用于白血病诊断、预后和治疗选择的方法和系统的制作方法

专利名称：用于白血病诊断、预后和治疗选择的方法和系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及白血病诊断基因和预后基因，和将所述诊断基因和预后基因用于AML或其它类型白血病的诊断、预后和治疗选择的方法。

背景技术：
急性髓性白血病(AML)是一种以骨髓中不成熟白血病母细胞过度增殖为特征的异质性克隆性病症。所有AML病例中约90％显示出CD33+母细胞的增殖，且CD33为一种细胞表面抗原，其似乎在原粒细胞和骨髓祖细胞中特异性表达，而在正常造血干细胞中并不存在。吉妥单抗(Gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg_或GO)是一种与刺孢霉素(calicheamicin)接合的抗CD33抗体，其经特别设计以靶向AML患者的CD33+母细胞以用于破坏。相关综述请参看Matthews，LEUKEMIA，12(增补版1)S33-S36(1998)；和Bernstein，LEUKEMIA，14474-475(2000)。
尽管吉妥单抗已在患有晚期AML患者中展现功效，但有时其作为单线药剂(singleline agent)不完全有效。活体外与活体内研究已证实，p-糖蛋白的表达和多药抗性(MDR)表型都与对吉妥单抗疗法的反应性的降低相关，这表明通过这一机制排挤吉妥单抗可为若干种吉妥单抗抗性的重要分子路径中的一种(Naito等人，LEUKEMIA，141436-1443(2000)；和Linenberger等人，BLOOD，98988-994(2001))。然而，MDR表型无法说明已发现为吉妥单抗抗性的所有情形。尽管吉妥单抗在大部分接收Mylotarg_疗法的患者中都显示出有利的安全性图谱(Sievers等人，J CLIN.ONCOL.，19(13)3244-3254(2001))，但在接收此疗法后，已报导少量但有效数量的肝静脉闭塞病病例(Neumeister等人，ANN.HEMATOL.，80119-120(2001))。近来，也已经结合蒽环类和阿糖胞苷评估GO以试图增加以单一药剂疗法形式投与的GO的有效性(Alvarado等人，CANCER CHEMOTHERPHARMACOL.，5187-90(2003))。


发明内容
因此，本发明的目的为提供评定基因表达与对治疗的反应之间的任何关系的有效药物基因组学分析。
本发明的目的为鉴别表达水平预测经历抗癌疗法的白血病患者的临床结果的白血病预后基因。
本发明的另一目的为提供一种预测白血病患者的临床结果的方法，以及基于药物基因组学分析选择对白血病患者的治疗的方法。
本发明的另一目的为鉴别白血病诊断基因，并且提供一种基于所述诊断基因的表达水平的分析来诊断或监测白血病的发生、发展、进展或治疗的方法。
因此，一方面，本发明提供一种用于预测对白血病治疗反应的临床结果的方法。所述方法包括以下步骤(1)在所述治疗之前，测量得自患者的外周血液单核细胞样本中一个或一个以上白血病预后基因的表达水平；和(2)将所述表达水平中每一者都与相应的对照水平相比较，其中所述比较的结果将预测临床结果。在本申请案中所提及的“预后基因”包括(但不限于)在具有不同临床结果的白血病患者的外周血液单核细胞(PBMC)或其它组织中差别表达的任何基因。具体来说，预后基因包括在白血病患者的PBMC或其它组织中的表达水平与所述患者的临床结果相关的基因。示范性预后基因展示于表1、表2、表3、表4、表5和表6中。本申请案中所提及的“临床结果”包括(但不限于)对任何白血病治疗的任何反应。
本发明适用于任何白血病的预后，包括急性白血病、慢性白血病、淋巴细胞白血病或非淋巴细胞白血病。本发明尤其适用于急性髓性白血病(AML)的预后。通常，临床结果是由对抗癌疗法的反应进行测量。举例来说，所述抗癌疗法包括投与一种或一种以上选自以下组成的群组的化合物抗CD33抗体、柔红霉素(daunorubicin)、阿糖胞苷、吉妥单抗、蒽环类和嘧啶或嘌呤核苷酸类似物。在一特定实例中，本发明可用于预测对吉妥单抗(GO)组合疗法的反应。
在一实施例中，适用于本发明的一个或一个以上预后基因包括至少一个选自第一类的第一基因和一个选自第二类的第二基因。所述第一类包括在经预测对治疗反应而具有较少所需临床结果的患者的外周血液单核细胞中具有较高表达水平的基因。示范性第一类基因展示于表1和表3中。第二类包括在经预测对治疗反应而具有较多所需临床结果的患者的外周血液单核细胞中具有较高表达水平的基因。示范性第二类基因展示于表2和表4中。在一实施例中，所述第一基因选自表3，且所述第二基因选自表4。
在一特定实施例中，所述第一基因选自以下组成的群组锌指蛋白217、肽转运体3、叉头框O3A、T细胞受体α位点和推定的趋化因子受体/GTP结合蛋白；且所述第二基因选自以下组成的群组金属硫蛋白、脂肪酸去饱和酶1、与Affymetrix ID 216336相对应的未确定基因、畸形表皮自调节因子1和生长停滞和DNA损伤诱导蛋白α。在另一实施例中，所述第一基因为血清糖皮质激素调节激酶，且所述第二基因为金属硫蛋白1X/1L。
在一些实施例中，将所述各预后基因表达水平与作为数值临界值的相应对照水平相比较。
在一些实施例中，本发明的方法可用于预测白血病患者对治疗反应的不良事件的发展。举例来说，所述方法可用于评定发展静脉闭塞疾病(VOD)的可能性。预测VOD的示范性预后基因展示于表5和表6中。在一特定实施例中，将测量p-选择素配体(p-selectin ligand)的表达水平以预测VOD的风险。
另一方面，本发明提供一种通过采取以下步骤预测白血病临床结果的方法(1)由患有白血病的患者的外周血样产生基因表达谱；和(2)将所述基因表达谱与一种或一种以上参考表达谱相比较，其中所述基因表达谱和所述一种或一种以上参考表达谱含有外周血液单核细胞中一个或一个以上所述白血病预后基因的表达模式，且其中所述基因表达谱与所述一种或一种以上参考表达谱之间的差异或相似性将指示所述患者的临床结果。
在一实施例中，可例如通过k最近邻分析或加权投票算法，将所述一个或一个以上预后基因的基因表达谱与所述一种或一种以上参考表达谱相比较。通常，所述一种或一种以上参考表达谱表示已知或可测定的临床结果。在一些实施例中，可将患者的基因表达谱与至少两种参考表达谱相比较，所述参考表达谱中每一者都表示不同的临床结果。举例来说，每一参考表达谱都可能表示选自以下组成的群组的不同临床结果对抗癌疗法反应而缓解至小于5％的母细胞；对抗癌疗法反应而缓解至不少于5％的母细胞；和对抗癌疗法反应而无缓解。在一些实施例中，所述一种或一种以上参考表达谱可包括表示无白血病人类的参考表达谱。
在一些实施例中，基因表达谱可通过使用核酸阵列产生。通常，基因表达谱是在抗癌疗法之前由患者的外周血样产生。
在一实施例中，所述一个或一个以上预后基因包括一个或一个以上选自表3或表4的基因。在另一实施例中，所述一个或一个以上预后基因包括十个或十个以上选自表3或表4的基因。在又一实施例中，所述一个或一个以上预后基因包括二十或二十个以上选自表3或表4的基因。
另一方面，本发明提供一种选择对白血病患者的治疗的方法。所述方法包括以下步骤(1)由得自白血病患者的外周血样产生基因表达谱；(2)将所述基因表达谱与多个参考表达谱相比较，所述参考表达谱各自表示对多种治疗中的一种反应的临床结果；和(3)基于步骤(2)的比较，从多种治疗中选择一种对白血病患者具有有利临床结果的治疗；其中所述基因表达谱和所述一种或一种以上参考表达谱包含外周血液单核细胞中一个或一个以上白血病预后基因的表达模式。在一实施例中，可例如通过k最近邻分析或加权投票算法，将所述基因表达谱与所述多种参考表达谱相比较。
在一实施例中，所述一个或一个以上预后基因包括一个或一个以上选自表3或表4的基因。在另一实施例中，所述一个或一个以上预后基因包括十个或十个以上选自表3或表4的基因。在又一实施例中，所述一个或一个以上预后基因包括二十或二十个以上选自表3或表4的基因。
另一方面，本发明提供一种诊断或监测白血病发生、发展、进展或治疗的方法。所述方法包括以下步骤(1)由患有白血病的患者的外周血样产生基因表达谱；和(2)将所述基因表达谱与一种或一种以上参考表达谱相比较，其中所述基因表达谱和所述一种或一种以上参考表达谱含有外周血液单核细胞中一个或一个以上所述白血病诊断基因的表达模式，且其中所述基因表达谱与所述一种或一种以上参考表达谱之间的差异或相似性将指示所述患者中白血病的存在、不存在、发生、发展、进展或治疗有效性。在一实施例中，白血病为AML。在本申请案中所提及的“诊断基因”包括(但不限于)在具有不同疾病状态的白血病患者的外周血液单核细胞(PBMC)或其它组织中差别表达的任何基因。具体来说，诊断基因包括，相对于无白血病患者的PBMC，在白血病患者的PBMC或其它组织中差别表达的基因。示范性诊断基因展示于表7、表8和表9中。诊断基因在本申请案中也称为疾病基因。
通常，所述一种或一种以上参考表达谱包括表示无疾病人类的参考表达谱。通常，所述一个或一个以上诊断基因包括一个或一个以上选自表7的基因。优选所述一个或一个以上诊断基因包含一个或一个以上选自表8或表9的基因。在一些实施例中，所述一个或一个以上诊断基因包括十个或十个以上选自表7的基因。优选所述一个或一个以上诊断基因包括十个或十个以上选自表8或表9的基因。
另一方面，本发明提供一种用于预测AML患者的临床结果的方法中的阵列。本发明的阵列包括具有多个位址的底物，每一所述位址都具有安置于其上的不同探针。在一些实施例中，所述多个位址中至少15％具有安置于其上可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML预后基因的探针。在一些实施例中，所述多个位址中至少30％具有安置于其上可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML预后基因的探针。在一些实施例中，所述多个位址中至少50％具有安置于其上可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML预后基因的探针。在一些实施例中，预后基因选自表1、表2、表3、表4、表5或表6。适用于本发明的探针可为核酸探针。或者，适用于本发明的探针可为抗体探针。
另一方面，本发明提供一种用于诊断AML的方法中的阵列，其包括具有多个位址的底物，所述位址中每一者都具有安置于其上的不同探针。在一些实施例中，所述多个位址中至少15％具有安置于其上可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML诊断基因的探针。在一些实施例中，所述多个位址中至少30％具有安置于其上可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML诊断基因的探针。在一些实施例中，所述多个位址中至少50％具有安置于其上可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML诊断基因的探针。在一些实施例中，诊断基因选自表7、表8或表9。适用于本发明的探针可为核酸探针。或者，适用于本发明的探针可为抗体探针。
另一方面，本发明提供一种计算机可读媒体，其含有以数字编码的表达谱，所述表达谱具有多个以数字编码的表达信号，其中所述多个以数字编码的表达信号中的每一者都包括表示外周血液单核细胞中AML预后基因表达的值。在一些实施例中，所述多个以数字编码的表达信号中的每一者都具有表示选自表1、表2、表3、表4、表5或表6的预后基因的值。在一些实施例中，所述多个以数字编码的表达信号中的每一者都具有表示具有已知或可测定临床结果的患者的外周血液单核细胞中AML预后基因的表达情况的值。在一些实施例中，本发明的计算机可读媒体含有包括至少十个以数字编码的表达信号的以数字编码的表达谱。
另一方面，本发明提供一种计算机可读媒体，其含有以数字编码的表达谱，所述表达谱具有多个以数字编码的表达信号，其中所述多个以数字编码的表达信号中的每一者都具有表示外周血液单核细胞中AML诊断基因表达的值。在一些实施例中，所述多个以数字编码的表达信号中的每一者都具有表示选自表7、表8或表9的诊断基因的值。在一些实施例中，所述多个以数字编码的表达信号中的每一者都具有表示无AML人类的外周血液单核细胞中AML诊断基因的表达情况的值。在一些实施例中，本发明的计算机可读媒体含有包括至少十个以数字编码的表达信号的以数字编码的表达谱。
另一方面，本发明提供一种用于白血病(例如AML)预后的试剂盒。所述试剂盒包括a)一个或一个以上探针，其可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML预后基因；和b)一个或一个以上对照，其各自表示可通过所述一个或一个以上探针检测的预后基因的参考表达水平。在一些实施例中，本发明的试剂盒包括一个或一个以上可特异性地检测选自表1、表2、表3、表4、表5或表6的预后基因的探针。
另一方面，本发明提供一种用于白血病(例如AML)诊断的试剂盒。所述试剂盒包括a)一个或一个以上探针，其可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML诊断基因；和b)一个或一个以上对照，其各自表示可通过所述一个或一个以上探针检测的预后基因的参考表达水平。在一些实施例中，本发明的试剂盒包括一个或一个以上可特异性地检测选自表7、表8或表9的诊断基因的探针。
本发明的其它特征、目的和优势将在下文的具体实施方式
中显而易见。然而，应理解当具体实施方式
说明本发明的实施例时，其仅以说明的方式而非限定性方式给出。所属领域技术人员根据具体实施方式
将了解在本发明范围内所作的各种改变和变更。



图式是出于说明而非限制的目的提供。
图1A展示选自表1和表2的98类相关基因的相对PBMC表达水平。在这98个基因中，相对于对Mylotarg组合疗法不反应的患者(NR)，有49个基因在对Mylotarg组合疗法反应的患者(R)的PBMC中具有升高的表达水平；且与有反应患者(R)相比，另外49个基因在无反应患者(NR)的PBMC中具有升高的表达水平。
图1B展示使用由表1和表2中的基因组成的154基因类别预测因子对各样本进行的交叉验证的结果，其中进行留一交叉验证并且计算各样本的预测强度。以与图1A相同的次序对样本排序。
图2说明使用经检测在一种或一种以上图谱中具有大于或等于10ppm的最大频率的7879种转录物对正常患者、患有AML的患者或患有MDS的患者的PBMC基因表达谱进行的无监督分级聚类(unsupervised hierarchical clustering)。对数据进行对数变换，并且对基因表达值进行中值集中，且使用平均连锁聚类法用非中心相关性相似性度量(uncentered correlation similarity metric)来聚集图谱。两种主要的正态与非正态聚类称为聚类1和聚类2。将聚类2中AML占优势的亚群称为“类AML”亚群；而将聚类2中MDS占优势的亚群称为“类MDS”亚群。
图3说明基于基因语义学(gene ontology)对GO组合疗法治疗AML患者期间改变的转录物进行的注释。将在治疗期间展现3倍或更高倍数阻遏的52种转录物注释于所列十二种类别中的每一种中。免疫反应类别中的转录物在随治疗而增多的转录物组中过度出现最为显著，而未归类的转录物在治疗期间受抑制的转录物组中过度出现最为显著。
图4说明4名最终经历静脉闭塞疾病(VOD)的AML患者的预处理PBMC中(左图)和32名不经历VOD的患者的预处理PBMC中(右图)p-选择素配体转录物的水平。将基于微阵列分析的频率(以ppm为单位)绘于y轴上，并且将各组中每一个别样本的p-选择素配体的水平绘制为离散式符号。
图5说明8名无法反应的患者(NR)的预处理PBMC中和28名有反应的患者(R)的预处理PBMC中MDR1转录物的水平。将基于微阵列分析的频率(以ppm为单位)绘于y轴上，并且以每一柱体表示36个预处理PBMC样本中的每一个别样本中的MDR1转录物水平。p值是基于采用不等方差的非配对Student t检验得到。
图6说明治疗前AML患者的PBMC样本中各种ABC盒转运体的转录物水平。将基于微阵列分析的频率(以ppm为单位)绘于y轴上，并且表示NR和R组中各转运体的平均水平和标准差。据检测，就关于U133A评估的任何编码ABC转运体的序列而言，NR与R组在表达方面无显著差异。
图7说明8名无法反应的患者(NR)的预处理PBMC中和28名有反应的患者(R)的预处理PBMC中CD33细胞表面抗原转录物的水平。将基于微阵列分析的频率(以ppm为单位)绘于y轴上，并且以每一柱体表示36个预处理PBMC样本中的每一个别样本中CD33转录物的水平。p值是基于采用不等方差的非配对Student t检验得到。
图8说明用于使对疗法最终有反应者与最终无反应者的预处理PBMC相区分的10基因分类因子的准确率。使用在涉及基于GO的疗法的两项独立临床研究的每一者的基线图谱中具有至少一个存在指令(present call)和一个大于或等于10ppm的值的总计11382个序列，将来自AML患者的基线PBMC图谱的数据缩放频率标准化在一起。遵循Genecluster中的z-分数标准化步骤进行分析。图A描述模型中36元训练集中的全局准确率，所述模型含有使用两级分类方法用将中间值用于类别评估的S2N相似性度量所建立的增加数量的特征(转录物序列)。对得到最高全局准确率的最小分类因子(10基因)作出指示(箭头)。图B描述10基因分类因子的10倍交叉验证准确率。使用加权投票算法来使用10基因分类因子对类别成员进行分配。各预测指令的置信分数是通过柱体表示，其中向下偏移表示“NR”指令，而向上偏移表示“R”指令。真无反应者是由浅色柱体表示，而真反应者是由深色柱体表示。在这一交叉验证中，已对8位无反应者中的4位作出正确鉴别，并且对28位反应者中的24位作出正确鉴别。
图9说明10基因分类因子用于评价独立临床试验中的AML患者的基线PBMC的用途。使用加权投票算法来使用10基因分类因子对类别成员进行分配。各预测指令的置信分数是通过柱体表示，其中向下偏移表示“NR”指令，而向上偏移表示“R”指令。真无反应者是由浅色柱体表示，而真反应者是由深色柱体表示。在这一独立测试集中，已对7位无反应者中的4位作出正确鉴别，并且对全部7位反应者都作出正确鉴别。
图10说明AML PBMC中与对基于GO的疗法所作的反应呈负性相关的两个基因的表达水平。图A表示AML患者的PMBC样本中血清/糖皮质激素调节激酶(Y轴)和金属硫蛋白1X/1L(X轴)的基于Affymetrix的表达水平(以ppm为单位)的二维图。对各患者中的每一转录物水平作图，其中以方形表示无反应者，且以圆形表示反应者。阴影部分表示涵盖最大数量无反应者和最小数量反应者从而界定这一成对分类因子的边界的X-Y图中的区域。满足有关小于30ppm的血清糖皮质激素调节激酶的表达水平和大于30ppm的金属硫蛋白1X/1L的表达水平的必要条件将能够成功地鉴别具有36个样本的原始数据集中8位无反应者中的6位，并且28位反应者中仅2位被错误鉴别为无反应者。图B说明对独立临床试验的14个AML样本中2基因分类因子的评价。满足相同必要条件将对7位无反应者中的4位作出正确鉴别，并且还将对所有反应者(7/7)都作出正确鉴别。

具体实施例方式 本发明提供可用于AML或其它类型白血病的预后或治疗选择的方法、试剂和系统。这些方法、试剂和系统使用白血病预后基因，所述基因在具有不同临床结果的白血病患者的外周血样中差别表达。本发明还提供用于诊断或监测AML或其它类型白血病的发生、发展、进展或治疗的方法、试剂和系统。这些方法、试剂和系统使用诊断基因，所述基因在具有不同疾病状态的白血病患者的外周血样中差别表达。因此，本发明代表着临床药物基因组学和白血病治疗的显著进步。
本发明的各个方面将于以下分节中进一步进行详述。分节的使用不意欲限制本发明。各分节可适用于本发明的任何方面。在本申请案中，除非另作说明，否则“或”的使用意谓“和/或”。
白血病和白血病治疗 适用于本发明的白血病类型包括(但不限于)急性白血病、慢性白血病、淋巴细胞白血病或非淋巴细胞白血病(例如，骨髓性白血病、单核细胞白血病或红白血病)。急性白血病包括(例如)AML或ALL(急性淋巴母细胞白血病)。慢性白血病包括(例如)CML(慢性骨髓性白血病)、CLL(慢性淋巴细胞白血病)或毛细胞白血病。本发明还涵盖对患有骨髓增生异常综合症(MDS)的患者的临床结果具有预后作用的基因。
可根据本发明分析任何白血病治疗方案。这些白血病治疗的实例包括(但不限于)化学疗法、药物疗法、基因疗法、免疫疗法、生物疗法、放射疗法、骨髓移植、手术或其组合。也可根据本发明评价其它常规、非常规、新颖或实验性疗法，包括处于临床试验中的治疗方法。
多种抗癌剂可用于治疗白血病。这些药剂的实例包括(但不限于)烷基化剂、蒽环类、抗生素、双膦酸盐类、叶酸拮抗剂、无机砷酸盐、微管抑制剂、亚硝基脲、核苷类似物、类视黄醇或拓扑异构酶抑制剂。
烷基化剂的实例包括(但不限于)白消安(busulfan)(Myleran、Busulfex)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)(Leukeran)、环磷酰胺(Cytoxan、Neosar)、美法兰(melphalan)、L-PAM(Alkeran)、达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC-Dome)和替莫唑胺(temozolamide)(Temodar)。蒽环类的实例包括(但不限于)多柔比星(doxorubicin)(Adriamycin、Doxil、Rubex)、米托蒽醌(mitoxantrone)(Novantrone)、伊达比星(idarubicin)(Idamycin)、戊柔比星(valrubicin)(Valstar)和表柔比星(epirubicin)(Ellence)。抗生素的实例包括(但不限于)更生霉素(dactinomycin)、放线菌素D(actinomycin D)(Cosmegen)、博来霉素(bleomycin)(Blenoxane)和柔红霉素(daunorubicin)、道诺霉素(daunomycin)(Cerabidine、DanuoXome)。双膦酸盐抑制剂的实例包括(但不限于)唑来磷酸(zoledronate)(Zometa)。叶酸拮抗剂的实例包括(但不限于)甲氨喋呤(methotrexate)和三甲曲沙(tremetrexate)。无机砷酸盐的实例包括(但不限于)三氧化二砷(Trisenox)。可抑制微管组装或分解的微管抑制剂的实例包括(但不限于)长春新碱(vincristine)(Oncovin)、长春碱(vinblastine)(Velban)、紫杉醇(paclitaxel)(Taxol、Paxene)、长春瑞滨(vinorelbine)(Navelbine)、多西紫杉醇(docetaxel)(Taxotere)、埃坡霉素B(epothilone B)或埃坡霉素D或其任一者的衍生物，和淅皮海绵内酯(discodermolide)或其衍生物。亚硝基脲的实例包括(但不限于)丙卡巴肼(procarbazine)(Matulane)、罗莫司丁(lomustine)、CCNU(CeeBU)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU、BiCNU、Gliadel Wafer)和磷雌氮芥(estramustine)(Emcyt)。核苷类似物的实例包括(但不限于)巯基嘌呤(mercaptopurine)，即6-MP(Purinethol)；氟尿嘧啶(fluorouracil)，即5-FU(Adrucil)；硫鸟嘌呤(thioguanine)，即6-TG(Thioguanine)；羟基脲(hydroxyurea)(Hydrea)；阿糖胞苷(cytarabine)(Cytosar-U、DepoCyt)；氟尿嘧啶脱氧核苷(floxuridine)(FUDR)；氟达拉滨(fludarabine)(Fludara)；喷司他丁(pentostatin)(Nipent)；克拉屈滨(cladribine)(Leustatin、2-CdA)；吉西他滨(gemcitabine)(Gemzar)；和卡培他滨(capecitabine)(Xeloda)。类视黄醇的实例包括(但不限于)维甲酸(tretinoin)、ATRA(Vesanoid)、阿利维A酸(alitretinoin)(Panretin)和贝沙罗汀(bexarotene)(Targretin)。拓扑异构酶抑制剂的实例包括(但不限于)依托泊苷(etoposide)、VP-16(Vepesid)、替尼泊苷(teniposide)、VM-26(Vumon)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)(Etopophos)、托泊替康(topotecan)(Hycamtin)和依立替康(irinotecan)(Camptostar)。可根据本发明评价包括使用这些抗癌剂中任一种进行的疗法。
白血病还可通过特异性识别患病细胞或其它不合需要的细胞的抗体来治疗。适用于这一目的的抗体包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、人化抗体、人类抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂交抗体、突变抗体、移植抗体或活体外产生的抗体。适当抗体也可为Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb，或保留抗原结合功能的其它抗体片段。在许多情况下，本发明中所使用的抗体可以至少10-6 M-1、10-7 M-1、10-8 M-1、10-9 M-1或更高的结合亲和力与患病细胞或不合需要的细胞上的特定抗原(例如，原粒细胞或骨髓祖细胞上的CD33抗原)结合。
本发明中所使用的许多抗体与可杀伤或抑制细胞生长或分裂的细胞毒性剂或其它抗细胞剂接合。细胞毒性剂或抗细胞剂的实例包括(但不限于)上文所述的抗肿瘤剂和其它化学治疗剂、放射性同位素或细胞毒素。两个或两个以上的不同细胞毒性部分可与一个抗体偶合，从而纳入可变或甚至增强的抗癌活性。
一个或一个以上细胞毒性部分与抗体连接或偶合可通过多种机制达成，例如共价结合、亲和结合、插入、配位结合和络合。结合方法优选涉及诸如使用化学交联剂、天然肽或二硫键进行共价结合的方法。
共价结合可(例如)通过直接缩合现存侧链或通过并入外部桥接分子而达成。许多二价试剂或多价试剂都可用于使蛋白质分子与其它蛋白质、肽或胺官能团偶合。偶合剂的实例为(不限于)碳化二酰亚胺、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和己二胺。
在一实施例中，在与细胞毒性部分连接前，首先使本发明中所使用的抗体衍生化。“衍生化”，意谓用适当化学交联剂对抗体底物进行化学修饰。用于这一方式的交联剂的实例包括含有二硫键的连接子SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸盐)和SMPT(4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α(2-吡啶基二硫基)甲苯)。也可使用生物可释放的键来构建临床上具活性的抗体，从而在抗体与靶细胞结合或进入靶细胞后，可将细胞毒性部分从所述抗体释放出来。已知多类用于所述目的的连接构建体(例如二硫键)。
白血病治疗方案中所使用的抗肿瘤剂可通过任何常用途径投与，只要通过所述途径可到达靶组织或细胞即可。这包括(但不限于)静脉内、导管插入、常位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、肿瘤内、经口、经鼻、口腔、直肠、阴道或局部投药。抗肿瘤剂和剂量方案的选择可视多种因素而定，诸如所使用的药物组合、所治疗的特定疾病和患者的病况和以前的病史。已知的特定剂量方案和获批准的抗肿瘤剂可见于最新版本的Physician′s Desk Reference，Medical Economics Company，Inc.，Oradell，N.J中。
此外，白血病治疗方案可包括不同类疗法的组合，诸如化学疗法加抗体疗法。本发明涵盖对所有类型的白血病治疗方案中预后基因的鉴别。
一方面，本发明提供对经历抗癌治疗的AML患者的临床结果具有预后作用的基因的鉴别。AML治疗可包括诱导缓解疗法、缓解后疗法或其组合。诱导缓解疗法的目的是通过杀伤血液或骨髓中的白血病细胞来保持缓解。缓解后疗法的目的是通过杀伤可能不具活性但可开始再生长并引起复发的任何白血病细胞来维持缓解。
AML患者的标准缓解诱导疗法包括(但不限于)组合化学疗法、干细胞移植、高剂量组合化学疗法、全反式视黄酸(ATRA)加化学疗法或鞘内化学疗法。标准缓解后疗法包括(但不限于)组合化学疗法；高剂量化学疗法和使用供体干细胞进行的干细胞移植；或高剂量化学疗法和在存在或不存在放射疗法的情况下使用患者的干细胞进行的干细胞移植。对于复发的AML患者而言，标准治疗方法包括(但不限于)组合化学疗法、以单克隆抗体进行的生物疗法、干细胞移植、作为姑息疗法以减轻症状并改善生活品质的低剂量放射疗法，或三氧化二砷疗法。本发明也涵盖非标准疗法，包括处于临床试验中的治疗方法。
在许多实施例中，将美国专利申请公开案第20040152632号中所述的治疗方案用于治疗AML或MDS。在这些治疗方案中对患者结果具有预后作用的基因可根据本发明来鉴别。在一实例中，治疗方案包括投与至少一种化学疗法药物和与细胞毒性剂接合的抗CD33抗体。化学疗法药物可选自(不限于)由蒽环类和嘧啶或嘌呤核苷类似物组成的群组。细胞毒性剂可(例如)为刺孢霉素或埃斯波霉素(esperamicin)。
适用于治疗AML或MDS的蒽环类包括(但不限于)多柔比星、柔红霉素、伊达比星、阿柔比星(aclarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星(carubicin)、诺加霉素(nogalamycin)、美诺立尔(menogaril)、匹柔比星(pitarubicin)和戊柔比星。可用于治疗AML或MDS的嘧啶或嘌呤核苷类似物包括(但不限于)阿糖胞苷、吉西他滨、曲氟尿苷(trifluridine)、安西他宾(ancitabine)、依诺他滨(enocitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、喷司他丁、溴尿苷(broxuridine)、卡培他滨、克拉屈滨、地西他滨(decitabine)、氟尿嘧啶脱氧核苷、氟拉达滨、谷氏菌素(gougerotin)、嘌呤霉素(puromycin)、替加氟(tegafur)、噻唑呋啉(tiazofurin)或杀结核菌素(tubercidin)。其它蒽环类和嘧啶/嘌呤核苷类似物也可用于本发明中。
在另一实例中，AML/MDS治疗方案包括向需要治疗的患者投与吉妥单抗(GO)、柔红霉素和阿糖胞苷。吉妥单抗可以(不限于)每天约3mg/m2到约9mg/m2、诸如每天约3mg/m2、4mg/m2、5mg/m2、6mg/m2、7mg/m2、8mg/m2或9mg/m2的量投与。柔红霉素可以(例如)每天约45mg/m2到约60mg/m2、诸如每天约45mg/m2、50mg/m2、55mg/m2或60mg/m2的量投与。阿糖胞苷可以(不限于)每天约100mg/m2到约200mg/m2、诸如每天约100mg/m2、125mg/m2、150mg/m2、175mg/m2或200mg/m2的量投与。在一实例中，治疗方案中所使用的柔红霉素为盐酸柔红霉素。
临床结果 白血病患者的临床结果可通过多种标准予以评定。临床结果测量的实例包括(但不限于)完全缓解、部分缓解、未缓解、存活、不良事件的发展或其任何组合。完全缓解的患者在治疗后于骨髓中展现小于5％的母细胞。部分缓解患者显示母细胞百分比降低到一定程度，但不会像小于5％的母细胞一样达成正常的造血作用。未缓解患者的骨髓中的母细胞百分比未因对治疗反应而以显著方式降低。
在许多情况下，用于鉴别预后基因的外周血样为“基线”或“预处理”样本。这些样本是在治疗性治疗之前从个别白血病患者分离，并且可用于鉴别基线外周血液表达谱与这些白血病患者对治疗反应而获得的临床结果相关的基因。在其它治疗或疾病阶段分离的外周血样还可用于鉴别白血病预后基因。
可将多类外周血样用于本发明中。在一实施例中，外周血样为全血样本。在另一实施例中，外周血样包含富集的PBMC。“富集”意谓样本中PBMC所占百分比高于其在全血中所占百分比。在一些情况下，富集PBMC的样本中PBMC所占百分比将比其在全血中所占百分比高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更高倍数。在一些其它情况下，富集PBMC的样本中PBMC所占百分比为至少90％、95％、98％、99％、99.5％或更局。含有富集的PBMC的血样可使用所属领域中已知的任何方法制备，诸如Ficoll梯度离心或CPT(细胞纯化试管法)。
基因表达分析 外周血液基因表达谱与患者结果之间的关系可使用基因整体表达分析来评价。适用于这一目的的方法包括(但不限于)核酸阵列(诸如cDNA或寡核苷酸阵列)、二维SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳/质谱法和其它高通量核苷酸或多肽检测技术。
核酸阵列允许一次性定量检测大量基因的表达水平。核酸阵列的实例包括(但不限于)Affymetrix(Santa Clara，CA)的Genechip_微阵列、Agilent Technologies(Palo Alto，CA)的cDNA微阵列和美国专利第6,288,220号和第6,391,562号中所述的微珠阵列。
可用一个或一个以上标记部分对将与核酸阵列杂交的聚核苷酸进行标记，从而允许检测杂交聚核苷酸复合物。标记部分可包括可通过光谱、光化学、生物化学、生物电子学、免疫化学、电学、光学或化学方式检测的组成。示范性标记部分包括放射性同位素、化学发光化合物、经标记结合蛋白、重金属原子、光谱标记(诸如荧光标记和染料)、磁性标记、连接酶、质谱标签、自旋标记、电子转移供体和受体等。还可使用未经标记的聚核苷酸。聚核苷酸可为DNA、RNA或其经修饰形式。
可以纯杂交或差别杂交格式进行杂交反应。在纯杂交格式中，将得自一个样本(诸如所选结果类别中患者的PBMC)的聚核苷酸与核酸阵列上的探针杂交。形成杂交复合物后所检测的信号与所述样本中的聚核苷酸水平相关。在差别杂交格式中，用不同标记部分对得自两个生物样本(诸如一个来自第一结果类别中的患者，且另一个来自第二结果类别中的患者)的聚核苷酸进行标记。将这些经差别标记的聚核苷酸混合物加到核酸阵列中。随后，在可独立检测来自两种不同标记的放射的条件下检验核酸阵列。在一实施例中，将荧光团Cy3和Cy5(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway N.J.)用作差别杂交格式中的标记部分。
可使用市售软件(诸如Affymetrix或Agilent Technologies所提供的软件)分析从核酸阵列聚集的信号。杂交实验中还包括诸如有关扫描灵敏度、探针标记和cDNA/cRNA定量的对照。在许多实施例中，在进行进一步分析之前，依比例确定核酸阵列的表达信号或将其标准化。举例来说，可将各基因的表达信号标准化，从而当在类似测试条件下使用一种以上阵列时可考虑杂交强度的变化。也可使用从各阵列上所含的内部标准化对照得到的强度使个别聚核苷酸复合物的杂交信号标准化。此外，可使用所述样本中具有相对一致表达水平的基因使其它基因的表达水平标准化。在一实施例中，使所述样本中基因的表达水平标准化，从而使平均值为零，且标准差为1。在另一实施例中，对通过核酸阵列检测的表达数据进行排除基因的差异过滤，从而展示所有样本间的最小或不显著的差异。
相关性分析 可使用多种方法将从核酸阵列收集的基因表达数据与临床结果联系起来。适用于这一目的的方法包括(但不限于)统计学方法(诸如Spearman秩相关性、Cox比例风险回归模型、ANOVA/t检验或其它秩检验(rank test)或生存模型)和基于类别的相关性度量(诸如最近邻分析)。
在一实施例中，基于对治疗性治疗的反应，将患有特定白血病(例如AML)的患者分成至少两类。随后通过监督聚类或学习算法分析外周血液基因表达(例如，PBMC基因表达)与患者结果类别之间的相关性。适用于这一目的的监督算法包括(但不限于)最近邻分析、支持向量机(support vector machines)、SAM方法、人工神经网络(artificialneural network)和SPLASH。在监督分析中，已知或可测定各患者的临床结果。可鉴别相对于另一类患者在一类患者的外周血液细胞(例如，PBMC)中差别表达的基因。这些基因可用作预测所关注的白血病患者的临床结果的替代标记。如此鉴别的许多基因与类别差异相关，所述类别差异表示不同结果类别的患者中这些基因的理想化表达模式。
在另一实施例中，基于外周血液基因表达谱，可将患有特定白血病(例如AML)的患者分成至少两类。适用于这一目的的方法包括无监督聚类算法，诸如自组织图(self-organized map，SOM)、k-平均、主成分分析(principal component analysis)和分级聚类(hierarchical clustering)。一类中相当大量(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％或更多)的患者可具有第一临床结果，且另一类中相当大量的患者可具有第二临床结果。可鉴别相对于另一类患者在一类患者的外周血液细胞中差别表达的基因。这些基因也可用作预测所关注的白血病患者的临床结果的预后标记。
在另一实施例中，基于临床结果或外周血液基因表达谱，可将患有特定白血病(例如AML)的患者分成三类或三类以上。多类别相关性度量可用于鉴别相对于另一类在一类患者中差别表达的基因。示范性多类别相关性度量包括(但不限于)WhiteheadInstitute(Cambridge，MA)的MIT Center for Genome Research所提供的GeneCluster 2软件所使用的度量。
在另一实施例中，使用最近邻分析(也称为近邻分析)将外周血液基因表达谱与白血病患者的临床结果联系起来。有关近邻分析的算法描述于Golub等人，SCIENCE，286531-537(1999)；Slonim等人，PROCS.OF THE FOURTH ANNUAL INTERNATIONAL CONFERENCEON COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Tokyo，Japan，4月8日-11日，第263-272页(2000)；和美国专利第6,647,341号中。在一种型式的近邻分析中，各基因的表达谱可以表达向量g＝(e1，e2，e3，...，，en)表示，其中ei与第i个样本中基因“g”的表达水平相对应。类别差异可以理想表达模式c＝(c1，c2，c3，...，cn)表示，其中ci＝1或-1，这视第i个样本是从类别0还是类别1中分离而定。类别0可包括具有第一临床结果的患者，且类别1包括具有第二临床结果的患者。也可使用其它形式的类别差异。通常，类别差异表示一种理想的表达模式，其中基因表达水平在一个类别的样本中都极高，而在另一类别的样本中都极低。
基因“g”与类别差异之间的相关性可通过信杂比分数来测量 P(g，c)＝[μ1(g)-μ2(g)]/[σ1(g)+σ2(g)]， 其中μ1(g)和μ2(g)分别表示类别0和类别1中基因“g”的经对数变换的表达水平的平均值，且σ1(g)和σ2(g)分别表示类别0和类别1中基因“g”的经对数变换的表达水平的标准差。较高的信杂比分数绝对值表明基因在一个类别中比在另一类别中的表达水平高。在一实例中，用于得出信杂比分数的样本包含富集的PBMC或经纯化的PBMC，且因此信杂比分数P(g，c)表示类别差异与PBMC中基因“g”的表达水平之间的相关性。
如所属领域技术人员所了解，也可通过其它方法，诸如通过Pearson相关系数或欧氏距离(Euclidean distance)测量基因“g”与类别差异之间的相关性。
可使用随机假设检验(random permutation test)来评价外周血液基因表达谱与类别差异之间相关性的显著性。当与随机模式相比较时，类别差异近邻内基因的异常高的密度表明，许多基因都具有与类别差异显著相关的表达模式。可通过近邻分析图以图解方式观察基因与类别差异之间的相关性，其中y轴表示在类别差异周围各个近邻内基因的数量，且x轴表示近邻的尺寸(即P(g，c))。图中还可包括展示不同显著性水平关于随机假设的类别差异的相应近邻内基因数量的曲线。
在许多实施例中，本发明所使用的预后基因在近邻分析图中都高于平均显著性水平。这意谓着，各预后基因的相关性量度P(g，c)使得具有P(g，c)尺寸的类别差异近邻内基因的数量大于随机排列的类别差异的相应近邻内处于平均显著性水平的基因数量。在许多其它实施例中，本发明所使用的预后基因超过40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％显著性水平。如本文所使用的x％显著性水平意谓，x％的随机近邻含有与类别差异周围实际近邻同样多的基因。
可使用本发明的预后基因构建类别预测因子。这些类别预测因子可用于将所关注的白血病患者分配到结果类别中。在一实施例中，类别预测因子中所使用的预后基因局限于通过假设检验展示与类别差异显著相关的基因，诸如高于1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％或50％显著性水平的基因。在另一实施例中，一类患者中的类别预测因子中各预后基因的PBMC表达水平实质高于或实质低于另一类患者中的所述PBMC表达水平。在另一实施例中，类别预测因子中的预后基因具有最高的P(g，c)的绝对值。在另一实施例中，在Student t检验(例如，两侧分布(two-tailed distribution)、两组样本的不等方差(two sample unequal variance))下，类别预测因子中各预后基因的的p值不超过0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001或更低。对于每一预后基因而言，p值表明于一类患者中对另一类患者中基因的平均PBMC表达谱之间所观察的差异的统计学显著性。较低p值表明不同类型白血病患者之间所观察的差异具有较高统计学显著性。
也可使用SAM法将外周血液基因表达谱与不同结果类别联系起来。随后可使用微阵列预测分析(PAM)法鉴别能最好表征预定结果类别并且预测新样本的类别成员的类别预测因子。参看Tibshirani等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.，996567-6572(2002) 在许多实施例中，本发明的类别预测因子在留一交叉验证、10倍交叉验证或4倍交叉验证中具有极高预测准确率。举例来说，本发明的类别预测因子在留一交叉验证、10倍交叉验证或4倍交叉验证中可具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的准确率。在典型k倍交叉验证中，将数据分成约相同大小的k个子集。将模型训练k次，每一次都从训练集中留出一个子集，并且将遗漏的子集用作测试样本以计算预测误差。如果k等于样本尺寸，那么其为留一交叉验证。
其它基于类别的相关性度量或统计方法也可用于鉴别外周血样中表达谱与白血病患者的临床结果相关的预后基因。可通过使用市售或公共可用的软件进行这些方法中的许多方法。
能够鉴别白血病预后基因的其它方法包括(但不限于)RT-PCR、Northern印迹法、原位杂交和免疫检定(诸如ELISA、RIA或Western印迹法)。相对于另一类患者，这些基因在一类患者的外周血液细胞(例如，PBMC)中差别表达。在许多情况中，一类患者中每一所述基因的平均外周血液表达水平与另一类患者的所述表达水平在统计学上不同。举例来说，在适当统计学显著性检验(例如，Student t检验)中，就所观察的差异而言，p值可不超过0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001或更低。在许多其它情况下，由此鉴别的各预后基因在一类患者与另一类患者之间的平均PBMC表达水平中具有至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或20倍的差异。
使用HG-U133A微阵列鉴别AML预后基因 举例来说，本发明的特征在于AML患者的外周血液中的信号，其为对化学疗法方案反应而引起的缓解的指示，所述化学疗法方案是由柔红霉素和阿糖胞苷诱导疗法与GO的伴随投药组成。具体说来，本发明使用药物基因组学方法鉴别治疗前从AML患者获取的与对疗法方案作出阳性反应相关的外周血样中的转录模式。
在36天的诱导疗法后，同意进行药物基因组学分析的36名AML患者中，有28名达成阳性反应，且8名无法对治疗方案作出反应。使用Genecluster的违约相关性度量(default correlation metric)(Golub等人，SCIENCE，286531-537(1999))鉴别具有与完整样本集中的反应者和无反应者图谱高度相关的表达水平的基因。药物基因组学同意的患者中无反应者的较少数量使得不可能将预处理的血样分成训练集和测试集。因此，将所有样本都用于鉴别对于分类反应者样本对无反应者样本显示高准确率的基因分类因子。
表1列出与对疗法反应(缓解到小于5％母细胞)的AML患者相比，最终无法对GO组合化学疗法反应(无缓解或部分缓解)的AML患者中具有较高预处理PBMC表达水平的基因。表3中列出无反应患者展示最高基线PBMC升高倍数的基因。表2描述与对疗法无反应的AML患者相比，最终对GO组合化学疗法反应的AML患者的PBMC中具有较高预处理表达水平的转录物。表4中列出反应患者展示最高基线PBMC升高倍数的基因。“(NR/R)改变倍数”表示无反应AML患者的PBMC中基因的平均表达水平超过有反应AML患者的所述表达水平的比率。“(R/NR)改变倍数”表示有反应AML患者的PBMC中基因的平均表达水平超过无反应AML患者中所述表达水平的比率。在各表中，转录物是按照实例中所述的监督算法所计算的信杂比度量分数的次序呈现。表1-4中所述的各基因和相应的Unigene是根据Affymetrix注释鉴别。
建立由选自表1和表2的基因组成的分类因子，并且对其预测准确率加以评价。各分类因子包括表1中前n个基因和表2中的前n个基因，其中n表示不小于1的整数。举例来说，所评价的第一分类因子包括基因1和78，第二分类因子包括基因1-2和78-79，第三分类因子包括基因1-3和78-80，第四分类因子包括基因1-4和78-81等等。由此构建的各分类因子产生显著的预测准确率。举例来说，通过对本研究中所使用的外周血液图谱进行的4倍交叉验证，由表1和表2中所有154个基因组成的分类因子得到81％的全局预测准确率。
实例中将进一步论述预处理转录模式与临床结果(包括不良事件的发生)之间的相关性分析。实例中还揭示其它分类因子。
表1.无反应患者中具有较高基线外周血液表达水平的基因 表2.有反应患者中具有较高基线外周血液表达水平的基因 表3.无反应者患者的PBMC中基线显著升高(p＜0.05)的前50种转录物 表4.有反应患者的PBMC中基线显著升高(p＜0.05)的前50种转录物 与静脉闭塞疾病发作相关的基因 静脉闭塞疾病(VOD)是造血干细胞移植后最严重的并发症之一，并且与其严重形式的极高死亡率相关。将来自经历VOD的白血病患者的预处理PBMC图谱与不经历VOD的患者的PBMC图谱相比较将鉴别可能在治疗前与这一严重不良事件相关的重要转录物。
为鉴别经历VOD的患者与无VOD患者之间基线表达中具有显著差异的转录物，通过基线VOD图谱中的平均表达水平除以基线无VOD图谱中的平均表达水平来计算VOD患者图谱与无VOD患者图谱之间的平均差异倍数。使用Student t检验(两样本，不等方差)评定各组之间表达差异的显著性。
VOD患者基线表达水平显著升高(p＜0.05)的基因展示于表5中。VOD患者基线表达水平显著阻遏(p＜0.05)的基因展示于表6中。其中值得关注的是，P-选择素配体为经历VOD的患者中基线升高最显著的转录物之一。不希望受理论束缚，所述转录物升高可为内皮细胞损伤的生物标记指示，经证实，所述内皮细胞损伤对于移植物相关疾病(诸如移植物抗宿主疾病、败血症和VOD)起到作用。
表5.VOD患者的PBMC中基线显著升高(p＜0.05)的前50种转录物 表6.VOD患者的PBMC中基线显著抑制(p＜0.05)的前50种转录物 白血病诊断基因的鉴别 上述方法也可用于鉴别白血病诊断基因(也称为疾病基因)。相对于无白血病或无疾病人类，这些基因中的每一者都在白血病患者的PBMC中差别表达。在许多情况下，白血病患者中白血病疾病基因的平均PBMC表达水平在统计学上与无白血病或无疾病人类中的所述表达水平不同。举例来说，就所观察的差异而言，Student t检验的p值可不超过0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001或更低。在许多其它情况下，白血病患者中白血病疾病基因的平均PBMC表达水平与无白血病人类中所述表达水平之间的差异为至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或更高倍数。本发明的白血病疾病基因可用于检测所关注的人类中白血病的存在与否，或监测所关注的人类中白血病的发展、进展或治疗。
白血病疾病基因也可在基于类别的相关性度量(例如，最近邻分析或微阵列(SAM)方法的显著性方法)通过将PBMC表达谱与类别差异相联系来鉴别。类别差异表示白血病患者和无疾病人类的PBMC中理想的基因表达模式。在许多实例中，在假设检验中，白血病疾病基因的PBMC表达谱与类别差异之间的相关性高于1％、5％、10％、25％或50％显著性水平。可使用本发明的白血病疾病基因构建基因分类因子。这些分类因子可有效预测所关注的人类的类别成员(例如，白血病对比无白血病)。
使用HG-U133A微阵列鉴别AML诊断基因 举例来说，外周血液中的AML相关表达模式是使用U133A基因芯片平台来鉴别。将来自一组无疾病志愿者(n＝20)的PBMC的平均基线基因表达水平与来自AML患者(n＝36)的PBMC的相应平均基因表达水平相比较。鉴别相对于健康对照，展示AML患者的PBMC水平升高或降低的转录物。这些转录物的实例描述于表7中。表7中的各转录物都具有至少2倍的AML PBMC与无疾病PBMC(“无AML/无疾病”)之间平均表达水平的差异。对于所观察的差异(“P值”)而言，Student t检验(不等方差)的p值也展示于表7中。“COV”是指变异系数。
表7.相对于无疾病志愿者在AML患者的PBMC中差别表达的AML疾病基因的实例 各HG-U133A限定符表示HG-U133A基因芯片的寡核苷酸探针组合。与HG-U133A限定符对应的基因的RNA转录物可在核酸阵列杂交条件下与所述限定符的至少一个寡核苷酸探针(PM或最佳匹配探针)杂交。优选所述基因的RNA转录物在核酸阵列杂交条件下不与PM探针的错配探针(MM)杂交。错配探针与对应的PM探针的不同之处在于，错配探针的中心处或邻近错配探针中心处存在单一同数取代(homomericsubstitution)。对于25-mer的PM探针而言，MM探针在第13位处具有同数碱基改变。
在许多情况下，与HG-U133A限定符对应的基因的RNA转录物可在核酸阵列杂交条件下与具有所述限定符的所有PM探针中至少50％、60％、70％、80％、90％或100％杂交，但不与这些PM探针的错配探针杂交。在许多其它情况下，如通过相应探针对的杂交强度差异(即，PM-MM)比总体杂交强度(即，PM+MM)的比率所测量，这些PM探针中每一者的辨识率(R)不低于0.015、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或更高。在一实例中，当根据制造商的说明与HG-U133A基因芯片杂交时，基因的RNA转录物在默认设置(即，临界值τ为0.015且显著性水平α1为0.4)下产生“存在”指令。参看GeneChip_Expression Analysis-Data Analysis Fundamentals(第701190部分，第2修订本，Affymetrix，Inc.2002)，其整体内容以引用的方式并入本文中。
HG-U133A基因芯片上各PM探针的序列和从其得到PM探针的相应靶序列可获自Affymetrix序列数据库。例如参看www.affymetrix.com/support/technical/byproduct.affx？product＝hgu133。所有这些靶序列和寡核苷酸探针序列都以引用的方式并入本文中。
此外，相对于无疾病个体，AML患者的PBMC中表达水平显著升高(p＜0.001)的基因展示于表8中。相对于无疾病个体，AML患者的PBMC中表达水平显著降低(p＜0.001)的基因展示于表9中。
表7、表8和表9中所述的各基因和相应Unigene都是基于HG-U133A基因芯片注释鉴别。Unigene是由非重复的基因导向聚类(gene-oriented cluster)构成。据信，各Unigene聚类包括表示独特基因的序列。表7、表8和表9中所列的各基因的信息和其相应Unigene也可从Biotechnology Information(NCBI)(Bethesda，MD)的NationalCenter的Entrez Gene和Unigene数据库获得。
除Affymetrix注释外，与HG-U133A限定符对应的基因可通过对人类基因组序列数据库搜索具有所述限定符的靶序列的BLAST鉴别。适用于这一目的的人类基因组序列数据库包括(但不限于)NCBI人类基因组数据库。NCBI还提供用于搜索其序列数据库的BLAST程序，诸如“blastn”。在一实施例中，通过使用具有所述限定符的靶序列的确切区段(例如，最长的确切区段)进行BLAST对NCBI人类基因组数据库的搜索。可鉴别与具有显著序列一致性的确切区段比对的基因。在许多情况下，经鉴别的基因与确切区段具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。
如本文所使用，所有表中所列的基因不仅涵盖特别描述的基因，而且还涵盖表中未列出但与表中的限定符对应的基因。所有这些基因都可用作诊断或监测AML的发展、进展或治疗的生物标记。
表8.相对于无疾病个体在AML患者的PBMC中水平显著升高(p＜0.001)的前50种转录物 表9.相对于无疾病个体在AML患者的PBMC中水平显著升高(p＜0.001)的前50种转录物 AML或其它白血病的预后、诊断和治疗选择 本发明的预后基因可用于预测所关注的白血病患者的临床结果。预测通常涉及所关注的白血病患者中一个或一个以上预后基因的外周血液表达谱与至少一种参考表达谱的比较。本发明所使用的各预后基因在具有不同临床结果的白血病患者的外周血样中差别表达。
在一实施例中，对结果预测所使用的预后基因加以选择，从而在基于类别的相关性分析(诸如，最近邻分析)中使各预后基因的外周血液表达谱与类别差异联系起来，其中所述类别差异表示具有不同临床结果的白血病患者的外周血样中所选基因的理想表达模式。在许多情况下，在随机假定检验中，所选预后基因以高于50％、25％、10％、5％或1％的显著性水平与类别差异相关。
还可对预后基因加以选择，从而使一类白血病患者的外周血样中各预后基因的平均表达谱在统计学上与另一类白血病患者的所述表达谱不同。举例来说，就所观察的差异而言，Student t检验的p值可不超过0.05、0.01、0.005、0.001或更低。此外，可对预后基因加以选择，从而使一类患者中各预后基因的平均外周血液表达水平与另一类患者的所述表达水平具有至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或20倍的差异。
可将所关注的患者的表达谱与一种或一种以上参考表达谱相比较。可同时测定参考表达谱与所关注的患者的表达谱。还可在电子设备或其它类型的储存媒体中预先测定或预先记录参考表达谱。
参考表达谱可包括平均表达谱或代表特定患者的外周血液基因表达模式的个别表达谱。在一实施例中，参考表达谱包括具有已知或可测定的临床结果的参考白血病患者的外周血样中预后基因的平均表达谱。任何平均方法都可使用，诸如算数平均、调和平均、绝对值平均、对数变换值的平均或加权平均。在一实例中，参考白血病患者具有相同的临床结果。在另一实例中，可将参考白血病患者分成至少两类，每一类患者都具有不同的个别临床结果。各类患者的平均外周血液表达谱组成单独参考表达谱，并且将所关注的患者的表达谱与这些参考表达谱中的每一者相比较。
在另一实施例中，参考表达谱包括多种表达谱，各表达谱都表示临床结果已知或可测定的特定白血病患者中预后基因的外周血液表达模式。其它类型的参考表达谱也可用于本发明中。在另一实施例中，本发明使用数值临界值作为对照水平。
可以任何形式构建所关注的患者的表达谱和参考表达谱。在一实施例中，表达谱包含结果预测中所使用的各预后基因的表达水平。表达水平可为绝对水平、标准化水平或相对水平。适当的标准化程序包括(但不限于)核酸阵列基因表达分析中所使用的程序或Hill等人，GENOME BIOL，2research0055.1-0055.13(2001)中所述的程序。在一实例中，使表达水平标准化，从而使平均值为零且标准差为1。在另一实例中，如所属领域技术人员所了解，基于内部或外部对照将表达水平标准化。在又一实例中，对血样中一种或一种以上具有已知丰度的对照转录物标准化表达水平。在许多情况下，使用相同或相当的方法构建所关注的患者的表达谱和参考表达谱。
在另一实施例中，所比较的各表达谱包含一个或一个以上不同预后基因表达水平之间的比率。表达谱还可包括能够表示基因表达模式的其它测量法。
本发明中所使用的外周血样可为全血样本或包含富集的PBMC的样本。在一实例中，用于制备参考表达谱的外周血样包含富集的PBMC或经纯化的PBMC，且用于制备所关注的患者的表达谱的外周血样为全血样本。在另一实例中，结果预测中所使用的所有外周血样都包含富集的PBMC或经纯化的PBMC。在许多情况下，外周血样是使用相同或相当的程序由所关注的患者和参考患者制备。
其它类型的血样也可用于本发明中，且这些血样中的基因表达谱在统计学上与患者结果显著相关。
用于本发明中的外周血样可从处于任何疾病或治疗阶段的个别患者分离得到，且这些外周血样的基因表达模式与临床结果之间的相关性在统计学上极为显著。在许多实施例中，临床结果是根据患者对治疗性治疗所作的反应测量，且结果预测中所使用的所有血样都是在治疗性治疗之前分离得到。因此，从这些血样得到的表达谱为治疗性治疗的基线表达谱。
表达谱的构建通常涉及对结果预测中所使用的各预后基因的表达水平的检测。多种方法可用于这一目的。举例来说，基因表达水平可通过测量所述基因的RNA转录物的水平来测定。适当方法包括(但不限于)定量RT-PCT、Northern印迹法、原位杂交、狭缝印迹法、核酸酶保护检定和核酸阵列(包括微珠阵列)。基因表达水平还可通过测量所述基因所编码的多肽的水平来测定。适当方法包括(但不限于)免疫检定(诸如，ELISA、RIA、FACS或Western印迹法)、二维凝胶电泳、质谱法或蛋白质检定。
一方面，预后基因的表达水平是通过测量外周血样中基因的RNA转录物水平来测定。可使用多种方法从外周血样中分离出RNA。示范性方法包括异硫氰酸胍/酸性酚方法、TRIZOL_试剂(Invitrogen)或Micro-FastTrackTM 2.0或FastTrackTM 2.0mRNA分离试剂盒(Invitrogen)。所分离的RNA可为总RNA或mRNA。可将所分离的RNA扩增成cDNA或cRNA，随后进行检测或定量。扩增可为特异性或非特异性扩增。适当扩增方法包括(但不限于)逆转录酶PCR(RT-PCR)、恒温扩增、连接酶链反应和Qbeta复制酶。
在一实施例中，扩增方案使用逆转录酶。可使用逆转录酶和由寡(dT)和编码噬菌体T7启动子的序列组成的引物，将所分离的mRNA逆转录到cDNA中。由此产生的cDNA为单链cDNA。使用与用于断裂DNA/RNA杂交物的RNase组合的DNA聚合酶合成cDNA的第二条链。合成双链cDNA后，加入T7RNA聚合酶，且随后由双链cDNA的第二条链转录cRNA。可通过与经标记探针杂交来检测或定量已扩增的cDNA或cRNA。扩增过程中也可对cDNA或cRNA进行标记，且随后进行检测或定量。
在另一实施例中，将定量RT-PCR(诸如TaqMan，ABI)用于检测或比较所关注的预后基因的RNA转录物水平。定量RT-PCR涉及RNA逆转录(RT)成为cDNA，随后进行相对定量PCR(RT-PCR)。
在PCR中，对于每一反应周期，已扩增靶DNA的分子数都增加约为2的因数，直到某些试剂变得不足为止。此后，扩增速度变得愈来愈小，直到各周期之间所扩增的目标不再增加为止。如果以周期数为X轴且以已扩增的靶DNA浓度的对数为Y轴作图，那么可通过连接标绘出的点形成具有特征形状的曲线。由第一周期开始，所述线的斜率为正值且为常数。据认为这是所述曲线的线性部分。某些试剂变得不足后，所述线的斜率开始减小且最终变为0。此时，已扩增的靶DNA的浓度开始渐近于某一固定值。据认为这是所述曲线的平稳部分。
PCR线性部分中靶DNA的浓度与开始PCR之前目标的起始浓度成比例。通过测定PCR反应(所述PCR反应已完成相同数量的周期且处于其线性范围内)中靶DNA的PCR产物的浓度，将有可能测定原始DNA混合物中特定靶序列的相对浓度。如果DNA混合物为由从不同组织或细胞分离的RNA合成的cDNA，那么个别组织或细胞中得到靶序列的特定mRNA的相对丰度可得以测定。PCR产物的浓度与相对mRNA丰度之间的这一直接比例确实在PCR反应的线性范围部分中。
曲线平稳部分中靶DNA的最终浓度是通过反应混合物中试剂的可用性测定，且其与靶DNA的原始浓度无关。因此，在一实施例中，当PCR反应处于其曲线的线性部分中时，对已扩增的PCR产物进行取样和量化。此外，可将可扩增cDNA的相对浓度标准化为某一独立标准，这可基于内部现存的RNA物质或外部引入的RNA物质。特定mRNA物质的丰度也可相对于样本中所有mRNA物质的平均丰度测定。
在一实施例中，PCR扩增利用与目标具有大致相同的丰度的PCR内标物。如果在线性期对PCR扩增产物取样，那么这一策略是极为有效的。如果当反应接近平稳期时对产物取样，那么较小丰度的产物可变得相对过量。以使得RNA的相对丰度差异小于实际差异的方式，对许多不同RNA样本所作的相对丰度的比较变得不正常，当就差别表达检查RNA样本时情况如此。如果内标物比目标丰富得多，那么可对其进行改进。如果内标物比目标丰富，那么可进行RNA样本之间的直接线性比较。
临床样本的固有问题在于其具有可变的数量或质量。如果用内标物进行相对定量RT-PCR形式的RT-PCR，那么这一问题可得以克服，其中内标物为比靶cDNA片段大的可扩增cDNA片段且其中编码内标物的mRNA的丰度比编码目标的mRNA的丰度高约5-100倍。这一检定将测量个别mRNA物质的相对丰度，而非绝对丰度。
在另一实施例中，相对定量RT-PCR使用外标物方案。在这一方案中，在PCR产物扩增曲线的线性部分对PCR产物取样。对各靶cDNA片段取样的最佳PCR周期数可凭经验确定。此外，可关于等浓度的可扩增cDNA将从各种样本分离的各RNA群体的逆转录酶产物标准化。虽然经验确定cDNA制剂的扩增曲线和标准化的线性范围是冗长且耗时的过程，但在某些情况下，所得RT-PCR检定可能优于那些源自用内标物进行相对定量RT-PCR的检定。
在又一实施例中，可使用核酸阵列(包括微珠阵列)检测或比较所关注的预后基因的表达谱。核酸阵列可为市售寡核苷酸或cDNA阵列。其也可为包含针对本发明的预后基因的浓探针的定制阵列。在许多实例中，本发明的定制阵列上至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的总探针为针对白血病预后基因的探针。这些探针可在严格或核酸阵列杂交条件下与相应预后基因的RNA转录物或其补体杂交。
如本文所使用，“严格条件”至少与(例如)表10中所示的条件G-L一样严格。“高度严格条件”至少与表10中所示的条件A-F一样严格。杂交是在杂交条件(杂交温度和缓冲液)下进行约4小时，接着在相应洗涤条件(洗涤温度和缓冲液)下进行两次各20分钟的洗涤。
表10.严格条件 1杂交体长度为杂交聚核苷酸的杂交区所预期的长度。当将聚核苷酸与未知序列的靶聚核苷酸杂交时，假定杂交体长度为杂交聚核苷酸的长度。当杂交已知序列的聚核苷酸时，杂交体长度可通过比对聚核苷酸序列且鉴别一个或一个以上具有最佳序列互补性的区域加以确定。
H杂交和洗涤缓冲液中，可用SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)替代SSC(1×SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)。
TB*-TR*预期长度小于50个碱基对的杂交体的杂交温度应比杂交体的熔解温度(Tm)低5-10℃，其中Tm是根据以下等式确定。对长度小于18个碱基对的杂交体来说，Tm(℃)＝2(A+T碱基的数目)+4(G+C碱基的数目)。对长度在18个与49个碱基对之间的杂交体来说，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N为杂交体中碱基的数目，且[Na+]为杂交缓冲液中钠离子的摩尔浓度(对于1×SSC而言，[Na+]＝0.165M)。
在一实例中，本发明的核酸阵列包括至少2个、5个、10个或更多个不同探针。这些探针中的每一者都能够在严格或核酸阵列杂交条件下与本发明的个别不同预后基因杂交。可将针对相同预后基因的多个探针用于相同核酸阵列中。所述阵列中的探针密度可在任何范围内。
针对本发明的预后基因的探针可为核酸探针，诸如DNA、RNA、PNA或其经修饰形式。各探针中的核苷酸残基可为天然存在的残基(诸如，脱氧腺苷酸、脱氧胞苷酸、脱氧鸟苷酸、脱氧胸苷酸、腺苷酸、胞苷酸、鸟苷酸和尿苷酸)或能够形成所需碱基配对关系的经由合成产生的类似物。这些类似物的实例包括(但不限于)氮杂嘧啶和去氮嘧啶类似物、氮杂嘌呤和去氮嘌呤类似物和其它杂环碱基类似物，其中嘌呤和嘧啶环中一个或一个以上碳原子和氮原子经诸如氧、硫、硒和磷的杂原子取代。类似地，探针的聚核苷酸主链可为天然存在的(诸如从5′到3′的键)或经修饰的聚核苷酸主链。举例来说，核苷酸单元可经由非典型键(诸如5′到2′的键)连接，只要键不干扰杂交即可。另举例来说，可使用组成碱基通过肽键而非磷酸二酯键连接的肽核酸。
针对预后基因的探针可与核酸阵列上的离散区稳定连接。“稳定连接”意谓杂交和信号检测期间探针相对于所连接的离散区保持其位置。核酸阵列上各离散区的位置可为已知或可测定的。可使用所属领域中已知的所有方法制造本发明的核酸阵列。
在另一实施例中，可使用核酸酶保护检定对外周血样中的RNA转录物水平定量。存在许多不同型式的核酸酶保护检定。这些核酸酶保护检定的共同特征在于其都涉及反义核酸与待定量的RNA杂交。然后用消化单链核酸比消化双链分子更有效的核酸酶消化所得的杂交双链分子。在消化后幸存的反义核酸的量为待定量的靶RNA物质的量的量度。合适的核酸酶保护检定的实例包括由Ambion，Inc.(Austin，Texas)提供的RNase保护检定。
针对本发明的预后基因的杂交探针或扩增引物可使用所属领域中已知的任何方法制备。对基因组位置尚未确定或一致性仅基于EST或mRNA数据的预后基因来说，针对这些基因的探针/引物可得自具有相应限定符的靶序列或相应EST或mRNA序列。
在一实施例中，针对预后基因的探针/引物显著偏离其它预后基因的序列。这可通过对人类基因组序列数据库(诸如NCBI的Entrez数据库)检查潜在探针/引物序列而达成。适用于这一目的的一种算法为BLAST算法。这种算法涉及首先通过在查询序列(querysequence)中鉴别具有长度W的短字来鉴别高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中具有相同长度的字相比对时，所述HSP匹配或符合某个正值临界值得分T。T称为邻近字得分临界值。最初的邻近字匹配将充当起始搜索以寻找含有其的更长HSP的根源。然后沿各序列双向延伸字匹配以增加累积比对得分。对核苷酸序列使用参数M(一对匹配残基获得得分；通常＞0)和N(错配残基处罚计分；通常＜0)计算累积计分。BLAST算法参数W、T及X测定比对的灵敏性和速度。如所属领域的技术人员所了解，这些参数可随不同目的而调整。
在另一实施例中，针对预后基因的探针在性质上可为多肽，诸如抗体探针。因此，通过测量由预后基因所编码的多肽水平来测定本发明预后基因的表达水平。适用于这一目的的方法包括(但不限于)免疫检定(诸如ELISA、RIA、FACS、斑点印迹、Western印迹法)、免疫组织化学和基于抗体的放射成像。此外，可使用高通量蛋白质测序、二维SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱或蛋白质检定。
在一实施例中，使用ELISA检测靶蛋白质的水平。在示范性ELISA中，将能够与靶蛋白质结合的抗体固定于所选择的展现蛋白质亲和力的表面(诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯微量滴定板中的孔)上。随后，将待测试的样本加到各孔中。在结合并洗涤移除非特异性结合的免疫复合物后，可对已结合的抗原进行检测。可通过加入对靶蛋白质具特异性并且与可检测标记连接的第二抗体来达成检测。检测也可通过加入第二抗体，随后加入对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体来达成，其中所述第三抗体与可检测标记连接。在加到微量滴定板中之前，可将样本中的细胞溶解或提取以使靶蛋白质与潜在干扰物质分离。
在另一示范性ELISA中，将怀疑含有靶蛋白质的样本固定于孔表面，且随后使其与抗体接触。在结合并洗涤移除非特异性结合的免疫复合物后，可对已结合的抗原进行检测。当初始抗体与可检测标记连接时，可对免疫复合物直接进行检测。还可使用对第一抗体具有结合亲和力的第二抗体检测免疫复合物，其中所述第二抗体与可检测标记连接。
另一示范性ELISA涉及在检定时使用抗体竞争。在这一ELISA中，将靶蛋白质固定于孔表面上。将经标记的抗体加到孔中，使其与靶蛋白质结合，并且借助其标记进行检测。接着，在与经涂覆孔一起培育之前或培育期间，通过将样本与经标记抗体混合来测定未知样本中靶蛋白质的量。未知样本中靶蛋白质的存在起到降低可用于与孔结合的抗体的量且由此减少最终信号的作用。
不同的ELISA格式可具有某些共同特征，诸如涂布、培育或结合、洗涤以移除非特异性结合的物质和检测已结合的免疫复合物。举例来说，在用抗原或抗体涂板时，可将培养板的孔与抗原或抗体溶液一起培育整夜或一段特定的时间段。随后，洗涤培养板的孔以移除未完全吸附的材料。接着，用对于测试样本呈抗原性中性的非特异性蛋白“涂布”各孔中的任何残余可用表面。这些非特异性蛋白的实例包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和奶粉溶液。所述涂布允许封闭固定表面上的非特异性吸附位点，且由此减少由抗血清于所述表面上的非特异性结合所引起的背景。
在ELISA中，可使用二级或三级检测方式。在蛋白质或抗体与各孔结合、用非反应性材料涂布以减少背景且洗涤以移除未结合材料之后，在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下，使固定表面与对照或待测试的临床样本或生物样本接触。这些条件可包括(例如)用诸如BSA、牛γ球蛋白(BGG)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)/Tween的溶液稀释抗原和抗体，和在室温下培育抗体和抗原约1到4小时或在4℃下培育整夜。通过使用经标记的次级结合配体或抗体，或次级结合配体或抗体与经标记三级抗体或第三结合配体的组合来促进对免疫复合物的检测。
ELISA中所有培育步骤之后，可洗涤接触表面从而移除未复合的材料。举例来说，可用诸如PBS/Tween或硼酸盐缓冲液的溶液洗涤表面。在测试样本与最初结合的材料之间形成特异性免疫复合物且随后进行洗涤之后，可测定一定量免疫复合物的出现。
为提供检测方式，第二抗体或第三抗体可具有相关标记以允许检测。在一实施例中，标记为与适当发色底物一起培育时显现颜色的酶。因此，举例来说，可在有助于另外形成免疫复合物的条件下，使第一或第二免疫复合物与接合脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶的抗体接触并培育一段时间(例如，在室温下于含有PBS的溶液(诸如PBS-Tween)中培育2小时)。
在与经标记抗体一起培育且随后洗涤移除未结合的材料之后，可(例如)通过与发色底物(诸如脲和溴甲酚紫)或在以过氧化物酶作为酶标记的情况下与2，2′-叠氮基-二-(3-乙基)-苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和H2O2一起培育来确定标记的量。定量可通过使用分光光度计测量颜色产生的程度来达成。
另一适用于检测多肽水平的方法为RIA(放射免疫检定)。示范性RIA是基于经放射标记的多肽与未经标记的多肽之间对于结合有限量抗体的竞争。适当的放射标记包括(但不限于)I125。在一实施例中，将固定浓度的经I125标记的多肽与经一系列稀释的对多肽具特异性的抗体一起培育。当将未经标记的多肽加到系统中时，与抗体结合的I125-多肽的量减少。因此，可构建标准曲线以表示与抗体结合的I125-多肽随未经标记的多肽浓度变化的量。从这一标准曲线可知，可测定未知样本中多肽的浓度。所属领域中众所周知进行RIA的方案。
用于本发明的适当抗体包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人化抗体、单链抗体、Fab片段或由Fab表达文库产生的片段。也可使用中和抗体(即，抑制二聚体形成的抗体)。所属领域中众所周知制备这些抗体的方法。在一实施例中，本发明的抗体可与相应的预后基因产物或其它所需抗原以至少104M-1、105M-1、106M-1、107M-1或更高的结合亲和力结合。
本发明的抗体可经一个或一个以上可检测部分标记以允许检测抗体-抗原复合物。可检测部分可包括可通过光谱、酶促、光化学、生物化学、生物电子学、免疫化学、电学、光学或化学方式检测的组成。可检测部分包括(但不限于)放射性同位素、化学发光化合物、经标记结合蛋白、重金属原子、光谱标记(诸如荧光标记和染料)、磁性标记、连接酶、质谱标签、自旋标记、电子转移供体和受体等。
本发明的抗体可用作探针以构建用于检测预后基因的表达谱的蛋白质阵列。所属领域中众所周知用于制造蛋白质阵列或生物芯片的方法。在许多实施例中，本发明的蛋白质阵列上的相当一部分探针为对预后基因产物具特异性的抗体。举例来说，蛋白质阵列上至少10％、20％、30％、40％、50％或更多探针可为对预后基因产物具特异性的抗体。
另一方面，预后基因的表达水平可通过测量这些基因的生物功能或活性来测定。当已知基因的生物功能或活性时，可开发适当的活体外或活体内检定以评估所述功能或活性。这些检定随后可用于评定预后基因的表达水平。
在测定各预后基因的表达水平之后，可使用多种方法比较表达谱。可以人工或电子方式进行对所关注的患者的表达谱与参考表达谱的比较。在一实例中，通过将一种表达谱中的每一组分与参考表达谱中的相应组分相比较来进行比较。所述组分可为预后基因的表达水平、两个预后基因表达水平之间的比率或能够代表基因表达模式的另一量度。基因表达水平可具有绝对值或标准化值或相对值。两种相应组分之间的差异可通过改变倍数、绝对差异或其它适当的方式评定。
也可使用图形识别或比较程序(诸如，如Armstrong等人，NATURE GENETICS，3041-47(2002)中所述的k最近邻算法或如下文所述的加权投票算法)进行对所关注的患者的表达谱与参考表达谱的比较。此外，可使用基因表达的连续分析(SAGE)技术、GEMTOOLS基因表达分析程序(Incyte Pharmaceuticals)、GeneCalling和定量表达分析技术(Curagen)和其它适当的方法、程序或系统比较表达谱。
可将多个预后基因用于表达谱的比较中。举例来说，可使用2个、4个、6个、8个、10个、12个、14个或更多个预后基因。此外，可对用于比较的预后基因加以选择以具有相对小的p值(例如，双边p值)。在许多实例中，p值表示不同类患者中基因表达水平之间差异的统计学显著性。在许多其它实例中，p值表明基因表达模式与临床结果之间相关性的统计学显著性。在一实施例中，用于比较的预后基因具有不高于0.05、0.01、0.001、0.0005、0.0001或更低的p值。也可使用p值高于0.05的预后基因。可(例如)通过使用相对少量的血样鉴别这些基因。
所关注的患者的表达谱与参考表达谱之间的相似性或差异将指示所关注的患者的类别成员。可通过任何适当的方式测定相似性或差异。所述比较可为定性比较、定量比较或二者。
在一实例中，参考谱中的组分为平均值，且所关注的患者的表达谱中的相应组分处于所述平均值的标准差内。在此情况下，可关于所述特定组分认为所关注的患者的表达谱与参考谱相似。可使用其它标准(诸如，标准差的倍数或分率或一定程度的增加或降低百分比)测量相似性。
在另一实例中，认为所关注的患者的表达谱中至少50％(例如，至少60％、70％、80％、90％或更高)的组分与参考谱中的相应组分类似。在这些情况下，可认为所关注的患者的表达谱与参考谱类似。表达谱中的不同组分可具有不同的权重以供比较。在一些情况下，使用较低百分比的临界值(例如，总组分中小于50％)测定相似性。
可对预后基因和相似性标准进行选择，从而使结果预测的准确率(正确指令比正确指令和不正确指令的总和的比率)相对较高。举例来说，预测准确率可为至少50％、60％、70％、80％、90％或更高。
结果预测的有效性可由灵敏性和特异性评定。可对预后基因和比较标准加以选择，从而使结果预测的灵敏性与特异性相对较高。举例来说，灵敏性和特异性可为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。如本文所使用的“灵敏性”是指正确阳性指令比真阳性指令加假阴性指令的总和的比率，且“特异性”是指正确阴性指令比真阴性指令加假阳性指令的总和的比率。
另外，可将基于外周血液表达谱的结果预测与其它临床证据或预后方法相组合以改善结果预测的有效性或准确率。
在许多实施例中，将所关注的患者的表达谱与至少两种参考表达谱相比较。各参考表达谱可包括平均表达谱或一组个别表达谱，所述组中每一者都代表特定AML患者或无疾病人类中的外周血液基因表达模式。用于将一种表达谱与两种或两种以上参考表达谱相比较的适当方法包括(但不限于)加权投票算法或k最近邻算法。能够进行这些算法的软件包括(但不限于)GeneCluster 2软件。GeneCluster 2软件可购自WhiteheadInstitute的Genome Research的MIT Center(例如，www-genome.wi.mit.edu/cancer/software/genecluster2/gc2.html)。
加权投票算法与k最近邻算法都使用可有效地将所关注的患者分配到结果类别中的基因分类因子。“有效”意谓类别分配在统计学上显著。在一实例中，类别分配的有效性可通过留一交叉验证或k倍交叉验证予以评价。在这些交叉验证方法中，预测准确率可例如为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。在这些交叉验证方法中，预测灵敏性或特异性也可例如为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。具有低分配灵敏性/特异性或低交叉验证准确率(诸如小于50％)的预后基因或类别预测因子也可用于本发明中。
在一种型式的加权投票算法中，类别预测因子中的各基因将加权投票投到两类(类别0和类别1)中的一类中。基因“g”的得票数可定义为vg＝ag(xg-bg)，其中ag等于P(g，c)并且反映基因“g”的表达水平与两类之间的类别差异之间的相关性，bg计算为bg＝[x0(g)+x1(g)]/2且表示类别0和类别1中基因“g”的表达水平的平均对数的平均值，且xg为所关注的样本中基因“g”的表达水平的标准化对数。正vg表示类别0的得票数，且负vg表示类别1的得票数。V0表示所有正得票数的总和，且V1表示所有负得票数的总和的绝对值。预测强度PS定义为PS＝(V0-V1)/(V0+V1)。因此，预测强度在-1与1之间变化，且可表示对一类(例如，正PS)或另一类(例如，负PS)的支持。接近“0”的预测强度表明险胜(narrow margin of victory)且接近“1”或“-1”的预测强度指示大胜(wide margin of victory)。参看Slonim等人，PROCS.OF THE FOURTH ANNUALINTERNATIONAL CONFERENCE ON COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Tokyo，Japan，4月8日-11日，第263-272页(2000)；和Golub等人，SCIENCE，286531-537(1999)。
适当的预测强度(PS)临界值可通过绘制累积交叉验证误差率对预测强度的图来评定。在一实施例中，如果所关注的样本的PS绝对值不小于0.3，那么可得到正预测。也可选择其它PS临界值(诸如，不小于0.1、0.2、0.4或0.5)用于类别预测。在许多实施例中，对临界值加以选择，从而使预测准确率最优化并且使假阳性结果与假阴性结果的发生率减到最小。
根据本发明构建的任何类别预测因子都可用于所关注的白血病患者的类别分配中。在许多实例中，本发明所使用的类别预测因子包括通过近邻分析鉴别的n个预后基因，其中n为大于1的整数。这些预后基因中有一半具有最大P(g，c)得分，且另一半具有最大-P(g，c)得分。因此，数字n为定义类别预测因子的唯一自由参数。
还可通过其它方式将所关注的患者的表达谱与两种或两种以上参考表达谱相比较。举例来说，参考表达谱可包括各类患者的平均外周血液表达谱。事实上，所关注的患者的表达谱与一种参考谱的相似性高于其与另一种参考谱的相似性表明，所关注的患者的临床结果与前一种参考谱的相关性很可能比其与后一种参考谱的相关性强。
在一特定实施例中，本发明提供对于所关注的AML患者的临床结果的预测。可基于对指定治疗方案的反应将AML患者分成至少两类。一类患者(反应者)对治疗反应而呈现完全缓解，且另一类患者(无反应者)对治疗反应而无缓解或呈现部分缓解。可对与这两类患者之间的类别差异相关的AML预后基因进行鉴别，且随后使用其将所关注的患者分配到这两个结果类别中的一个中。适用于这一目的的AML预后基因的实例描述于表1和表2中。
在一实例中，治疗方案包括投与至少一种化学治疗剂(例如，柔红霉素或阿糖胞苷)和与细胞毒性剂接合的抗CD33抗体(例如，吉妥单抗)，且通过使用加权投票算法或k最近邻算法将所关注的AML患者的表达谱与两种或两种以上参考表达谱相比较。所有这些表达谱都为基线图谱，其代表治疗方案前的外周血液基因表达模式。可将包括至少一个选自表1的基因和至少一个选自表2的基因的分类因子用于结果预测中。举例来说，分类因子可包括至少1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个或更多个选自表1的基因，和至少1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个或更多个选自表2的基因。从表1中选择的基因总数可等于或不同于选自表2的基因总数。
能够区别三种或三种以上结果类别的预后基因或类别预测因子也可用于本发明中。可使用多类相关性度量鉴别这些预后基因。用于进行多类别相关性分析的适当程序包括(但不限于)GeneCluster 2软件(Whitehead Institute，Cambridge，MA的Genome Research的MIT Center)。在所述分析中，可将患有特定类型白血病的患者分成至少三类，且每一类患者都具有不同的个别临床结果。相对于另一类患者的PBMC，以多类相关性分析鉴别的预后基因在一类患者的PBMC中差别表达。在一实施例中，在假定检验中经鉴别预后基因以高于1％、5％、10％、25％或50％的显著性水平与类别差异相关。类别差异表示具有不同临床结果的患者的外周血样中经鉴别基因的理想表达模式。
举例来说，图1A和1B说明用于区别对Mylotarg组合疗法反应或无反应的患者的PBMC的基因分类因子的鉴别和交叉验证。图1A展示98个类别相关基因的相对表达水平。如图所示，有反应患者PBMC中有49个基因相对于无反应患者的PBMC升高；且其它49个基因在无反应患者的PBMC中相对于有反应患者的PBMC升高。图1B描述使用由表1和表2中所述的154个基因组成的类别预测因子对各样本的交叉验证结果。进行留一交叉验证法并且计算各样本的预测强度。以与图1A中的最近邻分析相同的次序对样本排序。
154基因分类因子展现出82％的灵敏性，对本研究中28位真反应者中的24位作出正确鉴别。基因分类因子还展现出75％的特异性，对本研究中8位真无反应者中的6位作出正确鉴别。用由10倍交叉验证法和留一交叉验证法鉴别的最佳基因分类因子观察类似灵敏性、特异性和总体准确率。
上述调查对于治疗前AML患者的外周血样中的表达模式进行评价，并且鉴别出与对疗法的最初反应相关的转录信号。这项研究的结果证实，药物基因组学外周血液图谱战略使得能够鉴别对GO组合疗法反应而具有高的阳性结果或阴性结果可能性的患者。
诊断或监测AML发展、进展或治疗 可容易地将上述方法(包括血样的制备、类别预测因子的组装和表达谱的构建和比较)用于诊断或监测AML发展、进展或治疗。这可通过将所关注的个体中一个或一个以上AML疾病基因的表达谱与至少一种AML疾病基因的参考表达谱相比较来达成。所述参考表达谱可包括平均表达谱或一组个别表达谱，所述组中每一者都代表特定AML患者或无疾病人类中外周血液基因的表达。所关注的个体的表达谱与参考表达谱之间的相似性指示AML疾病状态存在与否。在许多实施例中，用于AML诊断的疾病基因选自表7。
一个或一个以上选自表7的AML疾病基因可用于AML的诊断或疾病监测。在一实施例中，各AML疾病基因都具有小于0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001或更低的p值。在另一实施例中，AML疾病基因包含至少一个“AML/无疾病”比率不小于2的基因和至少一个“AML/无疾病”比率不超过0.5的基因。
本发明的白血病疾病基因可单独用于或与其它临床测试组合用于白血病的诊断或疾病监测。用于检测或诊断白血病的常规方法包括(但不限于)骨髓穿刺、骨髓活检、有关白血细胞、血小板或血色素异常水平的血液测试、细胞遗传学、脊髓穿刺、胸部X射线或淋巴结、脾和肝肿大的身体检查。除本发明的方法外，还可使用这些方法中的任一种以及任何其它常规或非常规方法以改善白血病诊断的准确率。
本发明还提供可用于AML或其它白血病的预后、诊断或治疗选择的电子系统。这些系统包括用于接收所关注的患者的表达谱或参考表达谱的输入或通讯装置。可将参考表达谱存储于数据库或其它媒体中。表达谱之间的比较可以电子装置、诸如通过处理器或计算机进行。所述处理器或计算机可执行一个或一个以上将所关注的患者的表达谱与参考表达谱相比较的程序。可将程序存储于记忆器中或从另一来源(诸如互联网服务器)下载程序。在一实例中，程序包括k最近邻算法或加权投票算法。在另一实例中，将电子系统与核酸阵列耦合且可接收或处理由核酸阵列产生的表达数据。
用于白血病预后、诊断或治疗选择的试剂盒 此外，本发明提供可用于AML或其它白血病的预后、诊断或治疗选择的试剂盒。各试剂盒包括至少一个针对白血病预后基因或疾病基因的探针或基本上由至少一个针对白血病预后基因或疾病基因的探针组成(例如，选自表1、2、3、4、5、6、7、8或9的基因)。还可包括有利于试剂盒使用的试剂或缓冲液。可将任何类型的探针用于本发明中，诸如杂交探针、扩增引物或抗体。
在一实施例中，本发明的试剂盒包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个聚核苷酸探针或引物，或基本上由至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个聚核苷酸探针或引物组成。各探针/引物可在严格条件或核酸阵列杂交条件下与不同的个别白血病预后基因或疾病基因杂交。如本文所使用，如果聚核苷酸可与基因的RNA转录物或其补体杂交，那么所述聚核苷酸可与所述基因杂交。在另一实施例中，本发明的试剂盒包括一种或一种以上抗体，所述抗体中每一者都能够与由不同个别白血病预后基因或疾病基因编码的多肽结合。
在一实例中，本发明的试剂盒包括针对至少1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个或更多个选自表2a的基因的探针(例如，杂交或PCR扩增探针或抗体)和针对至少1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个或更多个选自表2b的基因的探针，或基本上由所述探针组成。针对选自表2a的基因的探针的总数可等于或不同于针对选自表2b的基因的探针的总数。
本发明中所使用的探针可经标记或未经标记。经标记探针可通过光谱、光化学、生物化学、生物电子学、免疫化学、电学、光学、化学方式或任何其它方式检测。用于探针的示范性标记部分包括放射性同位素、化学发光化合物、经标记结合蛋白、重金属原子、光谱标记(诸如荧光标记和染料)、磁性标记、连接酶、质谱标签、自旋标记、电子转移供体和受体等。
本发明的试剂盒还可具有容纳缓冲液或报告因子构件的容器。此外，所述试剂盒可包括用于进行阳性对照或阴性对照的试剂。在一实施例中，本发明中所使用的探针与一个或一个以上底物载体稳定地连接。可在所述底物载体上直接进行核酸杂交或免疫检定。用于这一目的的适当底物载体包括(但不限于)玻璃、二氧化硅、陶瓷制品、尼龙、石英晶片、凝胶、金属、纸、微珠、管、纤维、薄膜、膜、柱基质或微量滴定板孔。本发明的试剂盒还可含有一个或一个以上对照，其各自表示可由所述试剂盒中所含的一个或一个以上探针检测的预后基因或诊断基因的参考表达水平。
本发明还允许AML或其它白血病的个体化治疗。可根据本发明对多种治疗选择或方案进行分析，从而鉴别各治疗方案中的预后基因。所关注的患者的这些预后基因的外周血液表达谱指示患者临床结果，且因此可用于选择对患者具有有利预后的治疗。如本文所使用的“有利”预后为比所关注的患者的所有其它可用治疗中的大多数治疗的预后更好的预后。也可鉴别具有最佳预后的治疗方案。
可以手工或电子装置进行治疗选择。可将参考表达谱或基因分类因子存储于数据库中。能够进行算法(诸如k最近邻算法或加权投票算法)的程序可用于将所关注的患者的外周血液表达谱与数据库相比较以确定何种治疗应用于患者。
应了解，上述实施例和以下实例仅出于说明的目的而非限制的目的给出。所属领域技术人员根据本发明将了解本发明范围内的各种改变和变更。
实例 实例1.临床试验和数据收集 实验设计 AML患者(13名女性和23名男性)都为白种人且平均年龄为45岁(在19岁-66岁的范围内)。AML患者的纳入标准包括骨髓中母细胞过量20％；根据FAB分类系统的AML的形态学诊断；和指示阳性CD33+状态的流式细胞分析。参与临床试验需要现场病理学家遵照骨髓穿刺的组织学评估对AML所作的一致病理学诊断。患者细胞遗传特征的概述呈现于表11中。
表11.0903B1-206-US中有助于基线样本的PG同意AML患者的细胞遗传特征 所有患者都接收以下诱导化学疗法的标准过程，且随后在第36天时进行评估。第1天到第7天时，患者接收每天100mg/m2阿糖胞苷的连续输注。第1天到第3天时，以45mg/m2经静脉内(静脉内团注)给予柔红霉素。第4天时，以静脉内输注经约2小时的时间投与吉妥单抗(6mg/m2)。
PBMC的纯化和储存 所有无疾病和AML外周血样都经运输整夜，并且通过Ficoll梯度纯化来对PBMC进行处理。通过血液学分析仪测量全血和经分离PBMC小球中的细胞总数，并且将经分离的PBMC储存于-80℃下直到将RNA从这些样本中提取出来为止。
RNA提取 根据经修改的RNeasy微型试剂盒方法(Qiagen，Valencia，CA，USA)进行RNA提取。简单说来，在含有0.1％β-巯基乙醇的RLT溶解缓冲液中消化PBMC小球，并且使用RNeasy微型试剂盒进行全RNA的分离。随后进行酚:氯仿提取，并且使用Rneasy微型试剂盒试剂再纯化RNA。使用Spectramax 96孔板UV读数器(Molecular Devices.Sunnyvale，CA，USA)监测A260/280OD值来量化所洗脱的RNA。通过凝胶电泳评定各RNA样本的品质。
RNA扩增和基因芯片杂交探针的产生 根据标准实验室方法制备用于寡核苷酸探针的经标记目标。简单说来，使用在5′端含有T7DNA聚合酶启动子的寡-(dT)24引物将2微克全RNA转化成cDNA。将所述cDNA用作使用T7DNA聚合酶试剂盒(Ambion，Woodlands，TX，USA)和生物素化CTP和UTP(Enzo，Farmingdale，NY，USA)进行的活体外转录的模板。在94℃下，在40mL最终体积的40mM Tris-乙酸盐(pH 8.0)、100mM KOAc、30mM MgOAc中使经标记cRNA破碎35分钟。在具有100mg/mL鲱鱼精DNA和50mg/mL乙酰化BSA的1× MES缓冲液中对10微克经标记目标进行稀释。各杂交反应中都包括11个细菌基因的活体外合成的转录物。就关于总体转录物的对照转录物的数量而言，这些转录物的丰度在1∶300000(3ppm)到1∶1000(1000ppm)的范围内。根据Affymetrix GeneChipAnalysisSuite User Guide(Affymetrix)，使经标记探针在99℃下变性5分钟，且随后在45℃下变性5分钟，并且将其与由超过22000个人类基因组成的HG U133A寡核苷酸阵列(Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)杂交。在60rpm旋转下，使阵列在45℃下杂交16小时。杂交后，遵循制造商的说明，移除杂交混合物并加以储存，并且使用GeneChipFluidics Station 400(Affymetrix)洗涤阵列并用抗生蛋白链菌素R-藻红蛋白(MolecularProbes)对其进行染色，且用HP GeneArray扫描仪(Hewlett Packard，Palo Alto，CA，USA)进行扫描。这些杂交和洗涤条件统称为“核酸阵列杂交条件”。
Affymetrix信号的产生 使用Affymetrix MicroArray Suite(MAS5)软件处理阵列影像，从而使用MAS5桌面版将阵列扫描仪所产生的原始阵列影像数据(.dat)文档还原成探针特征层面的强度概述(.cel文档)。使用Gene Expression Data System(GEDS)作为图形用户界面，用户将为Expression Profiling Information and Knowledge System(EPIKS)Oracle数据库提供样本说明并且将正确的.cel文档与所述说明相关联。随后数据库处理调用MAS5软件以产生探针组合概述值；使用Affymetrix Affy Signal算法和关于各探针组的AffymetrixAbsolute Detection度量(不存在、存在或界限)概括各序列的探针强度。MAS5还用于通过将截尾均值(trimmed mean)缩放到值100进行的第一遍标准化。使用缩放频率标准化方法(Hill等人，Genome Biol.，2(12)research0055.1-0055.13(2001))将各转录物的“平均差异”值标准化为“频率”值，其中刺入各杂交溶液中具有已知丰度的11种对照cRNA的平均差异用于产生整体校准曲线。随后使用这一校准将所有转录物的平均差异值转化成在1∶300,000(3百万分率(ppm))到1∶1000(1000ppm)范围内以百万分率为单位表示的频率估计值。数据库处理还计算出一系列芯片品质对照度量，并将原始数据和品质对照计算储存于数据库中。所述分析中仅包括通过QC标准的杂交样本。
实例2.AML PBMC中与疾病相关的转录物 使用缩放频率标准化方法将36个AML PBMC样本与20个MDS PBMC和45个健康志愿者PBMC的得自U133A的转录谱共同标准化。对所述图谱中具有大于或等于10ppm(表示为1P，1≥10ppm)的最大频率的一种或一种以上图谱中总共7879种转录物进行检测。
为鉴别AML相关转录物，通过AML谱中的平均表达水平除以正常谱中的平均表达水平来计算AML与正常PBMC之间的平均倍数差异。使用Student t检验(两样本，不等方差)评定各组之间表达差异的显著性。
对于无监督分级聚类而言，使用满足表达过滤因子1P，1≥10ppm的7879种转录物。对数据进行对数转换，并且对基因表达值进行中值集中，且使用平均连锁聚类法和偏心相关性相似性度量(uncentered correlation similarity metric)群集图谱。
使用分级聚类进行的无监督分析证实，来自AML、MDS和正常健康个体的PBMC群集成两个主要聚类，其中第一亚组是仅由正常PBMC构成，且第二亚组是由AML、MDS和正常PBMC构成(图2)。第二亚组进一步分成两个可辨识的亚聚类，其是由主要提供AML PBMC谱的AML样聚类、主要提供MDS PBMC谱的MDS样聚类构成。
通过将来自健康志愿者组(n＝45)的PBMC的平均表达水平与来自AML患者(n＝36)的PBMC的平均表达水平相比较来鉴别外周血液中与AML相关的转录物。在增加的显著性水平下展现正常PBMC与AML PBMC之间至少2倍平均差异的转录物的数量呈现于表12中。总计660种转录物具有至少平均2倍的AML谱与正常PBMC谱之间的差异和未配对Student t检验中小于0.001的显著性。这些转录物呈现于上文的表7中。其中，有382种转录物展现2倍或更高倍数的AML升高的平均表达水平，且具有最高升高倍数的50个基因呈现于表8中。总计278种转录物展现2倍或更低倍数的AML降低的平均表达水平，且AML中具有最高降低倍数的50个基因呈现于表9。
表12.AML与无疾病PBMC之间满足增加水平的显著性的具有2倍改变的基因的数目 在这些研究中，总计382种转录物在AML PBMC中具有显著更高的表达水平。升高的表达水平可归因于1)在循环PBMC中增加的转录活化；或2)循环PBMC中升高的某些细胞亚型的水平。在这项研究中AML PBMC中升高的许多转录物似乎因这些患者的外周循环中所存在的白血病母细胞而促进。已知许多转录物在不成熟或白血病母细胞(髓过氧物酶、v-myb成髓细胞血症原癌基因、v-kit原癌基因、fms相关酪氨酸激酶3、CD34)中特异性表达和/或与疾病过程相关。此外，在AML PBMC中具有最高表达水平的许多转录物在经纯化的单核细胞、B细胞、T细胞和嗜中性粒细胞(数据未展示)集群中处于不可检测或极低的水平，且在健康志愿者观察研究中将其归类为低表达子。因此，据观察以较大量存在于AML PBMC中的大多数转录物不可能主要是由转录活化引起，而是由AML患者的循环中白血病母细胞的存在引起。
相反，在AML PBMC中具有显著较低水平的疾病相关转录物可能为在通常由细胞纯化管分离的一种或一种以上正常细胞类型(单核细胞、B细胞、T细胞和共纯化嗜中性粒细胞)中展现高表达水平的转录物。举例来说，在AML PBMC中具有较低水平的前十种转录物中的八种在其具有大于50ppm的个别纯化细胞类型中具有平均表达水平，且在健康志愿者观察研究中归类为高表达子。因此，据观察以较低量存在于AML PBMC中的大多数转录物不可能主要是由转录阻遏引起，而是由AML患者的富集母细胞的循环中正常单核细胞的存在减少引起。
实例3疗法的转录影响 总计27名AML患者提供可评估的基线且于第36天时提供治疗后PBMC样本。使用缩放频率标准化方法将27个配对AML PBMC样本的得自U133A的转录谱共同标准化。对所述图谱中具有大于或等于10ppm(表示为1P，1≥10ppm)的最大频率的一种或一种以上图谱中总共8809种转录物进行检测。
为鉴别治疗过程中有所改变的转录物，通过第0天基线图谱中的平均表达水平除以治疗后第36天时的图谱中的平均表达水平来计算第0天与第36天时PBMC图谱之间的平均差异倍数。使用Student t检验(两样本，不等方差)评定各组之间表达差异的显著性。
通过将来自基线样本(n＝27)的PBMC中的平均表达水平与来自相同AML患者的治疗后配对样本(n＝27)的PBMC中的平均表达水平相比较来鉴别外周血液中与基于GO的疗法相关的转录物。基线与治疗后PBMC之间展现至少2倍的平均差异且具有增加的显著性水平的转录物的数目呈现于表13中。总计607种转录物具有至少平均2倍的基线与治疗后样本之间的差异，和配对Student t检验中小于0.001的显著性。其中，有348种转录物在治疗过程中展现2倍或更高倍数的平均降低的表达水平，且GO疗法后具有最高降低倍数的50个基因呈现于表14中。总计259种转录物在治疗过程中展现2倍或更高倍数的平均升高的表达水平，且GO疗法后具有最高升高倍数的50个基因呈现于表15中。根据Gene Ontology注释，关于细胞功能对在治疗过程中改变最大(3倍或更高倍数的平均诱导或阻遏)的基因进行注释，且将各种类中转录物的百分比呈现于图3中。
表13.第0天(基线)与第36天(最后探访)之间满足增加水平的显著性的具有2倍改变的基因的数目 表14.36天的治疗方案后在AML PBMC中显著抑制(p＜0.001)的前50种转录物 表15.36天的治疗方案后AML PBMC中显著升高(p＜0.001)的前50种转录物 对AML患者的治疗前与治疗后PBMC图谱的比较揭示在治疗过程中转录物水平出现较大差异。使用Gene Ontology注释对治疗过程中显然受抑制的基因进行的注释(参看图3)证实，治疗后具有较低水平的许多转录物属于未确定的种类。进一步的评估揭示，这些转录物中绝大部分与疾病相关且因治疗后这些患者体内白血病母细胞的消失而以较小数量存在于治疗后样本中。与这一观察结果一致，GO方案后下调的前50种转录物中有45种为疾病(母细胞)相关基因。因此，v-kit、类胰蛋白酶、醛酮还原酶1C3、同源异形盒A9、meis1、髓过氧物酶的下调和展现最高倍数降低的大部分其它转录物可能是由循环中白血病母细胞的消失引起，而非化学疗法方案的直接转录作用引起。
对治疗后于PBMC中具有较高水平的转录物进行的评估揭示相反倾向，并且证实，这些转录物中绝大多数与正常PBMC表达相关且因大多数经治疗患者体内正常单核细胞的再现而以较高数量存在于治疗后样本中。GO方案后上调的前50种转录物中总计31种为与正常单核细胞表达相关的转录物。因此，TGF-β诱导蛋白(68kDa)、血栓调节蛋白、假定淋巴细胞G0/G1开关基因和大多数其它转录物的上调可能是由白血病母细胞的消失和循环中正常细胞的再增殖引起，而非化学疗法方案的直接转录作用引起。
对于较少数量的基因而言，转录活化或阻遏可为引起转录物水平差异的原因。举例来说，治疗后将诱导细胞色素P4501A1(CYP1A1)，但与正常单核细胞表达并不显著相关(即，与正常PBMC相比，AML PBMC中CYP1A1未受显著抑制)。柔红霉素的代谢中涉及CYP1A1，且柔红霉素为CYP1A1活性的机理性失活剂(mechanism-basedinactivator)。因此，CYP1A1 mRNA的升高可表示对本治疗方案的反馈性转录反应。干扰素可诱导的蛋白质在治疗期间也有所升高(干扰素可诱导的蛋白30、干扰素诱导的跨膜蛋白2)，且这些影响也可表示对治疗过程中所活化的干扰素依赖性信号转导路径的转录诱导。
无论是归因于母细胞的消失、正常细胞总数的升高还是实际转录活化或阻遏，若干PBMC转录物的改变都可为AML进展的功能性结果。TGF-β诱导细胞周期停滞并且拮抗FLT3诱导的白血病细胞增殖，且TGF-β诱导的蛋白质为治疗过程中PBMC中最强烈上调的转录物(＞7倍升高)。
实例4与静脉闭塞疾病相关的预处理表达模式 使用缩放频率标准化方法将36个AML PBMC样本的得自U133A的转录谱共同标准化。对所述图谱中具有大于或等于10ppm(表示为1P，1≥10ppm)的最大频率的一种或一种以上图谱中总共7405种转录物进行检测。
静脉闭塞疾病(VOD)是造血干细胞移植后最严重的并发症之一，并且与其严重形式的极高死亡率相关。为鉴别最终经历VOD的4名患者与32名无VOD患者之间具有显著基线表达差异的转录物，通过4名基线VOD图谱的平均表达水平除以32名基线无VOD图谱的平均表达水平来计算VOD患者图谱与无VOD患者图谱之间的平均差异倍数。使用Student t检验(两样本，不等方差)评定各组之间表达差异的显著性。
通过将来自VOD基线样本(n＝4)的PBMC中的平均表达水平与来自无VOD基线样本(n＝32)的PBMC中的平均表达水平相比较来鉴别与VOD发作显著相关的基线PBMC中的转录物。VOD与无VOD基线PBMC之间展现至少2倍的平均差异且具有增加的显著性水平的转录物的数目呈现于表16中。总计161种转录物具有至少平均2倍的基线VOD与无VOD样本之间的差异，和配对Student t检验中小于0.05的显著性。在161种转录物中，仅3种转录物在基线VOD PBMC中展现2倍或更高倍数的升高的平均表达水平。展示小于2倍但在基线VOD患者中展现最高升高倍数的这些转录物和47种其它转录物呈现于表5中。p-选择素配体(可能在最终经历VOD的患者的PBMC中显著升高的潜在生物学相关转录物)呈现于图4中。
表16.VOD患者(n＝4)与无VOD患者(n＝32)基线样本之间满足增加水平的显著性的具有2倍改变的基因的数目 剩余158种转录物在基线VOD PBMC中展现2倍或更高倍数的降低的平均表达水平，且在基线VOD患者PBMC中具有最高倍数降低的50个基因呈现于表6中。对这一组转录物的评估揭示大多数与白血病母细胞相关的标记。通过微阵列分析得到的这一意料之外的发现实际上表明，具有较低外周母细胞总数的患者可能在基于GO的疗法中更易受VOD影响。
实例5与临床反应相关的预处理转录模式 如前述实例中所述，选择经检测在一种或一种以上图谱中具有大于或等于10ppm的最大频率的7405种转录物用于进一步的评估。
为鉴别8名无反应(NR)患者与28名有反应(R)患者之间具有显著基线表达差异的转录物，通过8名基线NR图谱的平均表达水平除以28名基线R图谱的平均表达水平来计算NR患者图谱与R患者图谱之间的平均差异倍数。使用Student t检验(两样本，不等方差)评定各组之间表达差异的显著性。R与NR基线PBMC之间展现至少2倍的平均差异且具有增加的显著性水平的转录物的数目呈现于表17中。总计113种转录物具有至少平均2倍的基线R与NR样本之间的差异，和配对Student t检验中小于0.05的显著性。在113种转录物中，仅6种转录物在基线无反应者PBMC中展现2倍或更高倍数的升高的平均表达水平。基线反应患者中展示小于2倍但展现最高升高倍数的这些转录物和44种其它转录物呈现于表3中。总计107种转录物在基线无反应者的PBMC中展现2倍或更高倍数的降低的平均表达水平，且具有最高降低倍数的50种基因呈现于表4中。
表17.无反应患者(n＝8)与有反应患者(n＝28)基线样本之间满足增加水平的显著性的具有2倍改变的基因的数目 还特别对由在GO的代谢或作用机制中起到潜在作用的基因所编码的转录物的预处理水平进行询问。MDR1药物外排转运体的水平在所有PBMC样本中都极低，且于基线反应者与无反应者之间无显著差异(图5)。也就以下事件询问Affymetrix U133A基因芯片上所含的ABC转运体家族的剩余成员另一种ABC转运体可能差别表达，但ABC转运体在基线反应者与无反应者PBMC之间都无显著差异(图6)。对AML PBMC中一般较高水平的编码CD33细胞表面受体的转录物的水平进行检测，但与MDR1类似，CD33转录物在基线R与NR PBMC之间也无显著差异(图7)。
为基于基线基因表达模式鉴别能够将反应者与无反应者分类的基因分类因子，使用先前描述和(http://www.genome.wi.mit.edu/cancer/software/genecluster2.html)上可获得的Genecluster 2.0版进行基因选择和监督类别预测。就最近邻分析而言，使用缩放频率方法将36种基线AML PBMC的表达谱与来自GO与柔红霉素组合进行的独立临床试验的14种基线AML PBMC共同标准化。所有表达数据都在分析之前进行z分数标准化。在这一分析中，基于纳入在基线图谱中具有至少一个大于或等于5ppm的值的频率的所有转录物使用总计11382个序列。将36种PBMC基线图谱处理为训练集，且使用含有使用具有将中间值用于类别评估的S2N相似性度量的所有方法中的一种建立含有增加数量的特征(转录物序列)的模型。所有比较都为两成份差异(binary distinction)，且通过10倍交叉验证36种PBMC图谱对各模型(具有增加数量的特征)进行评估。随后，将36种PBMC图谱的10倍交叉验证中所产生的最佳预测模型应用于其它临床试验的14种共同标准化的图谱，以评估从治疗前的AML患者取得的独立临床样本组中基因分类因子的准确率。
通过对本研究中的外周血液AML图谱进行10倍交叉验证已发现10基因分类因子得到最高的全局预测准确率(78％)(图8和表18)。这一基因分类因子展现86％的灵敏性、50％的特异性、86％的正预测值和50％的负预测值。还将这一分类因子用于来自独立研究(其中GO加柔红霉素构成疗法方案)的14种未经测试的图谱；结果呈现于图9中。对于所述14种图谱而言，10基因分类因子展现78％的全局预测准确率、100％的灵敏性、57％的特异性、70％的正预测值和100％的负预测值。
表18.与治疗前反应者(上图)或无反应者(下图)中升高的PBMC水平相关的10基因分类因子中的转录物 将来将研发的一些药物基因组学联合诊断法(pharmacogenomic co-diagnostics)将很可能取决于基于qRT-PCR的检定，其可利用能够准确分类的较小(成对或更大)基因组合。为鉴别较小分类因子，对分别在无反应者与反应者的AML PBMC中过度表达的两个基因(即金属硫蛋白1X/1L和血清糖皮质激素调节激酶)(表19)的基于Affymetrix的表达水平作图，从而确定成对的转录物组合是否能够进行分类(图10，图A)。使用金属硫蛋白1X/1L和血清糖皮质激素调节激酶的两基因分类因子是基于以下因素选择1)其反应者与无反应者种类之间分别显著升高或受抑制的倍数差异；和2)已知注释。对各基线AML样本中各转录物的个别表达水平(以ppm为单位)作图以鉴别对于类别分配提供最高灵敏性和特异性的表达边界点。从最初的36名患者可知，八名无反应者中有6名具有＜30ppm的血清糖皮质激素调节激酶水平和＞30ppm的金属硫蛋白1X/1L水平。28名反应者中仅2名具有类似的基因表达水平。因此，对于这36个样本而言，2基因分类因子展现出88％的表观总体准确率、93％的灵敏性、75％的特异性、93％的正预测值和75％的负预测值。
表19.与治疗前反应者(血清/糖皮质激素调节激酶)或无反应者(金属硫蛋白1L、1X)中水平升高相关的2基因分类因子中的转录物 也将所述2基因分类因子(血清糖皮质激素调节激酶＜30ppm，金属硫蛋白1X、1L＞30ppm)用于来自独立临床试验(其中GO加柔红霉素构成治疗方案)的14种未经测试的图谱中(图10，图B)。在本研究中，2基因分类因子展现与10基因分类因子相同的总体性能，其中全局预测准确率为78％；灵敏性为100％；特异性为57％；正预测值为70％；且负预测值为100％。
表20中列出10基因分类因子与2基因分类因子对于具有36个样本的第一数据集的表观性能特征，和两种分类因子在评估14个独立样本时的实际性能特征。
表20.由交叉验证和测试集得到的2基因分类因子与10基因分类因子的性能特征 在这项分析中，将转录谱应用于基线外周血样以表征可能提供对AML患者对GO组合化学疗法方案反应或不反应的能力的了解或关于其的生物标记的转录模式。在这项研究中，最大百分比的患者具有正常染色体组型(33％)，而其它染色体异常在剩余患者之间相对均匀分布。细胞遗传背景的这种不均匀性使得我们能够分析全组的AML图谱，而无需将其分隔成基于染色体组型的组，其又使我们能够搜索可能与对GO组合方案反应相关的转录模式，而不必考虑这一复合疾病中所涉及的分子异常。尽管近期有关表达特征的描述都与AML中的各种染色体异常有关，但显然标志特征中许多个别转录物的表达对于特定染色体组型并非唯一的。此外，Bullinger等人，(2004)N.Engl.J.Med.3501605-16在其近期研究中重要地证实，尽管具有不同细胞遗传背景，但可检测来自各患者的AML样本中与总体生存相关的相对均匀的转录模式，且这些预后图谱将来自患者测试集的样本分隔成在总体生存中具有显著差异的良好结果与不良结果两类。
本研究的目的无需鉴别与总体生存相关的一般预后图谱，而是鉴别外周血液中的转录模式，如果经验证其还可能允许鉴别从GO组合化学疗法方案获益或不能获益(即，达成最初的缓解)的患者。对于反应者(即，缓解)与无反应者基线图谱的比较可鉴别多种在各组之间显著改变的转录物。
治疗前以较高水平存在于反应患者中的转录物包括T细胞受体α位点、血清/糖皮质激素调节激酶、水通道蛋白9、叉头框03、IL8、TOSO(fas诱导的细胞凋亡的调节子)、IL1受体拮抗剂、p21/cip1、IFN诱导转录物的特定亚单位和其它调节分子。反应者外周血液中升高的转录物的列表可能含有正常外周血液细胞(淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞)与类似母细胞特异性转录物的标记。较高百分比的促凋亡相关分子在最终对疗法反应的患者的外周血液中升高。FOX03为关键的促凋亡分子，其在IL2介导的T细胞存活期间中失活，且目前已证实其在骨髓细胞中FLT3诱导的PBKinase依赖性增殖刺激过程中失活。有关FOX03在最终对GO组合疗法反应的AML患者的外周血液中升高的发现支持以下理论凋亡地“待发”细胞(″primed″cell)将对基于GO的治疗方案且可能对其它化学疗法的作用更为敏感。FOX01A水平与在接收两种不同方案的AML患者中的存活呈正性相关。
还对无法对疗法反应的AML患者的血样中的多种转录物进行评估。对无法对当前GO组合方案反应相关的转录物与目前关于总体生存率报导为不良结果前兆的转录物进行比较。这项研究中无反应者的外周血样中同源异形盒B6水平升高与具有与生存率相关的不良结果的患者体内多个同源异形盒基因的过度表达相一致。同源异形盒B6在正常粒细胞生成和单核细胞生成期间升高，而通常在细胞成熟后将停止。已发现，同源异形盒B6在相当大百分比的AML样本中失调且已提议其在白血病形成中起到作用。
本分析还鉴别若干转录物家族，其中过度表达可能与无法对GO组合方案反应相关且可能与总体生存率无关。若干金属硫蛋白同功异型物在无法对GO组合方案反应的患者的外周血样中升高。基于GO作用机制，预期提高的抗氧化物防御将对chalechiamicin引导的细胞毒性接合物的功效具有不良影响。然而，这些发现与Goasguen等人(1996)Leuk.Lymphoma.23(5-6)567-76所报导的发现形成对照，所述文献将金属硫蛋白过度表达鉴别为在白血病患者中不存在或存在其它药物抗性表型的情况下与完全缓解强烈相关。近来已以AML中的t(15；17)染色体移位标志表征金属硫蛋白同功异型物的过度表达，但本研究中并无任何患者具有这一细胞遗传异常特征。然而，在这项研究中，金属硫蛋白同功异型物过度表达对也发生于若干其它染色体组型中的t(15；17)移位无特异性。
本发明的上述描述提供说明和描述，但不意欲为详尽的或将本发明限于所揭示的准确描述中。修改和变更可能与上述教示相符或可自本发明的实践中获取。因此，应注意，本发明的范围是由权利要求书和其等效内容界定。
权利要求
1.一种预测对白血病的治疗反应的临床结果的方法，所述方法包含以下步骤
(1)在进行所述治疗之前，测量从患者获得的外周血液单核细胞样本中一个或一个以上所述白血病的预后基因的表达水平；和
(2)将每一所述表达水平与相应对照水平相比较，
其中所述比较的结果将预测临床结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或一个以上预后基因包含至少一个选自第一类的第一基因，和选自第二类的第二基因，其中所述第一类包含在经预测对所述治疗反应具有较少所需临床结果的患者的外周血液单核细胞中具有较高表达水平的基因，且所述第二类包含在经预测对所述治疗反应具有较多所需临床结果的患者的外周血液单核细胞中具有较高表达水平的基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一基因选自表3，且所述第二基因选自表4。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一基因选自以下组成的群组锌指蛋白217、肽转运体3、叉头框O3A、T细胞受体α位点和推定的趋化因子受体/GTP结合蛋白，且所述第二基因选自以下组成的群组金属硫蛋白、脂肪酸去饱和酶1、与Affymetrix ID 216336相对应的未确定基因、畸形表皮自调节因子1和生长停滞和DNA损伤诱导蛋白α。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一基因为血清糖皮质激素调节激酶，且所述第二基因为金属硫蛋白1X/1L。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述临床结果为发展出不良事件。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述不良事件为静脉闭塞疾病。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一个或一个以上预后基因包含一个或一个以上选自表5或表6的基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述一个或一个以上预后基因包含p-选择素配体。
10.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述治疗包含吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin，GO)组合疗法。
11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述相应对照水平为数值临界值。
12.一种预测白血病的临床结果的方法，所述方法包含以下步骤
(1)从患有所述白血病的患者的外周血样中产生基因表达谱；和
(2)将所述基因表达谱与一种或一种以上参考表达谱相比较，其中所述基因表达谱和所述一种或一种以上参考表达谱包含外周血液单核细胞中一个或一个以上所述白血病预后基因的表达模式，且其中所述基因表达谱与所述一种或一种以上参考表达谱之间的差异或相似性将指示所述患者的临床结果。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述白血病为急性白血病、慢性白血病、淋巴细胞白血病或非淋巴细胞白血病。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述白血病为急性髓性白血病(AML)。
15.根据权利要求12至14中任一权利要求所述的方法，其中所述临床结果是通过对抗癌疗法的反应进行测量。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗癌疗法包含投与一种或一种以上选自以下组成的群组的化合物抗CD33抗体、柔红霉素(daunorubicin)、阿糖胞苷(cytarabine)、吉妥单抗、蒽环类(anthracycline)和嘧啶或嘌呤核苷酸类似物。
17.根据权利要求12至16中任一权利要求所述的方法，其中所述一个或一个以上预后基因包含一个或一个以上选自表3或表4的基因。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述一个或一个以上预后基因包含十个或十个以上选自表3或表4的基因。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述一个或一个以上预后基因包含二十个或二十个以上选自表3或表4的基因。
20.根据权利要求12至19中任一权利要求所述的方法，其中步骤(2)包含通过k最近邻分析法或加权投票算法比较所述基因表达谱与所述一种或一种以上参考表达谱。
21.根据权利要求12至19中任一权利要求所述的方法，其中所述一种或一种以上参考表达谱表示已知或可测定的临床结果。
22.根据权利要求12至19中任一权利要求所述的方法，其中步骤(2)包含将所述基因表达谱与至少两种参考表达谱相比较，所述参考表达谱各自表示不同的临床结果。
23.根据权利要求22所述的方法，其中每一参考表达谱都表示选自以下组成的群组的不同临床结果对所述抗癌疗法反应而缓解至小于5％的母细胞；对所述抗癌疗法反应而缓解至不少于5％的母细胞；和对所述抗癌疗法反应而无缓解。
24.根据权利要求12至19中任一权利要求所述的方法，其中所述一种或一种以上参考表达谱包含表示无白血病人类的参考表达谱。
25.根据权利要求12至19中任一权利要求所述的方法，其中步骤(1)包含使用核酸阵列产生所述基因表达谱。
26.根据权利要求15所述的方法，其中步骤(1)包含在所述抗癌疗法之前，从所述患者的外周血样中产生所述基因表达谱。
27.一种选择对白血病患者的治疗的方法，所述方法包含以下步骤
(1)从获得自所述白血病患者的外周血样中产生基因表达谱；
(2)将所述基因表达谱与多种参考表达谱相比较，所述参考表达谱各自表示对多种治疗中的一种治疗反应的临床结果；和
(3)根据步骤(2)的比较，从所述多种治疗中选择对于所述白血病患者具有有利临床结果的治疗，
其中所述基因表达谱和所述一种或一种以上参考表达谱包含外周血液单核细胞中一个或一个以上所述白血病预后基因的表达模式。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述一个或一个以上预后基因包含一个或一个以上选自表3或表4的基因。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述一个或一个以上预后基因包含十个或十个以上选自表3或表4的基因。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述一个或一个以上预后基因包含二十个或二十个以上选自表3或表4的基因。
31.根据权利要求27至30中任一权利要求所述的方法，其中步骤(2)包含通过k最近邻分析法或加权投票算法比较所述基因表达谱与所述多种参考表达谱。
32.一种诊断或监测白血病的发生、发展、进展或治疗的方法，所述方法包含以下步骤
(1)由患有所述白血病的患者的外周血样产生基因表达谱；和
(2)将所述基因表达谱与一种或一种以上参考表达谱相比较，
其中所述基因表达谱和所述一种或一种以上参考表达谱包含外周血液单核细胞中一个或一个以上所述白血病诊断基因的表达模式，且其中所述基因表达谱与所述一种或一种以上参考表达谱之间的差异或相似性将指示所述患者的白血病的存在、不存在、发生、发展、进展或治疗有效性。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述白血病为AML。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述一个或一个以上诊断基因包含一个或一个以上选自表7的基因。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述一个或一个以上诊断基因包含一个或一个以上选自表8或表9的基因。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述一个或一个以上诊断基因包含十个或十个以上选自表7的基因。
37.根据权利要求33所述的方法，其中所述一个或一个以上诊断基因包含十个或十个以上选自表8或表9的基因。
38.根据权利要求32所述的方法，其中所述一种或一种以上参考表达谱包含表示无疾病人类的参考表达谱。
39.一种用于预测AML患者的临床结果的方法中的阵列，其包含具有多个位址的底物，各位址包含安置于其上的不同探针，其中至少15％的多个位址具有安置于其上的探针，其可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML预后基因。
40.根据权利要求39所述的阵列，其中至少30％的多个位址具有安置于其上的探针，其可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML预后基因。
41.根据权利要求39所述的阵列，其中至少50％的多个位址具有安置于其上的探针，其可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML预后基因。
42.根据权利要求39至41中任一权利要求所述的阵列，其中所述预后基因选自表3、4、5或6。
43.根据权利要求39至41中任一权利要求所述的阵列，其中所述探针为核酸探针。
44.根据权利要求39至41中任一权利要求所述的阵列，其中所述探针为抗体探针。
45.一种用于诊断AML的方法中的阵列，其包含具有多个位址的底物，各位址包含安置于其上的不同探针，其中至少15％的多个位址具有安置于其上的探针，其可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML诊断基因。
46.根据权利要求45所述的阵列，其中至少30％的多个位址具有安置于其上的探针，其可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML诊断基因。
47.根据权利要求45所述的阵列，其中至少50％的多个位址具有安置于其上的探针，其可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML诊断基因。
48.根据权利要求45至47中任一权利要求所述的阵列，其中所述诊断基因选自表7。
49.根据权利要求45至47中任一权利要求所述的阵列，其中所述探针为核酸探针。
50.根据权利要求45至47中任一权利要求所述的阵列，其中所述探针为抗体探针。
51.一种计算机可读媒体，其包含以数字编码的表达谱，所述表达谱包含多个以数字编码的表达信号，其中所述多个以数字编码的表达信号中的每一者都包含表示外周血液单核细胞中AML预后基因的表达的值。
52.根据权利要求51所述的计算机可读媒体，其中所述预后基因选自表3、4、5或6。
53.根据权利要求51所述的计算机可读媒体，其中所述值表示具有已知或可测定临床结果的患者的外周血液单核细胞中所述AML预后基因的表达。
54.根据权利要求51所述的计算机可读媒体，其中所述以数字编码的表达谱包含至少十个以数字编码的表达信号。
55.一种计算机可读媒体，其包含以数字编码的表达谱，所述表达谱包含多个以数字编码的表达信号，其中所述多个以数字编码的表达信号中的每一者都包含表示外周血液单核细胞中AML诊断基因的表达的值。
56.根据权利要求55所述的计算机可读媒体，其中所述诊断基因选自表7。
57.根据权利要求55所述的计算机可读媒体，其中所述值表示无AML人类的外周血液单核细胞中所述AML诊断基因的表达。
58.根据权利要求55所述的计算机可读媒体，其中所述以数字编码的表达谱包含至少十个以数字编码的表达信号。
59.一种用于AML预后的试剂盒，所述试剂盒包含a)一个或一个以上探针，其可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML预后基因；和b)一个或一个以上对照，其各自表示可通过所述一个或一个以上探针检测的预后基因的参考表达水平。
60.根据权利要求59所述的试剂盒，其中所述预后基因选自表3、4、5或6。
61.一种用于AML诊断的试剂盒，所述试剂盒包含a)一个或一个以上探针，其可特异性地检测外周血液单核细胞中的AML诊断基因；和b)一个或一个以上对照，其各自表示可通过所述一个或一个以上探针检测的预后基因的参考表达水平。
62.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述诊断基因选自表7。
全文摘要
本发明提供用于AML或其它类型白血病的预后、诊断和治疗选择的方法、系统和设备。可根据本发明来鉴别对白血病患者的临床结果具有预后作用的基因。也可根据本发明来鉴别白血病疾病基因。相对于无疾病人类，这些基因在AML患者的PBMC中差别表达。这些基因可用于诊断或监测AML的发展、进展或治疗。
文档编号G01N33/50GK101156067SQ200680011926
公开日2008年4月2日 申请日期2006年2月16日 优先权日2005年2月16日
发明者迈克尔·E·布尔奇斯基, 弗雷德里克·伊默曼, 纳塔莉·C·特温, 珍妮弗·安·斯托弗, 安德鲁·J·多尔纳 申请人:惠氏公司