用于治疗前列腺癌的细胞因子表达细胞疫苗的制作方法

专利名称：用于治疗前列腺癌的细胞因子表达细胞疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用作治疗前列腺癌的疫苗的经遗传修饰的细胞因子表达细胞。更具体地说，本发明涉及发现一个针对抗原(β-细丝蛋白(β-Filamin))的增强的免疫应答，所述免疫应答在给患前列腺癌的病人施予经遗传修饰的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达细胞时检测到。
背景技术：
免疫系统在多种癌症的发病机理中起着关键作用。当癌症发生的时候，通常认为时免疫系统不能充分或恰当地应答，致使癌细胞生长。当前治疗癌症的标准医疗方法包括化疗，手术，放疗和细胞诊疗在功效和毒性上有着明显的局限性。迄今为止，基于癌症的种类、病人的总体健康状况、诊断时的病情阶段等等，这些手段取得的不同程度的成功。改进的方法将针对癌症的免疫应答的特定操控和标准的医疗方法联合起来，也许提供一种高功效低毒性的方法。
在一个发挥功效的免疫系统中，抗原在主要组织相容性复合体(MHC)I类分子和II类分子的环境中被加工和表达到细胞表面。一旦与抗原形成复合体，MHC I类分子和II类分子分别被CD8+和CD4+T细胞识别。这种识别产生了一系列二级细胞信号，并且旁分泌释放特定的细胞因子，迅速与细胞交互作用，刺激宿主防御以击退疾病。细胞因子的释放导致了抗原特异性免疫细胞的增殖。
众多的细胞因子被发现在针对癌症的免疫应答的调节中发挥作用。例如，美国专利NO.5,098,702记述了联合使用TNF，IL-2和IFN-β的协同效应的总和来抗击已经存在的肿瘤；美国专利NO.5,078,996和NO.5,904,920记述了使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)治疗肿瘤。然而，将细胞因子用于癌症治疗中直接给药并不可行，因为它们经常有系统毒性。(详见，例如，Asher et al.，J.Immunol.1463227-3234，1991and Havell et al.，J.Exp.Med.1671067-1085，1988.)这种方法的一个延伸涉及使用经遗传修饰的在疫苗部位局部细胞因子表达肿瘤细胞。通过在肿瘤模型中使用免疫调节细胞因子，包括IL-4，IL-2，TNF-α，G-CSF，IL-7，IL-6和GS-CSF，效果得到展示。分别详见Golumbeck PT et al.，Science 25413-716，1991；Gansbacher B et al.，J.Exp.Med.1721217-1224，1990；Fearon ER et al.，cell 60397-403，1990；Gansbacher B et al.，Cancer Res.507820-25，1990；Teng M et al.，PNAS883535-3539，1991；Columbo MP et al.，J.Exp.Med.1741291-1298，1991；Aoki et al.，Proc Natl Acad sci USA.89(9)3850-4，1992；Porgador A，et al.，Nat Immun.13(2-3)113-30，1994；DranoffG et al.，PNAS 903539-3543，1993；Lee CT et al.，Human Gene Therapy 8187-193，1997；Nagai E et al.，CancerImmunil.Immonther.472-80，1998以及Chang A et al.，Human GeneTherapy 11839-850，2000。使用自体癌细胞作为疫苗来增强肿瘤免疫已经有一段时间的探索。详见，例如，Oettgen et al.，“The History of CancerImmunotherapy”，InBiologic Therapy of Cancer，Devita et al.，(eds.)I.Lippincot Co.，pp87-199，1991；Armstrong TD and Jaffee Em，Surg Oncol ClinN Am.11(3)681-96，2002；以及Bodey B et al.，Anticancer Res 20(4)2665-76，2000。
一些使用分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的自体或异体肿瘤细胞疫苗的一期二期人体试验已经进行(Simons et al.Cancer Res 1999595160-8；Soiffer et al.Proc Natl Acad Sci USA 1998 9513141-6；Simons et al.CancerRes 1997 571537-46；Jaffee et al.J Clin Oncol 200119145-56；Salgia et al.JClin Oncol 2003 21624-30；Soiffer et al.J Clin Oncol 2003 213343-50；Nemunaitis et al.J Natl Cancer Inst.2004Feb 18 96(4)326-31；Borello andPardoll，Growth Factor Rev.13(2)185-93，2002；以及Thomas et al.，J.Exp.Med.200(3)297-306，2004)。
随着施予给病人经遗传修饰的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达癌细胞，结果显示免疫应答提高了，并且在一期二期临床试验中针对前列腺癌以及其它癌症的临床功效已经得到证实。尽管如此，应用细胞疫苗治疗前列腺癌的策略然而有待改进。

发明内容
本发明提供了治疗目标的前列腺癌的成分和方法，包含遗传修饰的细胞因子表达细胞。其中一个方面，发明包括一种在目标中治疗前列腺癌的方法，该方法通过施予目标经遗传修饰的细胞因子表达细胞以治疗前列腺癌。
这种方法通过遗传修饰(转导)第一组肿瘤细胞以产生一种细胞因子，例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，并且将第一组肿瘤细胞或连同第二组肿瘤细胞施予目标。随着施予遗传修饰的细胞因子表达细胞，针对一个大约278KD的抗原的免疫应答通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳被检测到，其中在施予细胞因子表达细胞之前，免疫应答没有被检测到。大约278KD的抗原被发现是β-细丝蛋白。
肿瘤细胞可以是来自同一个人(自体)或不同的人(异体)，或旁观者细胞，其特点是给药之前都使之失去增殖能力。其特点是，肿瘤细胞与被治疗的肿瘤或癌症是同种细胞，例如，遗传修饰的细胞因子表达细胞是前列腺或前列腺癌细胞(如PC-3细胞或LNCaP细胞)，并且目标患有前列腺癌。免疫应答可以是体液或细胞免疫应答。
如所期待的，随着施予一位前列腺癌病人细胞因子表达细胞，对病人的一个更好的治疗效果显现出来。


结合相应的附图阅读下面的记述，将能更加充分地理解本发明中前述的和其它的内容，及其不同特征，以及发明自身。
图1A-D示出了在本发明的方法和成分中使用的MGF载体示意图。
图1E示出了在本发明的方法和疫苗中使用的含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子编码的腺病毒载体(AV-MG-CSF)的示意图。
图1F示出了在本发明的方法和疫苗中使用的重组腺病毒伴随病毒(AAV)载体质粒(SSV9/MD2-hGM)的示意图。
图1G示出了在本发明的方法和疫苗中使用的含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达框并且侧翼有人类免疫缺陷病毒长末端重复序列的重组慢病毒载体的示意图。
图1H示出了在本发明的方法和疫苗中使用的含取代ICP22 HSV基因的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达框的I型单纯疱疹病毒表达载体的示意图。
图1I示出了在本发明的方法和疫苗中使用的含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达框，SV-40复制起始点以及病毒晚期基因的SV-40表达质粒(pSV MD GM-CSFII)的示意图。
图1J示出了在本发明的方法和疫苗中使用的含疫苗病毒启动子，终止序列，含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的cDNA序列的疫苗病毒表达框的示意图。
图2示出了在804号病人在异体前列腺(GVAX)临床试验中完全前列腺特异性抗原应答。第0天给药为疫苗治疗的起始剂量。
图3示出了免疫印迹分析的结果，显示在PC-3细胞而非LNCaP细胞中，804号病人免疫接种后的血清在大约278KD处识别抗原。
图4示出了使用免疫接种之前(第0周)和之后(第24周)804号病人的血清做的免疫印迹分析，结果显示804号病人免疫接种后的血清识别一个大约278KD的抗原，这在原代的正常前列腺上皮细胞系，前列腺基质以及前列腺平滑肌的细胞系(PrEC，PrSC，以及PrSmC)同样可以分别检测到，只是相比PC-3细胞处在一个较低的水平上。
图5示出了使用免疫接种之前(第0周)和之后(第24周)804号病人的血清做的免疫印迹分析，结果显示804号病人免疫接种后的血清识别一个大约278KD的抗原，这个抗原在非小肺腺癌细胞(NSCLC)H157中过表达，但在H1395NSCLC腺癌细胞系中没有表达。
图6示出了使用购自chemicon international(Temecula，CA)的兔抗人细丝蛋白的单克隆抗体做的免疫印迹分析，结果显示在PC-3细胞中有一个大约278KD的蛋白表达，但在LNCaP细胞中没有。
具体实施例方式除非有特别注明，本发明的实施利用的传统的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养以及转基因的技术，都属于技术人员掌握的技术范畴。详见，例如，Maniatis etal.，1982，Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York)；Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，2nd，ED.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook and Russel，2001，Molecular Cloning，3nd，ED.(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Ausubel et al.，1992，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，includingperiodic updates)；Glover，1985，DNA Cloning(IRL Press，Oxford)；Anand，1992，Techniques for the Analysis of Complex Genomes，Academic Press，NewYork；Guthrie and fink，1991，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Academic Press，New York；Harlow and Lane，1988，Antibodies，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Jakoby and Pastan，1979；Nucleic Acid Hybrization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription and translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture of AnimalCells(R.I.Freshney，Alan r.Liss，Inc.，1987)；ImmobilizedCells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(AcademicPress，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Millerand M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；ImmunochemicalMethods In And Molecular Biology(Mayer and walker，eds.，Academic Press，Landon，1987)；Handbook of Experimental Immunology，volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Riott，Essential Immunology，6thEdition，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1988；Hogan et al.，Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1986)。
定义除非有特别注明，在此所有用到的术语对所属领域中的技术人员具有相同的涵义。
出版物及其它材料包括全部专利、专利申请、公开出版物(包括公开的专利申请)、以及本说明书的数据库登录号，都用来在此阐释本发明的背景，特别是阐释一些情形以便为实施发明提供额外的细节。
在对本发明的记述中，下面的术语被定义成如下的涵义。
术语“核酸”，指以单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合体(多核苷酸)。除非特别限定，该术语包括的核酸含有与提及的核酸有类似结合特性的已知的类似的非人工核酸，并且其新陈代谢方式类似于自然地生成的核苷酸。除非有特别注明，一个特定的核酸分子/多核苷酸其中还暗含保守修饰的变异(如简并密码子替换)和互补序列以及明确注明的序列。特别的，简并密码子替换可以通过产生一个或多个(或全部)第三个位置的密码子用混和碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来完成(Batzer et al.，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka et al.，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；Rossolini et al.，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。核苷酸用他们的碱基的标准缩写注明，如下腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)，以及鸟嘌呤(G)。
术语“编码序列”和“编码区”指可以转录成RNA如mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，正义RNA或反义RNA的一段核酸序列。在一个实施例中，RNA在细胞内被翻译，产生一个蛋白质。
术语“ORF”指开放阅读框。
术语“基因”指基因组内的特定区域，除了前面提到的编码序列，还包括其它控制表达即编码区域的转录和翻译的核酸序列，主要起调控作用。一个基因还可能包含其它5′及3′端非翻译序列和终止序列。根据基因的来源，也许有更进一步的元件如内含子。
术语“异源的”和“外源的”在此涉及核酸分子例如启动子，基因编码序列，指相对一个特定的载体或宿主细胞，来自外部来源的序列，或者如果来自同一来源，则最初的形式被修饰。因此，病毒或细胞内的一个异源基因包括特定病毒或细胞内的内源基因，但是经过了修饰，如密码子最佳化。术语“异源的”和“外源的”还涉及自然发生的核酸序列的人工产生的多拷贝。因此，这两个术语指病毒或细胞的外源或异源的核酸片段，或尽管与病毒或细胞同源，却以不同于原来的形式处于病毒或细胞的基因组内。
术语“同源的”在此指核酸分子与一个同宿主病毒或细胞的自然相关的核酸序列。
术语“互补”和“互补的”指两条反向的核酸序列，能够在反向序列中互补碱基之间形成氢键而配对。
术语“天然的”指存在于野生型病毒或细胞基因组内的基因或蛋白。
术语“自然发生的”或“野生型”指与人工制造相区别的能在自然界中发现的物体。例如，生物体(包括病毒)中的一个蛋白或核酸序列，可以从自然界中的某来源中分离得到，并且没有被人类在实验室中有意修饰过，这就叫自然发生的。
术语“重组的”涉及的核酸分子，指用DNA重组技术将一组核酸分子拼接起来，从而产生子代核酸分子。这里关于病毒、细胞和生物体，术语“重组体的”、“转导的”、“转基因的”指一个异源基因被介导进入宿主病毒、细胞或生物体。核酸分子能够稳定整合到宿主的基因组内，或以染色体外分子的形式存在。这样的染色体外分子可以自动复制。这里理解的重组病毒，细胞和生物体不仅包括转导过程的终产物，还包括重组的子代。一个“非转导的”、“非转基因的”或“非重组的”宿主指不含异源核酸分子的野生型病毒，细胞，或生物体。
“调控元件”是涉及控制基因序列的表达序列。调控元件包括启动子，增强子和终止信号。它们通常包括核酸的准确翻译所必需的序列。
术语“启动子”指通常位于编码区上游的一段非翻译的DNA序列，它含有RNA聚合酶II的结合位点，启动DNA的转录。启动子区还可以包含其它元件，它们扮演着基因表达的调节器的角色。术语“最小启动子”指一个启动子元件，特别是一个TATA元件，当它缺少上游的激活元件时，使启动子的活性失去或大大降低。
术语“增强子”在本发明中可以是任何的遗传元件，例如当一段核酸序列有效地连接到编码序列上时，相比只有启动子，提高了有效地连接到启动子上的编码序列的转录。
术语“表达”指细胞中内源基因，转基因或编码区的转录和/或翻译。在反义结构的情形，表达可以仅仅指反义DNA的转录。
术语“上调”在此意思是与其它细胞相比，在目标细胞中，能够检测到一个特定基因的更大的RNA的量。例如与一个非肿瘤细胞相比，如果一个肿瘤细胞产生更多的端粒酶RNA，就是肿瘤细胞上调了端粒酶的表达。当特定RNA在一个目标细胞(如肿瘤细胞)中的表达量比在其它细胞(非肿瘤细胞)中高出至少3倍时，表达被认为是上调了。在另一个实施例中，特定RNA的量至少高出了5倍。在另一个实施例中，通过所属领域中的技术人员的常规技术(如Northern印迹法)检测到特定RNA的量至少高出了10倍。
术语“载体”，“多核苷酸载体”，“多核苷酸载体构建”，“核酸载体构建”以及“载体构建”在此被交替使用，如所属领域中的技术人员所理解的那样，指用于转基因的任一核酸构建。本发明中使用的载体可以随意编码一个可用来筛选的标记。
在此术语“病毒载体”沿用它在技术上被公认的涵义。它指一个核酸载体构建，包含有至少一个病毒复制起点，并且可以被包装成一个病毒载体颗粒。病毒载体颗粒可用来在体外或体内将DNA，RNA或其它核酸导入细胞内。病毒载体包括，但并不限于，逆转录病毒载体，痘苗病毒载体，慢病毒载体，疱疹病毒载体(例如HSV)，杆状病毒载体，巨细胞病毒(CMV)载体，乳头瘤病毒载体，猿猴空泡病毒(SV40)载体，辛德毕斯病毒病毒载体，闪姆利基森林病毒载体，噬菌体载体，腺病毒载体，腺相关病毒(AAV)载体。适宜的载体在美国专利Nos.6,057,155，5,543,328和5,756,086中有记述，在这里的引用中有清楚的记录。
交替使用的术语“病毒”，“病毒颗粒”，“载体颗粒”，“病毒载体颗粒”以及“病毒体”广义上理解为具有感染性的病毒颗粒，它们是在例如一个目标病毒载体被导入一个适宜的细胞或细胞系，以产生具感染性的颗粒时病毒颗粒形成的。本发明中的病毒颗粒可用来在体外或体内将DNA导入细胞。
当一段核酸被置于与另一段核酸序列的功能关系中时，称之为“有效连接”。例如如果两条序列是有效连接，或启动子或DNA调控序列被置于影响编码的表达水平或影响DNA序列的结构的位置，则一个启动子或DNA调控序列被称为“有效连接”到一段编码一个RNA或蛋白质的DNA序列。有效连接通常是邻近的，但这并不是必需的。
“可筛选标记”是一个在细胞中的表达给予细胞选择优势的蛋白。与没有转导的细胞相比，用可筛选标记基因转导的细胞的选择优势可能是由于它们在负筛选试剂如抗生素中生长的能力。与没有转导的细胞相比，转导的细胞的选择优势可能是由于增强的或新的利用添加的化合物作为营养物，生长元素，或能量来源的能力。可筛选标记蛋白包括那些可以使被转导的细胞被检测到并且可能使之与没有转导的细胞分离开的蛋白。例如，绿色荧光蛋白(GFP)可用作一个可筛选标记。在一个实施例中，细胞被导入一个编码有一个β-细丝蛋白或其免疫原性片段以及一个绿色荧光蛋白。被转导的表达绿色荧光蛋白的细胞通过流式细胞仪(FACS)得到分离。可筛选标记蛋白能够使大部分被转导的细胞与未转导的细胞分离开来。一个所属领域中的技术人员发现筛选和分离技术通常并不是百分之百的效果；本发明中，一组细胞中有一小部分未能筛选到是可以接受的。
在此术语“主要包含”或“主要包含的”涉及一个特定的核苷酸序列，该序列可能在5′和3′的一端或两端有额外的残基，其中这额外的残基实质上并不影响所列举的序列的基本和新的特征。
术语“转导”指用物理方法将外源核酸导入细胞。例如，转导包括将外源核酸用本发明中的病毒颗粒导入细胞。关于各种操作哺乳动物细胞的技术，详见Keown et al.，Methods ofEnzymology 185527-537(1990)。
在此提到的“包装细胞”指一个能够包装病毒基因组或修饰基因组以产生病毒颗粒的细胞。它能够提供一个丢失基因产物或其等价物。因此，包装的细胞能够为病毒基因组中删除的基因提供补足功能并且能够将病毒基因组包装成病毒颗粒。这样的颗粒的产生需要基因组被复制以及组装一个感染性病毒所必需的蛋白的产生。这些颗粒还需要病毒颗粒成熟所必需的某种蛋白。这种蛋白可以由载体或包装的细胞提供。
在此提到的“逆转录病毒转移载体”指一个含有一段编码一个转基因的核酸序列的表达载体，并且该表达载体进一步含有载体包装所必需的核酸序列。更可取的，该逆转录病毒转移载体还含有在细胞中表达基因的必需序列。
在此提到的“第二代”慢病毒载体系统指缺失功能附属基因的一个慢病毒包装系统，例如，它的附属基因vif，vpr，vpu以及nef被删除或失活。详见，例如，Zufferey et al.，1997，Nat.Biotechnol.15871-875。
在此提到的“第三代”慢病毒载体系统指含有第二代慢病毒载体系统特征的慢病毒包装系统，并且进一步缺失了tat基因，例如，它的tat被删除或失活。通常的，编码rev的基因由单独一个表达构建提供。
在此提到的“假型的”，指用一个外源的或功能被修饰的包膜蛋白替换天然的包膜蛋白。
在此提到的术语“暴露”指将一个转基因编码载体与目标细胞接触。这种“暴露”可以发生在体外，间接体内或体内。
在此提到的术语“稳定转导”，“稳定转染”和“转基因”指细胞中有一个整合到基因组上的非天然的(异源的)核酸序列。稳定转染由含有转染DNA的一组子代细胞的细胞系或克隆证实。在一下情况下，转导是不稳定的，亦即瞬时的。在瞬时转染的情况下，外源或异源的DNA被表达，然而被导入的序列并不整合到基因组上。
术语“细胞因子”或其语法上的同义词，在此指免疫系统细胞的各种激素，包括淋巴因子、单核因子及其它。如果没有限定，这个定义包括在局部发挥作用但并不在血液中循环的激素，并且当遵循本发明使用时，会导致个体免疫应答的改变。在此提到的“细胞因子”或“细胞因子们”指影响免疫系统细胞的各种生物分子。该定义包括，但并不限于，在局部或血液循环发挥作用的生物分子，并且当遵循本发明中的成分或方法使用时，可以用来控制或调节个体对癌症的免疫应答。实施本发明使用的典型细胞影响包括，但并不限于，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，白细胞介素(如IL-1到IL-29，特别是IL-2，IL-7，IL-12，IL-15以及IL-18)，肿瘤坏死因子(TFN)(如TFN-α，TFN-β)，.促红细胞生成素(EPO)，MIP3a，胞间粘附分子，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
“严格的杂交条件”和“严格的洗脱条件”在核酸杂交实验(如Southern印迹法和Northern印迹法)中取决于序列本身，并且因环境参数的不同而不同。较长的序列杂交温度也较高。核酸杂交的详细操作手册见Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part 1 chapter 2“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”Elsevier，New York。对于特定序列和确定的离子强度和pH值，高度严格的杂交和洗脱条件通常选择低于熔点5℃-20℃(倾向于5℃)。通常地，在严格条件下，探针会与其目标序列杂交，而不是其它无关的序列。
Tm是在确定的离子强度和pH值下，50％的目标序列与精确匹配的探针杂交的温度。对于一个特定的探针，选择的高度严格的条件等同于Tm。在Southern或Northern印迹中，对于滤膜上的一个超过100个互补残基的互补的核酸的杂交，典型的严格杂交条件是50％的甲酰胺和1mg的肝素，42℃杂交过夜。高度严格的洗脱条件的一个范例是0.1M NaCl在72℃下进行15分钟。高度严格的洗脱条件的一个范例是0.2xSSC，65℃洗脱15分钟(详见Sambrook，infra，for a description of SSC buffer)。通常，在一个高度严格的洗脱之前，有一个低严格度的洗脱以除去背景探针信号。对于一个例如超过100个核苷酸的双链，中度洗脱的范例是1xSSC，45℃进行15分钟。对于一个例如超过100个核苷酸的双链，低严格度的洗脱是4-6xSSC，40℃进行15分钟。对于短探针(例如大约10-50个核苷酸)，严格的洗脱条件通常涉及Na离子浓度低于1.0M的盐，通常Na离子(或其它盐)浓度大约是0.01至1.0M，pH值7.0值至8.3，并且温度是一般不低于大约30℃。一般而言，2倍(或更高)的信噪比而不是观察到特定杂交分析中的无关探针，说明检测到特定的杂交。
在上下文关于两段或更多核酸或蛋白序列中，术语“相似的”或“相似度”是指当与对应的最大量比较和比对，并且用在此记述的序列比较算法测量或用视觉检测时，两段或更多序列或子序列相同或有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同。
关于序列比对，通常是一段序列作为参考序列，被检测序列与它比对。当使用序列比对算法时，被检测序列和参考序列被输入计算机，必要的话子序列坐标会被指定，并且序列算法程序的参数会被指定。基于指定的程序参数，序列比对算法会计算出被检测序列相对于参考序列的序列相似度的百分比。
比较序列的最佳比对可以参考，例如，the local homology algorithm，Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)，the homology alignmentalgorithm，Needleman & Wunsch，J.Mol.Boil.48443(1970)，the search forsimilarity method，Pearson & Lipman，Proc.Natl.A cad.Sci.USA852444(1988)，computerized implementations of these algorithms(威斯康星遗传学软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，the BLAST algorithm，Altschul et al.，J.Mol.Biol. 215403-410(1990)，国家生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的软件是可以公开使用的，或通过视觉检测(参见Ausubel et al.，infra)。对本发明而言，比较序列的最佳比对最适用的是遵循the local homology algorithm，Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)。
“正常的细胞状态”或“正常的生理状态”指细胞处于正常的生理条件下，不分裂或以一种可控的方式分裂，即一个细胞处于正常的生理状态。“异常的细胞状态”定义为相同类型的细胞，在正常的生理条件下，处于分裂不可控的分裂状态。由此得出结论，处于“异常的细胞状态”的细胞表现出不受控制的细胞分裂。
在此提到的术语“癌症”，“癌细胞(cancer cells)”，“癌细胞(neoplasticcells)”，“肿瘤(neoplasia)”，“肿瘤(tumor)”，“肿瘤细胞”指表现为相对的自主性生长，因此它们表现出细胞增殖显著失去控制为特征的异常的生长表现型或异常的细胞状态。肿瘤细胞可以是增生的细胞，体外或体内表现出失去接触抑制的细胞，不能够在体内转移的细胞，或能够在体内转移的细胞。癌细胞可以是恶性的或良性的。由此得出结论，癌细胞被认为是处于异常的细胞状态。“肿瘤细胞”可以是源自源发性肿瘤或肿瘤转移。“肿瘤细胞”可以是新近从一个病人身上分离得到(原代肿瘤细胞)或长期体外培养得到。
在此提到的术语“原代肿瘤细胞”与所属领域中的涵义一致。原代肿瘤细胞是从一个哺乳动物的肿瘤分离出并且没有大量在体外培养的癌细胞。
在此交替提到的术语“来自肿瘤细胞的抗原”，“肿瘤抗原”和“肿瘤细胞抗原”指能够引起免疫应答的肿瘤细胞产生或表达的任何蛋白、多肽、糖类或其它成分。该定义包括，但并不限于，整个肿瘤细胞、肿瘤细胞碎片、肿瘤细胞的细胞质膜、肿瘤细胞表面的特异糖基或细胞内载体表达的抗原。该定义还包括需要经过特殊处理才能进入细胞的细胞表面的抗原。
在此提到的“遗传修饰的肿瘤细胞”指包含经过遗传修饰的表达一个转基因的一组细胞的成分，并且该成分被作为癌症疗法的一部分施予给病人。对于正在接受治疗的病人来说，遗传修饰的肿瘤细胞疫苗包括“自体的”或“异体的”，或与取自病人的肿瘤细胞混合的“旁观者细胞”。一个在此提到的遗传修饰的GM-CSF表达肿瘤细胞是GVAX。遗传修饰的自体或异体的癌细胞细胞因子表达如GM-CSF，随后被在此施予给病人以治疗癌症，详见美国专利No.5,637,483，No.5,904,920，No.6,277,368和No.6,350,445。用于治疗胰腺癌的一种遗传修饰的GM-CSF表达癌细胞或“细胞因子表达细胞疫苗”详见美国专利Nos.6,033,674和No.5,985,290，所述两个专利在这里作为参考。一个通用的表达免疫调控因子的旁观者细胞系在美国专利No.6,464,973中有记述，在这里作为参考。
在此提到的“增强的表达”是指与自然产生或来自亲代细胞的细胞相比，细胞特定蛋白的产生水平更高。细胞可以通过遗传修饰来提高细胞因子的表达，如GM-CSF，或随着施予细胞因子表达细胞疫苗，如GVAX，免疫应答得到增强的抗原。内源性抗原的表达可以通过所属领域内的任何方法来增强，如遗传修饰基因组序列的启动子区，或遗传改变细胞信号通路来提高抗原的产生。此外，细胞还可以导入一个编码抗原或其免疫原性片段的载体。
在此术语“系统的免疫应答”或其语法上的同义词，是指影响整个个体而非局部的免疫应答，因此对于同一刺激产生次级应答。
在此提到的术语“细胞增殖无能力”或“失活的”指细胞不能够进行多次有丝分裂，但仍保持表达诸如细胞因子或肿瘤抗原的蛋白的能力。这个可以通过所属领域中的技术人员熟知的很多方法实现。本发明的实施例包括，但不限于，至少95％，99％或100％充分地抑制细胞进一步增殖的治疗。在一个实施例中，在施予给哺乳动物之前，细胞用辐射处理的剂量是大约50-200rads/min，或大约120-140rads/min。通常的，当用辐射处理时，需要的水平是2,500rads，5,000rads，10,000rads，15,000rads或20,000rads。在几个实施例中，经过两天的辐射处理，以存活的细胞数为标准，产生β-细丝蛋白或其免疫原性片段的水平至少是未被辐射处理的细胞的大约10％，20％，50％或100％。在本发明的一个实施例中，细胞在施予给目标之前，通过辐射处理使其增殖被无能力。
术语“个体”，“目标”或其语法上的同义词均指任何哺乳动物个体。
在此提到的术语“逆转已确定的肿瘤”或其语法上的同义词指抑制，使退化，或部分或完全清除一个已经存在的肿瘤。该定义包括任何一个预先存在的肿瘤的体积，潜力或生长速率的减小或降低。
在此提到的术语“治疗”，“治疗用”或“医用”指任何及全部能够减轻或治愈一种疾病或病症的已公开的成分，或另一方面能够预防，阻止，延迟或逆转疾病或其它令人讨厌的征状的任何方式和方法。
本发明中术语“施予给的”指任何将细胞(如癌症疫苗)引入一个哺乳动物的方法。这包括，但并不限于，皮内的、肠胃外的、肌肉的、皮下的、腹膜内的、鼻内的、静脉内的(包括通过一根内置的导管)、瘤内的(通过一根导入分淋巴管)或其它根据病人病情适宜的途径。本发明中的成分可以施予到目标的任何部位。例如，它们可以被递送到距原发肿瘤“远侧的”或“远的”部位。
术语“增强的免疫应答”在此指可以检测到增强的一个特定的免疫应答激活(例如B细胞或T细胞的应答增多)。一个增强的免疫应答的范例是结合抗原的抗体的数量增多，并且这在施予本发明中的细胞因子表达细胞疫苗之前是检测不到或检测到处在一个较低的水平上。另一个范例是增强的细胞免疫应答。细胞免疫应答涉及T细胞，能够在体外(例如用铬释放分析测量)或体内被观察到。增强的免疫应答通常伴有一个特定群体的免疫细胞的增多。
术语“延迟肿瘤的生长”指减缓肿瘤的生长速率，抑制肿瘤尺寸或肿瘤细胞数目的增长，或减少肿瘤细胞数目或肿瘤数目。
术语“抑制肿瘤生长”指肿瘤重量，肿瘤体积，肿瘤细胞数量或肿瘤生长速率的任何可以测量到的减少。肿瘤重量的可以测量到的减少可以通过所属领域中的技术人员熟知的很多方法检测到。这包括可以接近的肿瘤的直接测量，肿瘤细胞计数(例如血液中存在的)，肿瘤抗原的测量(例如前列腺特异性抗原(PSA)，甲胎蛋白(AFP))以及各种成像技术(例如核磁共振成像，断层扫描和X-射线)。肿瘤生长速率的降低通常和患癌的哺乳动物的较长生存时间相关。
在此术语“有效治疗的用量”或其语法上的同义词，指抗原的数量，例如，本发明中细胞因子表达细胞疫苗足够来调节(刺激或抑制)一个个体的免疫应答。这个用量因个体，肿瘤类型，配制品的不同而不同。“有效治疗的用量”由所属领域中的技术人员例行使用的程序决定，如此会产生“改善的治疗效果”。
在此提到的关于癌症的术语“改善的治疗效果”和“提高的治疗功效”，指癌细胞或实体肿瘤的生长的延缓或缩减，或者癌细胞总数或总肿瘤负荷的减少。“改善的治疗效果”或“提高的治疗功效”因此指在遵循任何临床上可以的准则下，病人条件的改进，包括预期寿命的增加或生命质量的提高(如在此进一步描述的)。
在此术语“失活的细胞”和“增殖无能力的细胞”或其语法上的同义词指细胞被使它们增殖无能力的处理而失活。这种处理导致细胞不能够进行多次有丝分裂，但仍保持表达诸如细胞因子和/或肿瘤抗原的蛋白的能力。这个可以通过所属领域中的技术人员熟知的很多方法实现。辐射处理的细胞就是这类失活细胞的一个例子。这种辐射处理的细胞被暴露在辐射下以使它们发生增殖无能力。
本发明的细胞疫苗的成分本发明涉及一种治疗目标的前列腺癌的方法，将施予目标遗传修饰的细胞因子表达细胞作为治疗方案的一部分。该方法通过遗传修饰(转导)第一组肿瘤细胞以产生一种细胞因子，例如GM-CSF，并且将第一组肿瘤细胞或连同第二组肿瘤细胞施予目标。随着施予遗传修饰的细胞因子表达细胞，针对一个大约278KD的抗原的免疫应答通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳被检测到，其中在施予细胞因子表达细胞之前，免疫应答没有被检测到。肿瘤细胞可以是来自同一个人(自体)或不同的人(异体)，或旁观者细胞(下文中有进一步的记述)。通常，肿瘤细胞源自一个肿瘤细胞系，与正在治疗的肿瘤或癌症是同种类型，例如，被修饰的细胞是前列腺或前列腺癌细胞，并且病人患有前列腺癌。大约278KD的抗原被发现是β-细丝蛋白。
在本发明的一个方面中，免疫应答是体液免疫应答。通常遗传修饰的肿瘤细胞在作为药物施予之前处理成增殖无能力。在一个实施例中，哺乳动物是人，其患有的前列腺癌的肿瘤细胞与遗传修饰的细胞因子表达的肿瘤细胞是同一类型。在一个较佳的实施例中，随着施予给目标遗传修饰的细胞因子表达的肿瘤细胞，一个改善的治疗效果是显而易见的。对于所属领域中的技术人员，关于前列腺癌患者的改善的治疗效果各种参数中的任何一个，都可用来评估遗传修饰的细胞因子表达的肿瘤细胞的治疗功效，例如，血清中前列腺特异性抗原(PSA)的水平的降低。
还是另一个方面，本发明通过施予给目标有效治疗的用量的增殖无能力的遗传修饰的细胞因子表达细胞，从而刺激前列腺癌患者系统的免疫应答的方法。
本发明的一个较佳实施，在间接体内疗法中，利用一个病毒或非病毒载体将一段人类表达GM-CSF转基因(编码序列)转移至人类的肿瘤细胞。转导之后，细胞用辐射处理来使其增殖无能力。然后这些增殖无能力的GM-CSF表达肿瘤细胞被在此施予给病人(例如通过皮内的或皮下的途径)从而起癌症疫苗的作用。人类的肿瘤细胞可以是原代肿瘤细胞或源自一个肿瘤细胞系。
一般而言，在实施本发明中用到的遗传修饰的肿瘤细胞包括一种或多种自体肿瘤细胞，异体肿瘤细胞和肿瘤细胞系(即旁观者细胞)。肿瘤细胞的转导可以是体外，间接体内或体内。自体和异体的癌细胞被遗传修饰以细胞因子表达如GM-CSF，然后被再次施予给病人以治疗癌症，详见美国治疗No.5,637,483，No.5,904,920和No.6,350,445。用于治疗胰腺癌的一种遗传修饰的表达GM-CSF或“细胞因子表达细胞疫苗”(GVAX)详见美国专利No.6,033,674和No.5,985,290。一个通用的表达免疫调控因子的旁观者细胞系在美国专利No.6,464,973中有记述。
其中的细胞疫苗包含一个或多个从由DU-145，PC-3和LNCaP组成的细胞群中筛选出的前列腺肿瘤细胞系的一个异体的GVAX在WO/0026676中有记述。LNCaP是一个产生前列腺特异性抗原的前列腺肿瘤细胞系，而PC-3和DU-145是不产生前列腺特异性抗原的前列腺肿瘤细胞系。
临床使用的GM-CSF表达细胞疫苗(GVAX)已经被用于治疗前列腺癌、恶性黑素瘤、肺癌、胰腺癌、肾癌和多发性骨髓瘤。许多0GVAX细胞疫苗的临床试验被记述下来，最引人注目的是关于恶性黑素瘤、前列腺癌、肾癌和胰腺癌(Simons JW et al.Cancer Res.1999；595160-5168；Simons JW et al.Cancer Res.1997；571537-1546；Soiffer R et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998；9513141-13146；Jaffee，et al.J Clin Oncol 2001；19145-156；Salgia et al.J Clin Oncol 200321624-30；Soiffer R et al.J ClinOncol 2003213343-50；Nemunaitis et al.J Natl Cancer Inst.2004 Feb 1896(4)326-31)。
举个例子，在一个步骤中，遗传修饰的GM-CSF表达肿瘤细胞被作为异源的或旁观者细胞系与一种或多种另外的癌症治疗药剂一起包括在治疗方案中。在另一步骤中，一种或多种另外的转基因被异源的或旁观者细胞系表达，同时细胞因子(即GM-CSF)被自体的或异源的细胞表达。首选的GM-CSF编码序列是Huebner K.et al.，Science 230(4731)1282-5，1985中记述的基因组序列。尽管如此，在一些情况下，cDNA形式的GM-CSF在实施本发明时是有用的(Cantrell et al.，Proc Natl.Acad.Sci.，82，6250-6254，1985)。
一般而言，遗传修饰的肿瘤细胞在使用之前低温保存。比较可取的是，在施予给病人之前，遗传修饰的肿瘤细胞辐射处理的剂量是大约50-200rads/min，更可取的是大约120-140rads/min。比较适宜的是，细胞辐射处理的总剂量足够100％充分地抑制细胞的进一步增殖。因此，恰当的细胞辐射处理的总剂量是大约10,000至20,000rads，最理想的是大约15,000rads。
通常在一个疗程里，产生细胞因子(例如GM-CSF)的细胞被递送给目标的给药次数大于一次。根据具体的治疗过程，在一个时间点可以进行多次注射，并且在各个时间间隔可以重复。例如，一次初次的或“首次的”治疗可以紧跟着一次或多次“强化”治疗。此类“首次的”和“强化的”治疗通常都沿用同一途径和/或大体同一部位给药。当进行多次给药时，首次免疫的剂量可以比高于后续免疫的剂量。例如，5×106的首次剂量可以紧跟着几次106至3×106的产生GM-CSF的细胞。
单次产生细胞因子的细胞的注射量通常在106至108之间，例如，1×106，2×106，3×106，4×106，5×106，6×106，7×106，8×106，9×106，107，2×107，5×107，或多至108。在一个实施例中，每单位剂量的产生细胞因子的细胞数目在106至108之间。对于一个特定的产生细胞因子的细胞疫苗，产生细胞因子的细胞的数目可以根据细胞因子的产生水平来调整。
本发明的实施例包括，但并不限于，每剂量中的产生细胞因子的细胞，能够每百万个细胞在每24小时产生至少500ng GM-CSF。如后文中的示例所描述，并且根据在此提供的公开信息，最佳细胞剂量的确定是遵循常规来决定，这在普通执业者的能力之内。
在使用本发明中的成分和方法治疗前列腺病人时，主治内科医师可以施予较低剂量的细胞因子表达的肿瘤细胞并且观察病人的反应。较大剂量的细胞因子表达的肿瘤细胞可以施予直至有明显改善的治疗效果。
本发明中的产生细胞因子的细胞被加工处理以除去细胞制备时的大多数的额外成分。特别是去除胎牛血清，牛血清成分，或其它培养基中的生物添加物质。在一个实施例中，细胞被清洗，例如通过重复的轻微离心，进入药理学上不产生排斥的赋形剂。不产生排斥的赋形剂包括各种细胞培养基，等渗盐水，有或没有生理上不排斥的缓冲液如磷酸盐或N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠以及营养物如葡萄糖，生理适应性的离子，或氨基酸，其它特定的没有免疫原性的成分。运载介质，例如白蛋白，血浆组分和非活性的增稠剂，也可以使用。
使用自体细胞的使用自体的遗传修饰的GM-CSF表达细胞的优势是因为每一个病人的肿瘤表达独一无二的一组肿瘤抗原，可以使其与另一个病人的组织相似，主要组织相容性复合体匹配的肿瘤细胞区别开来。参见如Kawakamiet al.，J.Immunol.，148，638-643(1992)；Darrow et al.，J.Immunol.，142，3329-3335(1989)；和Hom et al.，J.Immunother.，10，153-164(1991).相反，主要组织相容性复合体匹配的肿瘤细胞的优势是病人不需要动手术来获取他们肿瘤的取样来生产遗传修饰的肿瘤细胞。
在一个较佳方面，本发明包含的治疗前列腺癌的方法的实施步骤是(a)从一个哺乳动物对象获取前列腺癌的肿瘤细胞；(b)通过遗传修饰使这些肿瘤细胞比没有修饰的肿瘤细胞能够产生更高水平的GM-CSF；(c)使这些被修饰的肿瘤细胞增殖无能力；(d)将遗传修饰的肿瘤细胞再施予给肿瘤细胞被获取的哺乳动物对象，或与获得的肿瘤细胞主要组织相容性复合体相同的哺乳动物。被施予的肿瘤细胞与宿主是同源的或主要组织相容性复合体匹配的。更可取地，成分是通过皮内，皮下或瘤内施予给哺乳动物对象的。
在一些情况下，单个自体肿瘤细胞可以只表达GM-CSF，或再附加一个或多个另外的转基因。在另外的情况下，GM-CSF和一个或多个另外的转基因可以被不同的自体肿瘤细胞表达。在本发明的一个方面，自体肿瘤细胞通过导入一个包含编码GM-CSF的核酸序列的载体被修饰，其中GM-CSF的核酸序列被有效连接到一个其表达所必需的启动子和表达/控制序列。在另一个方面，同一个或另外一个自体肿瘤细胞通过导入一个包含编码至少一个另外的转基因的核酸序列的载体被修饰，其中该转基因核酸序列被有效连接到一个其表达所必需的启动子和表达/控制序列。编码一个或多个转基因的核酸序列通过相同或不同的载体被导入相同或不同的自体肿瘤细胞。编码转基因的核酸序列可以也可以不进一步包含一个有效连接到一个启动子上的筛选标记。值得要的是，自体肿瘤细胞高水平地表达GM-CSF。
使用异体细胞的研究人员正努力寻找自体的和主要组织相容性复合体匹配的细胞的替代物作为肿瘤疫苗，见Jaffee et al.，Seminars in Oncology，22，81-91(1995)上的评论。早先的肿瘤疫苗策略建立在这样的理念上接种的细胞作用如同抗原呈递细胞(APCs)，将肿瘤抗原呈递到它们的主要组织相容性复合体(MHC)I类分子和II类分子，并且直接激活免疫系统的T细胞分支。Huang et al.(Science，264，961-965，1994)的结果说明，宿主的专业的APCs而非接种的细胞通过分泌细胞因子例如GM-CSF因而将源自骨髓的APCs征募到肿瘤区域，使免疫系统的T细胞分支做好准备。源自骨髓的APCs摄取整个肿瘤细胞的蛋白用于加工，然后将将抗原蛋白呈递给它们的主要组织相容性复合体I类分子和II类分子，从而使免疫系统的CD4+和CD8+T细胞分支做好准备，产生了系统的肿瘤特异性的抗肿瘤免疫应答。假如没有理论上的限制，这些结果显示，为引发抗癌的免疫应答，使用自体的或MHC匹配的细胞可能并非是必不可少的或最理想的，并且转移异体的MHC基因(来自同一物种而又遗传上不同的个体)能够提高肿瘤的免疫原性。特别是在某些情况下，注射肿瘤表达的异体的MHCI类分子会导致增强的针对随后的未修饰的亲代肿瘤激发的系统免疫应答。参见如Jaffee et al.，supra和Huang et al.，supra。
在此记述的“肿瘤细胞系”包含最初源自肿瘤的细胞。这类细胞通常是被改造过的(即培养时表现出无限期的生长)。在一个较佳方面，本发明提供的治疗前列腺癌的方法的实施步骤是(a)获取一个肿瘤细胞系；(b)通过遗传修饰使这些肿瘤细胞比没有修饰的肿瘤细胞能够产生更高水平的细胞因子如GM-CSF；(c)使这些被修饰的肿瘤细胞增殖无能力；(d)将肿瘤细胞系施予给一个至少患一种与肿瘤细胞系的来源同种类型的癌症的哺乳动物对象(目标)。被施予的肿瘤细胞系是异体的并且与目标的MHC不匹配。这种异体细胞系的优点是可以提前制备，鉴定，收集在装有已知数目的表达转基因(例如GM-CSF)的细胞的小瓶子中并储存(冷冻)，因而这些经过良好处理的细胞可以被施予给病人。生产遗传修饰的异体细胞的方法参见WO 00/72686中的例子。
在一个制备遗传修饰的GM-CSF表达异体细胞的步骤中，一段单独编码GM-CSF的核酸序列(转基因)或联合编码一个或多个另外的转基因的核酸序列被导入一个异体的肿瘤细胞系(即源自一个不是正在接受治疗的个体)。在另一个步骤中，一段单独编码GM-CSF的核酸序列(转基因)或联合编码一个或多个另外的转基因的核酸序列被导入不同的异体肿瘤细胞系。另外在另一个步骤中，两个或多个不同的遗传修饰的GM-CSF表达异体细胞系(如LNCaP和PC-3)被联合施予，典型比例是1∶1。一般而言，细胞或细胞群源自与正被肿瘤的肿瘤或癌症(如前列腺癌)是同种类型的细胞系。编码转基因的核酸序列可以通过相同或不同的自体被导入相同或不同的异体肿瘤细胞。编码转基因的核酸序列可以也可以不进一步包含一个有效连接到一个启动子上的筛选标记序列。值得要的是，异体肿瘤细胞高水平地表达GM-CSF。
在本发明的另一个方面，一个或多个遗传修饰的GM-CSF表达异体细胞与抗原接触，这样在GM-CSF存在的情况下，病人对抗原的免疫应答会增强，例如，遗传修饰的GM-CSF表达异体或旁观者细胞。这种接触可以发生在间接体内或体内。在一个较佳的实施例中，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到抗原大约是278KD。β-细丝蛋白由施予给目标的细胞或病人本身的细胞提供。在这种情况下，通常通过辐射处理使成分成为增殖无能力，其中异体细胞被铺在一个组织培养板上，在室温下用铯放射源处理，如在此进一步记述的。本发明的异体细胞成分可以包含异体细胞加上其它细胞，即不同类型的可以也可以不被遗传修饰的异体细胞，自体细胞，或旁观者细胞。如若被遗传修饰，不同类型的异体细胞，自体细胞，或旁观者细胞可以表达GM-CSF或别的转基因。给药时异体细胞和其它细胞的比例随其联合而变化。
任何合适的途径都可以用来将异体细胞系导入病人，更可取的是，成分通过皮内，皮下或瘤内的途径施予。
实施本发明时使用异体细胞的治疗优势是将遗传修饰的GM-CSF表达细胞系联合自体的癌抗原施予给病人，旁分泌产生GM-CSF导致对肿瘤的有效的免疫应答。这避免了为每个病人培养和转导自体的肿瘤细胞。
使用旁观者细胞的在一个进一步的方面，本发明提供了遗传修饰的至少表达一种转基因的通用的调节免疫的旁观者细胞。同一个通用的旁观者细胞系可以表达多种转基因或一种转基因可以被不同的通用的旁观者细胞系表达。通用的旁观者细胞系包含的细胞或者自然地缺失主要组织相容性复合体I(MHC-I)抗原和主要组织相容性复合体II(MHC-II)抗原，或被修饰因而缺失MHC-I和MHC-II抗原。在发明的一个方面，通用的旁观者细胞系通过导入一个包含编码转基因(如细胞因子GM-CSF)的核酸序列的载体被修饰，其中GM-CSF的核酸序列被有效连接到一个其表达所必需的启动子和表达控制序列。在另一个方面，同一个或另一个旁观者细胞系通过导入一个包含编码至少一个另外的转基因的核酸序列的载体被修饰，其中至少一个另外的转基因的核酸序列被有效连接到一个其表达所必需的启动子和表达控制序列。编码转基因的核酸序列可以通过相同或不同的自体被导入相同或不同的旁观者细胞系。编码转基因的核酸序列可以也可以不进一步包含一个有效连接到一个启动子上的筛选标记序列。任何刺激抗肿瘤免疫应答的转基因的联合在本发明的实施中都是有效用的。通用的旁观者细胞系更适宜在明确规定的即无血清的培养基中生长和悬浮。
一个首选的通用的旁观者细胞系范例是K562(ATCC CCL-243；Lozzioet al.，Blood 45(3)321-334(1975)；Klein et al.，Int.J.Cancer 18421-431(1976))。生产人类旁观者细胞系的详细记述参见例如美国专利No.6,464,973。
值得要的是，通用的旁观者细胞系高水平地表达转基因例如细胞因子GM-CSF。
在本发明的实施中，一个或多个通用的旁观者细胞系与自体的癌抗原(例如，由同时包含通用的旁观者细胞系成分的自体肿瘤细胞提供)孵育，然后该通用的旁观者细胞系被施予给病人。任何合适的途径都可以用来将通用的旁观者细胞系导入病人，更可取的是，成分通过皮内，皮下或瘤内的途径施予。
通常的，自体的癌抗原由被治疗的癌症的细胞提供，即自体的癌细胞。在这种情况下，成分通过辐射处理而增殖无能力，其中的旁观者细胞和癌细胞被铺在一个组织培养板上，在室温下用铯放射源辐射处理，这在前文中有详细记述。
在特定的给药中，旁观者细胞与自体癌细胞的比例随联合而变化。对于产生GM-CSF的旁观者细胞，在特定的给药中，旁观者细胞与自体癌细胞的比例应为有效治疗水平的GM-CSF得以产生。除了GM-CSF的下限之外，旁观者细胞与自体癌细胞的比例部应高于1∶1。恰当的旁观者细胞与肿瘤细胞或肿瘤抗原的比例可以通过所属领域中或普遍认可的方法来确定。
实施本发明时使用旁观者细胞的治疗优势是通过施予给癌症病人细胞因子表达的旁观者细胞系和至少一个另外的癌症治疗药剂(由相同或不同的细胞表达)，以及自体的癌抗原，旁分泌产生的免疫调节细胞因子，产生对肿瘤的有效的免疫应答。这避免了为每个病人培养和转导自体的肿瘤细胞。
通常最低3500rads的辐射剂量就足以使细胞失活并使其增殖无能力，尽管高至30,000rads的剂量也是可以接受的。在一个实施例中，在施予给哺乳动物之前，细胞用辐射处理的剂量是大约50-200rads/min，或大约120-140rads/min。通常的，当用辐射处理时，需要的水平是2,500rads，5,000rads，10,000rads，15,000rads或20,000rads。在一个实施例中，15,000rads的剂量被用来使细胞失活并使其增殖无能力。不言而喻，辐射只是使细胞增殖无能力的一个方法，并且本发明还包含其它的导致细胞不能多次分裂但仍保持着表达转基因(如细胞因子)的能力的失活方法(例如，用丝裂霉素C，放线菌酮和概念上的同功试剂处理，或导入自杀基因)。
细胞因子“细胞因子”或语法上的同义词，包括但不限于，局部作用但并不在血液中循环的激素，并且按照本发明使用时，会导致个体免疫应答的改变。同时包括细胞因子的定义中的还有能够导致个体免疫应答的改变黏附分子，辅助分子。因此，细胞因子的例子包括但不限于，IL-1(一个或多个)，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，GM-CSF，G-CSF，LIF，LT，TGF-P，y-IFN，a-IFN，P-IFN，TNF-a，BCGF，CD2，或ICAM。关于所述的细胞因子及其它适用的免疫调节试剂可以参见“Cytokine and Cytokine Receptors”A.S.Hamblin，D.Male(ed.)，OxfordUniversity Press，New York，NY(1993)，或“Guidebook to Cytokine and TheirReceptors”N.A.Nicola(ed.)，Oxford University Press，New York，NY(1995)。当仔细考虑治疗应用在人体的哪个部位时，细胞因子最好与人类的这个蛋白十分相似，或源自人类序列(即人源的)。在一个较佳实施例中，转基因是一个细胞因子，例如GM-CSF。
另外，与特定的人类细胞因子结构高度同源的和/或氨基酸序列一致的其它哺乳动物的细胞因子，若对人类免疫系统展示出相似的活性，则在本发明中是有用的。同样的，与某一特定的细胞因子高度同功的，但蛋白序列保守地变化的蛋白，则在本发明中也是有用的。因此，蛋白序列中的保守的替换可能不会扰乱蛋白分子的功能，并且因此在本发明中，蛋白可以被处理成功能与细胞因子一样，但氨基酸序列却与目前已知的序列稍有不同。这类保守的替换一般包括如下的替换甘氨酸丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰氨、谷酰氨；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是成纤维细胞、内皮细胞、T细胞和巨噬细胞产生的细胞因子。该细胞因子已被证实能够诱导粒细胞和巨噬细胞系的造血细胞的生长。此外，它还激活免疫系统中的主要抗原呈递细胞(APC)的树突状细胞的抗原加工和呈递功能。动物模型试验的结果令人信服地证实，与没有转导的亲代细胞相比，产生GM-CSF的细胞(即GVAX)能够引起免疫应答。
GM-CSF增强了能够激起强烈的抗肿瘤应答的树突状细胞亚群的抗原呈递能力(Gasson et al.Blood 1991Mar 15；77(6)1131-45；Mach et al.Cancer Res.2000Jun 15；60(12)3239-46；reviewed in Mach and Dranoff，Curr Opin Immunol.2000Oct；12(5)571-5)。参见，如Boon and Old，CurrOpin Immunol.1997Oct 19(5)681-3)。在引流区淋巴结，肿瘤抗原表位呈递到T细胞被认为会导致对肿瘤转移的系统免疫应答。此外，辐射处理的GM-CSF表达肿瘤细胞被证明是对肿瘤攻击的有效疫苗(在后文的标题为“GVAX”的部分有进一步的阐述)。已经有发现，由遗传修饰的细胞递送的局部高浓度的某些细胞因子，能够导致肿瘤消退(Abe et al.，J.Canc.Res.Clin.Oncol.121587-592(1995)；Gansbacher et al.，Cancer Res.507820-7825(1990)；Forni et al.，Cancer and Met.Reviews 7289-309(1988))。PCT出版物WO200072686中记述了表达各种细胞因子的肿瘤细胞。
在本发明的一个实施例中，细胞疫苗包含一段GM-CSF的编码序列，并且该序列有效连接到用于在疫苗的细胞中表达的调控元件。GM-CSF的编码序列可以是鼠源的或人源的GM-CSF，并且形式可以是基因组DNA(SEQ ID NO1)或cDNA(SEQ ID NO2)。对于cDNA，GM-CSF的编码序列并不含有需要在翻译之前剪接的内含子序列。相反，对于基因组GM-CSF，编码序列包含至少一个需要在翻译之前剪接的天然的GM-CSF内含子。在一个实施例中，GM-CSF编码序列编码SEQ ID NO3。GM-CSF编码序列的其它例子在Genbank中的登录号是AF373868、AC034228、AC034216、M10663和NM000758。
依照本发明，GM-CSF编码序列是可以在严格条件下跟SEQ IDNO1或SEQ ID NO2序列杂交的全长的互补序列。词语“与之杂交的”指当序列是一个在复杂的混和体(如全细胞)中的DNA或RNA时，一个分子与这个特定的核酸序列结合，成为双链，杂交。“显著结合”指一个探针核酸与目标核酸的互补杂交，并且能够对于包含的较小的错误配对能够通过降低杂交介质的严格性来适应，以期检测到目标核酸序列。
由此得出结论，依照本发明，细胞因子如GM-CSF的编码序列的全长与天然的GM-CSF编码序列相比，有着至少80，85，87，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％或更高百分比的相似性。例如，当与对应的最大量比较和比对，并且序列比较算法(如前文所述)测量或用视觉检测时，依照本发明，GM-CSF编码序列与序列如SEQ ID NO1或SEQID NO2有着至少80，85，87，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％或更高的相似性。在一个实施例中，特定百分比的序列相似性存在于长度至少是大约50个核苷酸的序列的一个区域。在另一个实施例中，特定百分比的序列相似性存在于长度至少是大约100个核苷酸的一个区域。在另一个实施例中，特定百分比的序列相似性存在于长度至少是大约200个核苷酸的一个区域。在另一个实施例中，特定百分比的序列相似性存在于序列的全长。
另外，依照本发明，当与对应的最大量比较和比对时，细胞因子如GM-CSF氨基酸序列与序列如SEQ ID NO3有着至少80，85，87，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％或更高的相似性。
在一个实施例中，随便被改变(遗传修饰)以提高与针对前列腺癌的免疫应答关联的抗原(如β-细丝蛋白)的表达，并且被进一步改变以提高针对前列腺癌的免疫应答的一个或多个蛋白例如细胞因子如GM-CSF的表达，或与被进一步改变以提高针对前列腺癌的免疫应答的一个或多个蛋白例如细胞因子如GM-CSF的表达的不同的细胞联合给药。
β-细丝蛋白本发明的一个实施例是一种治疗前列腺癌的方法，所用方式导致了针对抗原如β-细丝蛋白的增强的免疫应答，其中增强的免疫应答与目标的改善的治疗效果是关联的，例如，病人血清中PSA的降低，癌症引起的疼痛的降低或依照临床上可接受的标准的病人状况的改善，包括但不限于转移的减少，预期寿命的增加或生命质量的改进。β-细丝蛋白可以由病人的天然的细胞内源性表达或可以由提供给目标(病人)细胞外源性表达。
哺乳动物有三种细丝蛋白基因，Filamin-A，Filamin-B(β-Filamin；Filamin-3)和Filamin-C。人类的细丝蛋白是N末端为结合肌动蛋白的结构域并且其后是24个典型的重复。它们还与一些其它的细胞蛋白相互作用。细丝蛋白经常与其它细丝蛋白形成大约560KDA的同形或异形二聚体。β-Filamin还被认为是ABP-278/276(Xu et al.1998Blood 921268-1276)。参见，例如，Takafuta et al.1998 J Biol Chem 27317531-17538；Flier et al.，J.Cell Biol.，156(2)361-376，2002。β-Filamin蛋白序列的的2620个氨基酸可以查找Genbank登录号NP_001448。Filamin-B和Filamin-A的表达模式参见Sheen et al.，Human Mol.Gen.11(23)2845-2854，2002中记述的例子。Leedman et al.，Prol Natl Acad Sci U S A.90(13)5994-8，1993中记述了一个涉及结合肌动蛋白的蛋白，之后命名为β-Filamin。
在依照本发明的一个实施例中，与针对前列腺癌的免疫应答关联的抗原(如β-Filamin)的编码序列，其全长的互补序列在严格条件下能够与SEQ ID NO4的序列杂交。词语“与之杂交的”指当序列是一个在复杂的混和体(如全细胞)中的DNA或RNA时，一个分子与这个特定的核酸序列结合，成为双链，杂交。“显著结合”指一个探针核酸与目标核酸的互补杂交，并且能够对于包含的较小的错误配对能够通过降低杂交介质的严格性来适应，以期检测到目标核酸序列。
由此得出结论，依照本发明，与针对前列腺癌的免疫应答关联的抗原(如β-Filamin)的编码序列的全长与其天然的编码序列相比，有着至少80，85，87，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％或更高百分比的相似性。例如，当与对应的最大量比较和比对，并且序列比较算法(如前文所述)测量或用视觉检测时，依照本发明，β-Filamin编码序列与序列如SEQ ID NO4有着至少80，85，87，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％或更高的序列相似性。在一个实施例中，特定百分比的序列相似性存在于长度至少是大约50个核苷酸的序列的一个区域。在另一个实施例中，特定百分比的序列相似性存在于长度至少是大约100个核苷酸的一个区域。在另一个实施例中，特定百分比的序列相似性存在于长度至少是大约200个核苷酸的一个区域。在另一个实施例中，特定百分比的序列相似性存在于序列的全长。
另外，依照本发明，当与对应的最大量比较和比对时，与针对前列腺癌的免疫应答关联的抗原(如β-Filamin)氨基酸序列与序列如SEQ IDNO5有着至少80，85，87，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％或更高的序列相似性。
在本发明的实施中，在施予给病人细胞因子表达细胞疫苗如GM-CSF表达肿瘤细胞(如GVAX)之后，针对β-Filamin的免疫应答得到增强。
在本发明的一个实施例中，一组表达β-Filamin的细胞被作为细胞疫苗的一部分施予给病人。表达β-Filamin的细胞与细胞因子(如GM-CSF)表达细胞可以相同或不同。在本发明的另一个实施例中，细胞疫苗包含纯化的β-Filamin蛋白或其免疫原性片段。该细胞疫苗可以进一步包含免疫增强制剂(例如细胞因子如GM-CSF，起辅助或类似的作用)。在本发明的实施中，全长的β-Filamin可以作为抗原。不管用何种方法，当施予给目标β-Filamin的片段或在缺少外源提供的β-Filamin的同时施予细胞疫苗，如GVAX，所属领域中的技术人员将会意识到针对β-Filamin的免疫应答的检测是显著的。β-Filamin的片段可以包含全长氨基酸序列线性片段或等价剪接变异体、缺失突变体或其它突变体。为了在本发明中使用，β-Filamin的片段应该是免疫原性片段，即能够引发免疫应答。
细胞可以通过所属领域中的技术人员熟知的各种方法来提高β-Filamin的表达。例如，细胞可以导入一个有效连接到β-Filamin编码序列上的编码β-Filamin的载体。所属领域中的技术人员熟知可以利用的合适的启动子。任何能有效提高β-Filamin表达的载体都可以用于导入细胞。在一个实施例中，载体可以是病毒载体，例如，逆转录病毒载体如慢病毒载体，腺病毒载体或腺相关病毒载体。用于导入细胞的载体可以是能够提高针对目标癌症的免疫应答的编码区域，例如，细胞因子如GM-CSF。在导入相同或不同的细胞时，该编码区域和β-Filamin编码区域可以在同一个或不同的载体上。若在不同的载体上，这些不同的载体可以是相同或不同的起始点(例如逆转录病毒)。在一个实施例中，细胞先是被导入一个编码β-Filamin的载体之后被导入一个编码GM-CSF的载体。在另一个实施例中，细胞先是被导入一个编码至少一个能够增强针对前列腺癌的免疫应答的蛋白的载体，之后被导入一个编码β-Filamin的载体。
在本发明的一个实施例中，载体中编码β-Filamin的序列是一个天然的序列(Genbank NM 001457；SEQ ID NO4)或重新编码的序列。一个重新编码的基因指被用如下方式改变的编码序列核酸序列编码的多肽保持与没有改变的序列一致，但是编码多肽的核酸序列改变了。在所属领域中众所周知，由于遗传密码的简并性，存在能够编码同一氨基酸翻译产物的多种DNA和RNA密码子。更进一步讲，同样众所周知的是不同的生物体在合成氨基酸序列时对于使用特定的密码子有不同的优先选择。因此，在本发明的一个实施例中，载体包含了一段经过用在人体中优先选的择密码子重新编码的β-Filamin编码序列。β-Filamin的等价剪接形式参见Genbank登录号AF353666和AF353667以及Van der Flier等人(的文章)。
本发明的另一个实施例是提高对肿瘤细胞和/或β-Filamin的免疫应答的方法，包括将本发明中的遗传修饰的细胞因子表达细胞施予给患前列腺癌的病人，其中产生了改善的治疗效果。本发明的另一个实施例是提高对肿瘤细胞和/或β-Filamin的免疫应答的方法，包括将显示出提高β-Filamin表达的遗传修饰的细胞因子表达细胞施予给患前列腺癌的病人，其中在所述的给药之后，病人的针对前列腺癌的免疫应答增强了。另外本发明的另一个实施例是提高对肿瘤细胞和/或β-Filamin的免疫应答的方法，包括将显示出提高GM-CSF表达的遗传修饰的细胞因子表达细胞施予给患前列腺癌的病人，其中在所述的给药之后，病人的针对前列腺癌的免疫应答增强了。在一个实施例中，增强的是体液免疫应答。另外在另一个实施例中，增强的是细胞免疫应答。还是在另一个实施例中，增强的是细胞和体液的免疫应答。在本发明的一个较佳方面，在施予遗传修饰的细胞因子表达细胞之后，前列腺癌细胞的生长被抑制。
用于确定是否细胞表达了可检测水平的β-Filamin和/或在施予细胞因子表达细胞疫苗后对β-Filamin的免疫应答是否改变的检测方法包括，但不限于，酶联接免疫吸附剂测定，免疫印迹法，免疫荧光法(IFA)，流式细胞技术或电化学发光技术(ECL)。
用于用作癌症疫苗的细胞的遗传修饰在此，本发明的方法和成分通过特定的载体系统来详细举例，另一方面，所属领域中的技术人员将很容易认识到，在前列腺癌治疗中使用的相同的方法和成分，独立于基因载体系统。
本发明仔细考虑使用将转基因如GM-CSF和β-Filamin导入哺乳动物细胞的任何载体。典型的载体包括但不限于，病毒和非病毒载体，例如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒(Ad)载体及其增殖型、复制缺陷型和空壳型、腺相关病毒(AAV)载体、猿猴空泡病毒(SV40)载体、牛乳头瘤病毒载体、人疱疹病毒第四型病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、小鼠白血病病毒载体、哈维氏鼠科肉瘤病毒载体、鼠类乳腺肿瘤病毒载体、劳斯肉瘤病毒载体以及非病毒质粒载体。在一个优先选择的方法中，载体是病毒载体。病毒能够有效转导细胞并将它们的自体DNA导入宿主细胞。在产生重组病毒载体时，非必需基因被一个异源(或非天然)蛋白的基因或编码序列取代。
在构建病毒载体时，非必需基因被编码一个或多个治疗用的化合物或因子的基因取代。通常的，载体包含一个复制其实点，并且可以也可以不包含一个用于载体识别和筛选的“标记物”或“筛选标记”。当使用任何一种筛选标记时，在这种表达载体中的筛选标记通常为所属领域中的技术人员所熟知，并且适当的筛选标记的选择取决于宿主细胞。筛选标记的基因编码的蛋白赋予对抗生素和毒素包括氨苄青霉素、氨甲蝶呤、四环素、新霉素(Southern et al.，J.，J Mol Appl Genet.1982；1(4)327-41(1982))、霉酚酸(Mulligan et al.，Science 2091422-7(1980))，嘌呤霉素、zeomycin，潮霉素(Sugden et al.，Mol Cell Biol.5(2)410-3(1985))或G418的抗性。
腺病毒基因治疗载体以其在体外展示出的强烈表达和出色的滴定度，以及在体外转染分裂和非分裂细胞的能力而众所周知(Hitt et al.，Advin virus Res 55479-505(2000))。由于载体骨架引起的免疫应答，体内使用这些载体时，导致强烈的然而是瞬时的基因表达。本发明中使用的重组腺病毒载体包含(1)使载体被并入复制缺陷的腺病毒病毒体的包装位点；(2)治疗用化合物的编码序列。其它必需的或有用的被并入感染性的病毒体的元件，包括5′和3′端的腺病毒末端反向重复序列(ITRs)，E2和E3基因，等等。
本发明中包含重组腺病毒载体的复制缺陷的腺病毒病毒体是使用腺病毒包装细胞和包装技术的所属领域熟知的标准技术制作的。这些方法的示例可以参见美国专利No.5,872,005，在此结合整体引用。一个治疗的编码化合物的基因通常插入到腺病毒的病毒基因组中E1A，E1B或E3被删除的区域。实施本发明时优先选择的载体不表达一个或多个野生型的腺病毒基因产物，例如，E1a，E2b，E2，E3，E4。较佳的实施例是通常与补足E1，E2A，E4和E3(任选的)区域的功能的包装细胞联合使用的病毒体。参见，例如，美国专利No.5,872,005，No.5,994,106，No.6,133,028和No.6,127,175。腺病毒载体的纯化和构建使用所属领域中熟知的标准技术。重组的AAV载体的特征是它们能够在目标细胞中指导被选择的转基因产物的表达和产生。因此，包含至少所有衣壳化和感染目标细胞的物理结构必不可少的序列。
实施本发明使用的重组AAV(rAAV)病毒体可以用所属领域中的技术人员熟知的标准技术生产，并且其构建包括，有效连接的指导转录的组件，治疗用化合物或其生物活性片段的编码序列。这些组件通过有功能的AAV ITR序列结合到5′和3′端。通过“有功能的AAV ITR序列”指ITR序列的功能用于拯救，复制和包装AAV病毒体。因此，本发明中的载体所使用的AAV ITR不必有一个野生型的核苷酸序列，并且可以通过核苷酸的插入，删除或替换来改变或AAV ITR可以来自几个血清型AAV中的任何一个。一个AAV载体是来自血清型腺相关病毒的载体，包括但不限于，AAV-1，AAV-2，AAV-3，AAV-4，AAV-5，AAV-6，AAV-7，AAV-8，等等。首选的AAV载体的野生型的REP和CAP基因全部或部分被删除，但有功能的ITR侧翼序列。表1举例说明基因转移中使用的AAV血清型。
表1基因转移中使用的AAV血清型


通常的，AAV表达载体被导入生产细胞，之后导入一个AAV辅助建构，该AAV辅助建构包含能够在生产细胞中被表达和补足AAV载体中AAV辅助功能缺失的AAV编码区。辅助建构可以被设计用来下调大REP蛋白(REP78和REP68)的表达，通常通过突变起始密码子后的第五个点从ATG变为ACG，参见美国专利No.6,548,286。之后将辅助病毒和/或另外的载体导入生产细胞，其中辅助病毒和/或另外的载体起能够支持rAAV病毒产生的辅助功能。这些步骤按照标准方法实施。本发明中复制缺陷的AAV病毒体包装重组的AAV载体是通过AAV包装细胞和包装技术领域熟知的标准技术完成的。这些方法的示例可以参见，例如美国专利Nos.5,436,146；5,753,500；6,040,183；6,093,570和6,548,286。包装AAV的进一步的成分和方法参见Wang et al.(US 2002/0168342)，并且这些技术在所属领域技术人员的知识范围之内。
目前已知的AAV的血清型有很多种，尽管如此，在今天还有新的血清型及其变异体被发现，这在本发明的考虑范围之内。参见Gao et al(2002)，PNAS 99(18)11854-6；Gao et al(2003)，PNAS 100(10)6081-6；Bossis and Chiorini(2003)，J.Virol.77(12)6799-810。不同的AAV血清型被用来优化特定目标细胞或特定目标组织(如脑)范围内的特定的目标细胞的转导。不同AAV血清型的使用可以有助于恶性组织的针对性。AAV的血清型1，2，4，5和6已被证明能够导入脑组织。参见，例如，Davidson et al(2000)，PNAS 97(7)3428-32；Passini et al(2003)，J.Virol77(12)7034-40。特定的AAV血清型可以在目标组织或细胞内更有效的针对和复制。为了提高转导效率和产生更快起始的转基因的表达，在本发明的实施中使用了一个单独的自身互补的AAV载体(McCarty et al.，GeneTher.2001Aug；8(16)1248-54)。
在本发明的实施中用来产生rAAV病毒体的宿主细胞包括哺乳动物细胞，昆虫细胞，微生物和酵母。宿主细胞可以是AAV REP和CAP在宿主细胞或等价宿主细胞内稳定保持的包装细胞，宿主细胞或等价宿主细胞可以是AAV载体基因组稳定保持的生产细胞。典型的包装和生产细胞来自293，A549或HeLa细胞。AAV载体的纯化和构建使用所属领域中熟知的标准技术。
逆转录病毒是基因转移的常用工具(Miller，1992，Nature 357455-460)。在本发明的实施中可以使用逆转录病毒尤其是慢病毒。逆转录病毒已被证实和发现是将各种目标基因稳定导入很多类目标细胞的基因组DNA的适宜的运载工具。由于将未经重排的单拷贝的转基因转移到细胞中的能力，逆转录病毒适用于将基因转移至细胞。更进一步地，逆转录病毒通过逆转录病毒包膜糖蛋白与宿主细胞表面的特异受体的结合进入宿主细胞。因此，在本发明的实施中也会使用到被编码的天然的包膜蛋白被异源的包膜蛋白取代的有着与天然包膜蛋白不同的细胞特异性(例如，与天然的包膜蛋白相比，结合到不同的细胞表面受体)的假型逆转录病毒载体。在基因治疗的应用中，指导将编码转基因的逆转录病毒载体转移到特定类型的目标细胞的能力是十分需要的。
本发明提供的逆转录病毒载体包括例如，含有一个或多个转基因序列的逆转录转移载体和包含一个或多个包装元件的逆转录病毒包装载体。特别的，本发明提供了用于产生假型逆转录病毒的编码一个异源的或功能被修饰的包膜蛋白的假型逆转录病毒载体。
本发明中逆转录病毒的核心序列可以容易地得自各种各样的逆转录病毒，包括例如B，C，和D型逆转录病毒以及泡沫病毒和慢病毒(参见RNA Tumor Virus，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，1985)。本发明的成分和方法适用的逆转录病毒的范例包括，但不限于，慢病毒。本发明的成分和方法适用的其它逆转录病毒包括，但不限于，禽类白血病病毒，牛白血病病毒，小鼠白血病病毒，水貂细胞病灶形成病毒，小鼠肉瘤病毒，禽网状内皮组织增生症病毒和劳斯病毒。特别有先选择的小鼠白血病病毒包括4070A和1504A(Hartley and Rowe，J.Virol.1919-25，1976)，Abelson(ATCC No.VR-999)，Friend(ATCC No.VR-245)，Graffi，Gross(ATCC No.VR-590)，Kirsten，Harvey Saccoma Virus and Rauscher(ATCC no.VR-993)，和Moloney Murine Leukemia Virus(ATCC No.VR-190)。这些逆转录病毒可以很容易从储藏和收集例如美国模式菌种收集中心(“ATCC”；Rockville，Md)获得，或用常规可行的技术从已知的来源中分离。
本发明的逆转录病毒载体序列优先取自慢病毒。优先选择的慢病毒是人类免疫缺陷病毒，例如，1型和2型(即HIV-1或HIV-2，其中HIV-1以前被称为淋巴腺病综合征相关病毒3(HTLV-III)和艾滋病(AIDS)相关逆转录病毒(ARV))，或其它已发现的与艾滋病及其类似病症相关的HIV-1或HIV-2相关的病毒。其它的慢病毒载体包括，绵羊脱髓鞘脑白质炎病毒，猫免疫缺陷病毒(FIV)，牛慢病毒，猴免疫缺陷病毒(SIV)，马传染性贫血病毒(ELAV)，和山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)。
在适和在本发明的成分和方法中使用的各种种类和品系的逆转录病毒在所属领域中众所周知(参见，例如，Fields Virology，Third Edition，edited by B.N.Fields et al.，Lippincott-Raven Publishers(1996)；Chapter 58，RetroviridaeThe Viruses and Their Replication，Classification，pages 1768-1771，)，包括表1，结合在此的参考书目。
本发明提供用于产生能够产生逆转录病毒的生产者细胞和生产者细胞系的逆转录病毒包装系统，以及制作此类包装系统的方法。相应的，本发明还提供通过将逆转录病毒转移载体导入此类包装系统(例如，通过转染或感染)产生的生产者细胞和细胞系，以及制作此类包装细胞和细胞系的方法。
在实施本发明中使用的逆转录病毒包装系统至少包含两种包装载体包含一段含有gag，pol或gag和pol的基因的一条核酸序列的第一个包装载体；和包含一段含有异源的或功能修饰的包膜蛋白基因的另外一条核酸序列的第二个包装载体。在一个较佳的实施例中，逆转录病毒元件来自慢病毒，例如HIV。优先地，载体缺失一个功能基因tat和/或功能辅助基因(vif.vpr，vpu，vpx，nef)。在另一个较佳实施例中，系统进一步包含一个含有rev基因的核苷酸序列的第三个包装载体。包装系统可以以含有第一，第二，和第三(任选的)的核苷酸序列的包装细胞的形式提供。
本发明适用于多种逆转录病毒系统，并且所属领域中的技术人员会意识到不同种群逆转录病毒所共用的共同元件。在此的记述将慢病毒系统作为一个有代表性的范例。不管用何种方法，所有逆转录病毒的共同特征是包膜的病毒体有表面突起，含有一条线性正义单链的RNA分子，又二聚体构成的基因组，以及共同的蛋白gag，pol和env。
慢病毒具有共同的病毒体结构蛋白，包括env基因编码的包膜糖蛋白SU(gp120)和TM(gp41)；gag基因编码的CA(p24)，MA(p17)和NC(p7-11)；以及pol基因编码的RT，PR和IN。HIV-1和HIV-2包含涉及病毒RNA的合成和加工以及其它复制功能的调节的辅助蛋白和其它蛋白。vif.vpr，vpu/vpx编码的辅助蛋白在重组系统中可以被忽略(或失活)。另外，通过突变或删除，tat和rev基因可以被忽略或失活。
第一代慢病毒载体包装系统提供了gag/pol和env基因的包装建构，并且处于安全考虑，一般都利用了异源的或功能修饰的包膜蛋白。在第二代慢病毒载体系统中，辅助基因vif，vpr，vpu和nef被删除或失活。第三代慢病毒载体系统中tat基因已经被删除或失活(例如，通过突变)。
正常情况下由tat提供的转录调节的代偿作用可以通过使用重组的强启动子，如人巨细胞病毒立早增强子/启动子提供。其它的启动子/增强子可以根据重组启动子的活力，目标组织的特异性(例如，肝脏特异的启动子)或所属领域熟悉的表达控制的需要有关的其它因子来选择。例如。在一些实施例中，需要使用可诱导的启动子如tet来实现对表达的控制。编码rev的基因优先用单独的表达建构提供，因此典型的第三代慢病毒载体系统会涉及四个质粒用于gagpol，rev，envelope各一个以及转移载体。不管使用哪一代的包装系统，gap和pol可以用同一个或分离的建构提供。
通常的，包装载体包含在包装细胞中，并且通过转染，转导或感染被导入细胞。用于转染，转导或感染的方法为所属领域中的技术人员所熟知。本发明中的逆转录病毒载体可以通过转染，转导或感染被导入包装细胞系以产生生产者细胞或细胞系。本发明中的包装载体可以通过标准方法包括，例如，磷酸钙转染，脂质体转染或电穿孔导入人类细胞或细胞系。在一些实施例中，包装载体和显性的筛选标记如neo，DHFR，谷氨酰氨合成酶或ADA被共转染至细胞，之后用合适的药物筛选或分离克隆。筛选标记可以被物理地连接到包装载体编码的基因。众所周知，在稳定的细胞系中，其表现的配置的包装功能是由合适的包装细胞提供的。例如，参见美国专利No.5,686,279；和Ory et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)9311400-11406，其中记述了包装细胞。生产稳定细胞系的进一步记述参见Dull et al.，1998，J.Virology 72(11)8463-8471；和zfferey et al.，1998，J.Virology 72(12)9873-9880；；zfferey et al.，1997，NatureBiotechnology 15871-875，其中讲述了一个pol 3′端序列包括HIV-1包膜基因被删除的慢病毒包装质粒。建构包含tat和rev序列并且3′LTR被poly A序列取代。5′LTR和psi序列被另一个启动子如可以诱导的启动子所取代。例如，可以使用CMV启动子或其衍生物。
目标包装载体可以包含包装功能的额外改变以提高慢病毒蛋白表达和提高安全性。例如，上调gag的所有HIV序列可以被移除。同样的，下调包膜蛋白的序列可以被移除。此外，为增强RNA的剪接和翻译，可以采取步骤来修饰载体。
任选的，使用有条件的包装系统，参见Dull et al.，1998，J.Virology72(11)8463-8471中的记述。同样地，优先使用的是通过删除HIV-1长末端重复序列(LTR)以提高载体生物安全性的自我失活型载体(SIN)，参见zfferey et al.，1998，J.Virology 72(12)9873-9880中的记述。还可使用可以诱导的载体，例如通过一个tet诱导的LTR。
调节元件本发明中的基因治疗载体通常包含异源的控制序列，包括，但不限于，重组的启动子，可以诱导的启动子，肿瘤选择性的启动子和增强子，包括但不限于E2F启动子和端粒酶(hTERI)启动子；细胞巨化病毒增强子/鸡，β-肌动蛋白/兔，β-球蛋白启动子(CAG启动子；Niwa H.et al.1991.Gene 108(2)193-9)；延伸因子1-α(EF1-α)启动子(Kim DW et al.1990.Gene.91(2)217-23和Guo ZS et al.1996.Gene Ther.3(9)802-10)；神经胶质特异性的启动子(例如胶质纤维酸性蛋白启动子)和神经元特异性的启动子(例如神经元特异性烯醇化酶启动子或突触蛋白启动子)。
在一些情形下，可以使用例如巨细胞病毒(CMV)立早启动子，RSVLTR，MoMLV LTR，CAG启动子，磷酸甘油酸激酶-1启动子(PKG)或SV-40启动子。本发明中的基因治疗载体还包括增强子和信号肽的编码序列。载体建构可以也可以不包含内含子。很显然，本发明中的基因治疗载体可以包含然后数目的转基因，转基因的联合以及转基因/调节元件的联合。
本发明的方法和成分本发明提供了一种可以单独使用或与传统的治疗形式联合使用的治疗前列腺癌的另一途径。
本发明的一个实施例是一种由遗传修饰的细胞组成的癌症疫苗，其中细胞通常细胞因子表达如GM-CSF，并且随着施予给患前列腺癌的病人，可以检测到针对β-Filamin的增强的免疫应答。在另一个实施例中，细胞与哺乳动物中的肿瘤细胞是同一类型。一般而言，癌症疫苗由遗传修饰的肿瘤细胞组成，尽管如此，在实施本发明中非肿瘤细胞也是有用的。细胞可以是在体外生长和维持的已建立的细胞系。本发明中使用的已建立的肿瘤细胞系包括，但不限于，PC-3(ATCC#CRL-1435)、Hela(ATCC#CCL-2)、A549(ATCC#CCL-185)、LNCaP(ATCC#CRL-1740)、H157(ATCC#CRL-5802)或H1359细胞。在一个步骤中，遗传修饰的细胞来自目标分离出的细胞并且被导入引起细胞因子如GM-CSF表达的载体。然后遗传修饰的细胞作为癌症疫苗的一部分，施予给相同或不同的目标。不言而喻，子代细胞可能与亲代细胞完全一致(或者形态、基因型或表现型)。此外，细胞可以是未筛选的细胞组或特定的细胞克隆。例如细胞可以是遗传修饰的或筛选到的高水平细胞因子表达如GM-CSF或抗原如β-Filamin。细胞一般是人类细胞，通常在施予给目标之前冷冻存储。通常细胞是增殖无能力的。在一个实施例中，细胞是已经建立在间接体内培养的原代前列腺癌肿瘤的后代。
前列腺癌的严重程度基于各种规律，其中一个是疾病阶段，示例如下阶段1肿瘤很小，完全在前列腺内，直肠检查时感觉正常。
阶段2肿瘤仍然在前列腺内，但在直肠检查时感觉到变大和肿块或硬的区域。
阶段3肿瘤已经扩展到覆盖前列腺，可能已经生长到膀胱颈部或输精管。
阶段4癌症已经扩散到身体的其它部分，其中前列腺癌最常见的扩散部位是骨骼。前列腺癌扩散到其它身体器官并不常见。
另一个评价前列腺癌疾病严重程度的标准是格里森分数，一个程度描述的不同方式。当进行活组织切片检查时，根据细胞外观，显示癌细胞的每个区域分级的数值范围是1分到5分，1分是最低程度或看起来最正常，5分是最高程度，看起来最不正常。格里森分数的产生基于最高分数细胞的两个区域的平均水平，将它们的分数加起来产生格里森分数。
分级/格里森分数只是给了医生一个前列腺癌发展和/或对治疗的反应的一个概念。
依照本发明，药物成分包含可以用于治疗病人任意阶段的前列腺癌的细胞因子表达森细胞疫苗，并且在治疗病人的前列腺癌时，可以用在其它疗法的之后或之前或代替或联合其它疗法。例如，病人可能在之前或同时接受化疗，外照射放疗，和其它形式的免疫疗法/细胞疗法，如下文中的进一步描述。
前列腺癌的治疗方案变化多样并且包括众多选择，包括但不限于，一次或多次手术(即根治性前列腺切除术)；放疗(即外照射放疗或短距离放射治疗)；激素疗法，像“雄激素剥夺疗法”，例如施予抗雄激素物质；以及化疗。
在治疗前列腺癌中最经常使用的抗雄激素物质包括，但不限于亮丙瑞林，一种用于治疗前列腺癌的可注射的人造激素。亮丙瑞林(Lupron)是促性腺激素释放激素的类似物，可以被安排用于治疗晚期的前列腺癌。亮丙瑞林可以与戈舍瑞林(Zoladex)和康士德(比卡鲁胺)中的一种或两种联合使用。戈舍瑞林(Zoladex)含有人造的黄体素释放激素(LHRH)的十肽类似物，同样以促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂的类似物闻名。康士德(比卡鲁胺)是一种含有活性的比卡鲁胺成份的口服的非类固醇抗雄激素物质。它通过阻断雄性激素如睾丸激素的效果起作用。
在治疗晚期前列腺癌中，氟他胺也被使用。它通过阻止在前列腺中睾丸激素与雄激素受体结合起作用。它还作用于脑部的下丘脑，最终导致身体产生的睾丸激素的数量的减少。在前列腺癌的治疗中，氟他胺与LHRH的类似物联合使用。LHRH类似物是前列腺癌的标准疗法之一，包括的药物有布舍瑞林，戈舍瑞林，亮丙瑞林和曲普瑞林。
治疗前列腺癌用到的另一个药物是尼鲁米特(Anandron)，一个与雄激素受体(除了孕激素，雌激素，或糖皮质激素受体)有亲合力的非类固醇抗雄激素物质。
依照美国临床肿瘤学会第38和第40届年会的结论，包含Texotere(多西紫杉醇)，雌莫司汀(Emcyt)和泼尼松的治疗方案对治疗激素难治性前列腺癌(HRPC)非常有效。
依照本发明，包含细胞因子表达细胞疫苗的药物成分可以与正在使用的前列腺癌疗法先后或同时联合施予给前列腺癌病人，参见前文中的一些举例。
目标的前列腺癌的病情监视的常用手段在所属领域中广为人知，并且与针对抗原的免疫应答的评价协同进行，依照本发明，随着细胞因子表达(如GM-CSF)的细胞疫苗的施予，检测到增强的免疫应答。病人的监视可以采取多种方法如肿瘤重量，肿瘤体积，肿瘤细胞数量或肿瘤生长速率评价中的任意一种。可用于评价的参数包括但不限于，可及肿瘤的直接测量，肿瘤细胞计数(例如在血液中)，肿瘤抗原的测量(例如前列腺特异性抗原(PSA)，甲胎蛋白(AFP)，等等)，各种成像技术(例如核磁共振成像，断层扫描和X-射线)，骨密度测定或骨转移评价。这些分析中获得的信息用于调整细胞疫苗的给药剂量和时间表，以期优化病人的反应和实现关于前列腺癌的改善的治疗效果。可以适当施予额外的剂量，通常以两周为基础，直至获得期望的效果。之后，追加的强化剂量和维持剂量的施予是必不可少的。在一个典型的治疗方案中，细胞因子表达(如GM-CSF)的细胞疫苗通过皮内注射(置于皮下的下注射针头)到手臂，腿部或腹部。
本发明的一个方面包括，通过在首次施予前列腺癌病人细胞因子表达(如GM-CSF)的细胞疫苗之前和首次给药之后各个时间点获取的血清样品检测针对β-Filamin的免疫应答的检测系统。然后比较每个时间点的结合β-Filamin的抗体数量。任何确定样品中结合β-Filamin的抗体的数量的检测系统可以用于分析血清中结合β-Filamin的抗体。用来分析血清中结合β-Filamin的抗体的检测系统包括，但不限于，酶联接免疫吸附剂测定，免疫印迹法，免疫荧光法(IFA)，流式细胞技术或电化学发光技术(ECL)。在一个实施例中，免疫印迹法使用PC-3细胞的细胞裂解液作为β-Filamin抗原的来源。
在本发明的实施中，针对β-Filamin的免疫应答的评价在首次施予前列腺癌病人细胞因子表达(如GM-CSF)的细胞疫苗之前和首次给药之后各个时间点，使用抗原特异性细胞分析，增殖分析，细胞裂解分析，和使用重组肿瘤相关抗原或抗原的免疫原性片段或多肽的延迟型超敏性检验。当前使用更多的测量增强的免疫应答的检测手段以测量T细胞的应答，例如迟发性超敏反应检验，使用主要组织相容性复合体多肽四聚体的流式细胞仪，淋巴细胞增殖试验，酶联免疫吸附测定，酶联免疫斑点法，细胞因子流式细胞仪，直接细胞毒杀试验，通过定量反转录聚合酶链反应测定细胞因子mRNA，以及有限稀释法。参见，例如，Lyerly，HK，Semin Oncol.2003June；30(3Suppl 8)9-16。
本发明通过引用如下的实施例被描述，例子通过图解的方式提供，并且并不是意图以任何方式来限制本发明。使用的是所属领域中众所周知的标准技术和下文中明确描述的技术。
应了解，本发明中的方法和成分可以结合多个实施例，在此仅仅展示了一部分。对技术人员来说，很显然，存在其它的实施方式，这并不偏离本发明的主旨。因此，描述的实施例是说明性的而不应被认为是限制性的。
实施例实施例1用于制备GVAX疫苗的重组病毒载体的产生下文中的构建的编码细胞因子的病毒载体用于导入肿瘤细胞系或取自切除的人类肿瘤的原代细胞。
(1)逆转录病毒载体逆转录病毒载体的构建使用了所属领域熟知的标准的连接和限制性酶切技术。使用了含有编码一个或多个目标细胞因子的基因的多种逆转录病毒。MFG载体的描述参见美国专利No.6,544,771和No.5,637,483。它们还通过下文中对编码细胞因子的基因的结合和表达的详细引用被描述。此外，ATCC储藏有数种MFG载体未被修饰的MFG载体储藏在ATCC的登录号是No.68754；有VIII因子插入的MFG载体储藏在ATCC的登录号是No.68726；有tPA插入的MFG载体储藏在ATCC的登录号是No.68727。MFG载体与下文和专利No.6,544,771和No.5,637,483中描述的pEm载体相似，但是为了增强重组基因组在包装细胞系中的衣壳化，含有用于莫洛尼小鼠白血病病毒的gag序列的1038个碱基对，以及来自包含剪切受体序列的MOV-9的350个碱基对。一个包含Nco I和Bam HI酶切位点的18个碱基对的寡聚核苷酸直接依照MOV-9的序列，并且容许带有兼容酶切位点的基因的便捷插入。基因的编码区被连接到MFG载体骨架的Nco I和Bam HI酶切位点之间。担氨酸的起始密码子ATG被亚克隆至框架的Nco I和Bam HI酶切位点之间，即便要包括终止密码子之外的序列，也是为了避免使产物不稳定和引入保护位点。结果，插入的ATG出现在载体的野生型病毒的ATG出现的位点。因此，这个接合与莫洛尼小鼠白血病病毒中的出现的实质上一样，并且接合后的病毒运转良好。莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR控制转录和产生包含天然gag转录本的原来的5′端非翻译区和紧随其后的插入基因的阅读框的mRNA。在此载体中，莫洛尼小鼠白血病病毒(Mo-MuLV)的长末端重复序列被用来产生病毒的全长RNA(以便衣壳化产生病毒颗粒)，和负责插入基因表达的亚基因组mRNA(与Mo-MuLV的env mRNA相似)。载体在病毒的gag区域保持的两段序列用于提高病毒RNA的衣壳化和提供env mRNA产生所必需的正常的5′和3′剪切位点。所有的寡核苷酸的连接点用双脱氧终止法和T7DNA聚合酶测序。由于没有含有一个显性的筛选标记(尽管可以任意的插入一个)，病毒是无标记的，并且，由于高水平的转导效率和载体结构的固有表达，MFG衍生物的一般不涉及或需要一个筛选的步骤。
构建的MFG载体包含以下蛋白的基因小鼠的IL-2，GM-CSF，IL-4，IL-5，gamma-IFN，IL-6，ICAM，CD2，TNF-alpha和IL-1-RA(白细胞介素-1受体拮抗剂)。另外，利用可以公开得到的序列信息，构建了编码人类TNF-alpha，GM-CSF，和IL-2的序列。被亚克隆至MFG载体的精确的cDNA序列如下小鼠IL-2的49-564碱基对；小鼠IL-4的56-479碱基对；小鼠IL-5的44-462碱基对；小鼠GM-CSF(29)的70-561碱基对；小鼠ICAM-1的30-1657碱基对；小鼠CD2的48-1079碱基对；小鼠白细胞介素-1受体拮抗剂的15-563碱基对；人类TNF-alpha的86-788碱基对。
(2)腺病毒载体用于将人类的GM-CSF编码序列导入细胞(人类GM-CSF；AV-GM-CSF)的腺病毒载体含有一个替换5型腺病毒的E1基因的GM-CSF表达框，并且在病毒基因组的E3区域有一个额外的删除。根据Genbank中的Ad5的完全序列(登录号no.M73260)，E1区域删除的是455-3327碱基。编号从左侧末端反向重复序列的第一个碱基开始。
腺病毒载体的构建使用了所属领域熟知的标准的连接和限制性酶切技术。E3基因的删除是通过野生型300(来自H.Ginsberg)(0-27330)和dl324(Thimmappaya et al.(1982)Cell 31543-551)(21561至右侧末端)之间的重叠重组。GM-CSF的表达框通过cre/lox介导的pAdlox MC hGM和CRE8细胞内的E3基因被删除的腺病毒(Hardy et al.(1997)J.Virol.711842-1949)之间的重组添加到E1区域。pAdlox MC hGM源自pAdlox(Hardy et al.(1997))和pMD.G(Naldini et al.，(1996)Science 272263-267)并且含有如下序列Ad5的0-455，pBC 12/CMV/IL-2(Cullen(1986)Cell 46973-982)的巨细胞病毒(CMV)立早启动子/增强子(核苷酸位点-670至+72，Genbank登录号NO.X03922)，人类-球蛋白外显子2的一个小的区域和缩短的第二插入序列(ISV2)(核苷酸位点62613-62720加上63088-63532，Genbank登录号no.J00179)，外显子3和人类-球蛋白的多聚腺苷酸信号(核苷酸位点63532-64297)，插入到外显子3的GM-CSF的cDNA(位点63530)，来自SV-40的第二个多聚腺苷酸位点(位点2681-2534)，(Genbank登录号No.J02400)和连有一段来自Bluescript的细菌的序列的loxP位点。GM-CSF的cDNA序列的获得来自于一个质粒(DNAX分子和细胞生物学研究所(Palo Alto，CA))。DNA序列是通过在哺乳动物细胞中的功能表达从一个由伴刀豆球蛋白活化的人类T细胞克隆制备的文库分离出的。cDNA的分离和功能研究，包括基因的全部序列，已经在科研文献中有报导。(Lee et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)824360-4364)。克隆的确认通过其限制性内切酶消化来验证。MD的表达框通过PCR修饰，包含PmlI，EcoRI和BglII的限制性酶切位点，用于转基因下游的ISV2的插入。GM-CSF的cDNA用PmlI和BamHI从pMFG-S hGM上切下来(Dranoff et al.(1997)Human Gene Ther.7111-123)，插入到MD表达框的PmlI和BglII位点。插入到腺病毒(Ad GM病毒)中的pAdlox MDhGM质粒的区域进行双链测序。最初的病毒建构的正确结构通过限制性酶切技术和用于检测被感染的HeLa细胞中的GM-CSF的产生的ELISA来验证。然后将重组的病毒进行两轮斑点纯化。将取自一个斑点的重组病毒进行限制性作图并且在293细胞(来自微生物学会的已被鉴定的细胞)中扩增2代以产生研究用的病毒储存库。病毒中的GM-CSF基因通过以研究用的病毒储存库制备的病毒DNA的直接测序来确定。最后，对取自研究用的病毒储存库的重组病毒进行支原体和无菌状态的检测，如果检测结果是阴性的，则用于感染细胞以建立种子细胞储存库。
实施例2自体前列腺的GVAX疫苗试验9个病人参加了自体前列腺的GVAX疫苗试验。每位病人年龄都大于18岁，并且手术之后通过两次连续的PSA水平的异常评价确定为愈来愈严重的，有微小转移的前列腺癌，没有证据表明有可以检测到转移的疾病或之前有过激素治疗，并且在治疗的开始PSA的最小的基线浓度大于1.0ng/ml。术后的病人伴随着合适的药物治疗。病理诊断和疾病的分期在手术期间完成。
切除的肿瘤的一部分用于原代培养扩增，用携带GM-CSF基因的MFG病毒载体转导，通过辐射处理使细胞增殖无能力，并且在液氮中储存直至用于制备载体的GVAX疫苗。大约术后60天，疫苗便可以用于临床部位。对于每一次接种，用于注射的GVAX疫苗的准备和制造通过解冻，洗涤，用0.9％的氯化钠溶液或含2.5％人血清白蛋白的氯化钠溶液再悬浮。
大约术后60天，安排一次再接种检查以获取基线值并且开始第一次自体非转导的细胞的迟发性变态反应评价。血清取样并且通过RT-PCP检测PSA水平。再接种检查后两天，每位病人被安排3个接种周期，每个周期14天。如果3次接种后没有证据表明有累积毒性，并且如果还有存留的疫苗细胞，病人可以接受另外的3次接种，总共6次接种。
间隔和接种部位的定位如下面的表2所示。每一剂依照不需住院而在医院或门诊部接受诊断治疗的原则给药，之后在病人离开之前在门诊部进行临床观察。
表2接种时间表

注射以网格式皮内注射至病人的肢体。每一个注射的针头进入位点与相邻最近的注射位点至少5cm。对于剂量水平1，注射被施予给3位病人，每一个连续的周期注射到不同的肢体。对于剂量水平2，被注射的6位病人在一个周期注射两个肢体，在每一个连续的周期等分注射不同的两个肢体。第一次接种为第0天，随后的是第14、28、42、56和70天。对局部和系统的毒性和随后的引发的抗肿瘤免疫应答进行评价。自身免疫性的迹象也被评估。
在总共接受了41次完全可评价的接种的8位接种病人中，没有观察到美国癌症研究所常见毒性判定标准的剂量限制性毒性。皮下位点的活组织切片检查显示出独特的由巨噬细胞，树突状细胞，嗜曙红细胞和T细胞组成的与临床前效果模型类似的炎症浸出物。对未转导的自体的PCA目标细胞，100％的病人显示出DTH反应。术前血清PSA的中值是28.85(浮动范围6.7-7.5)并且在第一次接种后血清PSA的中值是0.65(浮动范围0.1-30.4)。通过超灵敏的血清PSA检测，手术和接种后的8人中有6人病情稳定地改善平均追踪调查时间24个月。该研究证实了体内GM-CSF基因转导的PCA疫苗的可行性，门诊安全性和生物活性。
实施例3异体前列腺的GVAX疫苗试验30个病人参加了第二次自体前列腺的GVAX疫苗试验。每位病人年龄都大于18岁，并且手术之后通过两次连续的PSA水平的异常评价确定为愈来愈严重的，有微小转移的前列腺癌，没有证据表明有可以检测到转移的疾病或之前有过激素治疗，并且在治疗的开始PSA的最小的基线浓度大于1.0ng/ml。异体的前列腺癌细胞系由两种相同细胞剂量的异体前列腺癌细胞系(LNCaP和PC-3)组成，它们被遗传修饰，每106个细胞每24小时分泌148-639ng的GM-CSF。或者，疫苗由3种不同的经辐射处理的自体的前列腺癌细胞系(LNCaP，PC-3和DU145)组成，它们被遗传修饰，每106个细胞每24小时分泌200-300ng的GM-CSF。每一小瓶制备的疫苗都在甘油和人血清白蛋白中，可以直接用于注射。每种细胞系的接种剂量如下面的表3所示。
表3接种时间表

在指定的接种日，病人接受注射总共1.2×108个细胞(每个细胞系6×107个细胞)，分4次皮内注射，每次1.0cc(每个细胞系注射2次)。每次注射都是皮内的。第0天后的接种日，注射位点被轮流。总剂量1.2×108个细胞，分成4次，每隔一周注射一次，共8周。
在治疗周期内，对局部和系统反应的评价在接种日进行(第1、2、3、4、5、6、7、8周)。从第一次接种开始，PSA的测量在4个月内每月进行一次，在研究的第二部分，两年内每4个月进行一次。如果临床需要，PSA水平评价频率则高于每4个月一次。用于PCR检测的血液样品的采集在第一次接种之前。第一部分的最后一次检查在最后一次疫苗接种之后(第8周)。对接受至少一次接种的登记的病人进行长期的PSA检查的跟踪调查。从那时以后，他们进行每年一次的体检和临床评价，如果临床需要，频率可以更高，直至病人死亡或异体前列腺癌细胞系疫苗被FDA批准。
实施例4前列腺肿瘤相关抗原的鉴定A.血清的制备研究用的血清由在自体或异体前列腺疫苗GVAX试验中接种前2小时和最后一次接种后2周取病人的血液制备。
B.细胞裂解液的制备源自前列腺基质、前列腺上皮细胞、前列腺平滑肌以及肺成纤维细胞的原代细胞系购自Clontenics(San Diego，CA)并且培养在SCGM、PrEGM、SmGM和GGM-2培养基中(Clontenics，San Diego，CA)。细胞被培养在含10％的胎牛血清，青霉素/链霉素和谷氨酰胺的DMEM+F12培养基中(JHR bioscience，Lenexa，KS)。当细胞密度至覆盖T-175培养瓶(Becton，Dickin&Company，Franklin Lakes，NJ)的80％时，细胞用PBS冲洗2遍后加入维尔烯(Gibco BRL，Grand Island，NY)孵育10-30分钟以使细胞与培养瓶分离。然后收集细胞，用台式离心机(CS-6R，Beckman，Palo Alto，CA)1,000rpm离心10分钟。细胞用PBS洗涤3遍。对于非贴壁细胞(Jurkat and外周血细胞)，细胞被收集，离心，并且用PBS洗涤3次。洗涤之后，2×107个细胞加入1ml裂解缓冲液(10mM Tris pH 7.4，1mMEDTA，10％甘油，1％NP40，1mM PMSF，和1％的cocktail set III蛋白酶抑制剂(Cat.539134，Calbiochem，San Diego，CA))，冰孵育1小时。不溶的细胞碎片用台式离心机4℃离心30分钟除去。取上清液，用BCA法(Pierce，Rockford，IL)测量蛋白浓度。
C.免疫印迹法细胞裂解液中的指明数量的蛋白(25-35μg/泳道)或纯化的PSA(Calbiochem，San Diego，CA)或癌症相关标志物通过4-20％的梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Norvex，San Diego，CA)分离，然后在25mV恒压，2-3小时条件下，通过电转移至印迹转移仪器(Xcell IIBlot Module，Norvex，San Diego，CA)中的硝化纤维素膜(Norvex，San Diego，CA)。转膜后，硝化纤维素膜在封闭溶液(含10％的脱脂牛奶，0.05％Tween 20的PBS)中4℃封闭过夜。封闭过夜之后，膜用病人的血清(1∶1000稀释在含0.1％的Tween 20的PBS中)室温下孵育2小时，然后用含0.1％的Tween20的PBS洗涤5次。次黄嘌呤磷酸核糖转移酶偶联(HPRT-conjugated)的山羊抗人IgM+G+A(Zymed，South San Francisco，CA，1∶3000稀释在含0.1％的Tween 20的PBS中)带膜孵育1小时，然后用含0.1％的Tween 20的PBS洗涤6次。结果是通过化学发光法(例如，使用ECL WesternBlotting System，Amersham Life Science，Arlington Heights，IL)得到。
实施例5在自体的GVAX的临床试验中的前列腺肿瘤相关抗原的鉴定在一项研究中，肿瘤相关抗原的鉴定如下。为制备自体的前列腺GVAX疫苗，从8位病人身上取下前列腺肿瘤以产生原代前列腺癌细胞系。含有人类GM-CSF的逆转录病毒载体被导入这些原代细胞系以产生分泌GM-CSF的细胞。病人被每2周通过皮内注射这些以GM-CSF表达自体的原代前列腺癌细胞为形式的疫苗。1-3号病人接受注射6次，每次107个细胞；4号接受注射5次；每次107个细胞；5号和7号病人接受注射6次，每次5×107个细胞；7号病人接受注射3次，每次107个细胞；8号病人接受注射3次，5×107个细胞。后面的研究用的血清在接种前2小时(作为接种前)和最后一次接种后2周(作为接种后)取病人的血液制备。
在自体的前列腺GVAX疫苗试验中，最后一次接种完成后，通过LNCaP前列腺癌细胞系的免疫印迹分析，特异性抗原被病人血清中的抗体识别。25μg的LNCaP裂解液在4-20％的梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，之后转移到硝化纤维素膜。1∶1000至1∶3000范围内稀释在含0.05％的Tween 20的PBS中的病人的血清被作为免疫印迹分析中的一抗。1∶3000稀释的过氧化物酶偶联的多克隆的羊抗人IgG+M+A被作为二抗。结果用ELC化学发光试剂盒得到。在自体的GVAX疫苗试验中，通过比较源自接种前和接种后的血清，新发现了多种LNCaP细胞表达的与PSA无关的抗原，包括一个“泛”肿瘤相关抗原，这在WO/0026676中有进一步的描述。
实施例6在异体的GVAX的临床试验中的前列腺肿瘤相关抗原的鉴定在接受异体的GVAX疫苗治疗的病人的血清中也发现了新的抗原。在异体的前列腺GVAX疫苗试验中，21位病人被接种1.2×107个细胞的GM-CSF表达LNCaP(LNCaP-GM)细胞和1.2×107个细胞的GM-CSF表达(PC-3/GM)细胞，每周一次，共8周。血清由在接种GVAX前2小时(作为“接种前”)和最后一次接种GVAX后2周(作为“接种后”)取病人的血液制备。选择来自几位接受异体的GVAX疫苗治疗的病人的血清用于进一步的研究。这些数据被概括在下面的表4中表4


在大多数病例中观察到针对LNCaP和/或PC3细胞的体液免疫应答。抗PC3和抗LNCaP的抗体应答的产生，和观察到接受异体的GVAX疫苗治疗的21位病人中的15人的PSA水平下降，显示出体液免疫应答在异体的GVAX疫苗的背景下，对前列腺癌发挥了治疗的作用。接受完异体的GVAX疫苗治疗的病人的血清被用于对PSA的抗体检测。3μg的PSA被用4-20％的梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶检测，然后用301，305，314，307和312号病人的血清进行免疫印迹分析。结果显示PSA不能识别这些血清，意味着PSA不是引起针对抑制肿瘤生长的相应的免疫应答的原因。为了进一步分析这些新的抗原，使用来自许多病人的接种前和接种后的血清，进行了免疫印迹分析。下列一组肿瘤细胞系被检测LNCaP(前列腺)；PC-3(前列腺)；A549(肺)；LS-174T(结肠)；MCF7(乳腺)；DU-145(前列腺)；KLEB(卵巢)；Jurkat(白血病)以及MDA-MB-435S(乳腺)。组织/细胞特异性表达的大约278KD的抗原和大约160KD的抗原被通过SDS-PAGE测定，然后用这组肿瘤细胞系和正常的原代前列腺细胞系分析。结果显示，大约160KD的抗原在PC-3癌细胞和正常的前列腺上皮细胞有表达，在A549(肺肿瘤)和MCF7(乳腺肿瘤)细胞有弱表达，但在其它种类的肿瘤细胞以及前列腺基质和平滑肌细胞都没有表达。这些结果显示，大约160KD的抗原(p160)是前列腺特异性抗原(数据省略)。在相同的试验中，分子量大约278KD的肿瘤相关抗原被通过SDS-PAGE测定(p278)，结果发现在前列腺癌细胞系，PC-3和DU-145，以及A549肺肿瘤细胞有表达。P278还显示在正常的前列腺上皮细胞有表达，但在前列腺基质和平滑肌中没有表达。这些结果有力地显示，p278至少是一个前列腺特异性的抗原和肿瘤相关抗原。事实是，存在针对正常前列腺特异性的抗原，如p278和p160的抗体应答，说明异体的GVAX疫苗能够打破免疫耐受性，并且引起免疫系统通过识别肿瘤相关抗原建立起抗击肿瘤的反应。
实施例7在异体的GVAX临床试验的第二阶段的前列腺肿瘤相关抗原的鉴定在进一步的临床试验中，其它新的抗原通过异体的GVAX疫苗治疗的病人的血清被发现。在这个前列腺GVAX疫苗试验中，24名患有转移性骨肿瘤的激素难治性病人接受了首量5亿个细胞的GM-CSF表达LNCaP细胞和GM-CSF表达PC-3细胞，之后注射12次强化剂量(每次1亿个细胞)，间隔2周一次，并且有10位病人接受了相同的首量，强化剂量则更高，每次3亿个细胞。血清由在接种GVAX前2小时(作为“接种前”)和最后一次接种GVAX后2周(作为“接种后”)取病人的血液制备。来自病人的血清被进一步研究。通过SDS-PAGE和免疫印迹法在接种后识别的抗原被概括在下面的表5中表5.通过SDS-PAGE和免疫印迹法在接种后识别的抗原


在大多数病例中观察到对LNCaP和/或PC3的体液免疫。接种后的血清不含任何抗PSA的抗体。804号病人的全部的PSA反应被观察到(图2)。804号病人和PC-3或LNCaP的细胞类型没有HLAI类型别匹配。
为分析804号病人对GVAX治疗的体液反应，该病人的接种前和接种后的血清被用于免疫印迹分析。结果发现接种后的血清识别一个在电泳迁移的大约278KD处的存在于PC-3细胞但在LNCaP细胞中没有的抗原(图3)。这个大约278KD的抗原在原代的正常的前列腺上皮细胞，前列腺基质，和前列腺平滑肌(PrEC，PrSC，和PrSmC)细胞系中也被检测到，但是与在PC-3细胞中相比水平较低(图4)。该抗原在非小肺腺癌细胞系，H157中过表达(图5)。
将PC-3细胞裂解液进行二维凝胶电泳，水平尺度上的pH梯度是3.5-10。大约278KD的抗原的电泳迁移由印迹分析确定。相应的条带被切下进行基体辅助激光解吸电离质谱法蛋白测序。大约278KD的抗原的蛋白序列与Genbank中登录号是NP 001448的一个肌动蛋白结合蛋白β-Filamin的序列相吻合。
用购自Chemicon International(Temecula，CA)的兔抗人β-Filamin的单克隆抗体做免疫印迹分析，结果显示在PC-3细胞中有一个大约278KD的蛋白表达，但在LNCaP细胞中没有(图6)。
实施例8用表达β-Filamin和GM-CSF的异体细胞接种逆转录病毒载体是用WO/0026676中描述的标准技术，通过插入GM-CSF的编码序列和Genbank中登录号NM 001457中显示的β-Filamin的编码区制备的。PC-3和LNCaP细胞被转导和遗传修饰以表达β-Filamin，并且PC-3细胞被遗传改变从而比未转导的PC-3细胞表达更高水平的β-Filamin。被转导的PC-3和LNCaP细胞以1∶1比例混合以组成细胞疫苗并且细胞被辐射处理以使之增殖无能力。疫苗中每种细胞2亿个，每106个细胞每天分泌大约100ng的GM-CSF。
被选出的病人患有前列腺癌，上升的PSA，美国东岸癌症临床研究合作组织行为能力状况得分0-1，肝脏正常，肾脏及骨髓发挥作用，以前没有做过化疗或基因治疗，没有活跃的自体免疫疾病，没有伴随的前列腺癌治疗，并且骨质扫描时肿瘤迁移为阳性，但没有需要麻醉止痛剂的骨疼痛。A组病人用疫苗A治疗，B组病人用疫苗B治疗。对于每一组，首量是5亿个细胞，之后是12次强化剂量，每次1亿或2亿个细胞，每次间隔2周。血清由首次接种前2小时和最后一次接种后2周从每一位病人的取血制备。
通过记录骨质扫描，骨密度评价，全身断层扫描，PSA水平的测量，以及存活对治疗的应答进行监控。
序列简要说明表6.序列简表(以列表方式提供)

为了明晰和便于理解，尽管在前文的发明已经通过图解和举例的方式阐述一些细节，对于所属领域的技术人员，很显然，可以进行一些变通和修改。通过一系列的试验，本发明的各个发明都已涉及，其中一些通过依照非限制的实施例进行描述。因此，这些描述和例子不应被视为对本发明范围的限制，本发明的范围见所附的权利要求。
序列表<110>细胞基因系统有限公司<120>用于治疗前列腺癌的细胞因子表达细胞疫苗<130>3802-104-27PCT<140>
<141>
<150>10/937,658<151>2004-09-10<160>5<170>PatentIn Ver.3.3<210>1<211>2027<212>DNA<213>人类<400>1tgtggctgca gagcctgctg ctcttgggca ctgtggcctg cagcatctct gcacccgccc60gctcgcccag ccccagcacg cagccctggg agcatgtgaa tgccatccag gaggcccggc120gtctcctgaa cctgagtaga gacactgctg ctgagatggt aagtgagaga atgtgggcct180gtgcctaggc cacccagctg gcccctgact ggccacgcct gtcagcttga taacatgaca240ttttcctttt ctacagaatg aaacagtaga agtcatctca gaaatgtttg acctccaggt300aagatgcttc tctctgacat agctttccag aagcccctgc cctggggtgg aggtggggac360tccattttag atggcaccac acagggttgt ccactttctc tccagtcagc tggctgcagg420aggagggggt agcaactggg tgctcaagag gctgctggcc gtgcccctat ggcagtcaca480tgagctcctt tatcagctga gcggccatgg gcagacctag cattcaatgg ccaggagtca540ccaggggaca ggtggtaaag tgggggtcac ttcatgagac aggagctgtg ggtttggggc600gctcactgtg ccccgagacc aagtcctgtt gagacagtgc tgactacaga gaggcacaga660ggggtttcag gaacaaccct tgcccaccca gcaggtccag gtgaggcccc acccccctct720ccctgaatga tggggtgaga gtcacctcct tccctaaggc tgggctcctc tccaggtgcc780gctgagggtg gcctgggcgg ggcagtgaga agggcaggtt cgtgcctgcc atggacaggg840cagggtctat gactggaccc agcctgtgcc cctcccaagc cctactcctg ggggctgggg900gcagcagcaa aaaggagtgg tggagagttc ttgtaccact gtgggcactt ggccactgct960caccgacgaa cgacattttc cacaggagcc gacctgccta cagacccgcc tggagctgta1020caagcagggc ctgcggggca gcctcaccaa gctcaagggc cccttgacca tgatggccag1080ccactacaag cagcactgcc ctccaacccc ggtgagtgcc tacggcaggg cctccagcag1140gaatgtctta atctaggggg tggggtcgac atggggagag atctatggct gtggctgttc1200aggaccccag ggggtttctg tgccaacagt tatgtaatga ttagccctcc agagaggagg1260cagacagccc atttcatccc aaggagtcag agccacagag cgctgaagcc cacagtgctc1320cccagcagga gctgctccta tcctggtcat tattgtcatt atggttaatg aggtcagagg1380tgagggcaaa cccaaggaaa cttggggcct gcccaaggcc cagaggaagt gcccaggccc1440aagtgccacc ttctggcagg actttcctct ggccccacat ggggtgcttg aattgcagag1500gatcaaggaa ggggggctac ttggaatgga caaggacctc aggcactcct tcctgcggga1560agggagcaaa gtttgtggcc ttgactccac tccttctggg tgcccagaga cgacctcagc1620ccagctgccc tgctctgccc tgggaccaaa aaggcaggcg tttgactgcc cagaaggcca1680acctcaggct ggcacttaag tcaggccctt gactctggct gccactggca gagctatgca1740ctccttgggg aacacgtggg tggcagcagc gtcacctgac ccaggtcagt gggtgtgtcc1800tggagtgggc ctcctggcct ctgagttcta agaggcagta gagaaacatg ctggtgcttc1860cttcccccac gttacccact tgcctggact caagtgtttt ttatttttct ttttttaaag1920
gaaacttcct gtgcaaccca gattatcacc tttgaaagtt tcaaagagaa cctgaaggac 1980tttctgcttg tcatcccctt tgactgctgg gagccagtcc aggagtg 2027<210>2<211>435<212>DNA<213>人类<400>2atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc60cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg120cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc180tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag240cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac300tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagac tatcaccttt360gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag420ccagtccagg agtaa 435<210>3<211>144<212>PRT<213>人类<400>3Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile15 10 15Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His20 25 30Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp35 40 45Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu ValIle Ser Glu Met Phe50 55 60Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys65 70 75 80Gln Gly Leu Arg Gly Ser LeuThr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met85 90 95Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser100 105 110Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys115 120 125Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu130 135 140<210>4<211>9432<212>DNA<213>人类<400>4gccgtggctc cggtagcagc aagttcgaac cccgctcccg ctccgcttcg gttctcgctc60cttcggccct tgggcctcca aacaccagtc cccggcagct cgttgcgcat tgcgctctcc120ccgccaccag gatgccggta accgagaagg atctagctga ggacgcgcct tggaagaaga180tccagcagaa cacgttcaca cgctggtgca acgagcacct caagtgcgtg aacaaacgca240tcggcaacct gcagaccgac ctgagcgacg ggctgcggct catcgcgctg ctcgaggtgc300tcagccagaa gcgcatgtac cgcaagtacc atcagcggcc cacctttcgc cagatgcagc360tcgagaatgt gtccgtggcg ctcgagttcc tggaccgtga gagcatcaag ctcgtgtcca420tcgatagcaa agccattgtg gatgggaacc tgaagctcat cttgggtctg gtgtggacgc480
tgatcctcca ctactccatc tccatgcccg tgtgggagga tgaaggggat gatgatgcca540agaagcagac gccaaagcag aggctgctgg ggtggattca gaacaagatc ccctacttgc600ccatcaccaa ctttaaccag aactggcaag acggcaaagc cctgggagcc ctggtagaca660gctgtgctcc aggtctgtgc ccagactggg aatcctggga cccgcagaag cctgtggata720atgcacgaga agccatgcag caggcagatg actggctggg tgtcccacag gtcatcactc780ctgaagaaat cattcacccg gatgtggacg agcactcagt tatgacttac ctgtcccagt840tccccaaagc caagctcaag ccgggggctc ctctcaaacc caaactcaac ccgaagaaag900ccagggccta tggcagagga atcgagccca ctggaaacat ggtgaagcag ccagccaagt960tcactgtgga caccatcagc gccgggcaag gagacgtgat ggtgtttgtt gaggacccag1020aagggaacaa agaggaggca caagtgaccc ctgacagcga caagaacaag acatactctg1080tggagtatct gcccaaggtc accgggctac acaaagtcac agtcctcttt gcaggacagc1140acatctccaa gagcccattt gaagtgagtg ttgacaaggc ccagggagat gccagtaaag1200tcactgcaaa aggtccaggg ttggaagctg tagggaacat cgccaataag cccacctact1260ttgacatcta tacggcagga gctggtgtgg gtgacattgg tgtggaggtg gaagatcccc1320aggggaagaa caccgtggag ttgctcgtgg aagacaaagg aaaccaggtg tatcgatgtg1380tgtacaaacc catgcagcct ggccctcacg tggtcaagat cttctttgct ggggacacta1440ttcctaagag tcccttcgtt gtgcaggttg gggaagcctg caatccaaat gcctgccggg1500ccagtggccg aggcctacaa cccaaaggcg tccgtatccg ggagaccaca gatttcaagg1560ttgacaccaa agctgcagga agtggggagc tcggggtaac catgaagggt cctaagggtc1620tggaggagct ggtgaagcag aaagactttc tggatggggt ctacgcattc gagtattacc1680ccagcacccc ggggagatac agcattgcca tcacatgggg gggacaccac attccaaaga1740gcccctttga agttcaagtt ggccctgaag cgggtatgca gaaagtccgt gcttggggcc1800ctgggctcca tggtgggatt gtcgggcggt cagcggactt cgtggtagaa tccattggct1860ctgaagtggg gtctctgggg tttgccattg aaggcccctc tcaggcaaag attgagtaca1920acgaccagaa tgatggatcg tgtgatgtca aatactggcc caaggagcct ggcgaatatg1980ctgttcacat catgtgtgac gacgaagaca tcaaggacag cccgtacatg gccttcatcc2040acccagccac gggaggctac aaccctgatc tggttcgagc atacgggcca ggtttggaga2100aatctggatg cattgtcaac aacctggccg agttcactgt ggatcctaag gatgctggaa2160aagctccctt aaagatattt gctcaggatg gggaaggcca acgcattgac atccagatga2220agaaccggat ggacggcaca tatgcatgct catacacccc ggtgaaggcc atcaagcaca2280ccattgctgt ggtctgggga ggcgtgaaca tcccgcacag cccctacagg gtcaacatcg2340ggcaaggtag ccatcctcag aaggtcaaag tgtttgggcc aggtgtggag agaagtggtc2400tgaaggcaaa tgaacctaca cacttcacgg tggactgtac tgaggctggg gaaggtgatg2460tcagtgttgg cattaagtgt gatgcccggg tgttaagtga agatgaggaa gacgtggatt2520ttgacattat tcacaatgcc aatgatacgt tcacagtcaa atatgtgcct cctgctgctg2580ggcgatacac tatcaaagtt ctctttgcat ctcaggaaat ccccgccagc cctttcagag2640tcaaagttga cccttcccac gatgccagca aagtgaaggc agaaggccca gggctcagca2700aagcaggtgt ggaaaatggg aaaccgaccc acttcactgt ctacaccaag ggggctggga2760aagccccgct caacgtgcag ttcaacagcc ctcttcctgg cgatgcagtg aaggatttgg2820atatcatcga taattatgac tactctcaca cggttaaata tacacccacc caacagggca2880acatgcaggt tctggtgact tacggtggcg atcccatccc taaaagccct ttcactgtgg2940gtgttgctgc accgctggat ctgagcaaga taaaactcaa tgggctggaa aacagggtgg3000aagttgggaa ggatcaggag ttcaccgttg ataccagggg ggcaggaggc caggggaagc3060tggacgtgac aatcctcagc ccctctcgga aggtcgtgcc atgcctagtg acacctgtga3120caggccggga gaacagcacg gccaagttca tccctcggga ggaggggctg tatgctgtag3180acgtgaccta cgatggacac cctgtgcccg ggagccccta cacagtggag gcctcgctgc3240caccagatcc cagcaaggtg aaggcccacg gtcccggcct cgaaggtggt ctcgtgggca3300agcctgccga gttcaccatc gataccaaag gagctggtac tggaggtctg ggcttaacgg3360tggaaggtcc gtgcgaggcc aaaatcgagt gctccgacaa tggtgatggg acctgctccg3420tctcttacct tcccacaaaa cccggggagt acttcgtcaa catcctcttt gaagaagtcc3480acatacctgg gtctcccttc aaagctgaca ttgaaatgcc ctttgacccc tctaaagtcg3540tggcatcggg gccaggtctc gagcacggga aggtgggtga agctggcctc cttagcgtca3600actgctcgga agcgggaccg ggggccctgg gcctggaagc tgtctcggac tcgggaacaa3660aagccgaagt cagtattcag aacaacaaag atggcaccta cgcggtgacc tacgtgcccc3720tgacggccgg catgtacacg ttgaccatga agtatggtgg cgaactcgtg ccacacttcc3780ccgcccgggt caaggtggag cccgccgtgg acaccagcag gatcaaagtc tttggaccag3840gaatagaagg gaaagatgtg ttccgggaag ctaccaccga ctttacagtt gactctcggc3900cgctgaccca ggttgggggt gaccacatca aggcccacat tgccaacccc tcaggggcct3960
ccaccgagtg ctttgtcaca gacaatgcgg atgggaccta ccaggtggaa tacacaccct4020ttgagaaagg tctccatgta gtggaggtga catatgatga cgtgcctatc ccaaacagtc4080ccttcaaggt ggctgtcact gaaggctgcc agccatctag ggtgcaagcc caaggacctg4140gattgaaaga ggcctttacc aacaagccca atgtcttcac cgtggttacc agaggcgcag4200gaattggtgg gcttggcata actgttgagg gaccatcaga gtcgaagata aattgcagag4260acaacaagga tggcagctgc agtgctgagt acattccttt cgcgccgggg gattacgatg4320ttaatatcac atatggagga gcccacatcc ctggcagccc cttcagggtt cctgtgaagg4380atgttgtgga ccccagcaag gtcaagattg ccggccccgg gctgggctca ggcgtccgag4440cccgtgtcct gcagtccttc acggtggaca gcagcaaggc tggcctggct ccgctggaag4500tgagggttct gggcccacga ggcttggtgg agccagtgaa catggtggac aatggagatg4560gcacacacac agtaacctac accccatctc aggagggacc ttacatggtc tcagttaaat4620atgctgatga agagattcct cgcagtccct tcaaggtcaa ggtccttccc acatatgatg4680ccagcaaagt gactgccagt ggccccggcc ttagttccta tggtgtgcct gccagtctac4740ctgtggactt tgcaattgat gcccgagatg ccggggaagg cctgcttgct gttcaaataa4800cggaccaaga aggaaaaccc aaaagagcca ttgtccatga caataaagat ggcacgtatg4860ctgtcaccta catccccgac aagactgggc gctatatgat tggagtcacc tacgggggtg4920acgacatccc actttctcct tatcgcatcc gagccacaca gacgggtgat gccagcaagt4980gcctggccac gggtcctgga atcgcctcca ctgtgaaaac tggcgaagaa gtaggctttg5040tggttgatgc caagactgcc gggaagggta aagtgacctg cacggttctg accccagatg5100gcactgaggc cgaggccgat gtcattgaga atgaagatgg aacctatgac atcttctaca5160cagctgccaa gccgggcaca tatgtgatct atgtgcgctt cggtggtgtt gatattccta5220acagcccctt cactgtcatg gccacagatg gggaagtcac agccgtggag gaggcaccgg5280taaatgcatg tccccctgga ttcaggccct gggtgaccga agaggcctat gtcccagtga5340gtgacatgaa cggcctggga tttaagcctt ttgacctggt cattccgttt gctgtcagga5400aaggagaaat cactggagag gtccacatgc cttctgggaa gacagccaca cctgagattg5460tggacaacaa ggacggcacg gtcactgtta gatatgcccc cactgaggtc gggctccatg5520agatgcacat caaatacatg ggcagccaca tccctgagag cccactccag ttctacgtga5580actaccccaa cagtggaagt gtttctgcat acggtccagg cctcgtgtat ggagtggcca5640acaaaactgc caccttcacc atcgtcacag aggatgcagg agaaggtggt ctggacttgg5700ctattgaggg cccctcaaaa gcagaaatca gctgcattga caataaagat gggacatgca5760cagtgaccta cctgccgact ctgccaggcg actacagcat tctggtcaag tacaatgaca5820agcacatccc tggcagcccc ttcacagcca agatcacaga tgacagcagg cggtgctccc5880aggtgaagtt gggctcagcc gctgacttcc tgctcgacat cagtgagact gacctcagca5940gcctgacggc cagcattaag gccccatctg gccgagacga gccctgtctc ctgaagaggc6000tgcccaacaa ccacattggc atctccttca tcccccggga agtgggcgaa catctggtca6060gcatcaagaa aaatggcaac catgtggcca acagccccgt gtctatcatg gtggtccagt6120cggagattgg tgacgcccgc cgagccaaag tctatggccg cggcctgtca gaaggccgga6180ctttcgagat gtctgacttc atcgtggaca caagggatgc aggttatggt ggcatatcct6240tggcggtgga aggccccagc aaagtggaca tccagacgga ggacctggaa gatggcacct6300gcaaagtctc ctacttccct accgtgcctg gggtttatat cgtctccacc aaattcgctg6360acgagcacgt gcctgggagc ccatttaccg tgaagatcag tggggaggga agagtcaaag6420agagcatcac ccgcaccagt cgggccccgt ccgtggccac tgtcgggagc atttgtgacc6480tgaacctgaa aatcccagaa atcaacagca gtgatatgtc ggcccacgtc accagcccct6540ctggccgtgt gactgaggca gagattgtgc ccatggggaa gaactcacac tgcgtccggt6600ttgtgcccca ggagatgggc gtgcacacgg tcagcgtcaa gtaccgtggg cagcacgtca6660ccggcagccc cttccagttc accgtggggc cacttggtga aggaggcgcc cacaaggtgc6720gggcaggagg ccctggcctg gagagaggag aagcgggagt cccagctgag ttcagcattt6780ggacccggga agcaggcgct ggaggcctct ccatcgctgt tgagggcccc agtaaggccg6840agattacatt cgatgaccat aaaaatgggt cgtgcggtgt atcttatatt gcccaagagc6900ctggtaacta cgaggtgtcc atcaagttca atgatgagca catcccggaa agcccctacc6960tggtgccggt catcgcaccc tccgacgacg cccgccgcct cactgttatg agccttcagg7020aatcgggatt aaaagttaac cagccagcat cctttgctat aaggttgaat ggcgcaaaag7080gcaagattga tgcaaaggtg cacagcccct ctggagccgt ggaggagtgc cacgtgtctg7140agctggagcc agataagtat gctgttcgct tcatccctca tgagaatggt gtccacacca7200tcgatgtcaa gttcaatggg agccacgtgg ttggaagccc cttcaaagtg cgcgttgggg7260agcctggaca agcggggaac cctgccctgg tgtccgccta tggcacggga ctcgaagggg7320gcaccacagg tatccagtcg gaattcttta ttaacaccac ccgagcaggt ccagggacat7380tatccgtcac catcgaaggc ccatccaagg ttaaaatgga ttgccaggaa acacctgaag7440
ggtacaaagt catgtacacc cccatggctc ctggtaacta cctgatcagt gtcaaatacg7500gtgggcccaa ccacatcgtg ggcagtccct tcaaggccaa ggtgacaggc cagcgtctag7560ttagccctgg ctcagccaac gagacctcat ccatcctggt ggagtcagtg accaggtcgt7620ctacagagac ctgctatagc gccattccca aggcatcctc ggacgccagc aaggtgacct7680ctaagggggc agggctctca aaggcctttg tgggccagaa gagttccttc ctggtggact7740gcagcaaagc tggctccaac atgctgctga tcggggtcca tgggcccacc accccctgcg7800aggaggtctc catgaagcat gtaggcaacc agcaatacaa cgtcacatac gtcgtcaagg7860agaggggcga ttatgtgctg gctgtgaagt ggggggagga acacatccct ggcagccctt7920ttcatgtcac agtgccttaa aacagttttc tcaaatcctg gagagagttc ttgtggttgc7980ttttgttgct tgtttgtaat tcattttata caaagccctc cagcctgttt gtggggctga8040aaccccatcc ctaaaatatt gctgttgtaa aatgccttca gaaataagtc ctagactgga8100ctcttgaggg acatattgga gaatcttaag aaatgcaagc ttgttcaggg ggctgagaag8160atcctgagta cactaggtgc aaaccagaac tcttggtgga acagaccagc cactgcagca8220gacagaccag gaacacaatg agactgacat ttcaaaaaaa caaaactggc tagcctgagc8280tgctggttca ctcttcagca tttatgaaac aaggctaggg gaagatgggc agagaaaaag8340gggacaccta gtttggttgt catttggcaa aggagatgac ttaaaatccg cttaatctct8400tccagtgtcc gtgttaatgt atttggctat tagatcacta gcactgcttt accgctcctc8460atcgccaaca cccccatgct ctgtggcctt cttacacttc tcagagggca gagtggcagc8520cgggcaccct acagaaactc agagggcaga gtggcagcca ggcccacatg tctctcaagt8580acctgtcccc tcgctctggt gattatttct tgcagaatca ccacacgaga ccatcccggc8640agtcatggtt ttgctttagt tttccaagtc cgtttcagtc ccttccttgg tctgaagaaa8700ttctgcagtg gcgagcagtt tcccacttgc caaagatccc ttttaaccaa cactagccct8760tgtttttaac acacgctcca gcccttcatc agcctgggca gtcttaccaa aatgtttaaa8820gtgatctcag aggggcccat ggattaacgc cctcatccca aggtccgtcc catgacataa8880cactccacac ccgccccagc caacttcatg ggtcactttt tctggaaaat aatgatctgt8940acagacagga cagaatgaaa ctcctgcggc tctttggcct gaaagttggg aatggttggg9000ggagagaagg gcagcagctt attggtggtc ttttcaccat tggcagaaac agtgagagct9060gtgtggtgca gaaatccaga aatgaggtgt agggaatttt gcctgccttc ctgcagacct9120gagctggctt tggaatgagg ttaaagtgtc agggacgttg cctgagccca aatgtgtagt9180gtggtctggg caggcagacc tttaggtttt gctgcttagt cctgaggaag tggccactct9240tgtggcaggt gtagtatctg gggcgagtgt tgggggtaaa agcccaccct acagaaagtg9300gaacagcccg gacctgatgt gaaaggacca cgggtgttgt aagctgggac cggaaccaaa9360ctggaatcaa acgcgactgt aaattgtatc ttataactta ttaaataaaa cattgctccg9420taaaaaaaaa aa9432<210>5<211>2602<212>PRT<213>人类<400>5Met Pro Val Thr Glu Lys Asp Leu Ala Glu Asp Ala Pro Trp Lys Lys1 5 10 15Ile Gln Gln Asn Thr Phe Thr Arg Trp Cys Asn Glu His Leu Lys Cys20 25 30val Asn Lys Arg Ile Gly Asn Leu Gln Thr Asp Leu Ser Asp Gly Leu35 40 45Arg Leu Ile Ala Leu Leu Glu Val Leu Ser Gln Lys Arg Met Tyr Arg50 55 60Lys Tyr His Gln Arg Pro Thr Phe Arg Gln Met Gln Leu Glu Asn Val65 70 75 80Ser Val Ala Leu Glu Phe Leu Asp Arg Glu Ser Ile Lys Leu Val Ser85 90 95Ile Asp Ser Lys Ala Ile Val Asp Gly Asn Leu Lys Leu Ile Leu Gly100 105 110Leu val Trp Thr Leu Ile Leu His Tyr Ser Ile Ser Met Pro Val Trp115 120 125
Glu Asp Glu Gly Asp Asp Asp Ala Lys Lys Gln Thr Pro Lys Gln Arg130 135 140Leu Leu Gly Trp Ile Gln Asn Lys Ile Pro Tyr Leu Pro Ile Thr Asn145 150 155 160Phe Asn Gln Asn Trp Gln Asp Gly Lys Ala Leu Gly Ala Leu Val Asp165 170 175Ser Cys Ala Pro Gly Leu Cys Pro Asp Trp Glu Ser Trp Asp Pro Gln180 185 190Lys Pro Val Asp Asn Ala Arg Glu Ala Met Gln Gln Ala Asp Asp Trp195 200 205Leu Gly Val Pro Gln Val Ile Thr Pro Glu Glu Ile Ile His Pro Asp210 215 220Val Asp Glu His Ser Val Met Thr Tyr Leu Ser Gln Phe Pro Lys Ala225 230 235 240Lys Leu Lys Pro Gly Ala Pro Leu Lys Pro Lys Leu Asn Pro Lys Lys245 250 255Ala Arg Ala Tyr Gly Arg Gly Ile Glu Pro Thr Gly Asn Met Val Lys260 265 270Gln Pro Ala Lys Phe Thr Val Asp Thr Ile Ser Ala Gly Gln Gly Asp275 280 285Val Met Val Phe Val Glu Asp Pro Glu Gly Asn Lys Glu Glu Ala Gln290 295 300Val Thr Pro Asp Ser Asp Lys Asn Lys Thr Tyr Ser Val Glu Tyr Leu305 310 315 320Pro Lys Val Thr Gly Leu His Lys Val Thr Val Leu Phe Ala Gly Gln325 330 335His Ile Ser Lys Ser Pro Phe Glu Val Ser Val Asp Lys Ala Gln Gly340 345 350Asp Ala Ser Lys val Thr Ala Lys Gly Pro Gly Leu Glu Ala Val Gly355 360 365Asn Ile Ala Asn Lys Pro Thr Tyr Phe Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Ala370 375 380Gly Val Gly Asp Ile Gly Val Glu Val Glu Asp Pro Gln Gly Lys Asn385 390 395 400Thr Val Glu Leu Leu Val Glu Asp Lys Gly Asn Gln Val Tyr Arg Cys405 410 415Val Tyr Lys Pro Met Gln Pro Gly Pro His Val Val Lys Ile Phe Phe420 425 430Ala Gly Asp Thr Ile Pro Lys Ser Pro Phe val Val Gln Val Gly Glu435 440 445Ala Cys Asn Pro Asn Ala Cys Arg Ala Ser Gly Arg Gly Leu Gln Pro450 455 460Lys Gly Val Arg Ile Arg Glu Thr Thr Asp Phe Lys Val Asp Thr Lys465 470 475 480Ala Ala Gly Ser Gly Glu Leu Gly Val Thr Met Lys Gly Pro Lys Gly485 490 495Leu Glu Glu Leu Val Lys Gln Lys Asp Phe Leu Asp Gly Val Tyr Ala500 505 510Phe Glu Tyr Tyr Pro Ser Thr Pro Gly Arg Tyr Ser Ile Ala Ile Thr515 520 525Trp Gly Gly His His Ile Pro Lys Ser Pro Phe Glu Val Gln Val Gly530 535 540Pro Glu Ala Gly Met Gln Lys Val Arg Ala Trp Gly Pro Gly Leu His545 550 555 560Gly Gly Ile Val Gly Arg Ser Ala Asp Phe Val Val Glu Ser Ile Gly565 570 575Ser Glu Val Gly Ser Leu Gly Phe Ala Ile Glu Gly Pro Ser Gln Ala580 585 590
Lys Ile Glu Tyr Asn Asp Gln Asn Asp Gly Ser Cys Asp Val Lys Tyr595 600 605Trp Pro Lys Glu Pro Gly Glu Tyr Ala Val His Ile Met Cys Asp Asp610 615 620Glu Asp Ile Lys Asp Ser Pro Tyr Met Ala Phe Ile His Pro Ala Thr625 630 635 640Gly Gly Tyr Asn Pro Asp Leu Val Arg Ala Tyr Gly Pro Gly Leu Glu645 650 655Lys Ser Gly Cys Ile Val Asn Asn Leu Ala Glu Phe Thr Val Asp Pro660 665 670Lys Asp Ala Gly Lys Ala Pro Leu Lys Ile Phe Ala Gln Asp Gly Glu675 680 685Gly Gln Arg Ile Asp Ile Gln Met Lys Asn Arg Met Asp Gly Thr Tyr690 695 700Ala Cys Ser Tyr Thr Pro Val Lys Ala Ile Lys His Thr Ile Ala Val705 710 715 720Val Trp Gly Gly Val Asn Ile Pro His Ser Pro Tyr Arg Val Asn Ile725 730 735Gly Gln Gly Ser His Pro Gln Lys Val Lys Val Phe Gly Pro Gly Val740 745 750Glu Arg Ser Gly Leu Lys Ala Asn Glu Pro Thr His Phe Thr Val Asp755 760 765Cys Thr Glu Ala Gly Glu Gly Asp Val Ser Val Gly Ile Lys Cys Asp770 775 780Ala Arg Val Leu Ser Glu Asp Glu Glu Asp Val Asp Phe Asp Ile Ile785 790 795 800His Asn Ala Asn Asp Thr Phe Thr Val Lys Tyr Val Pro Pro Ala Ala805 810 815Gly Arg Tyr Thr Ile Lys Val Leu Phe Ala Ser Gln Glu Ile Pro Ala820 825 830Ser Pro Phe Arg Val Lys Val Asp Pro Ser His Asp Ala Ser Lys Val835 840 845Lys Ala Glu Gly Pro Gly Leu Ser Lys Ala Gly Val Glu Asn Gly Lys850 855 860Pro Thr His Phe Thr Val Tyr Thr Lys Gly Ala Gly Lys Ala Pro Leu865 870 875 880Asn Val Gln Phe Asn Ser Pro Leu Pro Gly Asp Ala Val Lys Asp Leu885 890 895Asp Ile Ile Asp Asn Tyr Asp Tyr Ser His Thr Val Lys Tyr Thr Pro900 905 910Thr Gln Gln Gly Asn Met Gln Val Leu val Thr Tyr Gly Gly Asp Pro915 920 925Ile Pro Lys Ser Pro Phe Thr Val Gly Val Ala Ala Pro Leu Asp Leu930 935 940Ser Lys Ile Lys Leu Asn Gly Leu Glu Asn Arg Val Glu Val Gly Lys945 950 955 960Asp Gln Glu Phe Thr Val Asp Thr Arg Gly Ala Gly Gly Gln Gly Lys965 970 975Leu Asp Val Thr Ile Leu Ser Pro Ser Arg Lys Val Val Pro Cys Leu980 985 990Val Thr Pro Val Thr Gly Arg Glu Asn Ser Thr Ala Lys Phe Ile Pro995 10001005Arg Glu Glu Gly Leu Tyr Ala Val Asp Val Thr Tyr Asp Gly His Pro101010151020Val Pro Gly Ser Pro Tyr Thr Val Glu Ala Ser Leu Pro Pro Asp Pro1025 103010351040Ser Lys Val Lys Ala His Gly Pro Gly Leu Glu Gly Gly Leu Val Gly104510501055
Lys Pro Ala Glu Phe Thr Ile Asp Thr Lys Gly Ala Gly Thr Gly Gly106010651070Leu Gly Leu Thr Val Glu Gly Pro Cys Glu Ala Lys Ile Glu Cys Ser107510801085Asp Asn Gly Asp Gly Thr Cys Ser Val Ser Tyr Leu Pro Thr Lys Pro109010951100Gly Glu Tyr Phe Val Asn Ile Leu Phe Glu Glu Val His Ile Pro Gly1105111011151120Ser Pro Phe Lys Ala Asp Ile Glu Met Pro Phe Asp Pro Ser Lys Val112511301135Val Ala Ser Gly Pro Gly Leu Glu His Gly Lys Val Gly Glu Ala Gly114011451150Leu Leu Ser Val Asn Cys Ser Glu Ala Gly Pro Gly Ala Leu Gly Leu115511601165Glu Ala Val Ser Asp Ser Gly Thr Lys Ala Glu Val Ser Ile Gln Asn117011751180Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Ala Val Thr Tyr Val Pro Leu Thr Ala Gly118511901195 1200Met Tyr Thr Leu Thr Met Lys Tyr Gly Gly Glu Leu Val Pro His Phe120512101215Pro Ala Arg Val Lys Val Glu Pro Ala Val Asp Thr Ser Arg Ile Lys122012251230Val Phe Gly Pro Gly Ile Glu Gly Lys Asp Val Phe Arg Glu Ala Thr123512401245Thr Asp Phe Thr Val Asp Ser Arg Pro Leu Thr Gln Val Gly Gly Asp125012551260His Ile Lys Ala His Ile Ala Asn Pro Ser Gly Ala Ser Thr Glu Cys1265127012751280Phe Val Thr Asp Asn Ala Asp Gly Thr Tyr Gln Val Glu Tyr Thr Pro128512901295Phe Glu Lys Gly Leu His Val Val Glu Val Thr Tyr Asp Asp Val Pro130013051310Ile Pro Asn Ser Pro Phe Lys Val Ala Val Thr Glu Gly Cys Gln Pro131513201325Ser Arg Val Gln Ala Gln Gly Pro Gly Leu Lys Glu Ala Phe Thr Asn133013351340Lys Pro Asn Val Phe Thr Val val Thr Arg Gly Ala Gly Ile Gly Gly134513501355 1360Leu Gly Ile Thr Val Glu Gly Pro Ser Glu Ser Lys Ile Asn Cys Arg136513701375Asp Asn Lys Asp Gly Ser Cys Ser Ala Glu Tyr Ile Pro Phe Ala Pro138013851390Gly Asp Tyr Asp Val Asn Ile Thr Tyr Gly Gly Ala His Ile Pro Gly139514001405Ser Pro Phe Arg Val Pro Val Lys Asp Val Val Asp Pro Ser Lys Val141014151420Lys Ile Ala Gly Pro Gly Leu Gly Ser Gly Val Arg Ala Arg Val Leu142514301435 1440Gln Ser Phe Thr Val Asp Ser Ser Lys Ala Gly Leu Ala Pro Leu Glu144514501455Val Arg Val Leu Gly Pro Arg Gly Leu Val Glu Pro Val Asn Met Val146014651470Asp Asn Gly Asp Gly Thr His Thr Val Thr Tyr Thr Pro Ser Gln Glu147514801485Gly Pro Tyr Met Val Ser Val Lys Tyr Ala Asp Glu Glu Ile Pro Arg149014951500Ser Pro Phe Lys Val Lys Val Leu Pro Thr Tyr Asp Ala Ser Lys Val150515101515 1520
Thr Ala Ser Gly Pro Gly Leu SerSer Tyr Gly Val Pro Ala Ser Leu152515301535Pro Val Asp Phe Ala Ile Asp Ala Arg Asp Ala Gly Glu Gly Leu Leu154015451550Ala Val Gln Ile Thr Asp Gln Glu Gly Lys Pro Lys Arg Ala Ile Val155515601565His Asp Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Ala Val Thr Tyr Ile Pro Asp Lys157015751580Thr Gly Arg Tyr Met Ile Gly Val Thr Tyr Gly Gly Asp Asp Ile Pro158515901595 1600Leu Ser Pro Tyr Arg Ile Arg Ala Thr Gln Thr Gly Asp Ala Ser Lys160516101615Cys Leu Ala Thr Gly Pro Gly Ile Ala Ser Thr Val Lys Thr Gly Glu162016251630Glu Val Gly Phe Val Val Asp Ala Lys Thr Ala Gly Lys Gly Lys Val163516401645Thr Cys Thr Val Leu Thr Pro Asp Gly Thr Glu Ala Glu Ala Asp Val165016551660Ile Glu Asn Glu Asp Gly Thr Tyr Asp Ile Phe Tyr Thr Ala Ala Lys166516701675 1680Pro Gly Thr Tyr Val Ile Tyr Val Arg Phe Gly Gly Val Asp Ile Pro168516901695Asn Ser Pro Phe Thr Val Met Ala Thr Asp Gly Glu Val Thr Ala Val170017051710Glu Glu Ala Pro Val Asn Ala Cys Pro Pro Gly Phe Arg Pro Trp Val171517201725Thr Glu Glu Ala Tyr Val Pro Val Ser Asp Met Asn Gly Leu Gly Phe173017351740Lys Pro Phe Asp Leu Val Ile Pro Phe Ala Val Arg Lys Gly Glu Ile174517501755 1760Thr Gly Glu Val His Met Pro Ser Gly Lys Thr Ala Thr Pro Glu Ile176517701775Val Asp Asn Lys Asp Gly Thr Val Thr Val Arg Tyr Ala Pro Thr Glu178017851790Val Gly Leu His Glu Met His Ile Lys Tyr Met Gly Ser His Ile Pro179518001805Glu Ser Pro Leu Gln Phe Tyr Val Asn Tyr Pro Asn Ser Gly Ser Val181018151820Ser Ala Tyr Gly Pro Gly Leu Val Tyr Gly Val Ala Asn Lys Thr Ala182518301835 1840Thr Phe Thr Ile Val Thr Glu Asp Ala Gly Glu Gly Gly Leu Asp Leu184518501855Ala Ile Glu Gly Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ser Cys Ile Asp Asn Lys186018651870Asp Gly Thr Cys Thr Val Thr Tyr Leu Pro Thr Leu Pro Gly Asp Tyr187518801885Ser Ile Leu Val Lys Tyr Asn Asp Lys His Ile Pro Gly Ser Pro Phe189018951900Thr Ala Lys Ile Thr Asp Asp Ser Arg Arg Cys Ser Gln Val Lys Leu190519101915 1920Gly Ser Ala Ala Asp Phe Leu Leu Asp Ile Ser Glu Thr Asp Leu Ser192519301935Ser Leu Thr Ala Ser Ile Lys Ala Pro Ser Gly Arg Asp Glu Pro Cys194019451950Leu Leu Lys Arg Leu Pro Asn Asn His Ile Gly Ile Ser Phe Ile Pro195519601965Arg Glu Val Gly Glu His Leu Val Ser Ile Lys Lys Asn Gly Asn His197019751980
Val Ala Asn Ser Pro Val Ser Ile Met Val Val Gln Ser Glu Ile Gly198519901995 2000Asp Ala Arg Arg Ala Lys Val Tyr Gly Arg Gly Leu Ser Glu Gly Arg200520102015Thr Phe Glu Met Ser Asp Phe Ile Val Asp Thr Arg Asp Ala Gly Tyr202020252030Gly Gly Ile Ser Leu Ala Val Glu Gly Pro Ser Lys Val Asp Ile Gln203520402045Thr Glu Asp Leu Glu Asp Gly Thr Cys Lys Val Ser Tyr Phe Pro Thr205020552060Val Pro Gly Val Tyr Ile Val Ser Thr Lys Phe Ala Asp Glu His Val206520702075 2080Pro Gly Ser Pro Phe Thr Val Lys Ile Ser Gly Glu Gly Arg Val Lys208520902095Glu Ser Ile Thr Arg Thr Ser Arg Ala Pro Ser Val Ala Thr Val Gly210021052110Ser Ile Cys Asp Leu Asn Leu Lys Ile Pro Glu Ile Asn Ser Ser Asp211521202125Met Ser Ala His Val Thr Ser Pro Ser Gly Arg Val Thr Glu Ala Glu213021352140Ile Val Pro Met Gly Lys Asn Ser His Cys Val Arg Phe Val Pro Gln214521502155 2160Glu Met Gly Val His Thr Val Ser Val Lys Tyr Arg Gly Gln His Val216521702175Thr Gly Ser Pro Phe Gln Phe Thr Val Gly Pro Leu Gly Glu Gly Gly218021852190Ala His Lys Val Arg Ala Gly Gly Pro Gly Leu Glu Arg Gly Glu Ala219522002205Gly Val Pro Ala Glu Phe Ser Ile Trp Thr Arg Glu Ala Gly Ala Gly221022152220Gly Leu Ser Ile Ala Val Glu Gly Pro Ser Lys Ala Glu Ile Thr Phe222522302235 2240Asp Asp His Lys Asn Gly Ser Cys Gly Val Ser Tyr Ile Ala Gln Glu224522502255Pro Gly Asn Tyr Glu Val Ser Ile Lys Phe Asn Asp Glu His Ile Pro226022652270Glu Ser Pro Tyr Leu Val Pro Val Ile Ala Pro Ser Asp Asp Ala Arg227522802285Arg Leu Thr Val Met Ser Leu Gln Glu Ser Gly Leu Lys Val Asn Gln229022952300Pro Ala Ser Phe Ala Ile Arg Leu Asn Gly Ala Lys Gly Lys Ile Asp230523102315 2320Ala Lys Val His Ser Pro Ser Gly Ala Val Glu Glu Cys His Val Ser232523302335Glu Leu Glu Pro Asp Lys Tyr Ala Val Arg Phe Ile Pro His Glu Asn234023452350Gly Val His Thr Ile Asp Val Lys Phe Asn Gly Ser His Val Val Gly235523602365Ser Pro Phe Lys Val Arg Val Gly Glu Pro Gly Gln Ala Gly Asn Pro237023752380Ala Leu Val Ser Ala Tyr Gly Thr Gly Leu Glu Gly Gly Thr Thr Gly238523902395 2400Ile Gln Ser Glu Phe Phe Ile Asn Thr Thr Arg Ala Gly Pro Gly Thr240524102415Leu Ser Val Thr Ile Glu Gly Pro Ser Lys Val Lys Met Asp Cys Gln242024252430Glu Thr Pro Glu Gly Tyr Lys Val Met Tyr Thr Pro Met Ala Pro Gly243524402445
Asn Tyr Leu Ile Ser Val Lys Tyr Gly Gly Pro Asn His Ile Val Gly245024552460Ser Pro Phe Lys Ala Lys Val Thr Gly Gln Arg Leu Val Ser Pro Gly246524702475 2480Ser Ala Asn Glu Thr Ser Ser Ile Leu Val Glu Ser Val Thr Arg Ser248524902495Ser Thr Glu Thr Cys Tyr Ser Ala Ile Pro Lys Ala Ser Ser Asp Ala250025052510Ser Lys Val Thr Ser Lys Gly Ala Gly Leu Ser Lys Ala Phe Val Gly251525202525Gln Lys Ser Ser Phe Leu Val Asp Cys Ser Lys Ala Gly Ser Asn Met253025352540Leu Leu Ile Gly Val His Gly Pro Thr Thr Pro Cys Glu Glu Val Ser254525502555 2560Met Lys His val Gly Asn Gln Gln Tyr Asn Val Thr Tyr Val Val Lys256525702575Glu Arg Gly Asp Tyr Val Leu Ala Val Lys Trp Gly Glu Glu His Ile258025852590Pro Gly Ser Pro Phe His Val Thr Val Pro25952600
权利要求
1.一种在目标中处理前列腺癌的方法，包括(a)遗传修饰第一组肿瘤细胞以产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；(b)将所述肿瘤细胞施予给一个目标；(c)通过SDS-PAGE测定一个大约278KD的抗原免疫应答，其中所述的免疫应答在所述的施予之前没有被检测到。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的大约278KD的抗原是β-细丝蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的免疫应答是体液免疫应答。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述的第一组肿瘤细胞是增殖无能力的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的第一组肿瘤细胞是异体的。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述的第一组肿瘤细胞是自体的。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述的第一组肿瘤细胞是旁观者细胞。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述的第一组肿瘤细胞是PC-3细胞或LNCaP细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的免疫应答是体液免疫应答。
10.根据权利要求4所述的方法，其中一个第二组肿瘤细胞是被遗传修饰以产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子并与所述的第一组肿瘤细胞联合施予。
11.根据权利要求8所述的方法，其中第二组肿瘤细胞是PC-3细胞或LNCaP细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的免疫应答是体液免疫应答。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述的第二组肿瘤细胞是增殖无能力的。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述的第一组肿瘤细胞是异体的。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述的第一组肿瘤细胞是自体的。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述的第一组肿瘤细胞是旁观者细胞。
17.根据权利要求5所述的方法，其中所述的第二组肿瘤细胞是异体的。
18.根据权利要求5所述的方法，其中所述的第二组肿瘤细胞是自体的。
19.根据权利要求5所述的方法，其中所述的第二组肿瘤细胞是旁观者细胞。
20.根据权利要求6所述的方法，其中所述的第二组肿瘤细胞是异体的。
21.根据权利要求6所述的方法，其中所述的第二组肿瘤细胞是自体的。
22.根据权利要求6所述的方法，其中所述的第二组肿瘤细胞是旁观者细胞。
23.根据权利要求14所述的方法，其中所述的第一组肿瘤细胞是PC-3细胞，且第二组肿瘤细胞是LNCaP细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述的免疫应答是体液免疫应答。
25.一种降低前列腺癌病人的前列腺特异性抗原水平的方法，包括遗传修饰第一组肿瘤细胞以产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；将所述细胞施予给一个目标；通过SDS-PAGE测定一个大约278KD的抗原免疫应答，其中所述的免疫应答在所述的施予之前没有被检测到。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述的大约278KD的抗原是β-细丝蛋白。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述的免疫应答是体液免疫应答。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述的第一组肿瘤细胞是增殖无能力的。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述的第一组肿瘤细胞是异体的。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述的第一组肿瘤细胞是自体的。
31.根据权利要求25所述的方法，其中所述的第一组肿瘤细胞是旁观者细胞。
32.根据权利要求25所述的方法，其中所述的第一组肿瘤细胞从由PC-3细胞、LNCaP细胞、以及PC-3细胞加LNCaP细胞组成的细胞群中选出。
全文摘要
经遗传修饰的细胞因子表达细胞作为治疗前列腺癌的疫苗。更具体地说，描述了一种用经过遗传修饰，表达粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子的细胞作为产生针对β－细丝蛋白的增强的免疫应答的手段，以及相应的在治疗前列腺癌中的应用。
文档编号G01N33/537GK101076351SQ200580038526
公开日2007年11月21日 申请日期2005年9月9日 优先权日2004年9月10日
发明者刘坡成, 窛亭·安东尼·吴, 乔安娜·斯, 伏拉娃·博若利尼 申请人:细胞基因系统有限公司