专利名称：改变微球表面特性的方法
技术领域：
本发明总体上涉及改变微球表面特性的方法。某些实施方式包括将烯醇酸偶联到微球上，对微球表面特性进行改性，这样就能通过烯醇酸将一种试剂偶联到微球上。
相关技术介绍以下描述和实施例并不因为包括在本部分中，而被看作是现有技术。
分光光谱技术广泛应用于化学体系和生物体系分析中。多数情况下，这些技术涉及对目标物吸收或发射电磁辐射的测定。一种这样的应用是用于微阵列领域，它是一种被许多学科采用的技术，包括组合化学和生物检测行业。美国德克萨斯州，Austin的Luminex公司开发出一种系统，该系统可在各种着色的荧光微球表面上进行生物检测。这种系统的一个实例见述于Chandler等的美国专利第5981180号，该专利全文参考结合于本文。在这样的流体流动器件中，利用激光激发微球，当各单独的微球以较高速度通过检测区时，对其进行荧光检测。这种系统生成的测量数据可以很容易地传送到数据库中，用于进一步分析。
一些研究小组和个人也报道了对荧光微球进行多元分析的检测工作，见述于Fulton等，Clin.Chem.，1997，43，1749-1756；Kettman等，Cytometry，1998，33，234-243；McDade等，Med.Dev.Diag.Indust.，1997，19(4)，75-82；McHugh，Methods Cell Biol.，1994，42，575-595；Nikiforov等，NucleicAcid Res.，1994，22，4167-4175；Fulton的美国专利5736330，Chandler的美国专利6046807；Fulton的美国专利6057107；Chandler的美国专利6139800；Chandler等的美国专利6268222；Chandler的美国专利6366354；Chandler的美国专利6411904；Chandler等的美国专利6449562，这些文献都全文参考结合于本文中。
在上述系统中，荧光染料被吸收到微球中和/或结合到微球的表面。染料根据其在该系统选定的检测窗的波长范围内的发光能力进行选择。另外，各检测窗相隔一定的波长，选择的染料要尽可能减少染料荧光信号在相邻检测窗内的重叠。采用两个检测窗和两种染料，每种染料有10个不同的浓度，那么将有100种可通过荧光区分的微球搭配。
过去30年中，由于亲合色谱、固相合成和生物大分子(如蛋白质、寡聚核苷酸等)固定的领域的进步，它们已经进入基于微球的生物医学应用。例如，可将一个或多个生物分子连接到微球表面上。所述一个或多个生物分子根据要进行的具体检测形式进行选择。例如，一个微球群可包括不同子群的微球，每个子群与不同的抗原偶联。子群可与样品结合，然后可以通过检测来确定样品中存在哪些抗原。与微球相结合的生物分子可包括本领域已知的任何生物分子。
通过偶联可以达到生物分子或其他任何此类实体的固定，偶联方式包括微球表面上的活性/稳定反应基团与待固定实体上的特定官能团之间发生的以下作用(1)离子相互作用；(2)吸附；(3)络合(例如“金属配位”的偶联)；(4)共价键。例如，微粒[例如微米球和纳米球；纳米管；金属微粒，包括一种或多种具有任何尺寸、形状或组成的金属；半导体微粒；分子印迹聚合物(MIPS)；磁性微粒；以及其他染色物质]和微滴定板是许多固定系统中常用的固体基质。为确保能固定生物材料以进行足够灵敏的化验，制备并维持固体的官能化活性表面是很重要的。在固体表面上固定生物分子的现有方法通常涉及固体表面上的活化羧基、氨基、羟基或硫羟基与生物分子的反应。这些基团活化之后或引入官能化间隔基之后，活化的基团在固体表面上提供了直接连接生物分子的位置。
但是，当前用来提供直接连接位的基团有许多缺陷。例如，这些官能团中大多数官能团[如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、异硫氰酸酯等]在水性环境中容易发生水解，在不到1小时的时间就失去反应活性(即不具有化学活性)。因此，如果用这些官能团将生物分子连接到固体表面，它们可能在数量、可重复性和均匀性方面随着时间出现不利的变化。
活性微球或官能化微球一般通过对已经适当官能化的单体进行共聚或通过对预形成的微球进行化学改性来产生。后官能化是制备活性微粒的流行方法，如Upson早期在J.Polym.Sci.Polym.Symp.(1985，72，45)上所述，该文献全文参考结合于本文。
几个研究小组报道了制备和评价各种通过改性制得的微粒的近期工作，包括Margel等J.Polym.Sci.1991，A-29，347-355；Anal.Biochem.，1981，128，342-350)、Ugelstad等(Makromol.Chem.，1979，180，737-744；Adv.ColloidInterface Sci.，1980，13，102-140)和Rembaum等(Br.Polym.J.，1978，10，275-280；J. Macromol.Sci.Chem.，1979，A-13，603-632)，它们全文参考结合于本文。R.Arshady在Biomaterials，1993，14，5-15中的一篇综述介绍了经过标记的活性微球的合成与物理化学性质，该文献全文参考结合于本文。
Fray等，Bioconjugate Chem.，1999，10，562-571报道了用耐水解的醛官能团预活化微粒的策略，但观察到这些微球的反应产率小于8％，该文献全文参考结合于本文。Milton的美国专利6146833介绍了酰基氟活化的聚合物表面与氨基衍生的生物分子在室温的反应。Clerc等在国际公开专利WO 99/67228中介绍了氟苯基树脂在固相合成酰胺、肽、羟氨酸、胺、氨基甲酸酯、碳酸酯、磺酰胺和α取代羰基化合物中的应用，这些文献全文参考于本文。
Medvedkin等，Bioorg.Khirn.，1995，21(9)，684-690介绍了在肽的合成中使用经磺基-四氟苯基活化的酯，并证实了它们的反应活性和在水性存放条件下良好的稳定性，该文献全文参考结合于本文。显然，用这种试剂预活化聚苯乙烯表面还没有见诸报道。
1950年，Hoechst在Heyna等人的德国专利第DE 960534中提出用乙烯基砜(VS)改性的活性染料对纤维素和羊毛纤维染色，该文献全文参考结合于本文。Siegel在一篇综述中完整描述了基于VS及其受保护的2-硫酸根合乙基砜和2-硫代硫酸根合乙基砜的活性染料[E.Siegel，The Chemistry of Synthesis Dyes，第VI卷(Ed.K.Venkataraman)；2-108，Academic Press，1972，该文献全文参考结合于本文]。Snow等人的美国专利第5414135号描述了用PEG负载的VS对蛋白质进行改性，该文献全文参考结合于本文。
将生物分子(如寡聚核苷酸、蛋白质和碳水化合物)固定到荧光微球上的最常用方法是活化存在于微球表面的羧基。该活化需要过量的N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)以及4-6的偶联pH值。碳二亚胺与羧基官能团之间的反应形成了活化的O-酰基脲衍生物反应中间体。然后，该反应中间体受到与微球相连的生物分子上的氨基中的伯氮的亲核进攻，释放出取代的脲，并产生在反应中间体与生物分子之间的酰胺连接。
但是，这样活化羧基具有许多缺点。例如，反应中间体的半衰期极短，快速发生水解或重排产生N-酰基脲加合物。此外，形成O-酰基脲的最佳pH是4-5。不过，核苷酸上的伯氨基主要在约4-5的pH值下发生质子化，因此很不活泼。反应中间体的这些限制严重妨碍了生物分子与微球的偶联产率。此外，在低pH值下，生物分子中的核酸碱基可能发生严重的质子化。这种质子化引起DNA解链，暴露出螺旋上的疏水核，促使螺旋与微球的固体基质发生非特异性的疏水反应。
尽管有这些缺陷，EDC介导的偶联目前仍是将生物分子共价固定在固体表面的主要模式，见述于Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，AcademicPress，NY，1996；Frey，A.等，Bioconjugate Chem.，1999，10，562-571；Gilles，M.A.等，Anal.Biochem.，1990，184，244-248；Chan V.W.F.等，Biochem.Biophys.Res.Communications，1998，151(2)，709-716；Valuev，I.L.等，Biomaterials，1998，19，41-43，这些文献全文参考结合于本文。
对于组合库，诸如马来酸、二羟基苯甲酸、羟基苯基乙酸、六茜素羧酸、溴代二羟基苯甲酸、3-氧-1-茚满羧酸、3-硝基苯基乙酸和3，4-二氟苯甲酸这样的构建基元已经见诸报道，如Lin，R.等，J.Am.Chem.Soc.，2002，124，7678-7680，该文献的全部内容在此引为参考。
可引入聚合物以改进聚合物表面特性的一些分子已经见诸报道并示于下面。
用聚合物负载的催化剂、试剂或底物进行的有机反应为已知的，如Hodge，P.在“Synthesis and separations using functional polymers”(Sherrington，D.C.和Hodge，P.主编，1988，John Wiley，44-113)中所述，该文献全文参考结合于本文。
聚合物负载的酚类化合物是已知的。例如，聚合物负载的四氟苯酚现在用作化学库合成中的活化树脂，如Salvino，J.M.等，J. Comb.Chem.，2000，2，691-699所述，该文献全文参考结合于本文。
在糖类与其他具有1，2和1，3二醇官能团的客体的络合反应中，硼酸常被引入到合成受体，如Czarnik，A.W.等，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，5874；Shinkai，S.J.，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1994，477和Geert-Jan Boons等，Tetrahedron Lett.，200，41，6965所述，这些文献全文参考结合于本文。硼酸也可引入化学亲合体系，用于纯化蛋白质，如Bergseid，M.等在Biotechniques，2000，29，1126中所述，该文献全文参考结合于本文。用各种硼酸将两个实体连接在一起的情况见述于Stolowitz的美国专利6008406，Stolowitz等的美国专利6075126，Stolowitz等的美国专利6124471，Stolowitz等的美国专利6462179和Stolowitz等的美国专利6630577，这些文献全文参考结合于本文。
酸性官能团也可加到玻璃表面上，如Geiger，F.M.等，J.Am.Chem.Soc.，2004，126，11754所述，该文献的全文参考结合于本文。
因此，需要开发一种方法，在将生物分子连接到微球表面的过程中改变微球表面特性，但不存在上述的一种或多种缺点，如由于用来连接生物分子的官能团发生水解而随时间产生的各种变化。
发明概述以下对各种方法、微球和试剂盒(kit)实施方式的描述并不对所附权利要求的主旨构成任何限制。
一种实施方式涉及一种改变微球表面特性的方法。所述方法包括将一种烯醇酸与微球偶联，对微球的表面特性进行改性。烯醇酸可包括一种或多种偶联到微球上不同位置的烯醇酸。可通过烯醇酸将试剂与微球偶联。在其他实施方式中，烯醇酸可用烯醇酸衍生物或混和官能团代替。在另一些实施方式中，烯醇酸可以概括地表示为能与一种化学基团共轭的可离子化的极性基团。所述化学基团可以包括砜基或羰基等。
在一种实施方式中，烯醇酸包含至少一个亲水基团。在另一种实施方式中，烯醇酸可包括三角酸(deltic acid)、方形酸(squaric acid)、邻二羟环戊烯三酮酸(croconic acid)或玫棕酸，或者其他同系物。在一个不同的实施方式中，烯醇酸可包括5-取代羟基环庚三烯酚酮。在其他实施方式中，烯醇酸可包括氰尿酸或氰尿酸衍生物。在另外的实施方式中，烯醇酸可包括经改性后包含亲水基团的二甲氧基三嗪甲基吗啉。在又一种实施方式中，烯醇酸可包括混和官能团。所述混和官能团可包括硼酸或硼酸衍生物。在一些实施方式中，烯醇酸可包括硅酸或硅酸衍生物。
在一种实施方式中，将烯醇酸与微球偶联包括使包含乙烯基和烯醇酸的单体与不同的单体发生共聚反应，形成具有改性的表面特性的微球。在一个不同的实施方式中，将烯醇酸与微球偶联可包括将烯醇酸连接到微球表面。
经改性的表面特性可提高试剂与微球偶联时的稳定性。经改性的表面特性还可以提高用这些微球进行化验的效果。举例来说，试剂可包括生物分子。
表面特性可包括电荷密度。此外的或另外的表面特性可包括pKa。上述方法的每个实施方式可包括在此描述的任何其他步骤。此外，所述方法显然可包括同时(即在相同步骤中)改变上述多个微球的表面特性。
另一种实施方式涉及包含烯醇酸的微球，所述烯醇酸偶联到微球的聚合物核上，使烯醇酸能对微球的表面特性进行改性。烯醇酸可包括一种或多种偶联到微球上不同位置的烯醇酸分子。可通过烯醇酸将一种试剂与微球偶联。在其他实施方式中，烯醇酸可用烯醇酸衍生物或混和官能团代替。在更多的实施方式中，烯醇酸可以概括地表示为与一种化学基团共轭的可离子化的极性基团。所述化学基团可以包括砜基或羰基。
在一种实施方式中，烯醇酸至少包含一个亲水基团。在另一种实施方式中，烯醇酸可包括三角酸、方形酸、邻二羟环戊烯三酮酸或玫棕酸，或者其他同系物。在一种不同的实施方式中，烯醇酸可包括5-取代羟基环庚三烯酚酮。在其他实施方式中，烯醇酸可包括氰尿酸或氰尿酸衍生物。在另外的实施方式中，烯醇酸可包括经改性后包含亲水基团的二甲氧基三嗪甲基吗啉。在又一种实施方式中，烯醇酸可包括混和官能团。所述混和官能团可包括硼酸或硼酸衍生物。在一些实施方式中，烯醇酸可包括硅酸或硅酸衍生物。
在一种实施方式中，烯醇酸可通过包含乙烯基和烯醇酸的单体与另一种不同的单体发生共聚反应来偶联到聚合物核上。在一种不同的实施方式中，烯醇酸可通过将烯醇酸连接到聚合物核表面上来与聚合物核偶联。
经改性的表面特性可提高试剂与微球偶联时的稳定性。经改性的表面特性还可提高用这些微球进行化验的效果。所述试剂可以是生物分子。所述表面特性可包括电荷密度。此外，表面特性可包括pKa。微球的每种实施方式可根据本发明所述进一步调整配置、组成和/或形成方式。
另一种实施方式涉及试剂盒。该试剂盒包括微球。该试剂盒还包括含烯醇酸的活化试剂。此外，试剂盒包含一种或多种化学品，一种或多种器件，或它们的一些组合，可用来将烯醇酸偶联到微球的聚合物核上，使烯醇酸能对微球的表面特性进行改性。可通过烯醇酸将一种或多种试剂与微球偶联。
试剂盒和试剂盒的这些组件可如本发明所述进一步配置。例如，在一些实施方式中，烯醇酸可用烯醇酸衍生物或混和官能团代替。在另一些实施方式中，烯醇酸可以概括地表示为与一种化学基团共轭的可离子化的极性基团。所述化学基团可以包括砜基或羰基。
附图简述通过参照附图阅读以下详细描述，本发明的其他目标和优点将会显而易见，图中
图1所示是测量系统的一个实例的流程简图，该系统可利用本发明所述的微球的实施方式进行实验。
在附图和下文中显示了本发明的具体实施方式
，但是可以对本发明进行各种改变和替代。应当理解，附图及其详细描述无意将本发明限制于所介绍的特定形式，相反，本发明覆盖所有改进、等价和替代形式，只要它们落在附属权利要求书所界定的本发明精神和范围之内。
优选实施方式详述术语“微球”、“微粒”和“珠子”在这里可互换使用，指本领域已知的具有任何合适尺寸和形状的离散固体物质，其表面可与在此所述的一种或多种表面改性剂偶联。
本文所用术语“表面改性剂”一般指可与微球表面偶联或以其他方式位于微球表面上和可改变微球表面的特性的一种或多种分子。
本文所用术语“试剂”一般指偶联到微球上的分子，该试剂在用微球进行的化验或其他实验中可与被分析物反应。合适的试剂的例子包括但不限于生物分子，如蛋白质、核苷酸、寡聚核苷酸、酶、抗原、抗体或任何其他涉及或关乎人、动物、植物等的生物功能的分子，以及候选药物和染料。
本文一般性地描述了具有异常酸性的表面(例如聚苯乙烯表面)的微球的形成方法。例如，本文描述了在微球上偶联一种或多种诸如烯醇酸衍生物的表面改性剂的方法。在一种实施方式中，改变微球表面特性的方法包括将烯醇酸偶联到微球上，以改性微球的表面特性。可以通过烯醇酸将一种试剂偶联到微球上。虽然在此参照一个微球描述了这种方法的实施方式，但应当理解，烯醇酸可以同时(即在所述方法的同一步骤或相同几个步骤中)偶联到多个微球上。
聚合物微球的表面性质在许多涉及广谱生物化验的应用中扮演着重要角色。例如，微球的表面特性决定着是否有试剂以及哪些试剂能够连接到微球上。此外，微球的表面特性可以决定试剂偶联到微球上的量、可预测性、可重复性、均匀性等。在大多数市售微球中，端基为COOH或SO3H的功能单体被用来形成微球聚合物核的活化(或官能化)表面。酸性微球表面目前用诸如羧基、亚砜、氢氧化物、硼酸和硅酸这样的基团产生。
但是，在此所述方法包括用表面改性剂对微球表面进行改性，所述表面改性剂如与砜或羰基之类的化学基团共轭的可离子化极性基团。例如，在此所述的微球表面上可以加载一些官能团(或用进行官能化)，它们包括但不限于位于相邻碳原子上并共轭的羰基和OH，被双键或另一共轭键分隔的羰基和OH，共轭的砜和OH，羰基和COOH，砜和COOH，硼酸和OH，以及硅酸和COOH。相反，目前用作表面改性剂的酸包括位于碳、硼、硫或硅原子上的可离子化基团。
烯醇酸包含位于不同原子上的氧基和羟基，它们被一个或多个双键所分隔。根据处理微球的溶液的pH，位于微球表面的烯醇酸基团可发生离子化，并可影响微球的表面电荷(例如电荷密度)和界面电荷(即水溶液与微球表面之间的界面上的电荷)。换句话说，烯醇酸与微球发生偶联，以改性表面特性，如微球的表面电荷和界面电荷。表面电荷和界面电荷的这些变化反过来会控制微球表面上的化学连接(或偶联)，特别是诸如生物分子这样的试剂与固体表面之间的偶联。所述试剂也可通过烯醇酸偶联到微球上。
在此所述方法可采用如下烯醇酸、烯醇酸衍生物和混和官能团来实施。例如，在此所述的方法可用诸如方形酸、氰尿酸和硼酸，以及7元化羟基环庚三烯酚酮(seven membered hydroxyl-tropolone)和三烷基甲硅烷基化合物这样的烯醇酸。
Lugade等的美国专利申请公开第2004/0039201号介绍用方形酸氟化物作为预活化的烯醇酸氟化物，用于共价偶联生物分子的氨基；该文献全文参考结合于本文。在此所述的方法采用若干烯醇酸及其衍生物来开发其他可用于一批生物医药应用的试剂。
在一种实施方式中，本文所述的方法可用诸如方形酸或其衍生物的烯醇酸来实施。方形酸是相当强的二元酸，其pKa在约2-3.5的范围内。通过转移两个质子，方形酸可产生二价方形酸根阴离子，它是相对刚性的离域平面芳族二价阴离子，能够作为氢键的有效受体。该酸的其他同系物如三角酸、克酮酸和玫棕酸可用于在此所述方法的实施方式。附有方形酸酯的表面(由含胺表面制得)用来与含胺分子共轭。与方形酸相关的方法的例子见述于Blixt，O.等“Enymaticglycosoylation of reducing oligosaccharides linked to a solid phase or a lipid via acleavable squarate linker”，Carbohydrate Research，1999，319，80-91，以及Glusenkamp等的美国专利第6602692号和Aberg等的美国专利第6656876号，这些文献全文参考结合于本文。但是，在此所述的方法中，用方形酸来改变微球表面的特性，如表面pKa和表面电荷。
在另一种实施方式中，在此所述的方法可用oxocarbon acid来实施。Cole，R.J.等(Science，1973，179，1324)和Schmidt，A.H.等(Synthesis，1978，1)首先报道了具有如下通式的碳氧化合物，其中R＝Cl、烷基和芳基，这些文献全文参考结合于本文。
利用合适的连接基团R，可用包含表1第1行所示通式结构的烯醇酸对微球表面特性进行改性。
通过扩展Meier，H.等在文献Tetrahedron Lett.，1996，37(8)，1191中所报道的常规方法，可以制备包含乙烯基的单体，如3-羟基-4-(4-苯乙烯基)-3-环丁-1，2-二酮，该文献全文参考结合于本文。在聚合反应中，可以使用这种功能单体将烯醇酸基团偶联到微球表面。Sprenger，H.E.等在Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.，1968，7，530中报道了诸如3-羟基-4-乙烯基-3-环丁-1，2-二酮这样的乙烯基烯醇酸，该文献全文参考结合于本文。
在一种不同的实施方式中，在此所述的方法可用环庚三烯酚酮实施。例如，可在所述的方法中用作表面改性剂的另一种烯醇酸是5-取代羟基环庚三烯酚酮，它具有如下化学结构 可对Uemura，T.等在Mol.Cryst.Liq.Cryst.，1983，95，287中所描述的方法进行改进，用来制备5-氨基环庚三烯酚酮，它可如下所示连接到微球表面上，其中该文献全文参考于本文。
例如，J.Chem.Soc.(C)，1971，878；J.Chem.Soc.(PI)，1976，2329；J.Chem.Soc.，1951，2352报道了各种取代环庚三烯酚酮的合成过程，这些文献全文参考结合于本文。环庚三烯酚酮和带环庚三烯酚酮表面基团的微球的合成见述于后面提供的实施例4-6。
在另一些实施方式中，可用于所述方法的其他烯醇酸包括氰尿酸及其衍生物、硼酸及其衍生物、硅酸及其衍生物和其他烯醇酸及其衍生物。
氰尿酸及其衍生物包括由表1第2行所示通式表示的化合物。用氰脲酰氯活化的树脂和用来活化羧基的结合于树脂的三嗪用于在羧基位发生亲核取代而产生酰胺，见述于Venkataranman，K.等，Tetrahedron Lett.，1979，32，3037，该文献全文参考结合于本文。
通过在聚合反应过程中加入微球，可用如下所示的三嗪的乙烯基单体将氰尿酸或其衍生物偶联到微球表面上。
例如，如上所示乙烯基单体可用来制备具有表面烯醇酸的微球，所述烯醇酸包含氰尿酸及其衍生物。类似地，巴比妥酸及其各种衍生物可通过聚合反应或通过适当官能化的连接基团来引入(例如，见表1第3行)。
可用于本文所述方法的实施方式中的其他烯醇酸及其衍生物包括表1第5、6行所示通式结构的杂环化合物，它们具有弱酸性到中等酸性，可得自各种商业来源。属于抗坏血酸系列的烯醇酸(见下式)的pKa约为4-4.2。
“醌型”化合物(见表1第7行)如氯冉酸也可商购。利用合适的连接基团，可将这些化合物固定到微球表面。2-羟基萘醌是中等强酸，类似于oxocarbonacid。该化合物曾被描述为半方形酸的插烯物(vinylog)。2-羟基萘醌的羟基可被硼酸、硅酸、硒酸或磷酸基团置换，以改变该化合物的酸性，并由此改变与与该化合物偶联的微球表面。
酰肼衍生物如氨基苯二酰一肼(表1第8行)具有可离子化的OH基，可用氨基固定在微球表面上。像氨基苯二酰一肼这样的化合物已经用于化学发光分析。
1，3-环己二酮及其衍生物(表1第9行)的pKa值约为4.8。像酚烯酮(phenolenone)这样的化合物可以商购，利用合适的连接基团可将其偶联到微球上。这种化合物的酸性可通过引入吸电子基和释电子基来调节，所述基团包括任何本领域已知的适合于这些化合物的基团。
oxicam衍生物“Mobic”是烯醇酸类非类固醇消炎药的一员，其pKa值为1.1和4.2。该化合物的高酸值是由其结构中的砜基团提供的。引入与OH共轭的砜，可用来提高烯醇酸的酸性(见表1第10-13行)。
表1第14行所示的结构代表了可归为“含氧”酸的一类酸，其酸性类似于oxo carbon acid的酸性。
表1第15行示出了可与其他单体发生聚合产生含烯醇酸表面的微球的最优选的乙烯基单体的例子。
在其他实施方式中，本文所述的方法可用“混和烯醇酸”来进行。例如，苯胺和茴香醚方形酸酯的易得性有利于将表1第16-19行所示通式结构所代表的混和烯醇酸固定。类似化合物的合成见述于Gauger，J.等，Chem.Ber.，1970，103，2696；Bellus，D.，J.Am.Chem.Soc.，1978，100，8026；Law，K.Y.和Bailey，P.C.，J. Org.Chem.，1992，57，3278和Meier，H.等，Tetrahedron Lett.，1996，37，1191，这些文献全文参考结合于本文。环庚三烯酚酮的氨基衍生物可连接到oxo carbon acid如方形酸上(表1第19行)。
此外，本文所述的方法可用“活化烯醇酸”实施。例如，采用Lugade等在美国专利申请公开第2004/0039201号所述将方形酸转化为方形酸氟化物的方法，对所述的任何“涂覆”烯醇酸的微球(即微球表面有烯醇酸分子)进行活化，形成其烯醇酸氟化物的形式。这些新烯醇酸氟化物可用作交联剂，其方式类似于Lugade等在该专利申请中所述的将方形酸氟化物用作交联剂的方式。
借助其双官能性质，连有烯醇酸的微球还可用来形成特异性的金属离子络合物(例如参见下面所述)。而金属螯合剂络合物又可用于定位(site specific)捕获生物分子，用于蛋白质或肽的亲合纯化。
表1烯醇酸的例子表中字母“A”表示本领域已知的可用来将含烯醇酸的部分偶联到微球(例如偶联到微球表面上的官能团)的任何合适的连接基团。基团“A”还可包含乙烯基，以便在微球上的聚合物核发生聚合反应期间将烯醇酸引入微球。
下面列出可在本发明的实施方式中用作微球的表面改性剂和偶联活化剂的氰尿酸衍生物的一个例子。
研究了化合物二甲氧基三嗪甲基吗啉(DMTMM)作为微球表面改性剂的情况。在文献中，DMTMM用作肽键的活化剂。烷基取代的三嗪衍生物可以DMTMM商购。DMTMM还可如下面提供的实施例1和2所述进行合成。我们研究了它用作表面改性剂的情况，它与微球上的试剂偶联(见下面)。
DMTMM能够很好与微球偶联，但偶联了DMTMM的微球比使用常用表面改性剂—硫代-N-羟基琥珀酰亚胺(硫代-NHS)活化的微球的疏水性较高。换句话说，用DMTMM改性的微球倾向于相互粘连在一起，而不是分散在水溶液中。相反，在连接有硫代-NHS基团的微球上，当硫代-NHS与微球上原有的羧基发生反应，微球表面保留着喜水(即亲水)基团(硫基)。因此，微球能很好地分散在水、水溶液和溶剂中。相反，DMTMM因含有季铵盐部分而溶于水，但与微球表面上的羧基反应之后，它就失去此正电荷，同时也就失去水溶性。这样，微球表面上的亲水羧基被疏水芳环替代，从而降低了微球的亲水性。
为了提高活化微球的亲水性，用更高亲水性的链替代DMTMM上的甲氧基，如下面的反应式所示。现有技术已经通过制备二-(聚乙二醇)三嗪氯化物在生物分子中引入聚乙二醇链，如Sakurai等的日本专利第8092294所述，Roberts等还在Adv.Drug Delivery Rev.中(2002，54，459-476)作了综述，这些文献全文参考结合于本文。其他包含亲水基的三嗪化合物见述于Pyzhov等，DepositedDoc，1982，VINITI 1408-82；Martin等，J.Prak.Chem.，1981，323，694-699；Kashkin等，Zhurnal Organichkoi Khimii，1976，12，2030-2033；Ahne等，Synthesis，1975，184-186，这些文献全文参考结合于本文。因此，在一种实施方式中，所述的方法中所用的烯醇酸包括经改性后包含亲水基的DMTMM。如季铵离子、磺酸根、膦酸根、聚乙二醇(PEG)链、树枝状大分子结构等的亲水基可用来提高DMTMM和其他表面改性剂在与微球表面上的官能团偶联后的亲水性。在此所述方法中，可用DMTMM的亲水衍生物替代EDC/NHS表面改性活化剂。
X20＝-(CH2CH2-O)nCH3n＝1-100-(CH2)n-SO3--(CH2)n-PO3--(CH2)n-N(Y20)+，(Y20＝H，烷基)，n＝1-3-Si(OCH3)2-(CH2)3-N(CH3)3+-O-葡聚糖-O-碳水化合物-O-纤维素-O-卵磷脂下面的实施例3提供了用这样的亲水衍生物改变(活化)微球表面特性的一个例子。
含烯醇酸的微球表面可通过两种途径产生。例如，可以制备同时包含乙烯基和烯醇酸基的单体，然后可以使该单体与诸如苯乙烯的其他单体发生共聚反应，产生表面含有烯醇酸基团的微球，从而改进表面特性。聚合反应可用本领域已知的任何合适的方法进行。或者，将烯醇酸偶联到微球上的过程包括将烯醇酸结合到微球表面。换句话说，已经形成的微球的表面可通过连接烯醇酸来改变。将烯醇酸连接到已形成的微球上可以用这里介绍的方法进行，也可以用本领域已知的其他任何合适的方法进行。
在一种实施方式中，烯醇酸可包括一种或多种偶联到微球上不同位置的烯醇酸分子。换句话说，微球上可以偶联两种或更多种不同的烯醇酸。每种不同的烯醇酸分子可以直接与微球表面上的官能团偶联。或者，包含不同烯醇酸的单体可以与其他多个单体的组合发生共聚反应，形成微球的聚合物核，使烯醇酸位于其表面上。
在一种实施方式中，经过改性的表面特性可提高与试剂与微球偶联时的稳定性。在另一种实施方式中，改性的表面特性提高了用所述微球进行化验的性能。例如，不同生物分子可能需要不同的表面环境(即微球表面附近的环境)，以获得最佳化验效果(例如与样品中的被分析物产生最佳连接或发生最佳反应)。这些局部环境可用推荐的表面基团产生和调整。这里介绍的一些表面改性剂将提高试剂稳定性或化验效果。这里介绍的其他表面改性剂使得生物分子更容易连接到微球表面上。
例如，上述基于DMTMM的表面改性剂可用来减少生物材料没有规律地偶联到微球表面上的情况。这样，所述表面改性剂可以不必用来形成“自偶联”微球(即其表面基团有选择地自发与一种试剂偶联的微球)，但所述表面改性剂可用来替代EDC/硫代-NHS交联对，这种交联对目前用于提供连有经改进的表面改性剂且表面性质得到改进的微球。
此外，在一些实施方式中，标准EDC/硫代-NHS偶联过程可能多少存在一些问题。例如，EDC和硫代-NHS是吸湿固体，它们会与空气中的水汽反应，所以必须采取特殊的预防措施来使瓶中的表面改性剂保持不变。表面改性剂的工作溶液必须在使用之前临时配制。EDC活化产生的脲副产物有时难以从珠悬浮体中除去，会干扰后面的偶联反应或化验。
相比于将试剂偶联到微球上的标准方法，这里所述的方法具有许多优点。例如，可单独使用DMTMM型交联剂来活化微球(不用两种表面改性剂)。此外，DMTMM的水溶液在室温下可稳定存在数小时，若冷冻保存，稳定时间更长。不仅如此，DMTMM晶体对空气中的水汽更加稳定，因而使用起来更容易达到要求。另外，合成DMTMM不像合成EDC那么复杂，这可提高表面改性剂的质量和一致性。
另一实施方式涉及包含偶联到微球的聚合物核上的烯醇酸，使烯醇酸能改进微球的表面特性。微球的聚合物核可用本领域已知的任何合适的聚合物形成。烯醇酸可包括一种或多种偶联到微球上不同位置的烯醇酸分子。试剂可通过烯醇酸与微球偶联。在其他实施方式中，烯醇酸可被烯醇酸衍生物或混和官能团替代。在另一些实施方式中，烯醇酸可概括地表示为与一个化学基团共轭的可离子化的极性基团。所述化学基团可包括砜基或羰基。
在一种实施方式中，烯醇酸包含至少一个亲水基团。在另一种实施方式中，烯醇酸可包括三角酸、方形酸、克酮酸、玫棕酸或其他同系物。在不同的实施方式中，烯醇酸可包括5-取代羟基环庚三烯酚酮。在其他实施方式中，烯醇酸可包括氰尿酸或氰尿酸衍生物。在又一实施方式中，烯醇酸可包括经改性后含亲水基团的DMTMM。在另一些实施方式中，烯醇酸可包括混和官能团。所述混和官能团可包括硼酸或硼酸衍生物。在不同的实施方式中，烯醇酸可包括硅酸或硅酸衍生物。
在一种实施方式中，烯醇酸可以通过共聚反应偶联到聚合物核上，该共聚反应采用含乙烯基和烯醇酸的单体和另一种不同单体。在一种不同的实施方式中，通过将烯醇酸连接到聚合物核表面，可将烯醇酸偶联到聚合物核上。
改进的表面特性可提高与试剂与微球偶联时的稳定性。改进的表面特性还可提高了用微球进行化验的性能。所述试剂可以是生物分子。所述表面特性可包括电荷密度。此外，表面特性可包括pKa。微球的每种实施方式可根据本发明所述进一步调整配置、组成和/或形成方式。上述微球的每种实施方式具有上述方法的所有优点。
连有本发明所述表面改性剂的微球可以“即用型(ready to use)”微球的形式提供。此外，可以独立试剂盒的形式提供一种或多种表面改性剂，用以活化微球上的表面基团(偶联到微球上的表面基团)。
在一种实施方式中，所述试剂盒包括微球。该试剂盒还包括含诸如烯醇酸的一种或多种表面改性剂的活化试剂。此外，试剂盒包括一种或多种化学品，一种或多种器件，或它们的一些组合，可用来将烯醇酸偶联到微球的聚合物核上(或偶联到微球的聚合物核表面的基团上)，使烯醇酸能改进微球的表面特性。可通过烯醇酸将一种或多种试剂偶联到微球上。所述试剂可包含在试剂含中，也可不包含在其中。
试剂盒和试剂盒的这些组件可如本文所述进一步配置。例如，在一些实施方式中，烯醇酸可用烯醇酸衍生物或混和官能团替代。在另一些实施方式中，烯醇酸可以概括地表示为与一种化学基团共轭的可离子化的极性基团。举例来说，所述化学基团可以包括砜基或羰基。在此所述的试剂盒的每种实施方式具有上述方法的所有优点。
以下实施例仅是为举例目的，不构成对本发明实施方式的限制。
实施例1和2中的过程基于Kunishima，M.等，Tetrahedron Lett.，40，5327-5330，1999和Cronin，J.S.等，Syn.Commun.，26(18)，3491-3494，1996所述DMTMM的合成，这些文献全文参考结合于本文。
实施例12-氯-4，6-二-(2-甲氧基乙氧基)-1，3，5-三嗪的合成室温，向14.43克(190毫摩尔)2-甲氧基乙醇、6.83克(81毫摩尔)碳酸氢钠和1.3毫升(70毫摩尔)去离子水中加入5.0克(27毫摩尔)氰尿酰氯。溶液温度升高到30℃并搅拌1小时，其间停止二氧化碳释放。溶液温度升高到45℃并持续搅拌过夜。冷却之后，过滤混合物，用二氯甲烷洗涤固体。真空浓缩合并的滤液，得到8克2-氯-4，6-二-(2-甲氧基乙氧基)-1，3，5-三嗪的乳状液，该乳状液在制冷器中(-18℃)固化为蜡状固体。
该产物的质子核磁共振(1H NMR)得到如下结果(CDCl3，60MHz)δ4.7-4.4(m，4Hz)，3.8-3.5(m，4Hz)，3.4(s，6Hz)。该产物(净产物)的红外(IR)光谱发现了如下特征IR吸收频率1557cm-1，1417cm-1，1330cm-1，1115cm-1，1050cm-1，1022cm-1和814cm-1。
实施例22-氯-4，6-二-(2-(二异丙基氨基)乙氧基)-1，3，5-三嗪的合成室温，向27.6克(190毫摩尔)2-(二异丙基氨基)乙醇、6.83克(81毫摩尔)碳酸氢钠和1.3毫升(70毫摩尔)去离子水中加入5.0克(27毫摩尔)氰脲酰氯。溶液温度升高到30℃并搅拌1小时，其间停止二氧化碳释放。溶液温度升高到45℃并持续搅拌过夜。冷却之后，过滤混合物，用二氯甲烷洗涤固体。合并的滤液真空浓缩，得到6克2-氯-4，6-二-(2-(二异丙基氨基)乙氧基)-1，3，5-三嗪的液体。
实施例3氯化4-(4，6-二-(2-甲氧基乙氧基)-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓(morpholinium)的合成向3.5毫升无水四氢呋喃中的1.05克(4毫摩尔)2-氯-4，6-二-(2-甲氧基乙氧基)-1，3，5-三嗪(如实施例1所述得到)中加入530微升N-甲基吗啉。搅拌溶液30分钟后过滤，在阿布德哈登干燥器中用丙酮干燥12小时，得到0.5克(34％)氯化4-(4，6-二-(2-甲氧基乙氧基)-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓的白色粉末。产物(净产物)的IR光谱鉴定出以下特征IR吸收频率1605cm-1，1417cm-1，1336cm-1，1300cm-1，1118cm-1，1094cm-1，1068cm-1，1053cm-1，1028cm-1，1009cm-1，991cm-1，972cm-1，858cm-1和821cm-1。
按照类似的方式，用实施例2得到的氯化物，得到氯化4-(4，6-二-(2-(二异丙基氨基)乙氧基)-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓。
实施例4用亲水DMTMM衍生物活化羧基化微球的常规过程5.0E6羧基化微球悬浮在90微升合适的非亲核缓冲液(pH5-9)中，向该悬浮液的等分悬浮液里，加入10微升50毫克/毫升最新描述的亲水DMTMM衍生物之一(例如实施例3中所述化合物之一)在相同缓冲液中的溶液。搅拌悬浮液20-60分钟。用本领域已知的任何方便的方法(例如反复离心和倾析)从微球中分离出过量的试剂。活化微球在合适的非亲核缓冲液(pH4-9)中自发与含胺的分子(例如蛋白质)反应约2小时。
实施例55-亚硝基环庚三烯酚酮的合成搅拌下，向2.05克(16.9毫摩尔)环庚三烯酚酮在6毫升去离子水和6毫升冰醋酸中的溶液里滴加1.25克(18.1毫摩尔)亚硝酸钠在5毫升去离子水中的溶液。再搅拌1小时后，过滤所得固体，真空干燥2小时，得到5-亚硝基环庚三烯酚酮的黄色固体。产物(净产物)的IR光谱发现以下特征IR吸收频率1603cm-1，1519cm-1，1316cm-1，1110cm-1，1015cm-1，845cm-1，812cm-1和781cm-1。
实施例65-氨基环庚三烯酚酮的合成在搅拌下，向0.39克5-亚硝基环庚三烯酚酮(2.6毫摩尔，由上一实施例得到)和10毫升无水乙醇中加入2.92克氯化亚锡(II)(12.9毫摩尔)。溶液回流40分钟后，冷却，过滤，液体部分分配在乙酸乙酯与水之间。有机部分真空浓缩，得到35毫克(10％)5-氨基环庚三烯酚酮的黄色固体。产物(净产物)的IR光谱发现以下特征IR吸收频率3319cm-1，3181cm-1，2925cm-1，1511cm-1，1410cm-1，1261cm-1，837cm-1，781cm-1和739cm-1。
实施例7连有环庚三烯酚酮表面基团的微球的合成向100E6羧基化微球(事先用硫代-N-羟基琥珀酰亚胺和EDC活化)在0.5毫升碳酸盐缓冲液(pH9)中的悬浮液里加入2毫克5-氨基环庚三烯酚酮溶解在25微升二甲基亚砜中形成的溶液。搅拌悬浮液4小时，从微球上洗去过量的试剂。
现参见附图。图1所示为可用来对本发明所述的微球的实施方式进行实验的测试系统的一个例子。应当指出，图1未按比例绘制。具体地，图中某些部分的比例放大了很多，以强调这些部分的特征。为了简洁，该测量系统的某些部分如数字信号处理器(DSP)未在图中示出。
在图1中，测量系统是沿着比色皿12的截面所在平面展示的，微球10从比色皿12中流过。在一个实例中，所述比色皿可以是标准石英比色皿，如标准流动血细胞计数器中所用的。不过，任何其他合适类型的观察室或传送室也可用来传送供分析的样品。微球10可根据本发明所述的实施方式形成。
测量系统包括光源14。光源14可包括本领域已知的任何合适的光源，如激光。光源可设计成能发射一个或多个波长的光，如蓝光或绿光。光源14可设计成当微球通过比色皿的时候照射微球。光照射可引起微球发射具有一个或多个波长或波段的荧光。在一些实施方式中，该系统可包括一个或多个透镜(未示出)，用来将来自光源的光聚焦到微球或流路上。该系统还可包括一个以上的光源。在一种实施方式中，多个光源可设计成以不同波长的光(例如蓝光和绿光)照射微球。在一些实施方式中，光源可设计成从不同方向照射微球。
自微球向前散射的光可通过折叠式反射镜18或其他此类导光元件被导向检测系统16。或者，检测系统16可直接放在前向散射的光路上。按这种方式，折叠式反射镜或其他导光元件可以不包括在该系统中。在一种实施方式中，向前散射光可以是被微球沿着与光源14的照射方向大约成180度角的方向散射的光，如图1所示。前向散射光的角度不一定是与光源的照射方向刚好成180度，这样来自光源的入射光将不会射到检测系统的光敏表面上。例如，前向散射光可以是微球沿着与光源14的照射方向成小于或大于180度角的方向(例如成170度、约175度、约185度或约190度)散射的光。
也可在与光源照射方向成约90度的方向上收集被微球散射和/或发射的光。在一种实施方式中，可用一个或多个分束器或分色镜将该散射光分成一个以上的光束。例如，在与光照方向约成90度的角度上散射的光可以用分束器20分成2条不同的光束。这两条不同的光束又可用分束器22和24分成4条不同的光束。可将每条光束导向不同的检测系统，所示检测系统可包括一个或多个检测器。例如，可将4条光束中之一可导向检测系统26。检测系统26可用来检测被微球散射的光。
可将其余3条光束导向检测系统28、30和32。检测系统28、30和32可用来检测微球发射的荧光。每个检测系统可用来检测不同波长或不同波长范围的荧光。例如，检测系统之一可用来检测绿色荧光。另一检测系统可用来检测橘黄色荧光，而其他检测系统可用来检测红色荧光。
在一些实施方式中，检测系统28、30和32上可分别连接滤光器34、36和38。滤光器可用来阻挡检测系统不能检测的波长的荧光。此外，每个检测系统光学连接一个或多个透镜(未示出)。透镜可用来将散射光或发射荧光聚集在检测器的感光表面上。
检测器的输出电流与射在其上的荧光成正比，得到电流脉冲。该电流脉冲可转换为电压脉冲，经过低通过滤，然后用A/D转换器进行数字化。DSP对脉冲下面的面积进行积分，得到表示荧光强度的数值。
在一些实施方式中，由微球发射的荧光产生的输出信号经过处理后，可用来鉴定微球，提供有关微球表面已经发生或正在发生的反应的信息。例如，两个输出信号可用来鉴定微球，其他输出信号可用来确定微球表面已经发生或正在发生的反应。可根据两个或多个不同检测窗中产生的输出信号比来鉴定微球。例如，如果检测系统30和32具有不同的检测窗，从检测系统30产生的输出信号与检测系统32产生输出信号之比，并结合每个信号的强度，可以鉴定微球。因此，根据引入或连接到微球上的染料类型和/或待测反应(即引入或连接到反应中所涉及的反应物的染料)，可以选择不同的检测器和滤光器。
虽然图1所示系统包括两个检测系统，它们具有两个不同的检测窗，以区分具有不同染色特性的微球，但应当理解，该系统可包括两个以上的此类检测窗(即3各检测窗、4各检测窗等)。在这种实施方式中，测量系统可包括额外的分束器和具有其他检测窗的检测系统。用于两个以上检测系统的检测窗可根据上述方法确定。此外，每个额外的检测系统都可连接滤光谱器和/或透镜。
在另一个实施方式中，测量系统可包括两个或多个检测系统，用来区分在微球表面上发生反应的不同材料。这些不同反应物材料所具有的染色特性不同于微球的染色特性。
可用来对本发明所述表面改性微球进行测量的其他测量系统的例子见述于Chandler等的美国专利第5981180号、Chandler的美国专利6046807、Chandler的美国专利6139800；Chandler的美国专利6366354 B1、Chandler的美国专利6411904 B1、Chandler等的美国专利6449562 B1、Chandler等的美国专利6524793 B1，这些文献全文参考结合于本文。本发明所述测量系统也可根据这些专利所述的方法进一步设计。此外，可使用本发明所述微球实施方式的化验和实验包括这些专利中所述的任何化验和实验以及本领域已知的任何其他化验和实验。
对于知晓本发明所揭示的益处的本领域技术人员来说，应当理解的是，可以确信本发明提供了改变微球表面特性的方法。通过该描述，对本发明各方面的进一步改进和各种替代实施方式对暴露于技术人员将是显而易见的。因此，这些描述仅仅是说明性的，其目的是向本领域技术人员揭示实施本发明的一般方式。应当理解，应将本说明书所展示和描述的本发明的各种形式看作目前优选的实施方式。本说明书所展示和描述的要素和材料可以替换，各个部分和过程可以反向实施，本发明的某些特征可独立应用，正如本领域的技术人员知晓本发明所描述的益处之后所显见的那样。只要不背离下面的权利要求所描述的本发明的精神和范围，可对本说明书所描述的各个要素进行改变。
权利要求
1.一种改变微球表面特性的方法，该方法包括将烯醇酸偶联到微球上，来改变微球的表面特性，其中，可通过烯醇酸将试剂与微球偶联。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包含至少一个亲水基团。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包括三角酸、方形酸、克酮酸或玫棕酸。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包括5-取代羟基环庚三烯酚酮。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包括氰尿酸或氰尿酸衍生物。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包括改性后包含亲水基团的二甲氧基三嗪甲基吗啉。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包含混合官能团，所述混合官能团包括硼酸或硼酸衍生物。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包括硅酸或硅酸衍生物。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述偶联包括含乙烯基和烯醇酸的单体与不同单体发生共聚反应，形成具有改性的表面特性的微球。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述偶联包括将烯醇酸连接到微球表面上。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，经改性的表面特性提高了试剂与微球偶联时的稳定性。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，经改性的表面特性提高了用微球进行化验的性能。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂包括生物分子。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包括一种或多种偶联到微球上不同位置的烯醇酸分子。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面特性包括电荷密度。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面特性包括pKa。
17.一种微球，包含偶联到微球的聚合物核上的烯醇酸，使烯醇酸能改变微球的表面特性，其中试剂通过烯醇酸与微球偶联。
18.如权利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包含至少一个亲水基团。
19.如权利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包括三角酸、方形酸、克酮酸或玫棕酸。
20.如权利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包括5-取代羟基环庚三烯酚酮。
21.如权利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包括氰尿酸或氰尿酸衍生物。
22.如权利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包括改性后包含亲水基团的二甲氧基三嗪甲基吗啉。
23.如权利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包括混合官能团，所述混合官能团包括硼酸或硼酸衍生物。
24.如权利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包括硅酸或硅酸衍生物。
25.如权利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸通过共聚反应进一步偶联到聚合物核上，所述共聚反应使用含乙烯基和烯醇酸的单体与不同单体进行。
26.如权利要求17所述的微球，其特征在于，通过将烯醇酸连接到聚合物核的表面上，将所述烯醇酸进一步偶联到聚合物核上。
27.如权利要求17所述的微球，其特征在于，经改性的表面特性提高了试剂与微球偶联时的稳定性。
28.如权利要求17所述的微球，其特征在于，经改性的表面特性提高了用微球进行化验的性能。
29.如权利要求17所述的微球，其特征在于，所述试剂包括生物分子。
30.如权利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包括一种或多种偶联到微球上不同位置的烯醇酸分子。
31.如权利要求17所述的微球，其特征在于，所述表面特性包括电荷密度。
32.如权利要求17所述的微球，其特征在于，所述表面特性包括pKa。
33.一种试剂盒，它包含微球；含烯醇酸的活化试剂；一种或多种化学品，一种或多种器件，或它们的一些组合，可用来将烯醇酸偶联到微球的聚合物核上，使烯醇酸能改性微球的表面特性，其中一种或多种试剂通过烯醇酸与微球偶联。
34.一种改变微球表面特性的方法，它包含将烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能团偶联到微球上，以改性微球的表面特性，其中，试剂通过烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能团与微球偶联。
35.一种微球，它包含偶联到微球的聚合物核上的烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能团，使所述烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能团能改性微球的表面特性，其中，试剂通过烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能团与微球偶联。
36.一种试剂盒，它包含微球；含烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能团的活化试剂；一种或多种化学品，一种或多种器件，或它们的一些组合，可用来将烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能团偶联到微球的聚合物核上，使所述烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能团能改性微球的表面特性，其中，试剂可通过烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能团与微球偶联。
37.一种改变微球表面特性的方法，它包含将与一种化学基团共轭的可离子化极性基团偶联到微球上，以改性微球的表面特性，其中，试剂通过与该化学基团共轭的可离子化极性基团偶联到微球上。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述化学基团包括砜基或羰基。
39.一种微球，它包含偶联到微球的聚合物核上的与化学基团共轭的可离子化极性基团，使与该化学基团共轭的可离子化极性基团能改性微球的表面特性，其中，试剂通过与化学基团共轭的可离子化极性基团偶联到微球上。
40.如权利要求39所述的微球，其特征在于，所述化学基团包括砜基或羰基。
41.一种试剂盒，它包含微球；含与化学基团共轭的可离子化极性基团的活化试剂；一种或多种化学品，一种或多种器件，或它们的一些组合，可用来将与该化学基团共轭的可离子化极性基团偶联到微球的聚合物核上，使与该化学基团共轭的可离子化极性基团能改性微球的表面特性，其中，试剂可通过与该化学基团共轭的可离子化极性基团偶联到微球上。
42.如权利要求41所述的试剂盒，其特征在于，所述化学基团包括砜基或羰基。
全文摘要
提供了形成染色微球的各种方法。一种方法包括利用热或光活化与染料偶联的化学结构，在微球存在下形成反应中间体。反应中间体通过共价键连接到微球的聚合物上，由此将染料偶联到聚合物上，形成染色的微球。还提供了形成与一个分子偶联的染色微球的其他方法。这些方法包括如上所述给微球染色，然后在染色微球外表面上合成分子。还提供了染色微球群。染色微球群中的每个染色微球包含一种染料，该染料通过一种化学结构连接到每个染色微球的聚合物上。染色微球群的染色特性由染料引起的差异因数约小于10％。
文档编号G01N33/546GK101044403SQ200580034420
公开日2007年9月26日 申请日期2005年10月11日 优先权日2004年10月12日
发明者A·G·鲁加德, K·D·霍法克 申请人:卢米尼克斯股份有限公司