专利名称：用于测定组氨酸脱羧酶活性的荧光极化测定的制作方法
技术领域：
本发明的领域涉及用于检测HDC活性的荧光极化测定方法，可以用于疾病诊断以及确证HDC抑制剂。
2.背景技术组胺是一种强效生物活性胺，在多种病理以及生理状态中具有活性(Jutel M，Watanabe T，Akdis M，Blaser K，Akdis CAImmune regulation byhistamine.Curr.Opin.Immunol 2002；14735-740)。除了已经良好表征的对急性炎性以及过敏性反应的活性外，组胺调节抗原-特异免疫反应的多个方面(Schneider E，Rolli-Derkinderen M，Arock M，Dy MTrends in histamineresearchnew functions during immune responses and hematopoiesis.TrendsImmunol 2002；23255-263)。最近的发现，例如在免疫活性细胞上发现新的组胺受体(H4)以及H1和H2受体对T辅助细胞极化中作用的证实，引起了人们对组胺触发的免疫调节机制的极大兴趣(Schneider E，Rolli-Derkinderen M，Arock M，Dy M.；Trends Immunol.2002 May；23(5)255-63)。
组氨酸脱羧酶(HDC)是组胺生物合成中的限速酶(Watanabe T，Yamatodani A，Maeyama K，Wada HPharmacology ofα-fluoromethylhistidine，a specific inhibitor of histidine decarboxylase.Trends Pharmaceutical Sci1990；11363-367.)。哺乳动物HDC是吡哆醛5-磷酸(PLP)-依赖酶大家族中的成员(Christen P，Mehta PFrom Cofactor to enzymes.The molecular evolutionof pyridoxal-5’phosphate-dependent enzymes.Chemical Record 2001；1436-447.)。HDC在大多数组织中表达但是最高的水平见于皮肤、GI道以及气道。HDC是74Kd酶，能转化为更短的54Kd形式(Yatsunami K，Tsuchikawa M，Kamada M，Hori K，Higuchi TComparative studies of humanrecombinant 74-and 54-kDa L-histidine decarboxylase.J.Biol.Chem.1995；27030813-30817)。二种形式在体外都具有活性，但是二者不同时出现在亚细胞室中；74Kd形式主要见于内质网中(Tanaka S，Nemoto K，Yamamura E，Ohmura S，Ichikawa ADegradation of the 74kDa form of l-histidine de-carboxylase via the ubiquitin-proteasome pathway in a rat basophilic/mast cellline(RBL-2H3).FEBS Letters 1997；417203-207)。
最近得到的HDC-缺乏小鼠为内源性组胺在广泛的正常以及疾病过程中作用的研究提供了良好的系统(Ohtsu H，Watanabe TNew functions ofhistamine found in histidine decarboxylase gene knockout mice.BiochemBiophys Res Commun 2003；443-447)。HDC-/-小鼠具有下降数目的肥大细胞以及下降的粒状含量如肥大细胞蛋白酶(Ohtsu H，Tanaka S，Terui T，Hori Y，Makabe-Kobayashi Y，Pejler G，Tchougounova E，Hellman L，Gertsenstein M，Hirasawa N，Sakurai E，Buzas E，Kovacs P，Csaba G，Kittel A，Okada M，Hara M，Mar L，Numayama-Tsuruta K，Ishigaki-Suzuki S，Ohuchi K，Ichikawa A，Falus A，Watanabe T，Nagy AMice lacking histidine decarboxylase exhibit abnormalmast cells.FEBS 2001；50253-56.)。这些小鼠显示了下降的气道高反应性(Kozma GT，Losonczy G，Keszei M，Komlosi Z，Buzas E，Pallinger E，Appel J，Szabo T，Magyar P，Falus A，Szalai CHistamine deficiency in gene-targetedmice strongly reduces antigen-induced airway hyper-responsiveness，eosinophilia and allergen-specific IgE.International Immunol.2003；15963-973，下降的血管通透性(Ohtsu等Plasma extravasation inducedby dietary supplemented histamine in histamine-free mice.Eur J Immunol.2002；321698-708)、下降的皮肤炎症(Ghosh AK，Hirasawa N，Ohtsu H，Watanabe T，Ohuchi KDefective angiogenesis in the inflammatory granulation tissue inhistidine decarboxylase-deficient mice but not in mast cell-deficient mice.J.Exp.Med.2002；195973-982.)以及增加的骨密度(Fitzpatrick LA，Buzas E，GagneTJ，Nagy A，Horvath C，Ferencz V，Mester A，Kari B，Ruan M，Falus A，BarsonyJ.Targeted deletion of histidine decarboxylase gene in mice increases boneformation and protects against ovariectomy-induced bone loss.Proc Natl AcadSci USA.2003；100(10)6027-32)。因此，强效的HDC活性抑制剂可能可以用于过敏、炎性、免疫性、骨以及心血管疾病。组胺也已经证实是一些类型的癌症增殖的积极的调节剂(Hegyesi H，Somlai B，Varga VL，Toth G，Kovacs P，Molnar EL，Laszlo V，Karpati S，Rivera E，Falus A，Darvas Z.Suppression of melanoma cell proliferation by histidine decarboxylase specificantisense oligonucleotides.J Invest Dermatol.2001 Jul；117(1)151-3)。
组胺的生物作用已经进行了深入的研究，利用组胺受体特异性激动剂或者拮抗剂的药理学方法。尽管HDC在过敏性以及炎性响应中的重要的作用，目前几乎没有该酶的小分子抑制剂。这些抑制剂中的大多数都是通过合理设计策略发现的并且为组氨酸类似物。表征良好的HDC抑制剂为不可逆抑制剂α-氟甲基组氨酸(Watanabe T，Yamatodani A，Maeyama K，WadaH.Pharmacology of alpha-fluoromethylhistidine，a specific inhibitor of histidinedecarboxylase.Trends Pharmacol Sci.199011363-7)。
识别新类型的HDC抑制剂的能力受限于缺乏适合用于HTS的测定。最常使用用来HDC活性的测定基于o-苯二醛(OPT)方法(Roskoski R，RoskoskiLMA rapid histidine decarboxylase assay.Analytical Biochem.1978；87293-297.)。这种测定对组胺相对于组氨酸不具有选择性并且涉及酶产物与底物的层析分离。另外一种更加敏感的HDC测定利用[14C]-标记的组氨酸转化为[14C]-标记的-组胺。然后利用薄层层析分离底物以及产物。组胺ELISA试剂盒可以潜在地适于用来测量HDC活性。但是，这些测定需要乙酰化步骤(乙酰化的组胺)以实现任何有用的选择性以及灵敏度。此外，这些步骤需要大量的洗涤步骤，而这与HTS不符合。
发明概述用于测定候选化合物的HDC调节活性的荧光极化测定方法，包括下述步骤a)提供反应混合物，包括HDC、组氨酸、荧光标记的组胺探针、候选化合物以及抗组胺抗体，所述的抗组胺抗体对组胺相对于组氨酸的选择性大于至少10倍；b)孵育反应混合物；
c)测定在测试化合物存在下是否发生了HDC的抑制，其中荧光极化信号的增加表明测试化合物抑制HDC的活性。
在本发明的另一实施方案中，抗组胺抗体对组胺相对于组氨酸的选择性大于至少100倍。
在本发明的另一实施方案中，孵育反应混合物多于15分钟，并且更优选地介于60至120分钟之间并且最优选地介于约80至100分钟之间。
在本发明的另一实施方案中，使用人HDC。
在本发明的另一实施方案中，HDC为重组酶或者部分纯化的。
在本发明的另一实施方案中，组胺探针对抗组胺抗体的亲和力大于1μM。
在本发明的另一实施方案中，使用的抗组胺抗体利用通过连接基区域桥连至载体的组胺通过免疫小鼠产生，并且其中所述的连接基结构上类似于荧光探针。
在本发明的另一实施方案中，连接基区域为1，4-苯醌并且载体为白蛋白。
在本发明的另一实施方案中，荧光标记的组胺探针选自FITC、罗丹明、TAMRA或者Cy5。
在本发明的另一实施方案中，组氨酸浓度介于10μM和5mM之间并且更加优选地介于100μM和1mM之间。
本发明另外一方面提供了一种检测患者样品中HDC活性作为诊断疾病的工具的方法，其中所述的方法包括a)将所述的样品与反应混合物接触，所述的反应混合物包括HDC、组氨酸、荧光标记的组胺探针以及抗组胺抗体，所述的抗组胺抗体对组胺的选择性比组氨酸至少大10倍；b)孵育反应混合物；c)测定与对照样品中的HDC活性水平相比，患者样品中是否发生HDC活性的增加，其中相对于对照样品的荧光极化信号的下降表明患者样品处于患所述疾病的风险中。
在本发明的另一实施方案中，使用的抗组胺抗体利用通过连接基区域桥连至载体的组胺通过免疫小鼠产生，并且其中所述的连接基结构上类似于组胺-荧光探针。
在本发明的另一实施方案中，所述的疾病选自癌症、哮喘和肥大细胞瘤、免疫疾病以及胃肠道疾病。
附图简述
图1A显示了组胺的结构。
图1B显示了N-[3′，6′-二羟基-3-氧代螺[异苯并呋喃-1(3H)，9′-[9H]口占吨-5(或6)-基]-N′-[2-(1H-咪唑-4-基)乙基]-2，4-二甲基硫脲，二钠盐(FITC-组胺)探针分子的结构。
图2显示了FITC-组胺与抗-组胺抗体的结合。测定如在方法中所述在96-孔板中以一式两份运行，FITC-组胺浓度为6nM。这些数据利用SAS拟合并且测定的Kd值为3.9nM。
图3显示组胺(●)或者组氨酸(□)对结合至抗-组胺抗体的FITC-组胺的置换。如在方法中所述的，在96-孔板中进行一式三份测定，利用6nM FITC-组胺，50nM抗-组胺抗体以及标示的竞争性配体浓度。
图4A显示在不同酶浓度下的HDC时间进程。在384-孔板中的一式三份反应通过加入标示浓度的HDC而启动，并且在孵育0至180分钟的时间点测定荧光极化。探针、底物以及抗体浓度如在标准测定中所述。
图4B在90分钟时候的HDC滴定。测定(384-孔)以一式四份的形式进行，利用标示浓度的HDC在37℃在AllegroTM系统上进行90分钟。测定窗定义为在空白(无酶)以及反应孔之间的mP差值。
图5显示组氨酸甲基酯(A)、α-氟甲基组氨酸(B)以及二肽组氨酸-苯丙氨酸(C)对HDC的抑制。反应利用在方法中描述的标准条件以及标示的抑制剂浓度进行。利用XLFit4(IDBS软件)拟合数据得到IC50值。误差线显示一式三份测定的平均值±SD。
图6显示从单天筛选的90块板(384孔)得到的空白(●)以及阳性对照(□)值的散布图。
发明详述荧光标记的组胺探针。本发明提供了荧光探针。优选的探针为FITC-组胺(硫脲，N-[3′，6′-二羟基-3-氧代螺[异苯并呋喃-1(3H)，9′-[9H]口占吨-5(或6)-基]-N′-[2-(1H-咪唑-4-基)乙基]-2，4-二甲基，二钠盐)，其从Molecular Probes(Eugene，OR)得到。其他的合适的探针包括用罗丹明、TAMRA或者Cy5标记的组胺。
抗组胺抗体。本发明提供了一种使用抗组胺抗体的测定。能够使用的一种合适的单克隆抗体是组胺抗体D22.12，能够从Argene(Varilhes，France)得到。D22.12抗体利用偶联至白蛋白的2-组胺基-1，4-苯醌免疫小鼠而得到(Guesdon JL，Chevrier D，Mazie JC，David B，Avrameas SMonoclonalanti-histamine antibody.Preparation，characterization and application to enzymeimmunoassay of histamine.J.Immunol.Methods 1986；8769-78.)，而我们检测的所有其他的抗体利用偶联至白蛋白的组胺或者乙酰化组胺免疫得到。D22.12对组胺-荧光的高亲和力源自用来得到D22.12的免疫原(组胺基苯醌)和组胺-荧光探针之间的结构上的类似性。适用于本发明的其他的抗组胺抗体能够利用也具有与组胺探针结构类似的具有相似连接基的免疫原得到。取决于用作探针的荧光团，可以使用不同的抗-组胺抗体。
组氨酸能够从Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)得到。
HDC酶的来源a)重组-在本发明的优选的实施方案中，使用人HDC酶。包括可以使用全长蛋白或者截短形式如53KD形式，只要截短形式保持组氨酸脱羧酶活性。优选地，使用人HDC蛋白(SEQ ID.1)或其片段。HDC蛋白也可以融合到蛋白标记物上，如谷胱甘肽S-转移酶(GST)以有利于纯化。
b)纯化-本发明的方法可以利用纯化的HDC酶实施。如这里所述，术语部分纯化包括已经部分纯化的HDC酶以使其含量高于可以见于人体细胞的HDC酶。HDC的纯化方法是本领域公知的，并且得到Watabe A，Fukui T，Ohmori E，Ichikawa APurification and properties of L-histidine decarboxylasefrom mouse stomach.Biochem.Pharmacol.1992；43587-593的教导，其内容这里引入作为参考。
用于检测抑制剂的标准测定在标准的测定中，在HDC缓冲液中稀释的HDC(所述的缓冲液包含还原剂如DTT和酶辅因子PLP)，加入到样品板中。将在HDC缓冲液中的测试化合物以及合适量的DMSO或者单独的缓冲液加入到板中。荧光标记的-组胺和组氨酸在FP缓冲液中混合并且以10μL转移到板中。最终，将90nM抗-组胺抗体加入到20μL的FP缓冲液中。因此，在测定中的最终浓度为HDC 25至50nM，FITC-组氨酸3至6nM，组氨酸300至600uM，抗-组胺抗体25至50nM，以及DMSO 1至5％。然后将板在37℃孵育至少15分钟。在获取荧光极化的合适的仪器上读数荧光极化信号，如LJLAnalyst(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)，激发波长485nm，发射波长530nm，荧光分色镜在505nm并且G系数设定为1。荧光信号的下降为测试化合物抑制HDC活性的表征。
用于检测候选抑制剂的标准步骤的改良-参数的优化本发明提供了一种HDC测定，用于测定候选化合物的HDC调节活性以及一种用于测定患者样品中的HDC水平的诊断方法。可以预期本领域的普通技术人员可以实施本发明，通过改变许多参数以使测定适于自身的使用。可以改变的一些参数包括抗-组胺抗体浓度、底物组氨酸的浓度、探针浓度、HDC酶的来源以及浓度、测试化合物浓度、加入组分的顺序、单个成分的体积、反应的总体积、反应之前的HDC与测试化合物的预孵育步骤的加入、反应的持续时间、反应的温度、测定板的类型、冷却或者加热步骤、终止酶反应的加入步骤(例如酸、碱、盐、已知的HDC抑制剂或者其他)、用来读取荧光极化信号的仪器类型以及相关的参数。
荧光探针对其受体靶分子的选择性在本发明的一个实施方案中，抗-组胺抗体对组胺的选择性相对于组氨酸大于100X。合适的候选抑制剂预期IC50＜10μM。
诊断疾病的标准测定从正常或者疾病样品中提取以及制备组织或者血清以测定HDC活性的方法是本领域中公知的。例如(1)1-Sieja K，Stanosz S，vonMach-Szczypinski J，Olewniczak S，Stanosz M.Concentration of histamine inserum and tissues of the primary ductal breast cancers in women.Breast.2005Jun；14(3)236-41；(2)E.Masini，V.Fabbroni，L.Giannini，A.Vannaccil，L.Messerini，F.Perna，C.Cortesini and F.Cianchi Histamine and histidinedecarboxylase up-regulation in colorectal cancercorrelation with tumor stageInflamm.res.54，Supplement 1(2005)S80-S81；(3)3-Fogel WA，Dudkowska M，Wagner W，Grzelakowska-Sztabert B，Manteuffel-Cymborowska M.Ornithineand histidine decarboxylaseactivities in hypertrophic and hyperplastic mousekidney.Inflamm Res.2005 Apr；54 Suppl 1S62-3。
这些方法可以适用于制备样品以用于在这里描述的荧光HDC测定中的检测。我们的方法容许高通量测定正常靶或者疾病组织或者血浆或者血液样品中的HDC活性。
实施例试剂FITC-组胺(硫脲，N-[3′，6′-二羟基-3-氧代螺[异苯并呋喃-1(3H)，9′-[9H]口占吨-5(或6)-基]-N′-[2-(1H-咪唑-4-基)乙基]-2，4-二甲基，二钠盐)得自Molecular Probes(Eugene，OR)。组胺单克隆抗体22.12获自Argene(Varilhes，France)。L-组氨酸、组胺、磷酸钾(1M单-以及二碱溶液)、聚乙二醇400分子量、乙二醇四乙酸(EGTA)、二硫苏糖醇、吡哆醛-5-磷酸以及氯化钠得自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。3-[(3-Cholamidopropyl)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)得自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。二甲亚砜由Baker Chemical Corp提供。黑色不透明的聚苯乙烯384-孔板购自Corning-Costar。已知的HDC抑制剂组氨酸-甲基酯，以及His-Phe得自SigmaChemical Co以及α-氟甲基组氨酸得自Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals化合物库。
缓冲液HDC缓冲液由200mM磷酸钾(pH 6.8)，2％PEG-400，0.2mM EGTA以及0.03％CHAPS组成。FP缓冲液为16.6mM Tris-HCl(pH 7.5)和50mM NaCl。
组胺含量的HPLC测定HPLC分离在装配了二极管阵列检测器的Agilent 1090M上进行。使用Delta-Pak HPI C4 300，2.0×150mm柱(Waters)。流动相由20ml PICB-8Low UV Reagent(Waters)的1000ml 10mM三乙胺磷酸盐，pH 3.0组成。所有的分离在室温下(22℃)进行，流速0.2ml/分钟并且在215nm波长处监测。
利用浓度对响应面积的标准曲线计算组胺浓度。标准曲线利用一式二份注射组胺的对照缓冲液中的溶液产生，浓度为0至200或者600μM。使用6个等间距的浓度。在TI-68计算器上利用线性回归计算浓度(μM)对响应面积的标准曲线。相关系数大于0.999。
人HDC的克隆相应于全长人HDC的截短的53Kd形式(索取号NM 002112)的cDNA通过PCR扩增，利用源自人肥大细胞系HMC-1的总RNA(Maeda K，Taniguchi H，Ohno I，Ohtsu H，Yamauchi K，Sakurai E，Tanno Y，Butterfield JH，Watanabe T，Shirato KInduction of L-histidine decarboxylase in a human mastcell line，HMC-1.Exp Hematol.1998；26325-31.)。使用的引物为5’-atgatggagcctgaggagtacagag以及3′-acactactgactcaggatgagagt。将HDCcDNA(1.5Kb)克隆到pcDNA4.1载体上。克隆pcDNA4.1-HDC用作模板以得到PCR产物，包含HDC的首先的1431个碱基(氨基酸残基1-477)并且插入凝血酶裂解位点5’并且邻近首先的碱基。该PCR产物克隆到pDEST 20中，利用Gateway克隆技术(Invitrogen Life Technologies)，按照厂商的操作规程。从最终的表达克隆纯化的DNA进行测序证实并且然后转化成DH10Bac E.coli用于转座成杆粒。重组的杆粒DNA从单一的菌落纯化并且转座利用PCR分析证实。
GST-HDC的杆状病毒表达以及纯化将20L体积的SF900II-SFM(Invitrogen cat#10902-088)灭菌过滤到30LMBR的搅拌的罐生物反应器中。将MBR生物反应器装配pH、溶解的氧气以及温度探针并且控制设置参数为pH 6.2、DO 50％、温度27℃、RPM 110。将四份1L的Sf9细胞振荡瓶生长至细胞密度介于2.5×106和3×106细胞/mL之间并且用来接种生物反应器，得到24L的培养基，细胞密度约为4×105至5×105细胞/mL。对接种的生物反应器每天取样以检测细胞密度、生存力以及细胞直径，利用Cedex细胞计数器(Innovatious)。利用Bioprofile 100分析器(Nova Biomedical)也每天进行有营养的(葡萄糖、谷氨酸)以及废物(氨)分析。在初始细胞接种后24小时，将生物反应器用GST-HDC杆状病毒感染得到0.1的MOI。在感染前取样1.5mL的细胞上清液样品(离心，倾析以及冷冻)并且每24小时进行一次直至富集进行SDS-PAGE和WESTERN分析。感染后24小时，将25mg的Leupeptin溶解在SF900II-SFM培养基中，过滤灭菌并且注射到生物反应器中。感染后48小时富集。在12L的离心机(Sorvall BP12)中每次旋转@3000rpm，4℃离心10分钟沉淀感染的细胞。将沉淀合并到一个离心管中并且进行最终的离心在4℃在3500rpm离心10分钟。称量沉淀并且在-80℃冷冻直至使用。标准的沉淀为300克。
进行蛋白纯化的时候，所有的缓冲液制备自蒸馏以及去离子水并且所有的步骤在4℃进行。将细胞沉淀与裂解缓冲液(20mM Hepes，pH 7.5，150mM KCl，10％甘油，2mM DTT，1mM EGTA，Roche蛋白酶抑制剂混合物片，以及0.01mM PLP)以5ml/g细胞沉淀的比例混合。将细胞在冰上利用PolyTron PT 2100(Kinematica AG，Switzerland)匀浆，然后利用BransonSonifier 450(Converter，USA)以50％工作循环超声3次，每次5分钟。将细胞裂解液在18,600g离心30分钟，然后在225,071g离心60分钟。将澄清的裂解液直接负载到50mL Glutahione Sepharose 4B柱(Amersham，Sweden)上，利用AKTA Prime层析系统(Amersham，Sweden)。负载后，将柱用4柱体积(CV)的洗涤缓冲液(20mM Hepes，pH 7.5，150mM KCl，10％甘油，2mMDTT，0.5mM EDTA，0.5mM PMSF和0.01mM PLP)洗涤，并且然后利用10CV的洗脱缓冲液(20mM还原的GTH，2mM DTT以及洗涤缓冲液，pH 8.0)洗涤。富集从柱上洗脱的HDC产物，根据SDS-PAGE凝胶的视觉观察。标准收率为33mL的HDC，浓度1.8mg/mL。将富集的产品相对于5L的缓冲液1(20mM Hepes，pH 7.5，0.1mM EGTA，0.2mM PMSF，0.25mM DTT，10％甘油和0.01mM PLP)透析4小时，然后相对于5L的缓冲液2(0.1M磷酸钾，pH 7.5，2％PEG-400，0.1mM EGTA，2mM PMSF，10％甘油和0.02mM PLP)透析17小时。将最终的产物等分，在液氮中快速冻结并且储存在-80℃。
组氨酸脱羧酶测定在标准的测定中，HDC，在HDC缓冲液中稀释至90nM以及0.9mM DTT和99μM PLP，以20μL加入到黑色不透明的384-孔板中。以10μL将测试化合物在HDC缓冲液溶液以及6％DMSO中的溶液或者单独的缓冲液加入到板中。将36nM FITC-组氨酸和3.6mM组氨酸在FP缓冲液中混合并以10μL转移到板中。最后，将90nM抗-组氨酸抗体以在20μL的FP缓冲液中的溶液加入。因此，在测定中的最终浓度为HDC 30nM、FITC-组氨酸6nM、组氨酸600μM、抗-组胺抗体30nM、DMSO 1％。将板在37℃孵育90分钟。在LJL Analyst(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上获取荧光极化信号，激发波长485nm，发射波长530nm，荧光分色镜设置在505nm并且G因子设定为1。用于测定开发中的96-孔板的测定形式，如上描述进行，使用的体积是384-孔板中标示的两倍。
高通量筛选测定在Zymark AllegroTM机器人系统(Caliper-Zymark，Hopkinton，MA)上自动化，利用Multidrop以加入酶，Sciclone以加入底物/探针以及测试化合物，并且Multidrop以加入抗体。将板在潮湿环境中在37℃孵育，并且在集合到Allegro系统的LJL Analyst中读取荧光极化，利用上述设定。化合物以5μg/mL的浓度筛选。计算相对于测定空白(除了HDC以外包含全部的反应)，以及100％对照(包含HDC缓冲液以及1％DMSO代替化合物)的POC值。
结果HDC酶产物(组胺)以及组胺探针(FITC-组胺)的结构显示在图1中。我们首先开始检测数种商业化的抗组胺抗体与FITC-组胺探针之间的相互作用(数据未显示)。这些抗体中的一种(D22.12)，显示了通过荧光极化测定的强烈的探针结合并且保留用于进一步的表征。
我们首先测定探针对抗体的亲和力以及相互作用的特异性，二者对建立竞争模式的强有力的测定是至关重要的。图2显示了利用各向异性测量测定的探针和抗体的结合曲线。探针浓度保持在6nM并且抗体浓度以约3个logs变化。在拟合数据的基础上，测定解离常数为3.9nM。抗体对组胺相对于组氨酸的特异性如图3中所示证明。探针和抗体浓度分别保持恒定在6和50nM，而组胺和组氨酸的浓度随所显示的变化。在检测的5个log范围之内，组氨酸不能与FITC-组胺竞争结合抗体。然而组胺自由地与探针竞争结合抗体，得到135μM的IC50。因此，FITC-组胺与组胺单克隆抗体的紧密以及特异结合以及与酶反应的产物竞争结合的能力暗示可能开发针对HDC的强有力的竞争性FP测定。
图4A显示了在不同浓度的HDC酶反应的时间过程。600uM的组氨酸，约为报道的Km 200-400uM的两倍(Watabe等1992)。在HDC浓度＞100nM的时候，反应保持线性只有约30分钟。为了平衡随大规模筛选酶需求导致的测定窗的大小以及反应的线性，我们选择在标准的测定中使用25-50nM的HDC以及90分钟的孵育时间。图4B进一步完善，其显示了在Allegro机器人系统进行的在90分钟孵育时候的HDC滴度。从该实验中，我们得到酶浓度为30nM。因此，最终的测定条件设定为30nM HDC、30nM抗体以及6nM FITC-组胺，总体积60μL，在37℃反应90分钟。PLP浓度设定在33μM以保持酶的饱和。
图5显示了3种已知的HDC抑制剂在标准测定中的行为组氨酸甲基酯、α-氟甲基组氨酸以及二肽组氨酸-苯丙氨酸。我们测得3种化合物的IC50分别为7.7uM、1.4uM和228.1uM。这些数值与利用HPLC测定得到的数值较好地一致。
然后将如上描述的测定用来筛选库中的化合物，最终浓度为5μg/mL。将384-孔板设置包含352个化合物孔，16个对照孔(无化合物)以及16空白孔(无酶)每板。在纯净DMSO中的化合物，在缓冲液种稀释以得到测定中最终DMSO的浓度为1％。该DMSO浓度显示对酶活性或者稳定性没有影响(数据未显示)。该测定在Allegro自动体系中完全自动化，能够每天处理约100块板的通量。图6显示了90块板的单一筛选循环的空白以及对照孔的散射图，平均的Z’为0.6并且测定窗为80-100mP。在测定中筛选超过600,000种化合物，确证的命中率为0.05％，利用60％的对照作为命中标准。确证的命中化合物随后进行10点剂量效应测定以评价功效。
讨论对FP测定的性能发挥作用的重要的参数为荧光探针对其受体或者靶分子的亲和力。通常的规则是，探针结合至其受体的Kd与结合的级分成反比。因此，高亲和力结合允许最佳的荧光-配体/受体化学计量学以及强烈的FP信号。我们筛选了多种抗-组胺抗体以寻求发现一种对我们的组胺-荧光探针具有合适的亲和力。在这些抗体中只有一种，D22.12，具有足够高的亲和力用于开发FP测定。D22.12抗体是利用偶联至白蛋白的2-组胺基-1，4-苯醌通过免疫小鼠产生的(Guesdon等；1986)，而我们检测的所有的其他的抗体利用偶联至白蛋白的组胺或者乙酰化组胺免疫产生的。D22.12对组胺-荧光的高度结合亲和力源自用于得到D22.12的免疫原(组胺基苯醌)以及组胺-荧光探针之间的结构类似性。
HDC(54Kd形式)与其底物的组氨酸的Km为275μM(数据未显示)。因此，开发HDC测定的重要的必要条件是组胺相对于组氨酸的选择性。我们的FP测定显示组胺的选择性超过对组氨酸选择性的100-倍。但是，如图3中所示，由于FP信号中的非特异性增加，组氨酸浓度应该保持低于2mM。这种限制在测定HDC活性的大多数应用中不是问题，因为酶的Km远低于测定耐受的组氨酸的最大量。
脱羧酶构成了发挥重要生理作用的大的酶家族(Christen等；2001)。例如，DOPA脱羧酶负责关键神经递质多巴胺以及血清紧张素的合成，分别地通过对L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)和L-5-羟基色氨酸脱羧基。目前用于测定递质如血清紧张素和多巴胺的方法与组胺检测技术类似。因此，这里描述的针对HDC的测定可以适用于相关的酶如多巴脱羧酶并且使开发具有更好的药理特性的新的抑制剂成为可能。
序列表<110>贝林格尔·英格海姆药物公司(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals，Inc.)AUGUST，E.MichaelRAJOTTE，Daniel<120>用于测定组氨酸脱羧酶活性的荧光极化测定<130>9/327 PCT<140>PCT/US2005/041766<141>2005-11-15<150>60/628,242<151>2004-11-16<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>662<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Met Glu Pro Glu Glu Tyr Arg Glu Arg Gly Arg Glu Met Val Asp1 5 10 15Tyr Ile Cys Gln Tyr Leu Ser Thr Val Arg Glu Arg Arg Val Thr Pro20 25 30Asp Val Gln Pro Gly Tyr Leu Arg Ala Gln Leu Pro Glu Ser Ala Pro35 40 45Glu Asp Pro Asp Ser Trp Asp Ser Ile Phe Gly Asp Ile Glu Arg Ile50 55 60Ile Met Pro Gly Val Val His Trp Gln Ser Pro His Met His Ala Tyr65 70 75 80Tyr Pro Ala Leu Thr Ser Trp Pro Ser Leu Leu Gly Asp Met Leu Ala85 90 95
Asp Ala Ile Asn Cys Leu Gly Phe Thr Trp Ala Ser Ser Pro Ala Cys100 105 110Thr Glu Leu Glu Met Asn Val Met Asp Trp Leu Ala Lys Met Leu Gly115 120 125Leu Pro Glu His Phe Leu His His His Pro Ser Ser Gln Gly Gly Gly130 135 140Val Leu Gln Gln Thr Val Ser Glu Ser Thr Leu Ile Ala Leu Leu Ala145 150 155 160Ala Arg Lys Asn Lys Ile Leu Glu Met Lys Thr Ser Glu Pro Asp Ala165 170 175Asp Glu Ser Cys Leu Asn Ala Arg Leu Val Ala Tyr Ala Ser Asp Gln180 185 190Ala His Ser Ser Val Glu Lys Ala Gly Leu Ile Ser Leu Val Lys Met195 200 205Lys Phe Leu Pro Val Asp Asp Asn Phe Ser Leu Arg Gly Glu Ala Leu210 215 220Gln Lys Ala Ile Glu Glu Asp Lys Gln Arg Gly Leu Val Pro Val Phe225 230 235 240Val Cys Ala Thr Leu Gly Thr Thr Gly Val Cys Ala Phe Asp Cys Leu245 250 255Ser Glu Leu Gly Pro Ile Cys Ala Arg Glu Gly Leu Trp Leu His Ile260 265 270Asp Ala Ala Tyr Ala Gly Thr Ala Phe Leu Cys Pro Glu Phe Arg Gly275 280 285Phe Leu Lys Gly Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Phe Thr Phe Asn Pro Ser290 295 300Lys Trp Met Met Val His Phe Asp Cys Thr Gly Phe Trp Val Lys Asp305 310 315 320Lys Tyr Lys Leu Gln Gln Thr Phe Ser Val Asn Pro Ile Tyr Leu Arg325 330 335
His Ala Asn Ser Gly Val Ala Thr Asp Phe Met His Trp Gln Ile Pro340 345 350Leu Ser Arg Arg Phe Arg Ser Val Lys Leu Trp Phe Val Ile Arg Ser355 360 365Phe Gly Val Lys Asn Leu Gln Ala His Val Arg His Gly Thr Glu Met370 375 380Ala Lys Tyr Phe Glu Ser Leu Val Arg Asn Asp Pro Ser Phe Glu Ile385 390 395 400Pro Ala Lys Arg His Leu Gly Leu Val Val Phe Arg Leu Lys Gly Pro405 410 415Asn Cys Leu Thr Glu Asn Val Leu Lys Glu Ile Ala Lys Ala Gly Arg420 425 430Leu Phe Leu Ile Pro Ala Thr Ile Gln Asp Lys Leu Ile Ile Arg Phe435 440 445Thr Val Thr Ser Gln Phe Thr Thr Arg Asp Asp Ile Leu Arg Asp Trp450 455 460Asn Leu Ile Arg Asp Ala Ala Thr Leu Ile Leu Ser Gln His Cys Thr465 470 475 480Ser Gln Pro Ser Pro Arg Val Gly Asn Leu Ile Ser Gln Ile Arg Gly485 490 495Ala Arg Ala Trp Ala Cys Gly Thr Ser Leu Gln Ser Val Ser Gly Ala500 505 510Gly Asp Asp Pro Val Gln Ala Arg Lys Ile Ile Lys Gln Pro Gln Arg515 520 525Val Gly Ala Gly Pro Met Lys Arg Glu Asn Gly Leu His Leu Glu Thr530 535 540Leu Leu Asp Pro Val Asp Asp Cys Phe Ser Glu Glu Ala Pro Asp Ala545 550 555 560Thr Lys His Lys Leu Ser Ser Phe Leu Phe Ser Tyr Leu Ser Val Gln565 570 575
Thr Lys Lys Lys Thr Val Arg Ser Leu Ser Cys Asn Ser Val Pro Val580 585 590Ser Ala Gln Lys Pro Leu Pro Thr Glu Ala Ser Val Lys Asn Gly Gly595 600 605Ser Ser Arg Val Arg Ile Phe Ser Arg Phe Pro Glu Asp Met Met Met610 615 620Leu Lys Lys Ser Ala Phe Lys Lys Leu Ile Lys Phe Tyr Ser Val Pro625 630 635 640Ser Phe Pro Glu Cys Ser Ser Gln Cys Gly Leu Gln Leu Pro Cys Cys645 650 655Pro Leu Gln Ala Met Val660
权利要求
1.用于测定候选化合物的HDC调节活性的荧光极化测定方法，包括下述步骤a)提供反应混合物，包括HDC、组氨酸、荧光标记的组胺探针、候选化合物以及抗组胺抗体，所述的抗组胺抗体对组胺的选择性比组氨酸大至少10倍；b)孵育反应混合物；c)测定在测试化合物存在下是否发生了HDC的抑制，其中荧光极化信号的增加表明测试化合物抑制HDC的活性。
2.权利要求1的测定方法，其中抗组胺抗体对组胺的选择性比组氨酸大至少100倍。
3.权利要求1的荧光极化测定方法，其中反应混合物孵育多于15分钟。
4.权利要求3的荧光极化测定方法，其中反应混合物孵育60至120分钟。
5.权利要求4的荧光极化测定方法，其中反应混合物孵育约80至100分钟。
6.权利要求1的方法，其中HDC为SEQ ID.No.1的多肽。
7.权利要求1的方法，其中HDC为重组酶。
8.权利要求1的方法，其中HDC为部分纯化的。
9.权利要求1的方法，其中组胺探针对抗组胺抗体的亲和力大于1μm。
10.权利要求1的方法，其中使用的抗组胺抗体利用通过连接基区域桥连至载体的组胺免疫小鼠产生，并且其中所述的连接基在结构上类似于荧光探针。
11.权利要求10的方法，其中所述的连接基区域为偶联至载体的1，4-苯醌。
12.权利要求10的方法，其中所述的载体为白蛋白。
13.权利要求1的方法，其中荧光标记的组胺探针选自FITC、罗丹明、四甲基罗丹明和Cy5。
14.权利要求1的方法，其中组氨酸浓度介于10μM至5mM之间。
15.权利要求10的方法，其中组氨酸浓度介于100μm和1mM之间。
16.一种作为疾病诊断工具的检测患者样品中HDC活性的方法，其中所述的方法包括a)将所述的样品与反应混合物接触，所述的反应混合物包括组氨酸、荧光标记的组胺探针以及抗组胺抗体，所述的抗组胺抗体对组胺的选择性比组氨酸至少大10倍；b)孵育反应混合物；c)测定与对照样品中的HDC活性水平相比，患者样品中是否发生HDC活性增加，其中相对于对照样品的荧光极化的下降表明患者样品处于所述疾病的风险中。
17.权利要求16的方法，其中使用的抗组胺抗体利用通过连接基区域桥连至载体的组胺免疫小鼠产生，并且其中所述的连接基结构上类似于荧光探针。
18.权利要求16的方法，其中所述的疾病选自癌症、哮喘、肥大细胞瘤、免疫疾病、骨疾病以及胃肠道疾病。
19.权利要求18的方法，其中所述的疾病为癌症。
全文摘要
用于测定候选化合物的HDC调节活性的荧光极化测定方法，包括下述步骤a)提供反应混合物，包括HDC、组氨酸、荧光标记的组胺探针、候选化合物以及抗组胺抗体，所述的抗组胺抗体对组胺相对于组氨酸的选择性大于至少10倍；b)孵育反应混合物；c)测定在测试化合物存在下是否发生了HDC的抑制，其中荧光极化信号的增加表明测试化合物抑制HDC的活性。
文档编号G01N33/53GK101057146SQ200580038616
公开日2007年10月17日 申请日期2005年11月15日 优先权日2004年11月16日
发明者E·迈克尔·奥古斯特, 丹尼尔·拉乔特 申请人:贝林格尔·英格海姆药物公司