糖链14、聚合血清白蛋白受体
5、跨膜6、稳定化7、糖链28、跨膜 低聚合化·分泌本说明书包括作为本申请优先权基础的特愿2004-104702号说明书中记载的内容。
具体实施例方式
本发明为生物识别分子与蛋白质结合形成的传感工具，该蛋白质具有引入脂质双层膜形成纳米大小的粒子的能力。
本发明优选结合为共价结合的传感工具。
本发明优选纳米大小的粒子为中空纳米粒子的传感工具。
本发明优选蛋白质为病毒表面抗原蛋白质的传感工具。
本发明优选蛋白质为B型肝炎病毒的表面抗原蛋白质的传感工具。
本发明优选蛋白质为具有引入来源于真核细胞的脂质双层膜形成纳米大小的粒子的能力的蛋白质的传感工具。
本发明优选蛋白质为具有引入来源于酵母的脂质双层膜形成纳米大小的粒子的能力的蛋白质的传感工具。
本发明优选蛋白质为具有引入来源于动物或昆虫细胞的脂质双层膜形成纳米大小的粒子的能力的蛋白质的传感工具。
本发明优选生物识别分子为细胞功能调节分子的传感工具。
本发明优选生物识别分子为抗原、或抗体、或抗体的一部分、或抗体类似物的传感工具。
本发明优选生物识别分子为与配体物质结合的细胞表面或细胞内部的受体蛋白质、或其变体、或其一部分、或与其结合的物质的传感工具。
本发明优选生物识别分子为酶、或其变体、或其一部分、或与其结合的物质的传感工具。
本发明优选使选自荧光分子、发光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一种以上分子与生物识别分子结合的传感工具。
本发明优选使选自荧光分子、发光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一种以上分子与具有形成粒子能力的蛋白质结合的传感工具。
本发明优选使选自荧光分子、发光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一种以上分子与脂质双层膜结合的传感工具。
本发明优选使选自荧光分子、发光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一种以上分子包埋于中空纳米粒子的传感工具。
本发明优选采用纳米大小的粒子在基板上排列形成的平面膜状生物识别分子排列体的传感工具。
本发明为一种使用传感工具的生物传感方法，该传感工具是具有引入脂质双层膜形成纳米大小的粒子的能力的蛋白质与生物识别分子结合构成的。
在本发明中所谓“脂质双层膜”是指厚度为5～20nm的由2层脂质层构成的膜，在各层中两性脂质的极性头部与亲水性溶剂接触，非极性的烃部分朝向双层的内部。作为脂质双层膜的例子，可以举出细胞膜或核膜、内质网膜、戈尔吉体膜、液泡膜之类活细胞中的生物膜，或人工制作的脂质体等。其中，更优选来源于内质网膜的脂质双层膜。作为脂质双层膜，优选来源于真核生物，例如动物细胞、植物细胞、真菌细胞、昆虫细胞等的脂质双层膜，特别优选来源于酵母的脂质双层膜。
本发明中所谓“识别”是指2种以上物质根据相互的结构或性质特异地结合。此结合通过共价键、离子键、疏水键、氢键、金属键等所有分子间相互作用而形成，即使被识别的对象物质包含在杂质中也能特异地结合。
本发明中“生物识别分子与具有形成粒子的能力的蛋白质结合”的方式无特殊的限定，但优选生物识别分子根据基因工程方法通过共价键与“具有形成粒子的能力的蛋白质”融合(肽键)，即生物识别分子与“具有形成粒子的能力的蛋白质”以在细胞中作为融合蛋白质被表达的状态下形成粒子，或生物识别分子通过物理的或化学的修饰或吸附等方法与“具有形成粒子的能力的蛋白质”结合。此处所谓的“物理的或化合的”修饰或吸附是指利用例如离子键、疏水键、氢键、金属键、或二硫键等共价键等，或通过上述组合的修饰或吸附。
当然，可以是多个生物识别分子与“具有形成粒子的能力的蛋白质”结合。也可以将多个生物识别分子组合形成一个生物识别分子。此时，生物识别分子之间的结合方式没有特殊的限定，可以通过共价键、离子键、疏水键、氢键、金属键等，或其相互组合形成。
本发明中所谓“中空纳米粒子”是指纳米尺寸的粒子，优选直径为20～500nm、更优选50～200nm、进一步优选为80～150nm的粒子，是粒子内部具有装入多种物质(例如，荧光色素或蛋白质、核酸、化合物等)的空间的粒子。该空间不一定是气体类空间，也可以是能够稳定地维持进入内部的物质的溶液类空间。
本发明中所谓的“配体物质”是指激素(用于沟通(communicate)生物个体中某部位细胞与其他部位细胞的分子)或生长因子(控制细胞增殖的物质)、神经递质(在突触传递神经信息的物质)之类与对应受体结合后传递细胞内或细胞间的信号的物质，包括肽或蛋白质或甾体性或低分子化合物。
本发明中所谓“细胞表面”是指细胞壁或细胞膜中或其表面。上述配体物质可以通过下述方法获得，即由活细胞纯化的方法；通过基因重组制作表达配体物质的质粒，使用大肠杆菌或酵母、昆虫、动物、植物等细胞、或不用细胞的无细胞蛋白质合成体系进行生产、纯化的方法或化学合成。
本发明中所谓的“细胞内”是指由细胞膜包围的全部部分。另外所谓“受体蛋白质”是指与配体物质结合，参与细胞内或细胞间信号传递的一系列蛋白质群，作为其例，例如有鸟嘌呤核苷酸结合蛋白或核内受体之类蛋白质群，其存在于细胞膜或细胞内，与激素等配体物质结合，从而将此信号从细胞外向细胞内或从细胞质向细胞核传递；或与作为配体物质的生长因子结合的受体酪氨酸激酶或肾上腺素受体之类的识别神经递质传递其信号的蛋白质群等。
本发明中所谓“受体蛋白质”，除上述以外，还包括存在于细胞各膜内、参与金属离子等的主动转运的蛋白质群。上述“受体蛋白质”通过下述方法获得，例如，由活细胞纯化的方法；通过基因重组制作表达配体物质的质粒，使用大肠杆菌或酵母、昆虫、动物、植物等细胞、或不用细胞的无细胞蛋白质合成体系进行生产、纯化的方法或化学合成。本发明中“受体蛋白质”不需要全长，只要具有与配体特异结合的能力即可，可以为伴有氨基酸取代·缺损·附加等的变体或受体蛋白质的一部分。
本发明中所谓“酶”为通过在细胞内外修饰、剪切、融合、变性、结合核酸或糖、脂质、或其他的蛋白质而控制细胞生命现象的一系列蛋白质群，例如可以举出蛋白酶或磷酸·糖链修饰酶、核酸裂解(限制)酶、糖·脂质分解酶、核酸·蛋白质·糖·脂质的生物合成酶等，并且其自身无活性但有助于其他酶的活性的辅酶也包括在其中。
本发明中作为受体蛋白质或酶的“变体”，包括通过基因工程技术在蛋白质的一处或多处发生氨基酸取代而形成的变体，或从蛋白质的全长中切除一部分或增加新的蛋白质序列形成的变体，及通过核酸·糖·脂质·化合物等对蛋白质的一部分进行修饰形成的、且具有识别与突变前的受体蛋白质或酶作为生物识别分子识别的目标分子相同的分子的活性的变体。为制作上述变体，使用用于在含有表达该蛋白质的基因的环状质粒上进行氨基酸的缺失、置换或附加的引物以及QuikChange定点突变试剂盒(site-directed mutagenesis kit)、或QuikChange多点突变试剂盒(multi site-directed mutagenesis kit)、或QuikChange XL定点突变试剂盒(STRATAGENE社)等用于引发突变的试剂盒，进行12～18个PCR循环，用限制酶DpnI剪切其产物，转化至大肠杆菌中即可制作变体。作为通过核酸·糖·脂质·化合物等对蛋白质的一部分进行修饰的具体例子如下，利用磷酸化酶的蛋白质中丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸化，利用糖基化酶的天冬氨酸、或丝氨酸、或苏氨酸残基的糖基化，或利用还原·烷基化剂的半胱氨酸残基的还原·烷基化，为制作上述物质，可在蛋白质中混入磷酸、或糖链等，加入磷酸化酶或糖基化酶，维持此酶发挥作用的最佳条件(温度、pH、盐浓度等)，或在加入了蛋白质的溶液中加入还原剂二硫苏糖醇或巯基乙醇等使其最终浓度为5mM，在温度为60℃左右、pH为中性以上的条件下，反应1小时，再加入作为烷基化剂的浓度为5～15mM的碘乙酰胺，在室温下反应1小时以上。当然除上述举出的修饰外，还可以考虑针对蛋白质的各种修饰。
另外，本发明中所谓受体蛋白质或酶的“一部分”是指通过基因工程或蛋白质工程取出或合成的具有上述蛋白质全部或部分特性的一部分序列(至少5个以上的氨基酸连续一致的序列)，该序列具有能够识别与整体的受体蛋白质或酶所能识别的目标物质相同的物质的活性。
另外，本发明中所谓与受体蛋白质或酶“结合的物质”是指能够与受体蛋白质或酶的活性部位特异结合的物质，如受体蛋白质的配体物质、或酶的底物或抑制剂。或是指在细胞内与上述蛋白质稳定地结合存在的物质，或者通过结合来维持其结构的物质，或发挥辅助或补充其活性的作用的物质，例如，在核内受体中辅助分子伴侣蛋白或酶的活性的金属离子等辅酶，或具有将受体或酶准确地转运至细胞内特定部位或将膜结合型受体蛋白质·酶固定到膜上的作用的一系列膜蛋白质群等。
本发明中所谓“具有荧光、或发光、或吸光、或放射性同位素的蛋白质、或蛋白质衍生物”是指绿色荧光蛋白质或其变体之类的蛋白质自身接受一定波长的光后发出荧光的蛋白质、或通过使用化学修饰法与发出荧光的化合物结合的蛋白质；或荧光素酶、HRP、或AP之类具有使底物发光的活性的蛋白质、或与上述蛋白质结合的蛋白质；或血红素蛋白之类对特定波长具有强吸收的蛋白质、或与具有光吸收能力的化合物结合的蛋白质、或与具有光吸收能力的肽或蛋白质结合的蛋白质；或者半乳糖苷酶或HRP、AP之类能够使底物显色的蛋白质、或与上述蛋白质结合的蛋白质；或通过向蛋白质表达时的培养基中加入放射性同位素H3或C14、N15、P32、S35、Co57、Se75、I125等，或通过化学修饰进行标记的蛋白质。另外，作为上述蛋白质的衍生物，是指通过采用基因工程方法或蛋白质工程方法剪切一部分蛋白质，与其他分子即核酸或糖链、脂质、其他蛋白质、或化合物共价结合的物质，另外，蛋白质衍生物还包括使用化学修饰法或酶等使化合物与蛋白质共价结合形成的物质、或用糖基或核酸、脂质等修饰蛋白质形成的物质。此时，荧光、发光、吸光、或放射性同位素可以不标记在蛋白质自身上，而是标记在蛋白质衍生物中的与蛋白质结合的核酸、糖链、脂质等上。
本发明中所谓的带有荧光的“化合物”是指吸收特定波长的光后，在与吸收波长不同的波长范围内发出荧光的物质，例如可以举出，荧光素、罗丹明、丹酰、荧光黄VS、伞形酮酰、稀土螯合物、Cy2、Cy3、Cy5、异硫氰酸荧光素(FITC)、ALEXA(注册商标)(Molecular Probe社)、量子点等。本发明中所谓“基板”，如果为金属、塑料、有机·无机高分子材料，则没有特殊限定，但优选使用例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚砜、聚四氟-特氟隆(polytetrafluoro-Teflon)(PVDF)、纤维素、硅、云母、聚甲基戊烯(PMP或TPX(注册商标))、聚苯乙烯(PSt)、聚四氟乙烯(PTFE)、ABS树脂、聚二甲基硅氧烷(PDMS)等树脂，含有上述高分子化合物的共聚物或复合体，石英玻璃、Pyrex(注册商标)玻璃、苏打玻璃、硼酸玻璃、硅酸玻璃、硼硅酸玻璃等玻璃类及其复合体，金、银、铜、镍、钴等金属及其复合体，陶瓷及其复合体等。另外，优选用上述物质覆盖基板的整个表面或至少覆盖进行传感的部分表面。当然上述基板材料也可以多种组合使用。例如，优选使用金属覆盖玻璃基板的组合或用金属覆盖树脂基板的表面形成的基板等。另外，本发明的“基板”也包括为了易于传感利用亲水性聚合物(例如，聚乙二醇或聚乙烯醇等)对表面进行覆盖或接枝(graft)等处理的基板、或疏水化基板、自由基(radical)化基板、用抗体等蛋白质或DNA等核酸或糖等覆盖、修饰、处理上述基板得到的基板。
本发明中所谓“平面膜状生物识别分子阵列体”是指通过本发明定义的中空纳米粒子与基板结合，使基板处于由粒子覆盖的状态。此制作可采用下述方法，例如使中空纳米粒子物理吸附于基板表面的方法、或通过事先用与本中空纳米粒子特异地结合的蛋白质或肽、核酸、糖链、脂质、金属等修饰基板表面，从而使中空纳米粒子表面的蛋白质或脂质或糖链等能够与基板特异结合的方法等。在本发明的“平面膜状生物识别分子排列体”中，根据需要，中空纳米粒子可以以粒子状与基板结合，或粒子与基板结合后通过干燥或超声波处理、电击等方法破坏粒子，形成平面膜状的膜与基板结合，因此“平面膜状生物识别分子阵列体”的厚度为5nm～500nm。本发明中“平面膜状生物识别分子阵列体”的特征为，本发明的粒子通过“具有形成粒子能力的蛋白质”自我组织化形成，因此，与“具有形成粒子能力的蛋白质”结合的生物识别分子以高密度且有规则地排列在由粒子制作的“平面膜状生物识别分子阵列体”的表面，这在传感的精度·灵敏度方面是合适的。并且，还具有下述特征，即在本“平面膜状生物识别分子阵列体”表面，“具有形成粒子能力的蛋白质”以外的部分由脂质双层膜构成，难于引起与不参与反应的杂质的非特异结合。
本发明的具有含有脂质和蛋白质且为中空结构的纳米大小的粒子的微量生物传感工具及使用其的传感方法，通过在具有形成粒子能力的蛋白质上结合生物识别分子，显著地放大其传感信号，并且特异地识别各种目标分子，因此通过该发明，也能够传感检测至今难于或不可能传感检测的生物体内或环境中的微量成分。
此处，所谓“传感工具”是指通过将目标物质固定在基板上、并且结合中空纳米粒子检测荧光、发光、吸光、放射性强度等的变化的装置，其中所述中空纳米粒子含有识别目标物质的生物识别分子；或是指通过向含有目标物质的溶液中加入结合有识别目标物质的生物识别分子的该中空纳米粒子，检测浊度、荧光、发光、吸光等的变化的装置。本发明的“传感工具”也包括将该粒子作为“平面膜状生物识别分子阵列体”固定在基板上，与目标物质结合，或在将该粒子固定在溶液中、或基板上的状态下，与目标物质结合后，再与含有识别目标物质的其他生物识别分子的该粒子反应，通过三明治(sandwich)方式传感检测目标物质的装置。另外，本发明的“传感工具”还包括为进一步增强传感灵敏度而实施各种改变的装置。例如，如下的中空纳米粒子装置也是本发明的变形例之一，即，用识别固定于基板上的目标物质的抗体处理该目标物质，使用在粒子表面结合有能够特异性识别上述抗体的其他抗体、并且荧光、或发光、或吸光、或放射性同位素被呈递至其表面或包埋于其中的中空纳米粒子。本发明涉及的生物传感工具中的中空纳米粒子如图1所示，具有在细胞内能够高水平表达蛋白质的启动子序列，其下游为蛋白质的起始密码子，之后连接能够将蛋白质运送到内质网的信号蛋白序列与“具有形成粒子能力的蛋白质”序列，且在信号蛋白序列和“具有形成粒子能力的蛋白质”序列之间，或在“具有形成粒子能力的蛋白质”序列内部或下游导入生物识别分子序列，该中空纳米粒子可以如下制备制备具有上述序列的表达载体，将其转化至细胞中，诱导中空纳米粒子表达，之后经纯化制备得到中空纳米粒子。
实施例1和2中举例说明使用酵母表达·纯化中空纳米粒子。此处，作为制备中空纳米粒子的细胞只要是具有脂质双层膜，特别优选具有内质网，没有特殊的限定，优选使用真核生物细胞，例如动物细胞、植物细胞、真菌细胞、昆虫细胞等，特别优选酵母。其原因在于，酵母具有易于处理、容易进行重组，并且蛋白质的表达效率优良等优选性质。
使用此中空纳米粒子的本发明生物传感工具，通过组合“基板”、“中空纳米粒子”及“检测器”而构成，其中“基板”用于与含有被传感检测的目标物质的试样结合；“中空纳米粒子”能够从与基板结合的试样中特异地传感检测出目标物质，结合用于放大传感信号的能够特异地识别目标物质的生物识别分子，并且将荧光、或发光、或吸光、或放射性同位素呈递至其表面或包埋于其中；“检测器”能够检测来源于中空纳米粒子的荧光、或发光、或吸光、或放射性同位素的量。使用上述工具的传感检测按下述进行使试样与基板结合，在其上与中空纳米粒子反应后，冲洗未与被传感检测的目标物质结合的中空纳米粒子，之后通过检测器检测基板上残留(即，与被传感检测的目标物质特异性结合)的中空纳米粒子发出的荧光、或发光、或吸光、或放射性同位素的量，从而完成传感检测。此处，试样与基板结合的方法有通过干燥试样使其成为粉末状态或使其悬浊或溶解在溶液中与基板反应，引起物理吸附的方法；或预先用与被传感检测的目标物质特异结合的蛋白质或肽、核酸、糖链、脂质、金属、平面膜状生物识别分子阵列体等修饰基板，使被传感检测的目标物质特异地与基板表面结合的方法。此处，为了促进基板与被传感检测的目标物质之间或目标物质与中空纳米粒子之间的结合，优选对反应体系进行振动、或旋转、或温度控制等。
作为此传感工具的具体用途之一例，例如，可用于对某种疾病患者的血液中特异存在的蛋白质的存在或含量进行确认·定量，具体方法如下，使该特异存在的蛋白质的抗体或抗体的一部分与基板结合，更优选使用平面膜状生物识别分子阵列体在阵列状态下结合，使患者的血液与基板反应，患者特有的蛋白质与基板上的抗体结合·排列后，使用如下所述的中空纳米粒子识别与基板结合的患者特有的蛋白质，所述中空纳米粒子是表面结合有特异识别上述蛋白质的其他抗体，并且荧光、或发光、或吸光、或放射性同位素被呈递至其表面或包埋于其中的中空纳米粒子，通过测定来源于中空纳米粒子的荧光、或发光、或吸光、或放射性同位素的量对该蛋白质的存在或含量进行确认·定量。使用此生物传感工具的传感检测，由于具有放大微量信号的效果，所以当患者特有的蛋白质为nmol以下极微量时，发挥其威力。另外，也能够应用于环境激素的测定，以二氧芑为例进行说明，“AhR”蛋白质为哺乳动物体内的二氧芑受体，在阵列状态下将“AhR”蛋白质全长或只有二氧芑结合部位与SPR用金属基板结合，从可能被二氧芑污染的土壤、河水、母乳等中获得的经过粗制、或未经处理的试样与基板反应，用不含二氧芑的缓冲液清洗基板后，使表面结合有与二氧芑-AhR结合体特异地结合的核内蛋白质“ARNT”或二氧芑抗体的中空纳米粒子与基板反应，根据其表面等离振子的变化，对试样中二氧芑的有无或含量进行确认、定量。
使用本发明的生物传感工具测定环境激素，除SPR以外，还可以采用使用QCM的方法或使用将荧光、或发光、或吸光、或放射性同位素呈递至其表面或包埋于其中的中空纳米粒子的传感方法等。此时，环境中二氧芑的量非常少，一般情况下，为了定量必须进行从试样中萃取二氧芑再进行高度浓缩的前处理，需要数日至数周较长时间，期望通过本发明传感工具的信号放大效果，即使不进行前处理或通过比较简单的前处理也能进行测定，且测定时间也缩短至数小时～数日。
另外，作为本发明传感工具的其他用途之一例，含有作为被传感检测的目标物质的蛋白质或核酸等的试样通过SDS-PAGE或琼脂糖凝胶等进行电泳后，在电或渗透压的作用下转印(transfer)至PVDF或纤维性膜上，使转印后的膜在含有如下所述的中空纳米粒子的缓冲液中反应，即结合有能够特异地识别目标物质的生物识别分子结合，并将荧光、发光、吸光、或放射性同位素呈递至其表面或包埋于其中的中空纳米粒子，转印到膜上的目标物质或核酸等与中空纳米粒子结合。之后用不含中空纳米粒子的缓冲液清洗未结合的中空纳米粒子，检测残留在膜上的来源于中空纳米粒子的荧光、发光、吸光、或放射性同位素的量。
作为由“具有形成粒子的能力的蛋白质”构成的中空纳米粒子，能够举出通过在真核细胞中表达蛋白质获得的中空纳米粒子。即，当在真核细胞中表达“具有形成粒子的能力的蛋白质”时，该蛋白质作为膜蛋白质表达、蓄积在内质网膜上，作为粒子释放。此时，作为真核细胞能够使用酵母或昆虫细胞等。在本发明中酵母或动物细胞、昆虫细胞中还包括基因重组的酵母或动物细胞、昆虫细胞。使用酵母形成中空纳米粒子的方法，从由菌体内的可溶性蛋白质以高效率生成粒子的方面考虑，是优选的方法。另一方面，昆虫细胞可以说是比酵母更加接近高等动物的真核细胞，从能够修饰用酵母不能修饰的糖链等高级结构的方面考虑，可以说是在外源蛋白质的大量生产中优选的方法。
由于目前的昆虫细胞类使用杆状病毒且伴有病毒粒子的表达，因此，在蛋白质表达时细胞易于死亡或溶解。结果，存在从死亡细胞中游离出的蛋白酶分解表达的蛋白质的问题。另外，分泌表达蛋白质时，由于蛋白质中混入大量培养基中含有的胎牛血清，所以多存在即使分泌到培养基中也难于纯化的情况。但是最近，Invitrogen社开始销售不使用杆状病毒的昆虫细胞系或无血清培养试剂。所以，通过利用上述材料，能够得到易于纯化并且能够维持高级结构、糖基化修饰的蛋白质粒子。作为上述“具有形成粒子的能力的蛋白质”能够使用从多种病毒中获得的亚病毒粒子。具体可举出，B型肝炎病毒(Hepatitis BVirusHBV)或C型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)、微小病毒(microvirus)、噬菌体病毒(phage virus)、腺病毒(adeno virus)、Hepasonavirus、Parbo virus、乳多空病毒(papova virus)、逆转录病毒(Retrovirus)、呼肠孤病毒(Reo virus)、冠状病毒(Corona virus)、家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus)等表面抗原，或多角体蛋白等。
发明人等发现并报道了如下制备的中空纳米粒子，即，如后述实施例所示，通过采用基因重组酵母表达前述HBV表面抗原L蛋白质，能够形成短径约为20nm、长径约为150nm的椭圆状中空纳米粒子，该中空纳米粒子利用HBV表面抗原L蛋白质在来源于酵母内质网的脂质双层膜中包埋大量的该蛋白质(J.Bio.Chem.，Vol.267，No.3，1953-1961，1992)。上述粒子，由于完全不含HBV基因组或其他HBV蛋白，所以不具有作为病毒的功能，对人体的安全性极高。进而，使用酵母生产该中空纳米粒子，由于不使用对人体有病原性危险的牛血清，因此，对人体的安全性进一步提高。
本发明的含有脂质的中空纳米粒子中，通过将根据如上所述的各种方法获得的粒子表面的“具有形成粒子能力的蛋白质”变为任意的生物识别分子或与任意的生物识别分子相结合，能够特异地识别各种物质(核酸、蛋白质、肽、及化合物等)，显著地增强其传感灵敏度。
当然，“具有形成粒子能力的蛋白质”并不仅限于上述B型肝炎病毒表面抗原蛋白质，只要是能够形成粒子的蛋白质即可，可以使用任一种蛋白质。例如来源于动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、病毒、噬菌体、细菌类、菌类等的天然蛋白质或通过基因重组获得的蛋白质、各种合成蛋白质等，但优选使用来源于病毒的蛋白质，进一步优选来源于肝炎病毒的蛋白质，更优选来源于B型肝炎病毒的蛋白质。
作为与“具有形成粒子能力的蛋白质”结合的生物识别分子，例如可以举出细胞功能调节分子。在本发明中所谓“细胞功能调节分子”是指能够控制细胞生存所必需的各种生命现象的因子，例如，抗体或抗体类似物、各种抗体的抗原物质、与抗体结合的蛋白质、生长因子、细胞因子、酶、细胞表面或内部的各种配体物质的受体蛋白、生物激素或环境激素、伴侣蛋白、淀粉样蛋白等。实际作为生物识别分子使用时，不一定需要上述列举分子的全长，可以为其一部分或衍生物。上述生物识别分子的组成为，蛋白质或肽、核酸、糖链、脂质等和其衍生物，例如经糖链或磷酸、化合物等修饰的蛋白质或肽、或核酸等。同样也可以为用蛋白质、肽、核酸等修饰的糖或脂质。
作为本发明的“细胞功能调节分子”的获得方法，例如，用各种纯化柱从活细胞中纯化的方法或通过基因重组制作表达细胞功能调节分子的质粒，使用大肠杆菌或酵母、昆虫、动物、植物等的细胞、或不用细胞的无细胞蛋白质合成体系进行生产、纯化的方法等。采用基因重组法时，为了便于纯化，也可以在细胞功能调节分子中加入组氨酸标签(His-tag)等标签物质。作为未加入标签简单地表达·纯化细胞功能调节分子的方法，也可以使用无细胞体系的纯化体系(puresystem)(PGI社)的方法。另外，作为本发明的生物识别分子的细胞功能调节分子不为蛋白质时(例如，核酸或类固醇物质等)可以通过从生物体纯化或化学合成进行制备。
在本发明中所谓“抗体类似物”是指从生物体获得的抗体以外的能够特异性地识别成为抗原的物质的来自生物体的或人工合成的化合物，例如可以举出，通过基因重组只改变抗体的抗原识别部位得到的单链抗体(single chain antibody)或亲和抗体(affibody)、或能够特异识别含有被DNA结合蛋白质特异地识别的DNA序列的核酸分子或核酸的某段序列的蛋白质、或能够特异地识别淀粉状纤维结构的蛋白质或化合物等。可以根据目标物质(蛋白质、核酸、化合物、细胞、或组织等)适当选择上述物质。作为此抗体类似物的获得方法，可以举出根据基因重组制备表达抗体类似物的质粒，使用大肠杆菌或酵母、昆虫、动物、植物等的细胞、或不用细胞的无细胞蛋白质合成体系进行生产、纯化的方法；或用蛋白质分解酶等剪切抗体，对其一部分进行纯化、使用的方法；或当抗体类似物不是蛋白质时，可以使用通过化学合成或从细胞萃取所得的产物等。采用基因重组方法时，为了简便纯化也可以在抗体类似物中加入组氨酸标签等标签物质。作为不加入标签简单地表达·纯化抗体类似物的方法，也可以使用无细胞体系的纯化体系(PGI社)的方法。当然，本发明中的“生物识别分子”并不仅限于细胞功能调节分子，具有与被传感检测的目标物质特异结合的能力的分子均能满足要求。
另外，制备本粒子时，根据目的可以采用多种方法。例如，也可以通过电穿孔、或超声波、或自然扩散法等方法，将能够发出荧光、或发光、或吸光、或放射性同位素的物质包埋在中空纳米粒子中，放大传感信号。此时所谓的“电穿孔”是指通过电击导入物质的方法，根据包埋物质的性质或浓度等的不同，最佳条件也不同，但一般为在约200mV～1000V的电压下经几毫秒～几分钟的处理，可在粒子中包埋多种物质。通过超声波或自然扩散法的包埋，是通过使中空纳米粒子和待包埋的物质在水或缓冲液中共存，并进行搅拌或静置，或在10～400瓦特的强度下超声波处理10秒～2小时后完成。另外，可以通过化学修饰法或基因工程方法在“具有形成粒子的能力的蛋白质”的一部分上结合除目标生物识别分子之外的下列物质用于纯化本粒子的标签蛋白质、或用于简化传感检测的发出荧光、发光、吸光、或放射性同位素的物质、还有为了使上述蛋白质的一部分固定在各种传感基板(使用SPR或QCM等特异性传感物质时的基板)上的物质等，由此可以使多个分子同时与一个中空纳米粒子结合。多个分子与上述粒子表面(粒子的外侧或内侧)的结合，可以不是通过一个表达载体，而是通过分别使不同的分子与“具有形成粒子能力的蛋白质”结合形成的多个表达载体同时在一个细胞中表达而完成。使蛋白质呈递至表层的技术，已知有噬菌体展示法或使蛋白质呈递至酵母表层的方法、抗体等与聚合物或金属制粒子表面结合的方法(Szardenings M，J.ReceptSignal Transduct Res.，23，307-349，2003；植田充美，Bioscience andIndustry，55，253-254，1997；植田充美，村井稔幸，生物工程，76，506-510，1998)等。但上述技术在安全性或粒子尺寸或制作容易性等方面存在问题，在作为传感系统的应用中受到限制。由于本申请的纳米大小的粒子为纯化的蛋白质粒子，所以无感染性、不易受溶剂等环境变化的影响。另外，从可操纵性的方面来看，优选直径为20～500nm，更优选为50～200nm。此外，作为该纳米大小的粒子的应用，如发明人等的论文Anal.Biochem.，Vol.309，196-119，2002所述，由于本发明的纳米大小的粒子在硅等基板上展开形成平面膜结构，所以，与粒子表面结合的蛋白质通过脂质双层膜排列在基板上，从而形成“平面膜状生物识别分子阵列体”。同时，在基板上此“平面膜状生物识别分子阵列体”覆盖脂质双层膜，从而具有防止目标蛋白以外的蛋白质等非特异地附着到基板上的效果。
如上所述，本发明的使用中空纳米粒子的生物传感工具，为了排列与粒子表面结合的蛋白质的方向性或防止非特异性附着，也可以在基板上展开中空纳米粒子传感检测物质。此外，本发明的使用中空纳米粒子的生物传感工具也可以用作ELISA法中常用的三明治方式的传感工具，即，使被传感检测的目标物质与“平面膜状生物识别分子阵列体”结合后，从其上方再用其它中空纳米粒子传感检测目标物质，由此能够抑制对基板的非特异性吸附，同时提高目标物质的传感灵敏度。因此，通过本发明的使用中空纳米粒子的生物传感工具利用各种应用，能够获得目前生物传感工具不能得到的灵敏度和特异性。
如上所述，本发明涉及生物传感工具及使用该工具的传感方法，所述传感工具使用特征为含有脂质和蛋白质且为中空结构的纳米大小的粒子，其中，该粒子物理性质非常稳定，由于在粒子表面含有脂质膜成分而产生流动性，而且能够抑制物质的非特异吸附。其特征为，与将蛋白质呈递至细菌或病毒等的表面的方法相比较，本发明的方法安全，且由于粒子直径在100nm左右，也易于应用于SPR等现有的生物传感方法，能够有效地放大微量传感信号。此外，由于使用该工具能够有效地放大传感检测极微量存在的分子时的信号，所以可以应用于以简便或高灵敏度地传感检测生物体或环境中微量成分为目的的多种领域，如蛋白质芯片、医疗中诊断标记的传感·评价、环境物质测定、生物化学的物质测定·分析等。
实施例以下，根据附图列举实施例，更加详细地说明本发明的实施方案。当然，本发明并不仅限于下述实施例，也可以在细节部分作多种改变。
在以下实施例中，使用实施例1和3的组合了与金属基板结合的中空纳米粒子和金属基板的SPR装置或实施例2的组合了带有抗组氨酸标签的96孔板和GFP融合粒子以及荧光平板读数仪的荧光中空纳米粒子测定装置作为本发明的传感工具。
在以下实施例中，所谓HBsAg表示B型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B virus surface Antigen)。HBsAg是HBV的包膜蛋白，如图1的模式图所示，在HBsAg中有S蛋白、M蛋白、L蛋白3种蛋白。其中S蛋白是3种蛋白中共有的且重要的包膜蛋白，M蛋白是在S蛋白的N末端侧延伸55个氨基酸(pre-S2肽)的蛋白。另外，L蛋白是在M蛋白的N末端侧延伸108或119个氨基酸(pre-S1肽)的蛋白。已知HBV与肝细胞结合时，HBsAg L蛋白的Pre-S区域(pre-S1、pre-S2)分别发挥重要的作用。Pre-S1具有与肝细胞直接结合的部位，pre-S2具有通过血中聚合白蛋白与肝细胞结合的聚合白蛋白的受体。在真核细胞中表达HBsAg时，该蛋白作为膜蛋白表达、蓄积在内质网上。HBsAg的L蛋白在分子间引起凝集，进入内质网的同时以芽殖方式作为粒子释放到腔(lumen)侧。在以下的实施例中，使用HBsAg的L蛋白和其变体。图2为以下实施例所述的HBsAg粒子的表达及纯化操作的说明简图。
1、利用基因重组酵母表达HBsAg粒子根据发明人等报道的J.Bio.Chem.，Vol.267，No.3，1953-1961，1992中记载的方法，在合成培养基High-Pi及8S5N-p400中培养具有pGLDLIIP39-RcT的基因重组酵母(酿酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)AH22R-株)，表达HBsAg L蛋白粒子。(图2a、b)使用酵母蛋白提取试剂(Yeast Protein Extraction Reagen)(Pierce ChemicalCo.制)，由处于稳定期(约72小时后)的基因重组酵母配制全细胞提取液(whole cell extract)，所得提取液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离，通过银染色和使用HBs蛋白抗体的免疫印迹法(western blotting)(初级抗体抗HBsAg单克隆抗体)，鉴定试样中的HBsAg蛋白。
2、从基因重组酵母中纯化HBsAg粒子(1)将在合成培养基8S5N-P400中培养的基因重组酵母(湿重量26g)悬浊于100ml缓冲液A(7.5M尿素、0.1M磷酸钠、pH7.2、15mMEDTA、2mM PMSF、0.1％Tween 80)中，在珠磨式组织研磨器(BEAD-BEATER)中使用玻璃微珠(glass beads)破碎酵母。破碎后通过离心回收上清液(图2c，d)。
(2)然后，将上清液与0.75倍容量的33％(w/w)PEG6000混合，冰浴冷却30分钟。之后，进行离心(7000rpm，30分钟)，回收沉淀(pellet)。使该沉淀再次悬浊于不含Tween80的缓冲液A中。
(3)将再次悬浊的溶液叠放于具有10～40％梯度的CsCl上，以28000rpm超速离心分离16小时。将离心后的试样分成12级分，通过免疫印迹法鉴定含有HBsAg的级分。再用不含Tween80的缓冲液A透析含有HBsAg的级分。
(4)将(3)中得到的透析液(12ml)叠放于具有5～50％梯度的蔗糖上，以28000rpm超速离心分离16小时。离心后，与(3)相同地鉴定含有HBsAg的部分，用不合尿素和Tween80、而含有0.85％NaCl的缓冲液A透析含有HBsAg的级分((2)～(4)图2e)。
(5)反复进行与(4)相同的操作，用超滤器(Ultra Filter)Q2000(Advantech社制)浓缩透析后的试样，于4℃下冷藏保存至使用时(图2f)。根据CsCl平衡离心后的蛋白质印迹法(3)的结果，确认HBsAg为分子量52kDa且具有S抗原性的蛋白质。最终从来自2.5L培养基、湿重量26g的菌体中获得约24mg的纯HBsAg粒子。采用银染色SDS-PAGE分析一系列纯化过程中所得级分。另外，为了确认通过纯化已除去来自酵母的蛋白酶，将(5)中所得的HBsAg粒子在37℃培养12小时后，进行SDS-PAGE，通过银染色进行鉴定。结果确认经一系列的纯化过程完全除去了来自酵母的蛋白酶。
3、利用纳米大小的粒子放大表面等离振子信号在25℃下进行全部的SPR操作。按照上述方法使从酵母中纯化得到的HBsAg粒子以50mg/ml的浓度吸附到日本激光电子社的纳米传感器(Nanosensor)用SPR测定芯片上。作为对照，采用相同方法使牛血清白蛋白(BSA)蛋白质吸附在芯片上，测量两蛋白与SPR的金属基板结合时的信号变化。此结果如图3所示，与BSA相比HBsAg粒子的SPR信号为其6倍以上。利用相同的方法，与GFP、IgG等各种蛋白质的SPR信号相比，结果确认HBsAg粒子与SPR基板结合时的SPR的信号比上述蛋白质放大5～10倍以上。根据上述结果确认，使用本发明中的粒子传感检测物质的方法能够显著地提高其传感灵敏度。
1、利用基因重组制作融合了生物识别蛋白的HBsAgL粒子的表达载体首先，如发明人等报道的日本专利公开2001-316298所述，对根据作者等的报告J.Bio.Chem.，Vol.267，No.3，1953-1961，1992记载的方法制作的pGLDLIIP39-RcT进行修饰，制作本实施例中“融合了生物识别蛋白的HBsAg粒子的表达载体”的“pGLDLIIP39-RcT-GFP”。以下简单说明其制作方法。首先，使用序列号1和2的引物，用限制酶NotI位点(gcggccgc)的序列取代存在于上述pGLDLIIP39-RcT中的HBsAg的L蛋白序列的一部分(3～77编码区)，制作空pGLDLIIP39-RcT。该取代，使用QuikChange(注册商标)定点突变试剂盒(Stratagene社)，并按照该试剂盒附带的说明(protocol)进行，序列号1和2的引物是为了进行上述取代而按照该试剂盒附带的说明设计的互补序列的引物。然后使用序列3和4的引物进行PCR，进行GFP基因的扩增。序列号3的引物，在5’末端具有限制酶NotI位点的序列，在其下游连接有编码6个连续组氨酸残基的序列和识别GFP基因5’末端的29个碱基的序列，另外，序列号4的引物在其5’末端具有限制酶NotI位点的序列，在其下游连接有识别GFP基因3’末端的20个碱基的序列。用限制酶NotI处理通过此序列号3和4的引物扩增的PCR产物，并将其插入·连接在同样地用NotI剪切的上述制作的载体空pGLDLIIP39-RcT中，由此制作空pGLDLIIP39-RcT中插入了N-末端具有组氨酸标签的GFP的载体，即pGLDLIIP39-RcT-GFP(图4)。
2、利用基因重组酵母表达融合了生物识别用蛋白的HBsAgL粒子在合成培养基High-Pi和8S5N-P400中培养具有上述酵母表达载体pGLDLIIP39-RcT-GFP的基因重组酵母(酿酒酵母AH22R-株)，表达与生物识别用蛋白质融合的HBsAg L蛋白粒子。(图2a，b)使用酵母蛋白提取试剂(Pierce Chemical Co.制)由处于稳定期(约72小时后)的基因重组酵母制备全细胞提取液，所得提取液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离，通过银染色和使用组氨酸标签抗体的免疫印迹法鉴定试样中与HBsAg L蛋白融合的生物识别用蛋白。按照发明人等报告的日本专利公开2001-316298中所述的方法将pGLDLIIP39-RcT-GFP转化至酵母AH22R株中。根据上述表明，融合了生物识别用蛋白(GFP的融合)的HBsAg L蛋白的分子量为72kDa。
3、从基因重组酵母中纯化HBsAg粒子(1)将在1L合成培养基8S5N-P400中培养的基因重组酵母(湿重量10g)悬浊于100ml缓冲液A(0.1M磷酸钠、pH7.2、15mM EDTA、2mM PMSF、0.1％Tween 80)中，在珠磨式组织研磨器(BEAD-BEATER)中使用平均直径为0.5mm的玻璃微珠破碎酵母。破碎后通过离心回收上清液(图2c，d)。
(2)然后，使用Amersham社的HisTrap柱(1ml)，利用该社的蛋白质纯化装置(ACTA prime)，通过组氨酸和镍(Ni2+)之间的亲和力纯化上清液。纯化通过下述方式进行，在含有60mM咪唑的PBS(-)(第一制药)缓冲液中使组氨酸标签与镍柱结合，用20ml该缓冲液清洗后，用含有500mM咪唑的PBS(-)缓冲液萃取与镍结合的粒子。通过银染色和使用组氨酸标签抗体的免疫印迹法确认萃取出的蛋白质的纯度。
(3)然后，上述蛋白质通过截留分子量为100kDa的超滤膜(Ultra FilterQ2000(Advantech社制))脱盐、浓缩，于4℃下冷藏保存至使用时。
(4)通过荧光显微镜(Olympus社，BX51)可确认，在510nm的波长处GFP融合的HbsAg纯化粒子发出较强的绿色荧光。
(5)通过上述一系列的纯化操作，最终从来自1L培养基的湿重量为10g的菌体中获得约2mg的纯化粒子。
4、通过GFP融合粒子传感检测抗组氨酸标签抗体将多种浓度的被传感检测的目标物质抗组氨酸标签抗体(Nacalai Tesque，anti-His6 monoclonal)于96孔板(96-well plate)中在4℃下反应(结合)16小时后，在室温下用0.5％的牛血清白蛋白阻断1小时。然后，加入200ml按照上述实施例1的方法从酵母中纯化的GFP融合粒子(浓度50mg/ml)，反应在室温下进行，未反应的粒子用PBS清洗3次后，用荧光平板读数仪(Molecular device社，Spectra Max Gemini EM)，测定延长波长为484nm、发射波长为510nm时与抗组氨酸标签抗体结合的GFP的荧光。作为对照，在相同条件下只测定从大肠杆菌中纯化的具有组氨酸标签的GFP蛋白。结果确认，与只使用GFP的对照组相比，GFP融合粒子能够以非常高的灵敏度与抗组氨酸标签抗体结合，以相对于对照为100倍以上的高灵敏度进行传感检测。(表1)[表1]
采用SPR法传感检测组氨酸标签SPR分析芯片与上述实施例2的浓度为50mg/ml的抗组氨酸标签抗体结合，将其安装在日本激光电子社的纳米传感器上后，在其上同时流过按照上述实施例1的方法从酵母中纯化得到的GFP融合粒子和对照中具有组氨酸标签的GFP蛋白，测定镍基板上的组氨酸标签的传感灵敏度。结果表明，如图5所示，与对照组相比，相同量的抗组氨酸标签抗体的利用SPR的组氨酸标签的传感灵敏度能够大幅度地提高。需要说明的是，也可以使用通过氨基偶联法结合在SPR传感器上的镍络合物代替抗组氨酸标签抗体，得到了同样的结果。
使用SPR传感检测抗组氨酸标签抗体上述实施例2中具有组氨酸标签的GFP融合粒子以1mg/ml的浓度与日本激光电子社的纳米传感器用SPR分析芯片结合，利用GFP融合粒子形成平面膜状生物识别分子阵列体。用PBS清洗未反应的GFP融合粒子后，在分析芯片上加入浓度为2mg/ml的BSA，反应10分钟，用PBS清洗，检测BSA与平面膜状生物识别分子阵列体的非特异结合。之后，在分析芯片上加入浓度为200μg/ml的抗组氨酸标签抗体，反应10分钟。作为不形成平面膜状生物识别分子阵列体的对照组，从大肠杆菌中纯化的具有组氨酸标签的GFP蛋白以1mg/ml的浓度与SPR分析芯片结合，进行相同的实验。其结果如图6所示。
当从大肠杆菌中纯化的具有组氨酸标签的GFP蛋白与SPR分析芯片结合时，可观察到BSA的非特异结合，与其相对，在使GFP融合粒子与SPR分析芯片结合的平面膜状生物识别分子阵列体上，未见BSA的非特异结合。之后，在平面膜状生物识别分子阵列体上加入抗组氨酸标签抗体时，通过抗原-抗体反应的特异结合，能够观察到稳定的信号。因此，本发明的使用中空纳米粒子的平面膜状生物识别分子阵列体能够抑制非特异结合，并且生物识别分子进行排列，适用于高灵敏度的传感。
本说明书中引用的所有出版物、专利及专利申请，直接作为参考引入本说明书中。
产业上的可利用性本发明提供一种利用呈递了生物识别分子的中空纳米粒子、用于有效地传感检测生物体或环境中的极微量成分的通用传感工具及传感方法，该传感工具及传感方法可以应用于要求传感检测极微量成分的多种领域，如蛋白质芯片、医疗领域中诊断标记的传感·评价、环境物质测定、生物化学的物质测定·分析等。
序列表的自由文本序列号1-人工序列说明利用QuikChange(注册商标)定点突变试剂盒定点突变pGLDLIIP39-RcT时使用的引物序列号2-人工序列说明利用QuikChange(注册商标)定点突变试剂盒定点突变pGLDLIIP39-RcT时使用的引物序列号3-人工序列说明利用PCR扩增GFP基因时使用的含有6个连续组氨酸密码子序列的引物序列号4-人工序列说明通过PCR扩增GFP基因时使用的引物序列表<110>东丽株式会社<120>传感工具<130>PH-2429-PCT<140>
<141>
<150>JP2004-104702<151>2004-03-31<160>4<170>PatentIn Ver.3.1<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>发明人谷泽克行发明人黑田俊一发明人郑基晚发明人秋山英雄发明人信正均<220>
<223>人工序列说明利用QuikChange(注册商标)定点突变试剂盒定点突变pGLDLIIP39-RcT时使用的引物<400>1cgacaaggca tgggaggcgg ccgcagccct caggctcag39<210>2<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明利用QuikChange(注册商标)定点突变试剂盒定点突变pGLDLIIP39-RcT时使用的引物<400>2ctgagcctga gggctgcggc cgcctcccat gccttgtcg39<210>3<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明利用PCR扩增GFP基因时使用的含有6个连续组氨酸密码子序列的引物<400>3agcggccgct caggttctca tcatcatcat catcatagtt ctggttcagt gagcaagggc 60gagga 65<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明通过PCR扩增GFP基因时使用的引物<400>4gcggccgctc ttgtacagct cgtccatg 28
权利要求
1.一种传感工具，所述传感工具由生物识别分子与具有引入脂质双层膜形成纳米大小的粒子的能力的蛋白质结合形成。
2.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述结合为共价结合。
3.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述纳米大小的粒子为中空纳米粒子。
4.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述蛋白质为病毒表面抗原蛋白质。
5.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述蛋白质为B型肝炎病毒的表面抗原蛋白质。
6.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述蛋白质为具有引入来自真核细胞的脂质双层膜形成纳米大小的粒子的能力的蛋白质。
7.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述蛋白质为具有引入来自酵母的脂质双层膜形成纳米大小的粒子的能力的蛋白质。
8.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述蛋白质为具有引入来自动物或昆虫细胞的脂质双层膜形成纳米大小的粒子的能力的蛋白质。
9.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述生物识别分子为细胞功能调节分子。
10.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述生物识别分子为抗原、抗体、抗体的一部分、或抗体类似物。
11.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述生物识别分子为与配体物质结合的细胞表面或细胞内的受体蛋白质、该受体蛋白质的变体、该受体蛋白质的一部分、或与该受体蛋白质结合的物质。
12.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述生物识别分子为酶、该酶的变体、该酶的一部分、或与该酶结合的物质。
13.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述传感工具由选自荧光分子、发光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一种以上分子与生物识别分子结合形成。
14.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述传感工具由选自荧光分子、发光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一种以上分子与具有形成粒子的能力的蛋白质结合形成。
15.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述传感工具由选自荧光分子、发光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一种以上分子与脂质双层膜结合形成。
16.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述传感工具是使选自荧光分子、发光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一种以上分子包埋于中空纳米粒子中而形成的。
17.如权利要求1所述的传感工具，其中，所述传感工具使用纳米大小的粒子在基板上排列形成的平面膜状生物识别分子阵列体。
18.一种使用权利要求1所述的传感工具的生物传感方法。
全文摘要
本发明涉及一种使用中空纳米粒子的生物传感工具及传感方法，其中所述中空纳米粒子的特征为，将特定的生物识别分子导入具有引入脂质双层膜形成纳米大小的粒子的能力的蛋白质中。
文档编号G01N33/576GK1954215SQ20058001557
公开日2007年4月25日 申请日期2005年3月29日 优先权日2004年3月31日
发明者谷泽克行, 黑田俊一, 郑基晚, 秋山英雄, 信正均 申请人:东丽株式会社