用于脊髓损伤中抗Nogo-A抗体治疗的生物标记的制作方法

专利名称：：用于脊髓损伤中抗Nogo-A抗体治疗的生物标记的制作方法
技术领域：
：本发明一般地涉及组织样品的体外(/ww7w)分析性检验，并且更具体地涉及因施用抗Nogo-A抗体所诱导的基因表达方面。
背景技术：
：Nogo-A在抑制神经突长出中发挥重要作用。针对Nogo-A的抗体已经证实引起脊髓损伤后的轴突再生及功能性恢复。大量的微阵列基因表达概况研究已经阐述了脊髓损伤后的分子变化。综述见BareyreFM&SchwabME，7Ve"^fe7Ve"fYwc/.26:555-563(2003)。然而，本领域中持续需要抗Nogo-A抗体治疗效力的早期外周生物标记。此类生物标记将用于区分应答者与非应答者以及指导临床环境下的给药。发明简述本发明提供对因使用抗Nogo-A抗体抑制Nogo-A功能而产生的分子变化的描述。已经在体内系统中使用基因组方法鉴定了受Nogo-A抑制或减少的影响的基因及功能性途径。本发明也涉及在临床状况下增进中枢神经系统恢复、增进神经元连接再生及增进神经元塑性及突触塑性的新分子耙，其中所述的临床状况例如但不仅仅是损伤如创伤或中风、神经变性疾病如但不排它性地是阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化、抑郁以及其中轴突或树突的病理是疾病过程的部分或疾病结果的任何其它病症，如但不排它性地是任何脱髓鞘病，如多发性硬化。本发明也涉及靶向Nogo-A和/或因抑制Nogo-A而受影响的基因及途径的新适应症，其例如但不排它性地是神经变性疾病(阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、ALS)、抑症，如但不排它性地是任何脱髓鞘病，如多发性硬化。尤其，本发明涉及用于预测受试者对包含抗Nogo-A抗体的药物应答的方法，其中在施用包含抗Nogo-A抗体的所述药物之前和之后评估表25中至少一种基因的表达，并且其中在施用包含抗Nogo-A抗体的所述药物后表25中所述至少一种基因的所述表达与在包含抗Nogo-A抗体的药物的所述施用之前该基因的表达比较。在具体实施方案中，在施用包含抗Nogo-A抗体的药物后表25中至少一种基因的所述表达与所述施用包含抗Nogo-A抗体的药物之前该基因的表达比较时的失调指示对包含抗Nogo-A抗体的药物的所述施用的阳性应答(应答者)。在另一个实施方案中，在施用包含抗Nogo-A抗体的药物后表25中至少一种基因的所述表达与所述施用包含抗Nogo-A抗体的药物之前该基因的表达比较时缺乏失调指示缺少对包含抗Nogo-A抗体的药物的所述施用的应答(非应答者)。在优选的实施方案中，在施用包含抗Nogo-A抗体的药物后表25中至少一种基因的所述表达的失调是与所述施用包含抗Nogo-A抗体的药物之前该基因的表达比较时，大于或等于1.2倍并且统计学显著(p0.05，斯氏t检验)的表达改变。在最优选的实施方案中，评估黏着基因族、细胞骨架基因族及信号基因族的每个族中至少一种基因的表达，其中所述的黏着基因族由钙黏着蛋白11、钓勦着蛋白2、钓勦着蛋白8、钙縣着蛋白22、Eph受体A3、Eph受体A4、肝配蛋白A3、肝配蛋白B2、Eph受体B2、脑信号蛋白4A、脑信号蛋白4D、脑信号蛋白4F、脑信号蛋白6A、脑信号蛋白6B、semaF胞质结构域相关蛋白3和丛蛋白B2构成，其中所述的细胞骨架基因族由加帽蛋白(细肌丝)类凝溶胶蛋白、酪蛋白激酶1S、中心体肌动蛋白、凝溶胶蛋白、微管相关蛋白质tau和神经丝68构成，并且其中所述的信号基因族由Rho-GDP解离抑制物1、二氢嘧咬酶相关蛋白2、二氢嘧啶酶相关蛋白1、二氢嘧啶酶相关蛋白5构成。在另一个实施方案中，评估了表25中全部基因的表达。在本发明的一个实施方案中，在施用包含抗Nogo-A抗体的药物后表25中至少一种基因的表达与所述施用包含抗Nogo-A抗体的药物之前该基因的表达比较时的失调表明中枢神经系统再生。本发明的方法可以在体外开展。本发明还包含抗Nogo-A抗体在制造用于在患者群中治疗中枢神经系统损伤的药物中的用途，其中如本文中所述选择患者群。优选地，抗Nogo-A抗体是与人Nogo-A片段从第342-357位氨基酸的表位结合的完全的人单克隆抗体(IgG4/k)。本发明也涉及用于在受试者中以抗Nogo-A抗体治疗中枢神经系统损伤的方法和用于在施用抗Nogo-A抗体后的受试者中诊断中枢神经系统再生的方法。此外，本发明还包含用于开展本文中所述方法的试剂盒，该试剂盒包含至少两种探针，每种探针能够特异性地检测表25中一种基因的表达，其中所述的至少两种探针不检测相同基因的表达。因抑制Nogo-A而受影响的基因及分子途径本身可以治疗性地作为针对与可由Nogo-A抗体疗法治疗的那些病症相似病症的靶标。备选地，设计用于因抑制Nogo-A而受影响的基因及途径的新治疗法可以用作添加疗法以增进Nogo-A抑制的疗效。此外，因抑制Nogo-A而受影响的基因及途径为Nogo-A的抑制提供治疗适应症，如，但不排它性地是其中神经元塑性或突触塑性受影响的病症，如认知损伤相关的神经变性疾病(阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病)及精神障碍。附图简述附图以举例方式而非限制性方式描述优选的实施方案。在图中，相似的参考数字指相同或相似的要素。图1.由GSEA在T8中所鉴定的治疗一周后在11C7的方向上免疫及防雄卩相关性转录物的富集。图2.由GSEA在T8中所鉴定的治疗一周后在11C7的方向上细胞因子及趋化因子介导的信号传导途径的富集。图3.由GSEA在T8中所鉴定的治疗一周后在11C7的方向上Jak-stat级联相关性转录物的富集。图4.由GSEA在T8中所鉴定的治疗二周后在11C7的方向上氧化磷酸化相关性转录物的富集。图5.由GSEA在T8中所鉴定的治疗二周后在11C7的方向上突触传递相关性转录物的富集。图6.由GSEA在Tl-7中所鉴定的治疗一周后在IgG的方向上ECM介导信号传导相关性转录物的富集。图7.由GSEA在Tl-7中所鉴定的治疗一周后在11C7的方向上脂类代谢相关性转录物的富集。图8.由GSEA在Tl-7中所鉴定的治疗一周后在IgG的方向上生长因子稳态相关性转录物的富集。图9.由GSEA在Ll-5中所鉴定的治疗一周后在11C7的方向上免疫及防御相关性转录物的富集。图10.由GSEA在L1-5中所鉴定的治疗一周后在11C7的方向上信号转导相关性转录物的富集。图11.由GSEA在L1-5中所鉴定的治疗一周后在11C7的方向上细胞通信相关性转录物的富集。图12.由GSEA在Ll-5中所鉴定的治疗二周后在IgG的方向上免疫及防御相关性转录物的富集。图13.由GSEA在Ll-5中所鉴定的治疗二周后在IgG的方向上细胞通信相关性转录物的富集。图14.由GSEA在L1-5中所鉴定的治疗二周后在11C7的方向上突触传递相关性转录物的富集。图15.由GSEA在运动-体感皮层中所鉴定的治疗二周后在IgG的方向上亨廷顿舞蹈病相关性转录物的富集。图16.由GSEA在运动-体感皮层中所鉴定的治疗二周后在IgG的方向上EGF受体介导的信号传导相关性转录物的富集。图17.由GSEA在运动-体感皮层中所鉴定的治疗二周后在IgG的方向上FGF受体介导的信号传导相关性转录物的富集。图18.由GSEA在运动-体感皮层中所鉴定的治疗二周后在IgG的方向上NGF受体介导的信号传导相关性转录物的富集。图19.由GSEA在血液中所鉴定的治疗一周后在11C7的方向上受体介导的胞吞作用相关性转录物的富集。图20.由GSEA在血液中所鉴定的治疗一周后在11C7的方向上干扰素介导的免疫相关性转录物的富集。图21.由GSEA在血液中所鉴定的治疗一周后在IgG的方向上神经活性配体-受体相互作用相关性转录物的富集。图22.由GSEA在血液中所鉴定的治疗一周后在11C7的方向上巨噬细胞介导的免疫相关性转录物的富集。图23.由GSEA在血液中所鉴定的治疗一周后在IgG的方向上Illb信号传导相关性转录物的富集。图24.由GSEA在血液中所鉴定的治疗一周后在11C7的方向上B细胞活化相关性转录物的富集。图25.由GSEA在血液中所鉴定的治疗二周后在IgG的方向上免疫及防御相关性转录物的富集。图26.脊髓中11C7治疗一周后Cxcr4及Cxcll2(slit-robo途径)的上调。发明详述将理解的是本发明的某些方面、模式、实施方案、变型及特点在以下多个详细的水平上描述以便提供对本发明的实质性理解。通常，这类公开提供用于诊断及治疗有需求的受试者的有用生物标记。因此，本发明的多个方面涉及诊断/治疗方法和试剂盒以鉴定具有疾病素质的个体或将个体就药物应答性、副作用或最适药物剂量方面分类。方法及试剂盒用于研究疾病病因学、研究靼向性药物的效力、预测疾病的个体易感性以及预测对耙向基因产物的药物的个体应答性。因此，如下是说明这些方面的多个具体实施方案。本Jt效的W^核茅磁及多應。大鼠脊髓损伤模型中的基因表达概况分析在小鼠抗Nogo-A单克隆抗体11C7治疗后实施并且在治疗7日和14曰后在不同组织中与用抗植物凝集素IgG治疗的对照小鼠比较，产生12个不同比较。数据组接受如下分析(l)统计限制(Welcht-检验pO.0S)及通过倍数变化分级；并且(2)基因簇富集分析(GSEA),其中此分析是最先由MoothaVK等，7VW.34:267-273(2003)及随后由Subramanian等7VW/.U.SA102(43):15545-50(2005)引入的一种数据的途径中心观念。该分析导致鉴定在三种或更多种组织中在两个时间中任一个时间点上受治疗显著影响的24条途径。通过治疗效果大小进行分级，其中治疗效果大小以每个治疗组中显著差异性表达的基因的数目及前100个显著改变的转录物的倍数变化为基础，远离损伤部位(Ll-5)的脊髓、损伤部位(T8)以及血液是治疗一周后受影响最大的组织，运动-体感皮层及接近于损伤部位(Tl-7)的脊髓是二周治疗后受影响最大的区域。在两个时间中任一个时间点上，仅在额皮层中观察到最少的作用。GSEA鉴定免疫及防御、蛋白质代谢及磷酸化、核苷、核苷酸及核酸代谢、神经元活性以及Jak-stat级联为整体上受影响最大的途径。全部这些途径在3-4种组织中共同受到影响。在大鼠中脊髄损伤后鞘内施加的抗Nogo-A治疗在脊髓内具有最大作用。促进轴突导向及神经突长出的基因在抗Nogo-A治疗后在脊髓中上调，抑制性信号下调。在神经突长出/轴突导向相关的途径中，GSEA指示slit-robo介导的轴突导向途径最经常地受11C7治疗影响。此途径的两个成员Cxcl12及Cxc4r因11C7而以协调的方式在治疗一周后在所研究脊髓的全部节段中上调。Cxcl12及Cxc4r最近由LieberamI爭，A^inw47:667-679(2005)鉴定为是在发育期间定义哺乳动物运动轴突的初始轨道中的重要参与者。此研究结果提示该途径受11C7治疗影响并且因此可能对再生期间的抗Nogo作用机制有贡献。在损伤部位，EGF-受体介导的信号传导途径在治疗一周后受11C7上调，但在治疗二周后下调。在运动皮层区中，EGF-受体介导的信号传导途径在治疗一周后以及治疗二周后11C7下调。鉴定具有显著富集(qO.OOl)的总共24条途径在三种或多种组织中在两个时间中任一个时间点上受抗Nogo-A治疗影响。受影响最大的途径基本上与免疫及防御、蛋白质代谢及磷酸化和神经元活性有关。突触传递相关的探针组在抗Nogo-A治疗二周后腰段脊髓中上调。该结果在基因表达水平上证实受损脊髓及皮层运动区为鞘内施加的抗Nogo-A抗体疗法的主要作用部位。该分析鉴定了新的候选分子及新的候选途径如肌纤蛋白和split-robo途径作为抗Nogo-A治疗的可能靶标。该结果也指出免疫防御相关性途径强烈参与疗效。TAQMAN分析证实所选择的研究结果涉及分泌性蛋白Sfrp4、Mmp9和肌纤蛋白。^7V0go拔#。公布的PCT专利申请WO00/31235公开了针对Nogo蛋白质及其衍生物所产生的几种抗体。对于抗Nogo抗体(包括单克隆抗体及其片段)以及其使用方法的实例，见BregmanBS等，7V"m,e378:498-501(1995);BrosamleC等，/A^"my"..20:8061-8068(2000);BareyreFM等，/A^"r仍d.22:7097-7110(2002);Chen等，7Va似"403:434-439(2000);FiedlerM等，/VW"Vi五rtg.15:931-941(2002);MerklerD等，/A^"r仍c/.21:3665-3673(2001);OertleT等，/A^w/wd.23:5393-5406(2003);PapadopoulosCM等，.Ann.Neurol.(2002)和VonMeyenburgJ等，fjc/;JVe"A154:583-594(1998)。对于抗Nogo抗体在中风模型的用途,还见WiessnerC等，In尸Aflr廳co/ogvOfe6m//sc/^附iVi，编者KrieglsteinJ和KlumppS,(2003)第343-353页；以及WiessnerC等，Cere6."/oorfF/ow在Af"M.23:154-165(2003)。实施例中所用抗NogoA抗体的剂量已经证实在相同的模型中引起功能性恢复。Liebscher等，7Ve"ro/.58:706-719(2005)。公布的PCT专利申请WO00/31235也公开了针对NogoA序列产生的两种抗血清，即ASBruna和AS472。还见公布的PCT专利申请WO2000/05364Al，该专利申请公开了针对Nogo蛋白质片段的抗体。在实施例中，抗Nogo-A抗体11C7:小鼠单克隆抗体(mAb)llC7针对与大鼠第623-640位氨基酸序列对应的18aa肽Nogo-A产生；以在PBS中3mg/ml的浓度使用。对照抗体是针对植物凝集素的小鼠单克隆IgG，以在PBS中3mg/ml的浓度使用。这两种抗体的生物化学特性和中和特性在OertleT等，/TVe"nwd.23:5393-5406(2003)中描述。在本发明的一个实施方案中，抗Nogo抗体是从用人免疫球蛋白基因遗传重建的小鼠中产生的完全的人单克隆抗体(IgG4/K)并且其与人Nogo-A片段从aa342-357的表位结合。见公布的PCT专利申请WO90/05191及WO00/31235。因此，本发明涉及局部缺血性脑损伤(中风)、创伤性脑损伤(头损伤)、多发性硬化(MS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默氏病。本发明也涉及神经纤维损坏后的轴突再生和提高的萌发；外周神经系统及中枢神经系统的多种疾病、神经变性疾病如阿尔茨海默氏病、帕金森病、AL、Lewy样病理或其它常见痴呆，颅、脑及脊髓创伤后的疾病、中风或脱髓鞘性疾病，包括多发性硬化、单相型脱髓鞘、脑脊髓炎、多灶性白质脑病、全脑炎、胼胝体变性、脑桥髓鞘溶解症、肾上腺脑白质营养不良、佩-梅病、海绵状变性、亚历山大病、卡纳万病、异染性脑白质营养不良和球形细胞脑白质营养不良；涉及^L网膜细胞或角膜细胞变性的退行性眼病，包括局部缺血性视网膜病变、前部局部缺血性视神经病变、视神经炎、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、嚢样黄斑水肿、视网膜色素变性、青年遗传性黄斑变性、Best卵黄状视网膜变性、先天性黒矇和其他遗传性视网膜变性、病理性近视、早产儿视网膜病变、Leber遗传性视神经病变、角膜移植或角膜屈光手术后的影响、单纯疱渗病毒性角膜炎。定乂。以下提供如本说明书中所用某些术语的定义。其它术语的定义可以在美国能源部科学办公室人类基因组计划(http:〃www.ornl.gov/sd/techresoiices/Humaii_Genome/glossary/)提供的词汇表中找到。在实施本发明中，使用分子生物学、微生物学及重组DNA中众多的常规技术。这些技术是众所周知的并且在例如尸rotoa/s,ViAfo/ecw/"r说o/^j，第巻，Ausubel编辑(1997);Sambrook等，Afo/ecw/flrC7柳Vig:爿丄fl^onitofyAffl聰"/，,二戚(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989);O麵"g'.爿尸mctor/々/wwcA，第I及II巻，GloverD编辑(1985);0//gow"c/eoftVfe5^fi^re喊Gait编辑(1984);7Vwc/e/cJ"V/场6nVfe",/ow，Harness和Higgins，编者(1985);7Vflwscn[p^mflwrf7Va/istoVfi，Hames&Higgins，编者(1984);爿w/顧/O//Cw/,"re，Freshney编辑(1986);7m歸緒/WO/Zs朋</五"Z戸"(1RLPress,1986);Perbal，J户m"/c"/(7w/fifetoAfo/ec"/frC7ow/wg，.丛书，'Vi五"z戸o/.(AcademicPress,Inc.，1984);GeneTransferVectorsforMammalianCells,Miller和Calos，编者(ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1987)以及编者分别是Wu和Grossman及Wu的MW/^Ai>i￡>igwo/o^，第154和155巻中解释.如本文中所用，术语"抗体"包括，但不限于例如多克隆抗体、单克隆抗体、人源化或嵌合抗体和足以使抗体片段与蛋白质结合的有生物学功能的抗体片段。在本发明的实施方案中，抗体是抗Nogo抗体。术语"生物学样品"意图包括，但不限于例如分离自受试者的组织、细胞和生物流体以及在受试者中存在的组织、细胞及流体。在实施例中，生物学样品是中枢神经系统样品。然而，预期使用其它生物学样品。合适的"生物学样品，，例如是血液、血清、淋巴、内皮细胞、痰、尿、粪便或精液。中枢神经系统(CNS)组织液和/或脑脊液(CSF)尤其适合本发明的方法。如本文中所用，术语"临床应答"意指如下情况的任意或全部对应答，无应答及不利应答(即副作用)的定量测量。如本文中所用，术语"临床试验"意指设计旨在收集有关对特定疗法应答的临床数据的任何研究，并且包括，但不限于I、II及III期临床试验。^L用标准方法来定义患者群及招募受试者。如本文中所用，术语化合物的"有效量"是足够实现所需治疗作用和/或预防作用的量，例如导致预防正在治疗的疾病或减轻与该疾病有关的症状的量。施用至受试者的化合物的量将取决于疾病的类型及严重性并且取决于个体特点，如一般健康状况、年龄、性别、体重及药物耐受。它还取决疾病的程度、严重性及类型。技术人员将能够根据这些因素及其它因素确定适宜的剂量。一般地，足够实现治疗或预防作用的本发明化合物的有效量是约0.000001mg/千克体重/日到约10,000mg/千克体重/日。优选的剂量是约0.0001mg/千克体重/日到约l，OOOmg/千克体重/日。另一个优选的剂量是约0.01mg/千克体重/日到约100mg/千克体重/日。本发明的化合物也可以彼此组合或与一种或多种另外的治疗化合物组合加以施用。在实施例中，实施例中所用抗NogoA抗体的剂量已经证实在相同的模型中引起功能性恢复。Liebscher等，A^"/W.58:706-719(2005)。也见公布的PCT专利申请WO2000/05364Al，该专利申请公开了针对Nogo蛋白质片段的抗体。如本文中所用，"表达"包括但不限于如下情况的一种或多种将基因转录成前体mRNA;将前体mRNA剪接并且另外加工以产生成熟mRNA;使mRNA稳定；将成熟mRNA翻译成蛋白质(包括密码子选择及mRNA可获得性)；以及根据正确表达和功能的需要，使翻译产物糖基化和/或其它修饰。如本文中所用，术语"基因"意指含有用于调节RNA产物生物合成的全部信息的DNA节段，包括启动子、外显子、内含子及控制表达的其它非翻译区。如本文中所用，术语"基因型"意指在个体中在一对同源染色体上的基因座中于一个或多个多态性位点内存在的核苷酸对的未定相的(unphased)5，-3，序列。如本文中所用，基因型包括全基因型和/或亚基因型。如本文中所用，术语"基因座"意指染色体或DNA分子上与基因或物理特征或表型特征相对应的位置。如本文中所用，术语"同基因，，意指群体中存在的给定基因的不同形式。13如本文中所用，术语"突变体"意指来自野生型的作为突变作用结果的任何可遗传性变异，例如，单核苷酸多态性。术语"突变体"在本说明书通篇范围内可与术语"标记"、"生物标记"及"靶"互换使用。如本文中所用，术语"医学状况"包括，但不限于表现为需要治疗的一种或多种身体和/或心理症状的任何状况或疾病，并且包括先前及新近鉴定的疾病及其它病症。如本文中所用，术语"核苷酸对"意指在来自个体的染色体的两个拷贝上在多态性位点上发现的核苷酸。如本文中所用，术语"多态性位点"意指基因座中的位置，在该位置中至少两种替代性序列存在于群体中，其中该位置最经常具有不超过99%的频率。如本文中所用，术语"群体，，可以是至少两名个体的任何组。群体例如可以包括但不限于参考群体、群体组、家族群体、临床群体及相同性别群体。如本文中所用，术语"定相的(phased)"在应用于基因座中两个或多个多态性位点的核苷酸对的序列时，意指在单拷贝基因座上在这些多态性位点中存在的核苷酸的组合是已知的。如本文中所用，术语"多态性，，意指以>1%的频率存在于群体中的任意序列变体。序列变体可以在显著大于1%如5%或10%或更高的频率存在。该术语还可以用来指在个体中在多态性位点上观察到的序列变异。多态性包括核苷酸置换、插入、缺失及微卫星并且可以但不必须产生在基因表达或蛋白质功能上的可检测差异。如本文中所用，术语"多核苷酸"意指任意的RNA或DNA，其可以是未修饰的或修饰的RNA或DNA。多核苷酸包括，不限于单链及双链DNA，作为单链区及双链区的混合物的DNA、单链及双链RNA、作为单链区及双链区混合物的RNA，以及这样的杂合分子，它们包含可以是单链或更常见地是双链或是单链区及双链区混合物的DNA及RNA。此外，多核苷酸指的是包含RNA或DNA或既有RNA又有DNA的三链区域。术语多核苷酸也包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及具有为稳定性或出于其它原因而已l务饰的主链的DNA或RNA。如本文中所用，术语"多肽"意指包含通过肽键或修饰的肽键(即肽等构物)彼此连接起来的两个或多个氨基酸的任意多肽。多肽指的是短链，通常称作肽、糖肽或低聚物，以及较长的链，一般称作蛋白质。多肽可以含有除基因编码的20种氨基酸之外的氨基酸。多肽包括通过天然过程如翻译后加工或通过本领域众所周知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。此类修饰在基本教科书及在更详细的专著中，以及在大部头的研究文献中充分描述。如本文中所用，术语"参考标准群体"意指由一种或多种生物学特点(例如药物应答性、基因型、单元型、表型等)表征的群体。如本文中所用，术语"参考标准基因表达概况"是在施用化合物之前在参考标准群体或单个受试者中观察到的一种或多种基因的表达^^式。如本文中所用，术语"受试者，，意指受试者优选地是哺乳动物、如人，但也可以是动物，包括但不限于家养动物(例如犬、猫等)、家畜(例如奶牛、绵羊、猪、马等)和实验动物(例如猴(如猕猴)、大鼠、小鼠、豚鼠等)。如本文中所用，"试验样品，，意指从目的受试者中得到的生物学样品。例如，试验样品可以是生物流体(例如血清)、细胞样品或组织，或分离的核酸或从其中衍生的多肽。如本文中所用，术语"失调"意指与对照相比大于或等于1.2倍并且是统计学显著(p〈0.05，斯氏t检验)的改变。例如1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍数变化。如本文中所用，施用活性剂或药物至受试者或患者包括自我施用以及由其它人施用。还理解的是治疗或预防如所述医学状况的多种模式意指"基本上"，这包括完全和亚完全的治疗或预防，并且其中实现一定的生物学或医学相关的结果。本发明的一个或多个实施方案的细节在下文后续描述中阐述。虽然与本文中所述的那些方法及材料相似或等同的任意方法及材料可以在本发明的实施或试验中使用，现在描述优选的方法及材料。本发明的其它特征、目的和优势将从说明书以及权利要求书中显而易见。在本说明书及所附权利要求书中，单数形式包括复数指称，除非清楚地指出相反。除非另外定义，本文中所用的全部技术及科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。本文中引用地全部参考文献在本文中完整引用作为参考并且以这样的相同程度用于全部目的，如同具体并且单独地指示将每篇独立的出版物、专利或专利申请完整地引用作为参考用于全部目的一样。^Vf乾差西^。靶区可以使用任何寡核苷酸指导的扩增方法扩增，所述扩增方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)(美国专利号4,965,188)、连接酶链式反应(LCR)(Barany等，ZVoc.7Vfl,/.爿o^.S"CAS^，88:189-193(1991);公布的PCT专利申请WO90/01069)，和寡核苷酸连接测定(OLA)(Landegren等，Sdewce，241:1077-1080(1988))。在此类方法中用作引物或探针的寡核苷酸应当与含有多态性位点或与其接近的核酸区域特异性地杂交。其它已知的核酸扩增方法可以用来扩增靶区，包括基于转录的扩增系统(美国专利号5,130,238;EP0329822;美国专利号5,169,766，公布的PCT专利申请WO89/06700)及等温方法(Walker等，7V""颠d5W.，USA，89:392-396(1992)。爭在_^~#并#慕核茅^与乾差忠杀充等位基因特异性寡核苷酸与靶多核普酸的杂交可以用这两种实体在溶液中进行，或这种杂交可以在寡以例如由抗体-抗原相互作用、聚L-赖氨酸、链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白-生物素、盐桥、疏水性相互作用、化学键、紫外线交联、焙烘作用等介导。等位基因特异性寡核苷酸可以在固相支持体上直接合成或在合成后连接至固相支持体上。合适在本发明的检测方法中使用的固相支持体包括由硅、玻璃、塑料、纸等制成的基质，其中所述基质可以例如形成孑L(如在96孔平板中)、载玻片、板、膜、纤维、芯片、皿和珠。固相支持体可以进行处理、涂层或衍生化以促进等位基因特异性寡核苷酸或耙核酸的固定。个体基因的基因型或单元型也可以通过将含有该基因的一个或两个拷贝的核酸样品与如在WO95/11995中所述的核酸阵列及亚阵列杂交而确定。阵列将含有一组等位基因特异性寡核苷酸，其代表将在基因型或单元型中包括的每个多态性位点。也见Mio/""/wC7ow/"g爿Z^omto^vMaw"a/,第二版，Sambrook，Fritsch和Maniatis编辑(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989);Z)A^C7owi"g，第I和II巻，GloverDN编辑(1985);5y",to/s，GaitMJ编辑(1984);7V"c/eZcJ"V/母6W妝aft》w，HamesBD和HigginsSJ编者，1984)。^于存餘4'^示《萄4这成^^^炎凝的^#农系鍵。本发明也提供计算机系统用于存储并显示对基因所测定的数据。多态性数据是这样的信息，其包括，但不限于例如多态性位点的位置；在这些位点中的序列变异；多态性在一个或多个群体中的频率；对基因所测定的不同基因型和/或单元型；一种或多种这些基因型和/或单元型在一个或多个群体中的频率；性状与该基因的基因型或单元型间的任何已知关联。计算机系统包含计算机处理单元、显示器和含有多态性数据的数据库。多态性数据包括对参考群体中给定基因所鉴定的多态性、基因型及单元型。在优选的实施方案中，计算机系统能够产生显示根据进化关系组织起来的基因表达i普的视图。此外，计算机可以执行如此程序，其中所述程序产生显示在显示设备上的视图(或荧光屏图像)并且用户借助该程序与视图交互并分析与基因及其基因组变异相关的大量信息，包括染色体位置、基因结构M因家族、基因表达数据、多态性数据、遗传序列数据以及群体临床数据(例如对一个或多个群体的有关人种地理学起源、临床应答及基因表达语的数据)。本文中所述的多态性数据可以存储为关系数据库的部分(例如Oracle数据库的实例或一组ASCII平面文件)。这些多态性数据可以存储在计算枳J更盘上或可以例如存储在CD-ROM或存储在可由计算机访问的一种或多种其它存贮设备上。例如，数据可以存储在通过网络与计算机通讯的一个或多个数据库中。在以下实施例中，如下文开展数据归一化将低于0的值设为0.1。每个量值除以样品中全部量值的第50.0百分位。此后，每个基因的归一化通过归一化至天然样品的中位数表达值而进行。在实施例1中，载体与处理间差异性表达的基因在每个实验中基于如下限制进行鉴定(l)粗滤进一步分析中所包含的探针组在任何条件下必须以4/6的重复中带标记地存在(flaggedpresentin4/6ofreplicates)。原始数据信号强度必须在至少一个治疗组中是最小50。(2)统计限制p<0.05(Wekht-检验(参数性))。相似的统计限制总是适用于待比较的不同组并且在每个比较中提到。在实施例1中，使用基因簇富集分析(GSEA)方法来分析微阵列数据。在超过75%的芯片上具有低于100的表达水平的基因作为低表达或不表达基因被抛弃。微阵列结果随后在一系列配对比较中在成组条件(例如处理与对照)间进行分析。每种基因在条件,和#伴2下的相对表达水平计算为表达率<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>其中/^是基因Z在条件^下的平均表达值。基因随后根据它们的表达率排序，以至于在条件7下具有比在条件2下更高表达的那些基因位于该列的顶端。其次，将可获得基因簇的集合映射到排序的表上。该步骤实质上将先验的生物学知识应用于实验数据以鉴定以协调方式表达的功能性相关基因。一次处理一个基因簇。对于基因簇G，若差茵,.eG，则标注表达率r,'处于，该基因簇中，并且若差^;gG，则'不在，该基因簇中。计算双尾Wilcoxon秩和检验以确定标注'处于，基因簇G中的基因是否在这个排序的表的顶端或底部富集。采用StoreyJD和TibshiraniR，ProcNatlAcadSciUSA100:9440-9445(2003)的错误发现率方法以将p-值转化成多重检验修正的q-值。来自GSEA的输出是与JV个可获得的基因簇对应的一列q-值&，&，…，W和标记(/7，&…，/yv)，/,(顶部,底部)。小q-值^表明基因簇中的基因在表达率序列的顶部或底部显著富集。实施例2也提供对GSEA分析方法的描述。本^坊^试WJ^应当理解的是本文中所述的本发明方法一般也可以包括本发明试剂盒的用途。本发明提供用于对个体中基因做单元型分型和/或基因分型的核酸及多肽检测试剂盒。此类试剂盒用于受试者分类。通常，本发明的方法可以按照先体外后体内(oWw)方式开展，并且本发明具体构思此类先体外后体内方法。此外，在本发明的方法可以包括可以在人体或动物上实施的步骤时，本发明具体构思仅包括不在人体或动物体上实施的那些步骤的方法。本发明的试刺盒用于检测生物学样品中与本发明标记相对应的多肽或核酸的存在，其中所述的生物学样品例如是任何体液，包括但不限于例如血清、血浆、淋巴、胆嚢液、尿、粪便、脑脊液、腹水或血液并且包括体组织的活组织检查样品。例如，试剂盒可以包含能够检测生物学样品中多肽或mRNA的标记化合物或试剂(其中所述的mRNA编码与本发明标记对应的多肽)并且包含用于确定样品中多肽或mRNA的量的手段，例如与多肽结合的抗体或与编码该多肽的DNA或mRNA结合的寡核苷酸探针。对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可以包含例如(l)与对应于本发明标记的多肽结合的第一抗体，例如，该抗体与固相支持体连接；并且任选地；(2)不同的第二抗体，其中所述的第二抗体与这种多肽或第一抗体结合并与可检测标记缀合。对于基于寡核苷酸的试剂盒，试剂盒可以包含例如(l)与编码对应于本发明标记的多肽的核酸序列杂交的寡核苷酸，例如，以可检测方式标记的寡核苷酸；或(2)用于扩增与本发明标记对应的核酸分子的引物对。试剂盒可以还包含例如緩沖剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒还可以包含检测可检测标记所需要的组分，例如酶或底物。试剂盒也可以含有对照样品或一系列对照样品，其中对照样品可以受到分析并且与试验样品比较。试剂盒的每种组分可以封装在单个容器中并且各种容器全部可以置于单个包装物中，与解释利用该试剂盒所进行分析的结果的说明书在一起。在优选的实施方案中，该试剂盒还可以包含DNA样品收集手段。本发明的试剂盒可以在试剂盒容器表面或内部含有印刷品。印刷品描述如何使用试剂盒中含有的试剂，例如，如何在确定用于预防或治疗受试者中医学状况的策略中使用本发明的生物标记。在几个实施方案中，试剂的使用可以参考本发明的方法。在一个实施方案，试剂是用于确定相关基因的基因表达的基因芯片。炎菱试者与标凉參孝举傳初^。为了推导对治疗的临床应答与基因表达i普间的相关性，需要得到关于受治疗个体的群体即临床群体表现的临床应答方面的数据。这种临床数据可以通过对临床试验结果的回溯性分析得到。备选地，临床数据可以通过设计并实施一个或多个新的临床试验得到。临床群体数据的分析用于定义标准参考群体，而标准参考群体则用来对参加临床试验或接受所选治疗性治疗的受试者分类。在优选的实施方案中，包含在临床群体中的受试者已经对目的医学状况的存在加以分级。对潜在受试者的分级可以包括例如标准体检或一种或多种实验室检验。备选地，对受试者的分级可以包括使用基因表达语。例如，在基因表达谱与疾病易感性或严重性间存在强相关性的情况下，将基因表达镨用作分级标准。此类标准参考群体包含共有基因表达模式i普特点的受试者。例如，生物标记基因表达特点用于本发明的方法以便与给定受试者中一种或多种基因表达产物的测量水平比较。用于本发明的方法中的这种基因表达产物包括但不限于例如与特定基因型组或该基因型组的基因表达产物多肽相关的特征性mRNA。在一个实施方案，基于受试者中一种或多种生物标记的测量水平与标准参考群体中所观察到一种或多种生物标记的水平间的相似性，将受试者分成或分配至特定的基因型组或类。在本发明的一个实施方案中，目的治疗性治疗施用至试验群体中的每个受试者，并且每个受试者对治疗的应答使用一个或多个预定的标准进行测量。构思了在多种情况下，试验群体将表现应答范围，并且研究人员将选择由各种应答构成的(例如低、中等、高)应答者组的数目。此外，对试验群体中每名个体的基因做基因分型和/或单元型分型，这可以在施用治疗之前或之后进4亍。可以寸吏用的统计分才斤方法在FisherLD和vanBelleG，丑/仍to他rics.'^AfC/ro^/ogy幼e/Tefl/幼5Wewces(Wiley誦lnterscience，NewYork，1993)中描述。这种分析也可以包括回归计算，其中基因中的多态性位点最显著地对表型上的差异作出贡献。用于找到单元型内容与临床应答间相关性的备选方法使用基于误差最小化优化算法的预测模型，其中所述算法之一是遗传算法(JudsonR，"遗传算法及它们在化学中的用途，，在ZwCo附/Mtorio朋/C7^附/W/j中，第10巻，第1-73页，编者LipkowitzKB和BoydDB(VCHPublishers,NewYork,1997)。也可以使用模拟复性法(Press等，7Vw柳encfl/7^"》^/wC,77fe/SWe"断c0附/"//"《，笫10章(CambridgeUniversityPress,Cambridge,1992)、神经网络法(RichE和KnightK，/"te//^e"ce，第二版，第10章(McGraw-Hill，NewYork,1991)、标准梯度下降法(Press等，尤其第IO章)或其它全局或局部优化方法等。关联性也可以使用方差分析(ANOVA)技术进行分析，以确定临床数据中多少变异由基因中多态性位点的不同亚组解释。使用ANOVA来检验这样的假设，即应答变量是否由可测量的一种或多种性状或变量所致或与之相关。见FisherLD和vanBelleG，爿McAcito/og};幼e好efl/,/r5Wewces(Wiley-lnterscience，NewYork,1993》第10章。在已经得到临床数据及多态性数据后，产生个体应答与基因型或单元型内容间的相关性。相关性可以按照几种方式产生。在一种方法，个体由其基因型或单元型(或单元型对)(也称作多态性组)分组，并且随后计算由各多态性组的成员表现的临床应答的平均数及标准差。技术人员可以从上文所述的分析中构建预测作为基因型或单元型函数的临床应答的数学模型。对临床应答与基因的基因型或单元型(或单元型对)间关联的鉴定可以是设计诊断方法以确定如此个体的^出，其中所述个体将会或不会对治疗应答，或备选地将会在更低水平上应答并且因此可能需要更多治疗，即药物的更大剂量。诊断方法可以采取几种形式中的一种例如直接DNA检验(即对基因中一个或多个多态性位点进行基因分型或单元型分型)、血清学试验或体检测量。唯一要求是在诊断性检验结果与作为基础的基因型或单元型之间存在良好的相关性。在优选的实施方案中，这种诊断方法使用上文所述的预测性单元型分型方法。;^刺屋夢。本发明也涉及预测医学领域，在预测医学中为预后性(预测性)目的而使用诊断性分析法、预后分析法以及监测临床试验以预防性治疗受试者。因此，本发明的一个方面涉及诊断性分析法，用于确定生物学样品(例如、血液、血清、细胞、组织)环境下的生物标记分子表达以及生物标记分子活性，以便因而确定个体是否遭受疾病或病症侵袭或具有发展病症的风险，其中所述的病症与异常的生物标记分子表达或活性相关。本发明也提供预后性(或预测性)分析法，用于确定个体是否具有发展与生物标记分子表达或活性相关的病症的风险。此类分析法可以用于预后性或预测性目的以便因此在病症发作前预防性地治疗个体，其中所述病症以生物标记多肽为特征或与^M目关。某些多肽在受试者的特定组织(或血液)中的水平可以指示给定药物在施用至受试者时的毒性、效力、清除速率或代谢速率。本文中所述的方法也可以用来确定此类多肽在受试者中的水平以便辅助预测这类受试者对这些药物的应答。本发明的另一个方面提供用于确定个体中突变多肽的活性以便因而为该个体选择适宜治疗性或预防性化合物的方法。本发明的方法允许选择化合物(例如药物)以便基于个体基因型(例如旨在确定个体对特定化合物的应答能力而检验的个体的基因型)治疗性或预防性地治疗该个体。豫者为Vf法.预后性化合物与生物标记分子(例如生物标记多肽或编码性相关的病症或具有发展该病症风险的受试者(其如上文所述)。预后性化合物是与生物标记分子结合或连接的任何化合物，包括但不限于例如抗生物标记多肽的抗体、小分子、核酸、多肽、寡糖、脂类或其组合。备选地，受试者。因此，本发明提供用于鉴定与生物标记表达或活性相关的疾病或病症的方法，在所述方法中试验样品从受试者得到并且对预后性化合物的结合或活性进行检测，其中存在预后性化合物的结合或活性改变诊断受试的风险。如本文中所用，"试验样品"指的是从目的受试者中得到的生物学样品。例如，试验样品可以是生物流体(例如血清)、细胞样品或组织，或从其中衍生的分离的核酸或多肽。此外，本文中所述的预后分析法可以用来确定受试者是否可以施用化合物(例如激动剂、拮抗剂、肽模拟物、多肽、肽、核酸、小分子或其它药物候选物)以治疗生物标记相关性疾病或病。如本文中所用，施用化合物至受试者或患者包括自我施用以及由其它人施用。在一个实施方案，本文中所述的预后分析法用来确定受试者是否将对化合物应答。例如，此类方法可以用来确定受试者是否可以用治疗化合物对生物标记相关性病症(即生物标记相关性医学状况)有效治疗。因此，本发明提供用于确定受试者是否可以用化合物对与生物标记表达或活性相关的病症有效治疗的方法，在所述方法中得到试验样品并且使用预后性化合物检测生物标记分子(例如其中生物标记分子的存在，或与参考中生物标记的表达水平相比，生物标记分子改变的表达水平对可以施用化合物以治疗生物标记相关性病症的受试者具有诊断性)。存在这样的多种疾病，即生物标记相关性疾病或医学状况，其中已知某些生物标记分子过量表达(或过低表达)的程度指示受试者是否会发展疾病。因此，检测样品中生物标记的方法可以用作预测受试者是否会发展疾病的方法。测定一种或多种生物标记在来自具有疾病发展风险的受试者的合适组织或血液样品中的水平并且将其与合适对照(如没有这种疾病发展风险的受试者中的水平)比较。与对照相比，样品中一种或多种生物标记过量表达(或过低表达)的程度可以预测受试者将发展疾病的可能性。相对于对照的过量表达(或过低表达)越大，受试者越有可能发生疾病。本文中所述的方法可以例如通过使用包含至少一种探针试剂(例如本文中所述的抗生物标记多肽的抗体)的预包装诊断试剂盒开展，其中所述预包装诊断试剂盒可以例如在临床环境下用于诊断这样的患者，其表现涉及本发明生物标记的疾病或疾患的症状或家族史。此外，其中表达本发明生物标记的任何细胞类型或组织可以用于本文中所述的预后分析法中。J^刺/屁尿效力。监测物质(例如药物、化合物)对生物标记的表达或活性(例如调节异常细胞增殖和/或分化的能力)的影响可以应用于基本药物筛选和临床试验中。例如，如通过本文中所述的筛选分析法确定的物质增加生物标记基因表达、蛋白质水平或上调生物标记活性的有效性可以在表现生物标记基因表达、蛋白质水平降低或生物标记活性下调的受试者的临床试验中进行监测。备选地，如通过筛选分析法确定的降低生物标记基因表达、蛋白质水平或上调生物标记活性的物质有效性可以在表现生物标记基因表达、蛋白质水平增加或生物标记活性上调的受试者的临床试验中进行监测。在此类临床试验中，生物标记并优选在例如增殖性病症及癌症中有关的其它基因的表达或活性可以用作特定细胞应答性的"读出"或标记。例如，可以鉴定细胞中受如此物质(例如化合物、药物或小分子)治疗调节的基因，包括编码本发明生物标记的基因，其中所述的物质调节(例如在如本文中所述的篩选分析法中鉴定的)生物标记活性。因此，为了研究物质例如在临床试中对细胞增殖病症的作用，可以分离细胞，并且制备RNA并对其分析在病症中有关的生物标记及其它基因的表达水平。基因表达的水平(即基因表达语)可以如本文中所述通过RNA印迹分析或RT-PCR，或备选地通过如本文中所述的方法之一测量所产生蛋白质的量，或通过测量基因或其它基因的活性水平进行定量。以这种方式，基因表达语可以用作指示细月包对物质的生理应答的标记。因此，这种应答状态可以在用该物质处理个体之前或在此期间的多个时间点上确定。差厉4这及^试,》类。基因表达产物的标准对照水平通过测量不同对照组中的基因表达而确定。对照组的基因表达水平随后与给定受试者中基因表达产物的测量水平比较。这种基因表达产物可以是与特定基因型组或这种基因型组的基因表达多肽产物相关的特征性mRNA。基于测量水平与给定组的对照水平具有多大相似性，受试者可以分成或分配至特定的基因型组。如本领域技术人员将理解，在作出这种决定中存在一定程度的不确定性。因此，对照组水平的标准差可以用来作出概率性决定并且本发明的方法适用于多种基于概率的基因型组决定。因此，例如并且不作为限制，在一个实施方案中，若基因表达产物的测量水平处于任何对照组的均值的2.5个标准差范围内，则该个体可以分配至这个基因型组中。在另一个实施方案中，若基因表达产物的测量水平处于任何对照组的均值的2.0个标准差范围内，则该个体可以分配至这个基因型组中。在又一个实施方案中，若基因表达产物的测量水平处于任何对照组的均值的1.5个标准差范围内，则该个体可以分配至这个基因型组中。在又一个实施方案中，若基因表达产物的测量水平处于任何对照组的均值的1.0个标准差或更小的范围内，则该个体可以分配至这个基因型组中。因此，这个方法允许以多个概率度确定应当将特定受试者置于哪个组内，并且这种基因型组的分配随后将决定个体应当归入的风险类别。^參标记差竭4这^^豸。用于检测生物学样品中的本发明突变多肽或核酸的存在或不存在的示例性方法包括从试验受试者中得到生物学样品并且使生物学样品与化合物或能够检测突变多肽或核酸(例如mRNA、基因组DNA)的化合物接触，以至于在该生物样品中检测到突变基因的存在，其中所述的核酸编码本发明的突变多肽。用于检测突变mRNA或突变基因组DNA的化合物是能够与突变mRNA或突变基因组DNA杂交的标记的核酸探针。核酸探针可以例如是全长的突变核酸或其部分，如具有至少5、15、30、50、100、250或500个核苷酸长度并且足以在严格条件下与突变mRNA或突变基因组DNA发生特异性杂交的寡核苷酸。用于本发明诊断性分析法中的其它合适探针在本文中描述。用于检测本发明突变多肽的化合物的实例是针对本发明突变多肽所产生的能够与突变多肽结合的抗体，优选地是具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆的或更优选地是单克隆的。可以使用完整的抗体或其片段(例如Fab或F(ab，)2)。术语"标记的，，相对于探针或抗体而言意图包含通过偶联(即物理地连接)可检测物质至探针或抗体而对探针或抗体的直接标记，以及通过与另一种受到直接标记的化合物的反应性而对探针或抗体的间接标记。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，以及用生物素对DNA探针进行末端标记以至于DNA探针可以用荧光标记的链霉抗生物素蛋白检测。也即，本发明的检测的方法可以用来在体外及体内(iViWw)检测生物学样品中本发明的突变mRNA、多肽或基因组DNA。例如，用于检测突变mRNA的体外技术包括Northern杂交及原位杂交。用于检测本发明突变多肽的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀及免疫荧光。用于检测本发明的突变基因组DNA的体外技术包括Southern杂交，此外，用于检测突变多肽的体内技术包括向受试者导入标记的抗突变多肽抗体。例如，抗体可以用放射性标记物标记，其中所述i文射性标记物在受试者中的存在及位置可以通过标准成像技#测。在一个实施方案，生物学样品含有来自试验受试者的多肽分子。备选地，生物学样品含有来自试验受试者的mRNA分子或含有来自试验受试者的基因组DNA分子。优选的生物学样品是通过常规手段从受试者中分离的外周血白细胞样品。在实施本发明中，使用分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学及重组DNA学中的众多常规技术。这些技术是众所周知的并且在例如C"/rewf/Vo似co/s/"Afo/"w/ar祝o/ogy，第I-III巻，Ausubel编辑(1997);Sambrook等，Afo/ec"/"/*C7o附Vig..jZ^0rfl,wyMaw做/，岸二應(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989);DiV^aomVig;^iV""/cfl/^/woad，第I及II巻，Glover编4辱(1985);0//^w"cfeCiVfeSj;"^m/s，G"^编4耳(1984);7V"c/e/c爿"V/母6n妝flft》w，Harness和Higgins,编者(1985);7hmsrn>ft》《flwd7>flws7ft'o，Hames和Higgins，编者(1984);O//C"//we，Freshney编辑(1986);/附附o緒/zed0/&朋</J5yiz戸es(!RLPress,1986);Perbal，爿1Vfl"/ca/(7wiV/etoAfo/ecw/"rC7o/wg;丛书，Me仇￡>igwo/"(AcademicPress,Inc.,1984);GeneTransferVectorsforMammalianCells,Miller&Calos，编者(ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1987);和编者分别是Wu及Grossman,以及Wu的Me幼o必/w五"z戸o/ogy,第154和155巻中解释。检测并测量mRNA水平(即基因转录水平)以及多肽基因表达产物水平(即基因翻译水平)的方法是本领域众所周知的，并且包括核苷酸樣吏阵列的使用以及多肽检测方法，其涉及质谱和/或抗体检测及定量技术。还见Strachan和Read,/T"wmwiMo/ec"/iirGewefc，第二版(JohnWileyandSons,Inc.,NewYork,1999)。用于检测本发明所述基因的基因表达的技术包括，但不限于RNA印迹法、RT-PCT、实时PCR、引物延长、RNA酶保护、RNA表达镨及相关技术。用于通过检测由本发明所述基因编码的蛋白质产物而检测基因表达的技术包括，但不限于例如识别蛋白质产物的抗体、蛋白质印迹、免疫荧光、免疫沉淀、ELISA及相关技术。这些技术对本领域技术人员而言是众所周知的。SambrookJ.等，Mo/ec"/"rC7omVig..JLfl6omto/jAffl簡"/，第三版(ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NewYork,2000)。在一个实施方案，用于检测基因表达的技术包括基因芯片的使用。基因芯片的构建及使用是本领域众所周知的。见美国专利号5，202，231;5，445，934;5,525,464;5,695,940;5，744，305;5,795,716及5，800，992.还见JohnstonM，Cm/t.历o/"8:R171-174(1998);IyerVR等，5Wewce，283:83-87(1999)并且EliasP，"新的人基因组'芯片，酝酿一场革命"L仍Jwge/^Z)似7j;7V^^(2003年10月3曰)。在以下实施例1中，微阵列杂交如微阵列系统制造商推荐进行(Affymetrix,SantaClara，California;表达分析技术手册)。来自每个治疗组的6份样品分别(不合并)杂交到含有>31000个探针组的大鼠基因组RAE2302.0基因表达探针阵列组(Affymetrix,Inc.,SantaClara,California,美国)上。双链cDNA以起始量大约5照全长总RNA，使用SuperscriptChoice系统(InvitrogenLifeTeehnologies)在T7-(dT)24DNA寡核苷酸引物存在下合成。合成后，将cDNA通过酚/氯仿/异戊醇萃取及乙醇沉淀法纯化。纯化的cDNA随后使用BioArray⑧高产率RNA转录物标记试剂盒(ENZO)在生物素化的核糖核苷酸存在下进行体外转录，形成生物素标记的cRNA。标记的cRNA随后在亲和树脂(RNeasy，Qiagen)上纯化、定量并且片段化。将大约10照量的标记cRNA在45°C与表达探针阵列杂交大约16小时。随后该阵列使用FluidicsWorkstation400400(Affymetrix)洗涤并用链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白(MolecularProbes)染色两次。阵列随后用共聚焦激光扫描仪(GeneArrayScanner,Agilent)扫描两次，产生扫描图像。该结果".dat-file"使用MAS5程序(Affymetrix)处理成".cel-file"。原始数据使用"靶强度"150转化成表达水平。确定^^记差厉脊^。确定生物学样品例如个体的组织或体液中标记基因表达产物的水平可以按照多种方式进行。众多的表达检测方法使用分离的RNA。对于体外方法，对mRNA分离无选择性的任何RNA分离技术可以用于从细胞中纯化RNA。例如见Ausubel等编辑，C"fr.Mo/.5"/.(JohnWiley&Sons,NY，1987-1999)。在一个实施方案，测定了标记基因的mRNA表达产物的水平。测量特定mRNA的水平的方法是本领域众所周知的并且包括RNA印迹分析、逆转录PCR及实时定量PCR或通过与寡核苷酸阵列或^:阵列的杂交。在其它更优选的实施方案中，测定表达水平可以通过测定体液或组织样品(包括但不限于血液或血清)中基因的蛋白质或多肽表达产物的水平而进行。在具体实施方案中，与标记对应的mRNA的水平可以通过原位(/"W似)模式及通过体外模式，使用本领域已知的方法在生物学样品中确定。此夕卜，大量的组织样品可以使用本领域技术人众所周知的技术，如美国专利号4,843,155的单步骤RNA分离方法便利地处理。分离的mRNA可以在包括但不限于Southern或Northern分析、PCR分析及探针阵列的杂交或扩增分析法中使用。一种用于检测mRNA水平的优选诊断方法包括使分离的mRNA与核酸分子(探针)接触，其中所述的核酸分子可与待检测基因所编码的mRNA杂交。核酸探针可以例如是全长cDNA或其部分，如具有至少7、15、30、50、100、250或500个核苷酸长度并且足以在严格条件下与编码本发明标记的mRNA或基因組DNA发生特异性杂交的寡核苷酸。用于本发明诊断性分析法的其它合适探针在本文中描述。mRNA与探针的杂交表明所提及的标记正在被表达。在一种模式中，例如通过将分离的mRNA在琼脂糖凝胶上电泳并将mRNA从凝胶转移到膜(如硝酸纤维素膜)上而将mRNA固定在固体表面上并与探针接触。在备选的模式中，探针固定在固体表面并且mRNA与探针接触，例如在Affymetrix基因芯片阵列中。技术人员可以便利地调整已知的mRNA检测方法以检测由本发明标记编码的mRNA的水平。用于测定样品中与本发明标记对应的mRNA的水平的备选方法包括核酸扩增方法，例如通过RT-PCR(实验实施方案由Mullis，美国专利号4,683,232描述)；连接酶链式反应，Barany(1991)，丄X;自持性序列复制，Guatelli等，/Voc，7V"汰Jow/.&/，USA，87:1874-1878(1990);转录性扩增系统，Kwoh等，尸/w.7Va汰爿c"rf.5W.USA，86:1173-1177(1989);Q-B复制酶，Lizardi等，说o/.r"^fo/og，6:1197(1988);滚环复制，美国专利号5，854，033或任何其它核酸扩增方法进行，随后使用本领域技术人员众所周知的技术检测已扩增的分子。这些检测方案尤其用于检测以极低的量存在的核酸分子。如本文中所用，扩增引物定义为可以与基因的5，区或3，区(分别是正链和负链，或负链和正链)复性并含有5，区及3，区间短的区域的一对核酸分子。通常，扩增引物具有约10-30个核苷酸长度并且在约50-200个核苷酸长度的区域的侧翼。在适宜条件下及用适宜的试剂，此类引物允许扩增这样的核酸分子，其包含两侧分布该引物的核苷酸序列。如上文指出，RT-PCR(实时定量PCR)是评估基因表达水平的一种方式，例如评估本发明基因(例如含有目的SNP和多态性的那些基因)的基因表达水平。RT-PCR分析法利用RNA逆转录酶来催化DNA链从RNA链(包括mRNA链)的合成。可以特异性检测并且定量所产生的DNA并且该方法可以用来测定特定类别的mRNA的水平。一种用于进行这种分析的方法是在商标名称TAQMAN(PEAppliedBiosystems，FosterCity,CA)下已知的并且利用AMPLITAQGOLDTMDNA聚合酶的5，核酸酶活性以在PCR反应期间切割特定形式的探针。这种特性形式的探针称作TAQMANr,针。见Luthra等，J附./.尸fl^o厶，153:63-68(1998))。这种探针由具有5，报道分子染料和3，猝灭剂染料的寡核苷酸(通常s20聚体)构成。荧光报道分子染料如FAM(6-氣基焚光素)与寡核苷酸的5，末端共价连接。报道分子由通过位于3，末端的接头臂所连接的TAMRA(6羧基-N,N，N，，N，-四甲基罗丹明)猝灭。见Kuimelis等，iV"c/.外附/.^r.,37:255-256(1997)及Mullah等，7Vwc/.v4cMs/d，26(4):1026-1031(1998))。在反应期间，探针的切割使报道分子染料与猝灭剂染料分开，导致增加的报道分子荧光。PCR产物的积累通过监测报道分子染料的荧光增加而直接检测。见Heid等，Ge朋附e/d，6(6):986-994(1996)。反应以循环期间的如此时间点为表征，此时首先检测到PCR产物的扩增，而不是在固定次数的循环后积累的PCR产物量。核酸靶的初始拷贝数越高，越早观察到荧光的显著增加(Gibson等，Gem附eid，6:995-1001(1996))。当探针完整时，报道分子染料对猝灭剂染料的接近导致主要因F6rster-型能量转移而阻遏报道分子荧光。见Lakowicz等，/.祝o/.C7ie附.，258:4794-4801(1983))。在PCR期间，若目的耙存在，则探针特异性地在正向引物位点与反向引物位点之间复性。AMPUTAQGOLDTMDNA聚合酶的5，-3，溶核活性仅在探针与靶标杂交才切割在报道分子与猝灭剂之间的探针。探针片段随后从靶标中被替换，并且链的聚合继续。该过程在每个循环中发生并且不干扰产物指数式聚集。探针的3，末端被封闭以阻止PCR期间探针延长。被动参考物是在TAQMANTM緩沖液中包含的一种染料并且不参与5，核酸酶分析法。被动参考物提供内标，可以在数据分析期间使报道分子染料信号对其归一化。需要归一化以校正因浓度或体积变化所致的荧光波动。如此实现归一化，即对给定反应管，将报道分子染料发射强度除以被动参考物的发射强度而得到定义为Rn的比例(归一化的报道分子)。阈循环或Ct值是首次检测到ARn的统计显著性增加时的循环。在Rn对循环数的曲线图上，阈循环在序列检测应用开始检测到与PCR产物指数增长相关的信号增加时出现。为开展定量测量，在每个实验中包括cRNA(标准)的连续稀释物以构建精确及快速mRNA定量所必需的标准曲线。为了估计技术的可再现性，可以进行多次相同cRNA样品的扩增。用于测量细胞转录状态的其它技术产生了用于电泳分析的有限复杂性的限制性片段库，如联合双限制酶消化和定相引物(phaseingprimer)的方法(例如见EP0534858Al)或这样的方法，其选择带有与定义的mRNA末端最接近的位点的限制片段。例如见Prashar等，爿ow/.USA,93(2):659-663(1996))。其它方法以统计方式对cDNA库采样，如通过对多种cDNA的每一cDNA中的足够碱基(例如20-50个碱基)测序以鉴定每种cDNA，或通过测序相对于已定义mRNA末端途径模式在已知位置处产生的短标签(例如9-10个碱基)。见例如Velculescu，Sde""，270:484-487(1995)。将样品中的cDNA水平定量并且每种cDNA的平均值、平均数及标准差使用本领域技术人员众所周知的标准统计方法确定。BaileyNTJ，AfC/^A/"第三版(CambridgeUniversityPress,1995)。备选地，表达水平可以作为相对表达水平提供。为确定标记基因的相对表达水平，在测定目的样品的表达水平之前，对10份或更多份的正常生物学样品与疾病生物学样品、优选50份或更多份样品测定标记表达的水平。测定并且使用在大量样品中所分析的每一基因的平均表达水平，作为该标记的基线表达水平。对试验样品所测定的标记表达水平(绝对表达水平)随后除以对该标记所得到的平均表达值。这提供相对表达水平。优选地，用于基线测定中的样品来自无多态性的受试者。细胞源的选择取决于相对表达水平的用途。使用正常组织内存在的表达作为平均表达得分有助于验证所分析的标记是否具有(对正常细胞)特异性。此外随着更多数据积累，可以修改平均表达值，基于积累的数据提供改进的相对表达值。^#标记差厨翻译的刺定。在本发明的另一个实施方案中，检测了与标记对应的多肽。对体液或组织中生物标记基因的生物标记多肽(又叫做生物标记、标记、标记蛋白质或标记多肽)表达产物的检测可以用来确定多态性的存在或不存在，并且生物标记多肽表达产物的相对水平可以用来确定多态性是否以纯合或杂合状态存在(并且因此确定个体的风险类别)。也即，在本发明的另一个实施方案中，检测了与标记对应的多肽(即生物标记多肽)。体液或组织样品中这种生物标记多肽基因表达产物的水平可以由本领域已知的任何方法确定。^嫂趁辦才法。由本发明基因编码的蛋白质的表达可以通过探针检测，其中所述的探针以可检测方式标记或可以随后进行标记。通常，探针是识别所表达蛋白质的抗体。多种模式可以用来确定样品是否含有与给定抗体结合的生物标记蛋白质。用于检测本发明的生物标记多肽的免疫测定方法包括但不限于例如点印迹、蛋白质印迹、蛋白质芯片、竟争性和非竟争性蛋白质结合分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫组织化学、荧光激活它方法，并且可商业地使用多种方法。技术人员可以方便地调整已知的蛋白质/抗体检测方法以用于确定细胞是否表达本发明的标记以及确定血液或其它体组织中这种特定多肽表达产物的相对浓度。来自个体的蛋白质可以使用本领域技术人员众所周知的技术分离。所用的蛋白质分离方法例如可以是在Harlow和Lane，^Iw船oWd'丄tf6omtof^Ma冊a/(ColdSpringHarbor,NewYork,1988))中描述的那些蛋白质分离方法。可以使用完整抗体或其片段例如Fab或F(ab，)2。识别特定表位的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，此类片段包括但不限于可通过胃蛋白酶消化抗体分子而产生的F(ab，)2片段以及可通过还原F(ab，)2片段的二硫桥而产生的Fab片段。备选地，可以构建Fab表达文库(见Huse等，5Wewce，246:1275-1281(1989))以允许快速而容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段。术语"标记的"相对于探针或抗体而言意图包含通过偶联(即物理地连接)可检测物质至探针或抗体而对探针或抗体的直接标记，以及通过与另一种受到直接标记的化合物的反应性而对探针或抗体的间接标记。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，以及用生物素对DNA探针进行末端标记以至于DNA探针可以用荧光标记的链霉抗生物素蛋白检测。作为针对特定抗原的均一抗体群的单克隆抗体(mAb)可以通过连续细32胞系培养而产生抗体分子的任意技术得到。这些技术包括但不限于Kohler&Milstdn，A^re，256:495-497(1975)的杂交瘤技术；和美国专利号4,376,110;Kosbor等，/附附"朋/.ro甴j;，4:72(1983)的人B-细胞杂交瘤技术；Cole等，iVfl汰fAS^，80:2026-2030(1983);以及EBV-杂交瘤技术，Cole等，Mowoc/otf/Jw^^/esawdCVmm*77rmi/^,第77-96页(AlanR.Liss，Inc.，1985)。此类抗体可以是任意的免疫球蛋白类，包括lgG、IgM、IgE、IgA、IgG以及其任意的亚类。产生本发明mAb的杂交瘤可以在体外或体内培养。体内高效价mAb的产生使其成为目前优选的产生方法。此外，可以使用旨在通过如此方式产生"嵌合抗体"而开发的技术(见Morrison等，iVoc.iV,/Jcflrf.USA，81:6851-6855(1984);Neuberger等，iV^""，312:604-608(1984)及Takeda等，TV","",314:452-454(1985))，也即把来自具有适宜抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适宜生物学活性的人抗体分子的基因剪接在一起。嵌合抗体是其中不同部分来自不同动物种的分子，如具有来自小鼠mAb和人免疫球蛋白恒定区的可变区或高变区的那些分子。备选地，可以修改所述用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778;Bird,S"e騰，242:423-426(1988);Huston等，尸亂胸"ow/.5W.USA,85:5879-5883(1988)和Ward等，7V"似re，334:544-546(1989)以产生差异性表达基因的单链抗体。如此形成单链抗体，即通过将Fv区的重链片段与轻链片段经氨基酸桥连接，产生单链多肽。更优选地，可以修改用于产生"人源化抗体"的技术以产生针对蛋白质、片段或其4汙生物的抗体。此类在美国专利号5,932,448;5,693,762;5,693,761;5,585,089;5,530,101;5，569，825;5,625,126;5,633,425;5,789,650;5,661,016及5，770，429中公开。识别特定表位的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，此类片段包括但不限于可通过胃蛋白酶消化抗体分子而产生的F(ab，)2片段以及可通过还原F(ab，)2片段的二硫桥而产生的Fab片段。备选地，可以构建Fab表达文库(见Huse等，5We""，246:1275-1281(1989))以允许快速而容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段。在一种模式中，抗体或抗体片段可以用于方法如蛋白质印迹或免疫荧光技术中以检测所表达的蛋白质。在这类用途中，一般优选地将抗体或蛋白质固定在固相支持体上。合适固相支持体或栽体包括能够结合抗原或抗体的任何支持体。众所周知的支持体或栽体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁石。已知蛋白质在生物学样品中表达的程度通过利用上文所述的抗体的免疫测定方法确定。为便于检测，尤其优选的是夹心ELISA,其存在多种变型，它们均意图用于本发明的方法和分析法中。例如在常见的正向分析法中，未标记的抗体固定在固体基质上并且在合适的温育时间后使待检验样品与结合的分子接触，持续的时间足以允许形成抗体-抗原二元复合体。此时，随后添加并温育第二抗体，其中所述的第二抗体用能够诱导可检测信号的报道分子标记，持续的时间足以形成抗体-抗原-标记抗体的三元复合体。洗去任何未反应的物质，并且抗原的存在通过观察信号而确定或可以通过与含有已知量抗原的对照样品相比较而定量。正向分析法的变型包括同时分析法，其中将样品和抗体同时添加至结合的抗体上，或反向分析法，其中将标记的抗体及待检验样品首先合并、温育并添加至未标记的表面结合的抗体。这些技术是本领域技术人员众所周知的，并且细微变化的可能性将是显而易见的。如本文中所用，"夹心测定"意图包含对基本双位点技术的全部变型。对于本发明的免疫测定，唯一的限制性因素是标记的抗体必须是对由目的基因所表达的蛋白质特异的抗体。二举凝應逸泳。蛋白质可以通过二维凝胶电泳系统分开并随后鉴定和/或定量。二维凝胶电泳是本领域众所周知的并且通常包括沿着第一方向的等点聚焦作用，随后沿第二方向的SDSPAGE电泳(例如见，Hames等，GW^E7e"ro/7Aoresis1o/iVo,"7z51.'/1iVfl"/cflr/^4/7/nflc/r(IRLPress,NY，1990);Shevchenko等，iVw胸/.USA，93:14440-14445(1996);Sagliocco等，P^rW，12:1519-1533(1996)和Lander,274:536-539(1996))。产生的电泳图镨可以通过多种技术加以分析，包括质谙技术、蛋白质印迹及使用多克隆及单克隆抗体的免疫印迹分析和内部及氨基末端微量测序。使用这些技术，有可能鉴定在给定生理条件下(包括在暴露于药物的细胞例如酵母中，或在例如因特定基因的缺失或过量表达而受修饰的细胞中)所产生的全部蛋白质的大部分。##。生物标记多肽的身份及表达水平均可以使用质谱技术(MS)确定。基于MS的分析方法学用于分析分离的生物标记多肽以及分析生物学样品中的生物标记多肽。用于分析生物标记多肽的MS模式包括电离(I)技术，如但不限于MALDI，连续或脉沖式ESI及相关方法如离子喷雾或热喷雾，以及质簇碰撞(MCI)(massiveclusterimpact)。此类离子源可以与检测模式匹配，所述检测模式包括线性或非线性反射器TOF、单个或多个四极杆、单个或多个扇形磁场、傅里叶变换-离子回旋加速器共振(FTICR)、离子阱及其组合如离子阱/TOF。为了电离，可以使用多种基质/波长组合(MALDI)或溶剂组合(ESI)。例如使用ESIMS(Valaskovic等，Sci'e恥e，273:1199-1202(1996))及MALDIMS(Li等，/爿附.C7^肌Soc.，118:1662-1663(1996))，已经检测到亚-埃摩尔水平的蛋白质。对于MS分析，生物标记多肽可以在适宜的溶液或试剂系统中增溶。溶液或试剂系统例如有机溶剂或无机溶剂的选择将取决于生物标记多肽的特性及所开展MS的类型，并且以本领域众所周知的方法为基础。对于MALDI，例如见Vorm等，Z"a/.C7^肌，61:3281(1994),并且对于ESI，见Valaskovic等，爿《"/.C7ie肌，67:3802(1995)。肽的MS也例如在国际PCT申请号WO93/24834和美国专利号5,792,664中描述。选择这样的溶剂，其中所述溶剂使生物标记多肽会因所导入用于气化过程的能量而分解的风险最小化。降低生物标记多肽分解的风险可以通过例如将样品包埋在基质中而实现。合适的基质可以是有机化合物如糖，例如戊糖或己糖，或多糖如纤维素。此类化合物以热解方式分解成C02和H20以至于没有形成可能导致化学反应的残渣。基质也可以是基本上分解而不留下任何残渣的无机化合物，如硝酸铵。这些溶剂及其它溶剂的用途是本领域技术人员已知的。例如见美国专利号5，062，935。电喷射MS已经由Fenn等，/C/^附.，88:4451-4459(1984)以及在PCT申请号WO90/14148中描述，并且目前的应用在综述文章中总结。见Smith等，爿wa/.Oie肌，62:882-89(19卯)以及Ardrey，5^e"r仍o/^,4:10-18(1992)。借助ESI，对飞摩尔量的样品中分子量的测定因存在多个离子峰而是极其精确的，其中所述的峰全部可以用于质量计算。基质辅助激光解吸(MALDI)是本文MS方法中一种优选的方法。用于开展MALDI的方法是本领域技术人员众所周知的。用于改进分辨率的多种方法也是已知的。例如，MALDI-TOF-MS中的分辨率可以通过降低离子提取期间高能碰撞的次数而改善。例如见Juhasz等，为V^C7^附.，68:941-946(1996);还例如见，美国专利号5,777,325;5，742，049;5,654,545;5,641,959;5，654，54及5,760,393对MALDI和延时提取方案的描述。MALDI-TOF:MS已经由Hillenkamp等，Burlingame和McCloskey编者，第49-60页(ElsevierSciencePubl"1990)描述。在优选的实施方案中，生物学样品例如体液或组织样品中生物标记蛋白质的水平可以通过质谱(MS)方法测量，所述质谱方法包括但不限于本领域已知的那些方法，如下文更详细描述的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质镨(MALDI-TOF-MS)和表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI画TOF-MS)。3/ASx"/-roF-MS蛋^^检承y拔^。在一些优选的实施方案中，对生物学样品例如体液或组织样品中特定蛋白质或多肽基因表达产物的检测通过MS、尤其基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MASLDI-TOF-MS)进行。这些^R术已经用来分析大分子如蛋白质或生物分子并且利用样品探针表面化学，其能够选择性捕获分析物(包括完整大分子)并使之直接从探针表面解吸成为气体(气相)，并且在最优选的实施方案中，无需添加的化学基质。在其它实施方案中，可以使用多种其它利用质语检测标记的技术。见Afflws15^e"ro附e外C。"/emiceie/wW，Hillenkamp编辑，第354-362页(1988);AftfssiS，"ro附"ij0w/emicei印oW，Karas和Hillenkamp编者，第416-417页(1988);Karas和Hillenkamp，爿w"C7^附"60:2299-2301(1988)以及且Karas等，祝o附^/五"W/wiAf似s5^c&"/fi，18:841-843(1989)。激光束在TOF-MS中的用途在例如美国专利号4,694,167;4,686,366;4,295,046及5,045,694中显示，其中所述专利在本文中完整引用作为参考。其它MS技术成功地促使高分子量生物聚合物挥发，而没有片段化，并能够使类型广泛的生物大分子通过质谱分析。^面增强激^席^/冶庠(5^丄""。在本发明的优选实施方案中，使用了采用具有如此表面的新MS探针元件组成的其它技术，其中所述的表面允许探针元件主动参与对特定分析物的捕获和停靠，称作亲和质谱(AMS)。几种类型新MS探针元件已经设计用于表面增强亲和捕获(SEAC)。见Hutchens和Yip，及fly^V/Co附/mw".Af"^5^e"ro附.，7:576-580(1993)。SEAC探针元件已经通过利用有关蛋白质表面结构及生物特异性分子识别的知识而成功地用来回收并系留不同类别的生物聚合物，尤其是蛋白质。在本发明又一个优选的实施方案中，与本发明方法一起使用的检测方法使用通用类型的探针元件，即借助表面增强激光解^^/电离(SELDI)的样品呈递方法。见SELDI专利美国专利号5，719，060;5，894，063;6，020，208;6,027,942;6,124,137以及美国专利申请号U.S.2003/0003465。目的多肽可以经接头直接与支持体连接。可以使用本领域技术人员已多肽可以经可变间隔区与支持体如珠缀合。接头包括Rink酰胺接头(例如见，Rink,7^mA^//wi2>汰，28:3787(1976));三苯甲基氯接头(例如见，Leznoff，爿ceC7^附.11:327(1978))和Merrifield接头(例如见，Bodansky爭，尸印ftV/e^威w、第二版(AcademicPress,NewYork,1976))。例如，三苯甲基接头是已知的(例如见，美国专利号5,410,068和5,612,474)。氨基三苯甲基接头也是已知的(例如见，美国专利号5,198,531)。其它接头包括可以掺入融合蛋白并在宿主细胞中表达的那些接头。此类接头可以是选择的氨基酸、酶底物或任何合适的肽。接头可以例如在分离核酸时通过引物的合适选择而产生。备选地，接头可以由目的蛋白质的翻译后l务饰作用添加。炎^奸工类(^Vi7Vw()窗定/农。使用针工具固定目的多肽至固相支持体可以是特别有利的。针工具包括在本文中公开或本领域已知的那些针工具。例如见美国专利申请序号08〃86，988和08/787,639以及国际PCT申请号WO98/20166。阵列例如4x4阵列中的针工具可以用于含有目的多肽的孔。在针工具具有与每一针尖连接的官能团，或固相支持体(例如官能化珠或顺磁珠)与每个针连接时，孔中的多肽可以被捕获(lpmol容积)。目的多肽尤其生物标记多肽可以因与针工具接触而固定。进一步固定可以通过对针工具施加电场引起。例如见Juhasz等，Jwfl/"&，Jwtf/.C7^w.，68:941-946(1996)，并且还例如见美国专利号5，777，325;5，742,049;5,654,545;5,641,959及5,760,393对MALDI及延时提取方案的描述。针工具可以用于在阵列上以空间可寻址方式固定目的多肽。这类空间可寻址的或预可寻址的阵列可用于多种方法中，包括例如质量控制及氨基酸序列诊断。在美国申请号08/786,988及08/787,639和国际PCT申请号WO98/20166中描述的针工具是可以用来在固定的固相支持体表面上产生多肽的多要素阵列(multi-elementarrays)的串行及并行分配工具。^參夢炎,悉的^它才面。在本发明的多种实施方案中，可以测量生物活性状态的方面或混合方面以便得到药物及途径应答。可以测量与表征细胞功能有关的蛋白质活性，并且本发明的实施方案可以以这类测量为基础。活性测量可以通过适用于正在表征的特定活性的任何功能性、生物化学性或物理方法进行。在活性涉及化学转化的情况下，细胞蛋白可以与天然底物接触并且测量转化速率。在活性涉及多亚基单元结合例如激活的DNA结合复合体与DNA结合的情况下，可以测量结合蛋白的量或这种结合的继发后果，如所转录mRNA的量。当然在仅已知功能性活性的情况下，例如在细胞周期控制中，可以观察功能的表现。无论如何获知和测量，蛋白质活性的变化形成由本发明方法分析的应答数据。在备选及非限制性实施方案中，应答数据可以由细胞的生物学状态的复合方面构成。应答数据可以例如从某些mRNA丰度的变化、某些蛋白质丰度的变化和某些蛋白质活性的变化中构造出来。给出如下实施例以便更充分说明本发明的优选实施方案。这些实施例无论如何不应当理解为限制如所附权利要求所定义的本发明范围。实施例1在以抗NOGOA抗体11C7治疗后的大鼠脊髓损伤模型中的基因组学探索性研究；微阵列基因表达分析^#。本实施例的目的是显示大鼠中因脊髓损伤后抗Nogo-A抗体治疗而产生的基因表达变化，以便鉴定治疗效力、作用机制或任何潜在不利作用的生物标记候选物。^n说^".实施例涉及生命的部分如下开展总共40只成年雌性Lewis大鼠(及fl"附wonv"/c附，160-1卯g)从无特定病原(SPF)种畜群(R.Janvier，Legenet-St-Isle，法国)中得到并且在标准化笼具(4型，Macrolon，Indulab，Hanstedt，德国)内以4—6只动物为组，在12小时昼/夜循环下按照标准规范饲养，不限制食物和饮水。将大鼠随机分成5组两组16只大鼠经历脊髓半切除处理并接受IgG或抗NogoA抗体(llC7)。第三组(8只大鼠的幼稚组)不经历手术并且不接受任何治疗，结果治疗组1)IgG治疗7曰2)Nogo-A治疗7曰3)IgG治疗14曰4)Nogo-A治疗14曰5)幼稚对照动物用随机数字编号并且实验员在全部步骤及实验阶段间自始至终对治疗不知晓。全部治疗、手术方法和处死及初始数据分析以盲法实施。抗体代码为"橙"和"黄"。戎#.抗Nogo-A抗体11C7:小鼠单克隆抗体(mAb)llC7，针对与大鼠第623-640位氨基酸序列对应的18aa肽Nogo-A产生；以PBS中3mg/ml的浓度使用。对照抗体是针对植物凝集素的小鼠单克隆IgG,以PBS中3mg/ml的浓度^f吏用。这两种抗体的生物化学特性和中和特性在OertleT等，/A^"r仍c/.23:5393-5406(2003)中描述。手i才法。动物用皮下注射枸橼酸芬太尼(120jLil/200g体重JanssenPharmaceutics,Beerse，比利时)和多美康(每200g体重在150|nl中0.75mgRochePharmaceuticals,Basle，瑞士)进行麻醉。应用含维生素A的眼膏(Blache，ChauvinNovopharmAG，瑞士)以在相对长时间的操作过程期间保护眼睛不脱水。在胸水平T8处用虹膜切开剪和锋利的尖头刀片产生包括带CST的主突起以及背外侧突起和腹内侧突起的脊髓背半部的T形损伤。从腰水平L2/L3插入一只细的鞘内导管(32号，来自RECATHCO，AllisonPark,Pennsylvania,美国)并且上推至T9，通过渗透性微泵(5jil/h，3.1pg/|Lil，Alzet2ML2,CharlesRiverLaboratories,LesOncins，法国)送递抗体至损伤部位持续2周。在手术后，将动物放在恒温调节的加热垫上直至完全清醒。不给予止痛药或抗生素以便不影响结果。当动物显出脱水病征时，皮下给予林格液(FreseniusKabiAG,Stans，瑞士)。^yS。分别在1周和2周后，大鼠用异氟烷轻度麻醉并断头处死。幼稚动物随1周动物组一起处死。将1ml全血收集至EDTA管内，混合，用1mlNaCl0.9%稀释，转移至含有Fas的管内。混合物在干水上冷冻。在Lith/Hep管中收集大约1ml全血，混合并且在2000xg离心10分钟(冷却)前置于冰上。上清液(血浆)在干冰上冷冻。暴露脑及脊髓，对特定组织区域采样并且立即在千冰上冷冻。每组动物数及性别8只雌鼠/组，总共40只。年龄8-9周。体重160-190g。41研究设计，动物分配及试验项目剂量组l组2组3组4组5化合物11C7IgG11C7IgG幼稚动物治疗期7曰7曰14曰14曰无治疗i.ti.ti.t,i.t.施用途径和频率通过微量泵连续施通过微量泵连续施通过微量泵连续施通过微量泵连续施无治疗.用用用用最后给药与处死间0小时O小时O小时0小时无治疗的时间治疗开始时的动物88888数动物数1-1617-3233-4849-64113-128对如下组织采样1)在损伤的水平处胸段脊髓(T8)2)在高于损伤处胸段脊髓(T1-T7)3)颈段脊髓4)腰段脊髓5)脑-额皮层6)脑-运动皮质和体感皮质7)脑-枕叶皮质8)脑-紋状体9)脑-海马10)脑干12)腰DRG13)血液细胞14)血清15)CSF样品在干冰上并且随后在-80。C深冷冰箱中存储直至进一步使用。如下组织样品为基因表达镨分析进行处理并分析1)在损伤的水平处胸段脊髓(T8)2)在高于损伤处胸段脊髓(T1-T7)3)腰段脊髓4)脑-额皮层5)脑-运动皮质和体感皮质6)血液细胞脑分成两个半球并且左半球保持完整以便使用原位杂交/免疫组织化学进一步证实微阵列的发现，而右半球用于解剖。iA^爽承及銷^.简而言之，总RNA通过酸性硫氰酸胍(acidguanidiniumthiocyanate)-酚画氯仿提取(Trizol，InvitrogenLifeTechnologies)从每种冷冻组织切片中得到，并且总RNA随后根据制造商说明书在亲和树脂(Rneasy，Qiagen)上纯化并且定量。总RNA由在人=260nm(A26加m)的吸光度定量，并且纯度通过比例A26Qnm/A280nm估计。RNA分子的完整性通过4吏用Agilent2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies,PaloAlto，California,美国)用非变性琼脂糖凝胶电泳证实。保存每个单独RNA样品的等分试样用于通过基于荧光的实时PCR(TAQMAN;Applera)证实微阵列的发现。RNA存储在-80。C直至分析。微萍/y^r發.全部微阵列杂交如微阵列系统制造商所推荐(Affymetrix，SantaClara，California;表达分析技术手册)实施。来自每一治疗组的6份样品分别(不合并)在含有>31000个探针组的大鼠基因组RAE2302.0基因表达探针阵列组(Affymetrix，Inc.,SantaClara，California,美国)上杂交。双链cDNA以起始量大约5全长总RNA，使用SuperscriptChoice系统(InvitrogenLifeTechnologies)在T7-(dT)24DNA寡核苷酸引物存在下合成。合成后，将cDNA通过酚/氯仿/异戊醇萃取及乙醇沉淀法纯化。纯化的cDNA随后使用BioArray⑧高产率RNA转录物标记试剂盒(ENZO)在生物素化的核糖核苷酸存在下进行体外转录，形成生物素标记的cRNA。标记的cRNA随后在亲和树脂(RNeasy,Qiagen)上纯化、定量并且片段化。将大约10照量的标记cRNA在45。C与表达探针阵列杂交大约16小时。随后该阵列4吏用GeneChipFluidicsWorkstation400(Affymetrix)洗涤并用链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白(MolecularProbes)染色两次。阵列随用共聚焦激光扫描仪(GeneArrayScanner,Agilent)扫描两次，产生扫描图像。该结果".dat-file"使用MAS5程序(Affymetrix)处理成".cel-file"。原始数据使用"耙强度"150转化成表达水平炎拔为Vf。对脊髓组织T8(在损伤的水平处)及接近于损伤的脊髓组织Tl-7的数据组的初始数据分析以盲法开展。该分析导致鉴定代码为"橙，，的样品作为11C7治疗组，此后，该代码解密并且样品身份得到证实。其余分析不是盲法的。^#控辦。对每个样品研究如下的质量量值换算系数、背景、当前呼叫的百分比(percentpresentcalls)、AFFX-GAPDH3，:AFFX-GAPDH5，-比例、AFFX-GAPDH3，方差、AFFX-P肌动蛋白3，:AFFX-p肌动蛋白5，-比例。注意数据的均匀性。背景噪音水平的平均值和标准差决定了后续分析中所用的原始数据限制值。GAPDH3，方差是在各样品之间变异的度量并且可以用作可靠倍数差异(reliablefolddifference)的标线。i要^为、为、浙。开展包括在RatGenome2.0上的全部探针组(11=15866)作为变量的主要成分分析(PCA)以便在使用Simca-P10.0软件(Umetrics，Ume益，Sweden)对数据做对数变换及中心化后鉴定异常微阵列(outliermicroarray)。在剔除技术性异常值后，使用GeneSpring(SiliconGenetics,RedwoodCity,California,美国)7'0版重复进行PCA。炎凝々一化。在QC后，MAS5归一化的微阵列数据输入GeneSpring7.0版(SiliconGenetics)。分别对每种组织进行各自的实验。如下对每个实验归一化将低于0的值设为0.1。每个量值除以该样品中全部量值的第50，0百分位数。最后，每个基因的归一化通过归一化至幼稚样品的中位数表达值而进行。:#尤羞#'/^疯^賴差風载体与处理间差异性表达的基因在每个实验中基于如下限制进行鉴定(1)粗滤进一步分析中所包含的探针组在任何条件下必须带标记地存在于4/6的重复物中。原始数据信号强度必须在至少一个治疗组中是最小值50。(2)统计限制pO.05(Welcht-检验(参数性))。相似的统计限制总是应用于待比较的不同组并且在每个比较中提到。差風襄,桌为V^T"E4人使用基因簇富集分析方法的自制实现来分析微阵列数据。在超过75%的芯片上具有低于100的表达水平的基因作为低表达或不表达基因被抛弃。微阵列结果随后在一系列逐对比较中在成组条件(例如处理与对照)间进行分析。每种基因在条件/和务伴2下的相对表达水平计算为表达率^^二一其中/^是基因Z在条件j下的平均表达值。基因随后根据它们的表达率排序，以至于在条件/下具有比在条件2下更高表达的那些基因位于该列的顶端。其次，将可获得基因簇的集合映射到排序列(sortedlist)上。该步骤实质上将先验的生物学知识应用于实验数据以鉴定以协调方式表达的功能性相关基因。一次处理一个基因簇。对于基因簇G,若差厨/eG，则标注表达率r,.'处于，该基因簇中，并且若差西ygG，则'不在，该基因簇中。进行双尾Wilcoxon秩和检验以确定标注'处于，基因簇G*中的基因是否在这个排序列的顶端或底部富集。采用StoreyJD和TibshiraniR,ProcNatlAcadSciUSA100:9440-9445(2003)的错误发现率方法以将p-值转化成多重检验^^正的q-值。来自GSEA的输出是与TV个可获得的基因簇对应的一列q-值"7，《2，…，^和标记仏，&…，W，e(顶部，底部)。小q-值仏.表明基因簇C中的基因在表达率列表的顶部或底部显著富集。潜采。对脊髓组织T8(在损伤的水平处)及接近于损伤的脊髓组织Tl-7的数据组的初始数据分析以盲法开展。该分析导致鉴定代码为"橙"的样品作为11C7治疗组，此后，该代码解密并且样品身份得到证实。其余分析不是盲法进行的。#體7W在源谅^水"f义)。比较IgG治疗组与11C7治疗组的Welcht-检验产生在分别治疗一周和二周后643种和449种差异性表达的基因。前100个最大倍数变化的平均倍数变化在治疗一周后是1.93±1.06并且在治疗二周后是1.31±0.07。治疗一周后的前100位基因表达变化列于在实施例2表4中并且在治疗二周后的前100位基因表达变化列于表5。90%的前20位转录物在11C7治疗一周后下调(而在总的差异性表达的转录物中，41%下调)。有意思的是，在这些转录物当中，存在7种转录物，它们编码与胞外基质(ECM)和伤口愈合和/或瘢痕形成(无孢蛋白(asporin)前体、皮连蛋白(dermatopontin)、胶原)有关的蛋白质、2种分泌性巻曲样蛋白(Sfrl2及4)、2种IGF结合蛋白(Igfbp5和6、IGF的负向调节蛋白)和肌纤蛋白/TIGR，其中肌纤蛋白/TIGR最近证实抑制神经突长出并且在CNS损伤后在慢性神经胶质痴痕中上调。JurynecMJ等，Afo/.CW/.7Ve"r^d.23:69-80(2003)。基因簇富集分析(GSEA)鉴定到治疗一周后具有差异性富集转录物显著富集的总共30条途径(实施例3的表16)。最显著的富集在免疫及防御相关性转录物(图1)、细胞因子及趋化因子介导的信号途径(图2)及Jak-stat级联(图3)中观察到，均在11C7的方向上。就神经系统相关的途径而言，在11C7治疗的动物中神经元活性、神经发生和神经-神经突触传递下调(qO.OOl)，而slit-robo介导的轴突导向(q-0.018)上调。在治疗二周后，倍数变化显著比治疗1周后小。仅一种转录物受到>1.5倍的显著差异调节(p53应答基因3，在11C7治疗后上调1.6倍)。GSEA鉴定了其中观察到差异性表达转录物的显著富集的19条途径。氧化磷酸化(图4)、电子/离子/阳离子运输、凝血、前mRNA加工和突触传递(图5)是其中最显著受影响的途径(实施例3的表21)。#^77-7f接近f橫银举在)。比较IgG治疗组与11C7治疗组的Welcht-检验产生在分别治疗一周和二周后566种和579种差异性表达的基因。前100个最大倍数变化的平均倍数变化在治疗一周后是1.43±0.17并且在治疗二周后是1.56±0.98。治疗一周后的前100位基因表达变化列于表18中并且在治疗二周后的前100位基因表达变化列于实施例3表19。在11C7治疗一周后的最大变化再现了损伤部位中观察到的主题前20位变化中的8个变化与ECM有关(腔蛋白聚糖、胶原lal-2及5al、纤蛋白2、四连蛋白(tetranectin)、基质糖蛋白SC1/ECM2)并且在以11C7治疗后下调。在治疗二周后，倍数变化比治疗1周后略高。最大变化中的一些变化与编码在淋巴细胞中所表达蛋白质的转录物下调有关。基因簇富集分析(GSEA)鉴定了治疗一周后5条途径中的显著富集(表18，实施例3)。治疗二周后没有途径显著受到影响(qO.OOl)。在一周后受影响最显著的途径是ECM介导信号传导、脂类、脂肪酸及固醇代谢和生长因子稳态(图6-8)。脊體ZJ-5(^逸庠橫務部^)。比较IgG治疗组与11C7治疗组的Welcht-检验产生在分别治疗一周和二周后1303种和1301种差异性表达的基因。前100个最大倍数变化的平均倍数变化在治疗一周后是1.72±0.5并且在治疗二周后是1.91±2.0。治疗一周后的前100位基因表达变化列于表1-5中并且在治疗二周后的前100位基因表达变化列于实施例3表21。在11C7治疗一周后的最大变化与由淋巴细胞表达的转录物(类似于Igy-2C链C恒定区(LOC362795)、mRNA、分泌性白细胞蛋白酶抑制物、淋巴细胞选凝素、脂笼蛋白2、凝血调节蛋白、趋化因子(C-X-C基序)配体12)有关并且当上调时，可能暗示在11C7治疗后淋巴细胞向组织中的运输增加。Sfrp4和肝配蛋白B1也在11C7治疗后上调。在治疗二周后，最显著改变的转录物包括核受体MrgAlORF酰胺G蛋白偶联受体(MrgalO)和核受体辅激活物3以及在11C7治疗后下调的免疫相关性转录物。大多数的显著变化与突触传递或突触嚢泡循环(突触发生相关mRNA序列6、突触嚢泡糖蛋白2b、突触孔蛋白)有关并且在11C7治疗后上调。基因簇富集分析(GSEA)鉴定了治疗一周后58条途径中的显著富集(表19，实施例3),以及治疗二周后48条途径中的显著富集(表20，实施例3)。受影响最显著的途治疗一周后是免疫及防御、信号转导及细胞通信(在11C7上均上调；图8-10)并且在治疗二周后是免疫及防御、细胞通信及突触传递(图11-13)。有意思的是，免疫及防御相关性途径在治疗二周后在IgG治疗的方向上极为显著地富集(在11C7治疗后下调)。突触传递、神经元活性及神经递质释方文相关途径在11C7治疗二周后显著富集(上调)。适动-傳毒'发x^.比较IgG治疗组与11C7治疗组的Welcht-检验产生在分别治疗一周和二周后574种和910种差异性表达的基因。前100个最大倍数变化的平均倍数变化在治疗一周后是1.42±0.19并且在治疗二周后是1，46±0.09。治疗一周后的前100位基因表达变化列于实施例3表20中并且在治疗二周后的前100位基因表达变化列于表21。在治疗一周后运动-体感皮层中的70%前100位变化是EST，因而使数据解释复杂化。然而在改变的前100位中，已知的转录物是S100钙结合蛋白A9(巨噬细胞表达的4丐粒蛋白B,在11C7治疗后上调3倍)和Crmp5(瓦解蛋白应答介导物蛋白5，在11C7治疗后上调)。瓦解蛋白-应答介导物蛋白(CRMP)在发育的脑中高度表达，在脑中它们参与神经元分化的若干方面。在成人中，它们在持续神经发生的区域内表达。VeyracA等，五w.丄A^wwc/.21:2635-2648(2005)。在治疗二周后，80%的前100位变化是EST。基于多重检验修正分析，GSEA鉴定在治疗一周后没有途径具有差异性表达转录物的显著富集。在治疗二周后，氧化磷酸化途径显示差异性表达基因的显著富集(q〈0.001;表21，实施例3)。有趣的是，亨廷顿舞蹈病、EGF-、FGF-和NGF的信号途径均受到影响，但是脱离推荐的显著性水平(q<0.04vsq<0.001)。它们均在11C7治疗后下调(图M-l7)。受影响途径中的少数途径可能反映了在本数据组中不能归入任何途径的大量差异性表达的EST。^"发i。比较IgG治疗组与11C7治疗组的Welcht-检验产生在分别治疗一周和二周后657种和275种差异性表达的基因。前100个最大倍数变化的平均倍数变化在治疗一周后是1.3±0.3并且在治疗二周后是1.2±0.05。治疗一周后的前100位基因表达变化在附件-l中列于表l-9中并且在治疗二周后的前IOO位基因表达变化列于表1-10。仅13种转录物在治疗一周后以及10种转录物在治疗二周后差异性表达>1.3倍，从而表明应答该治疗的非常弱的基因表达。在>1.3倍数变化中在治疗一周后是由巨噬细胞表达的S100钩结合蛋白A9(钓粒蛋白B)、与细胞分化有关的c-fos癌基因、Dusp6和Egr-l并且在治疗二周后是stathmin1、Nr2f2、G蛋白偶联受体27和髓鞘相关的少突胶质细胞碱性蛋白(Mobp;在11C7治疗后上调l.28倍)。由于少数显著变化，对额皮层数据组未进行GSEA。j&濕。比较IgG治疗组与11C7治疗组的Welcht-检验产生在分别治疗一周和二周后389种和427种差异性表达的基因。前100个最大倍数变化的平均倍数变化在治疗一周后是2.U0.56并且在治疗二周后是1.80±0.40。治疗一周后的前100位基因表达变化在附件-1中列于表1-11中并且在治疗二周后的前100位基因表达变化列于表1-12。11C7治疗一周后的最大变化中有基质金属蛋白酶Mmp8及Mmp9、Hipk3、分泌性白细胞蛋白酶抑制物(在一周后在Ll-5中也上调)及钙粒蛋白A的上调。在治疗二周后，类似于p淀粉状蛋白结合蛋白(LOC362545)，mRNA及Creb结合蛋白在11C7治疗后下调，而神经保护性mGluR8及凋亡相关性Sfrp4在11C7治疗后上调。基于多重检验修正分析，GSEA鉴定到在治疗一周后6条途径具有差异性表达转录物的显著富集(qO.001;附件-2，表l-7)。胞吞作用、胞内蛋白质运输、受体介导的胞吞作用(图18)、一般的小泡运输、干扰素介导的免疫(图19)、神经活性配体-受体相互作用(图20)、mapk信号传导途径、巨噬细胞介导的免疫(图21)和随后的Il-lb及B-细胞活化(分别是图22及23)是受影响最大的途径。有趣的是，在所有以上所提及富集方向除了神经活性配体-受体相互作用以外，均是在11C7的方向上。这表明转录物的上调与11C7治疗后的那些途径有关。在治疗二周后，8条途径显示差异性表达基因的显著富集(qO.001;附件-2，表l-8)。蛋白质代谢及修饰、免疫及防御(图24)以及蛋白质修饰属于受影响最大的途径。在治疗二周后在血液中除一条途径外的全部途径均在IgG的方向上富集。^s&。本实施例的目的是与对照治疗即小鼠抗植物凝集素IgG抗体相48比，在大鼠中鉴定在脊髓半切除后用单克隆小鼠抗Nogo-A抗体11C7治疗一周和二周后的治疗相关性改变。在治疗一周后，最显著的基因表达变化就数目和幅度而言在远离损伤部位(Ll-5)处，见察到，其次是损伤部位(T8)和血液，而额皮层、运动-体感皮层和接近于损伤部位的脊髓(T1-7)则明显更少受到影响(表2)。在治疗二周后，最大影响尺度就基因表达而言在Ll-5中观察到，随后是对运动-体感皮层、接近于损伤部位的脊髓(Tl-7)及血液的相对类似的影响。治疗二周后在T8及在额皮层中观察到明显较少的治疗影响(表2)。表2在所研究的组织中基因表达变化的总结l周2周组织显著变化的数目前100个的平均倍数变化作用大小级别组织显著变化的数目前100个的平均倍数变化作用大小级别Ll画513031.72±0.51Ll-513011.9U2.01T86431.93±1.062MCx9101.46±0.092血液3892.1±0.563Tl誦75791.56±0.982FCx6571.3±0.34血液4271.8±0.043MCx5741.42±0.195T84491.31±0.074Tl-75661.43±0.175FCx2751.2±0.055影响尺度级别是基于显著性基因表达变化的数目及在该组织中前100位基因表达变化的平均倍数变化对所研究的组织分级。在损伤部位》见察到11C7的极强烈影响，在治疗一周后下调与胞外基质和伤口愈合有关的转录物。无孢蛋白(asporin)前体、皮连蛋白、微原纤维相关的糖蛋白-2和几种胶原以及两种分泌性巻曲相关蛋白Sfrp2和Sfrp4处于位居前列的下调变化中，其中发现所述分泌性巻曲相关蛋白的表达与凋亡相关。发现肌纤蛋白/TIGR在llC7治疗一周后下调2.67倍，其中肌纤蛋白/TIGR是CNS损伤后在慢性神经胶质疤痕中表达上调并且在体内对背根神经节神经原具有神经突长出抑制作用的一种分泌性糖蛋白(JurynecMJ等，Afo/.O//.7Vewwd23:69-80(2003))。提出肌纤蛋白是受抗Nogo-A治疗抑制的新的神经突长出抑制性分子。其它神经突长出/轴突导向相关性变化包括通过GSEA鉴定(qO.02)的slit-robo介导的轴突导向途径相关性转录物，其中所述的转录物编码趋化因子(C-X-C基序)配体12和趋化因子(C-X-C基序)受体4。Cxcl12和CXCR4显示在用11C7治疗一周后在所研究全部脊髓节段中的一致性上调(图M)。Cxcr4由其可溶性配体CxclU(Sdfl)的激活已经证实在体外影响生长锥运动和神经突延长(ArakawaY等，/.Ce//.161:381-391(2003);PujolF等，./CCSc/.118:1071-1080(2005);XiangY等，iVatA^Mnd.5:843-848(2002))。有趣的是，认为这种作用由Rho/ROCK途径介导以至于低浓度的Cxcl12刺激了介导促进轴突延伸的Rho依赖性途径。ArakawaY等，/.CW/.161:381-391(2003)。最近，显示Cxcll2-CXCR4趋化因子信号传导途径定义了发育期间哺乳动物运动轴突的初始轨道。LieberamI爭，Neuron47:667-679(2005)。我们的研究结果认为该途径可以因11C7治疗而上调并且可以因此对再生期间抗NogoA的作用才几制有贡献。在个体基因水平上(但未经GSEA鉴定)，与脑信号蛋白-瓦解蛋白介导性途径有关的变化是在治疗l周后在T8及在运动-体感皮层中观察到介导对迁移性生长锥的排斥信号的semaA/脑信号蛋白3A及瓦解应答蛋白4和5——Crmp4/5被下调。GSEA首先由MoothaVK等，G^"e/.34:267-273(2003)描述为鉴定孩t阵列数据中功能性相关基因族之间协调性转录变化的方法。基因簇富集分析方法已经在内部实现并且具有对原始方法学的若干改进[RD-2005-50762。通常在孩i阵列数据中，单个转录物水平的变化往往因细微的倍数变化而仍是不显著的，而大多数影响整个途径的此类变化将是显著的。因为通常在神经系统中观察到的细微倍数变化(最有可能因不均一细胞群体的大的基因稀释作用所致)，GSEA方法尤其在解释源自神经组织的数据时尤其令人感兴趣。已经从多种来源收集在本研究的GSEA中所导入的途径信息，所述来源包括可公用的数据库(KEGG)和专有数据库(Celera、Pathart)。在三种或多种组织中具有显著(qO.001)基因簇富集的总共24条途径在表3中列出。受影响最大的途径总体上是免疫及防御(4种组织)、蛋白质代谢及砩酸化(4种组织)、核苷、核苷酸及核酸代谢(4种组织)、神经元活性(4种组织)及Jak-stat级联(4种组织)。GSEA在本研究中揭示了免疫防御途径中的极清晰效果，包括B细胞和T细胞介导的信号传导、B细胞活化、巨嗷细胞-、NK-细胞介导以及嗜中性粒细胞介导的免疫、toll样受体途径和细胞因子及趋化因子介导的信号途径。有趣的是，免疫及防御介导的途径在治疗一周后在11C7的方向上富集，但是在治疗二周后在IgG的方向上富集。相同模式也在全部其它免疫机制相关性途径中观察到，如B-细胞、T-细胞、巨噬细胞及NK-细胞介导的免疫途径。对免疫相关途径的显著影响最常见在脊髓的损伤部位(T8)及远离此损伤部位的地方(Ll-5)和在血液中观察到，而在血液中的富集方向与脊髓组织的富集方向一致。虽然没有用显微镜详细研究，但是这表明与IgG治疗的动物相比，在用11C7治疗一周后淋巴细胞、巨噬细胞和NK-细胞在血液和在受损脊髓中均增加，并且还可能淋巴细胞向受损脊髓中的运输增加。由于已经提出靶向Nogo-A胞外部分(Nogo-66)的抗体在多发性硬化动物模型中具有治疗效力(KarnezisT等，2VfltTVe"nwd.7:736-744(2004);FontouraP等，丄J附/m/wo/.173:6981-6992(2004))，免疫相关性机制可能参与化合物的作用特别重要。在超过三种所研究组织中受到影响的其它显著富集的途径包括凋亡和凋亡信号途径、凝血/凝固、细胞黏着介导的信号传导、胞外基质蛋白介导的信号传导、生长因子稳态、癌基因、氧化磷酸化及突触传递。富集方向在大多数途径中与免疫相关性途径中观察到的富集方向相似，在治疗一周后朝向11C7，而在治疗二周后朝向IgG。一个令人感兴趣的例外是突触传递途径，其中该途径在11C7治疗一周后下调，但在治疗二周后则上调。神经元活性以及神经-神经-突触传递途径遵循相同的模式并且在脊髓中在T8和Ll-5水平上显著受到影响。在抗Nogo-A抗体的作用中鉴定出几种生长因子途径，包括EGF、FGF、NGF、PDGF和TGFP信号途径从若干角度看是有意义的最近报道EGF-受体激活是轴突再生中来自髓磷脂和硫酸软骨素的抑制性信号的介体，并且抑制EGF受体信号传导导致损伤后视神经的再生。HeZ&KoprivicaV，Annu.Rev.Neurosci.27:341-368(2004);KoprivicaV等,Science310:106-110(2005)。在本发明数据组中，EGF受体介导的信号途径在血液和Ll-5中在11C7治疗1周后上调，不过令人感兴趣的是在运动曙体感皮层中在11C7治疗二周后下调。PDGF信号途径在11C7治疗一周后在脊髓中所研究的全部三个水平上(T8、Tl-7、Ll-5)上相伴地上调。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>表3在三种或多种组织中具有显著基因簇富集的途径<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>潜论。本结果在基因表达水平证实受损脊髓和皮层运动区作为鞘内施用的抗Nogo-A抗体治疗的主要部位。本分析鉴定了新的候选分子及新的候选途径作为抗Nogo-A治疗的可能耙标，如肌纤蛋白和slit-robo途径。该结果还指出免疫防御相关的途径强烈涉及疗效。选择分泌性蛋白Sfrp4、Mmp9和肌纤蛋白作为疗效的候选标记以进行进一步研究。进行对所选择研究结果的TAQMAN证实。全部选择的转录物得到证实(Sfrp2、Sfrp4、肌纤蛋白、无孢蛋白前体、皮连蛋白、Mmp9)。实施例2以抗NOGOA抗体11C7治疗后的大鼠脊髓损伤;漠型中的基因组探索性研究；微阵列基因表达分析(续)差塔#貧漠为V々G5"五4)。基因簇富集分析(GSEA)如MoothaVK等，34:267-273(2003)所述进行。简而言之，GSEA确定了给定基因簇的成员是否在两个类之间的差异性表达最明显的基因中富集。首先，基因基于差异度量(differenemetric)进行排序。差异度量可以是在两个类别的均值的差异，其中所述的均值除以两个诊断类别的标准差的总和，但i也可以使用其它差异度量。对于每一基因簇，进行称作ES的富集测量。这是归一化的Kolmogorov-Smirnov统计量。考虑基于两个类别之间的差异度量排序的基因Rl，..，RN与含有G个成员的基因簇S。我们定义当Ri不是S的成员，则《=—、，或当Ri是S的成员，贝'J《=口然后计算所有N个基因的动求和(ruimingsum)。ES定义为^戸max〉:j!■=1或观察到的动求和的正偏差的最大值。对每个考虑的基因簇测量ES。基因簇以来自Celera、Pathart和KEGG的途径信息为基础。为确定任意的给定基因簇是否显示与该类别表型特征的相关性，将类别标记置换1000次，每次记录全部基因簇范围内的最大ES。在这个方面，检验单一假设。无效假设是没有基因簇与类别特征相关。錄果。对脊髓组织T8(在损伤的水平处)及接近于损伤的脊髓组织Tl-7的数据集的初始数据分析以盲法开展。该分析导致鉴定编码为"橙"的样品作为11C7治疗组，此后，该编码解密并且样品身份得到证实。其余分析不是盲法进行的。脊鑀rS(^務谅的,"f#入比较IgG治疗组与11C7治疗组的Welcht-检验产生在分别治疗一周和二周后643种和449种差异性表达的基因。前100个最大倍数变化的平均倍数变化在治疗一周后是1.93±1.06并且在治疗二周后是1.31±0.07。治疗一周后的前20位基因表达变化列于表4中并且在治疗二周后的前20位基因表达变化列于表5。卯％的前20位转录物在11C7治疗一周后下调(而在总共差异性表达的转录物中，41%下调)。有意思的是，在这些转录物当中，存在7种转录物，它们编码与胞外基质(ECM)和伤口愈合和/或斑痕形成(无孢蛋白前体、皮连蛋白、胶原)有关的蛋白质、2种分泌性巻曲样蛋白(Sfr12及4)、2种IGF结合蛋白(Igfbp5和6、IGf的负向调节蛋白)和肌纤蛋白/TIGR，其中肌纤蛋白/TIGR最近证实抑制神经突长出并且在CNS损伤后在慢性神经胶质疤痕中上调。JurynecMJ等，Afo/.O//.7Vewf^c^23:69-80(2003)。基因簇富集分析(GSEA)鉴定在用11C7治疗一周后在免疫及防雄卩相关性转录物、细胞因子及趋化因子介导的信号途径及Jak-stat级联、凋亡抑制中以及在90条其它途径中的显著富集(表4)。就神经系统相关的途径而言，在11C7治疗的动物中神经元活性、神经发生和神经-神经突触传递下调，而slit-robo介导的轴突导向上调。表4在用小鼠单克隆抗NogoA抗体11C7治疗一周后在脊髓中损伤水平(T8)处探针组名称D画值(ANOVA、的前20位基因表达变化在抗Nogo画A治疗与IgG治疗中的倍数基因名称常用名1381504—at1380726at0.0038690.0018931373674at6.91E-041391946—at1371732at0.0463990.0057261368394at0.040183变化0.10.10.32.90.30.31392832at0.0023010.4类似于无孢蛋白前体(LOC306805)，mRNA类似于无孢蛋白前体(LOC306805)，mRNA类似于微原纤维相关的糖蛋白-2(LOC362429)，mRNA选凝素，血小板Sdp皮连蛋白Dpt分泌性巻曲相关蛋白4Sfrp4转录的序列，其与蛋白质参考号:NPJ)04664.1(人)促血管生成素样l前体；促血管生成素Y1;促血管生成素3[人具有强相似表4在用小鼠单克隆抗NogoA抗体11C7治疗一周后在脊髓中损伤水平(T8)处的前20位基因表达变化在抗探针组名称Nogo-A治"疗与feG治^疗中的做变化基因名称性常用名1387313—at0.0093351373947一at0.0055431372615一at0.0135821387625—at0.00166113卯119一at0.0374511376105—at0.0028821374070at0.0453851392965aat0.0215551397830at0.0354791383708at0.0051410.40.40.40.40.40.42.40.40"Myoc,TIGRDptAoc3肌纤蛋白皮连蛋白含铜的胺氧化酶3胰岛素样生长因子结合蛋白6分泌性巻曲相关蛋白2类似于XIV型胶原(LOC314981),mRNA谷胱甘肽过氧化Sfrp2转录的序列，其与蛋白质参考号:NP—071420.1(人)分泌性模块式钙结合蛋白1[人具有弱相似性胰岛素样生长因子结合蛋白5Igftp5转录的序列，其与蛋白质参考号:NPJ)04782.1(人)类p整联蛋白1具有强相似性<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>表5在T8数据集上实施的GSEA。在gG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q〈0.05)途径名称NF画kB级联B细胞及抗体介导的免疫粒细胞介导的免疫胞内蛋白质运输toll样受体信号途径自然杀伤细胞介导的免疫细胞凋亡蛋白水解外胚层发育细胞运动性细胞因子/趋化因子介导的免疫凋亡信号途径DNA代谢Jak-stat信号途径蛋白质修饰凋亡蛋白质糖基化胞吞作用T-细胞介导的免疫细胞周期碎申经元活性神经发生造血toll受体信号途径来源探针丝q值富集方向335.42E-0611C7Celera351.97E-0511C7214.45E-0511C7Cckra6234.45E-0511C7KEGG294.45E-0511C7135.94E-0511C7Cclcra2478.75E-0511C74000.0003211C7Celera1530.00032IgGCdera990.0003711C7310,00041911C7Celera公用510.00041911C71280.00041911C7公用80.00045511C7Cdcra5880.00049111C7KEGG390.00050111C7Cclcra880.00050311C7Celcra1640.00089411C7Celera580.0009311C7Celera3920.00111C7Celera2270.001IgGCdcra1430.0011IgGCelera530.0011911C7Cdcra公用150.0017411C7表5在T8数据集上实施的GSEA。在gG治疗或11C7治疗一周后具有富集基<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>表5在T8数据集上实施的GSEA。在gG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)探针途径名称来源公用q值富集方向信号传导:褐家鼠:生理:凋亡:tnf信号途径Pathart80.015711C7信号传导:褐家鼠疾病类风湿性关节炎:白细胞介素信号途径Pathart30.016411C7环核苷酸代谢Cclcra230.0164IgG非脊推动物过程Cclcra120.0164IgGPDGF信号途径Celcra公用190.016511C7齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩(drpla)KEGG120.017711C7淀粉及蔗糖代谢KEGG250.017911C7slit-robo介导的轴突导向公用30.018311C7生长因子稳态80.0187IgG其它的核苷、核苷酸及核酸代谢Cekra180.020411C7信号传导:褐家鼠疾病动脉粥样硬化:nfkb信号途径Pathart30.021611C7信号传导:褐家鼠疾病动脉粥样石更化:ldl信号途径Pathart170.021611C7糖酵解/糖异生KEGG290.022311C7神经-神经突触传递240.0223IgG糖鞘脂代谢KEGG90.022311C7信号传导褐家鼠生理其它的:fcerl信号途径Pathart130.023611C7胞内信号级联4380.025211C7在T8数据集上实施的GSEA。在gG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称来源探针丝q值富集方向信号传导:褐家鼠疾病动脉粥样硬化:凝血调节蛋白信号途径Pathart0.0262IgG由趋化因子及细胞因子信号途径介导的炎症公用480.028111C7信号传导:褐家鼠:生理:凋亡:TGFP诱导的凋亡Pathart230.029111C7前/后4莫式形成50.0293IgG其它的多糖代谢Cclcra560.030211C7突触传递810.0308IgGn-聚糖生物合成KEGG80.031711C7信号传导:褐家鼠疾病多发性硬化:应答基因Pathart30.03211C7p53途径公用120.03211C7信号传导:褐家鼠:生理:凋亡"rail介导的凋亡Pathart50.03411C7DNA重组Gdcra130.037811C7受调节的胞吐作用500.037811C7血液循环及气体交换160.0378IgG组氨酸代谢KEGG100.0395IgG补体介导的免疫160.040111C7一般的小泡运输C!clera1800.040311C7单糖代谢Celera310.042811C7，六氯代环己烷降解KEGG50.043611C7胆固醇生物合成Celera公用110.04711C7类固醇生物合成KEGG140.047111C7在T8数据集上实施的GSEA。在gG治疗或11C7治疗一周后具有富集基途径名称因的途径(q0.05)来源探针q值富集方向Pathart4Pathart2260.0490.04930.049711C711C711C7信号传导:褐家鼠:疾病阿尔茨海默氏病:igfl信号途径信号传导褐家鼠疾病粥样硬化:ilip信号途径B细胞活化Ctle^公用在治疗二周后，倍数变化显著比治疗l周后小。仅一种转录物>1.5倍差异显著受到调节(p53应答基因3在11C7治疗后上调1.6倍)。GSEA鉴定了其中观察到差异性表达转录物的显著富集的45条途径。氧化磷酸化、电子/离子/P曰离子运输、mRNA加工和突触传递是其中最显著受影响的途径沐6)。表6在用小鼠单克隆抗NogoA抗体11C7治疗二周后在脊髓中损伤水平fT8)处的前20位基因表达变化探针组名称P-值函OVA)1383897at0.022836在抗NogoA治疗中的倍数变化L6基因名称常用1384687at0.0285760.7类似于调亡诱导因子(AIF)同源的线粒体相关的死亡诱导物；p53-应答基因3(LOC361843)，mRNA类似于外胚层-神经皮质-1蛋白质(ENC-l)(LOC294674)，ENC-1mRNA表6在用小鼠单克隆抗NogoA抗体11C7治疗二周后在脊髓中损伤水平(T8)处的前20位基因表达变化1398648at0.0023461385349at0.0003201369476at0.0401451384863at0.0310621380611at0.0485421368726aat0.0096471389666at0.0480661384950at0.0040451387606at0.0234801368911at0.0480081384437at0.0282500.70.70.71.41.40.70.70.70.70.70.7类似于恶性纤维组织细胞瘤扩增的序列1;具有富亮氨酸串联重复序列1的MFH扩增序列(LOC306508)，mRNA类似于中心粒蛋白4(LOC361934)，mRNA肝配蛋白Bl类似于copine家族成员(LOC361433),mRNA类似于FKBP51(LOC361810)，mRNA促性腺激素诱导性卵巢转录因子2类似于视杆细胞外节膜蛋白1(LOC309201)，mRNA类似于磷脂酰肌醇4-激酶2型p;II型磷脂酰肌醇4-激酶|5(LOC305419)，mRNA成纤维细胞生长因子2钾内向整流通道超家族J成员8类似于染色质al同种型a的SWI/SNF相关的基质结合性肌动蛋白依赖的调节子；蔗糖非发酵2样蛋白1;SNF2样l;总体转录激活子同源序列(LOC317575)，mRNAEfnblGiot2FGF2Kcnj8表6在用小鼠单克隆抗NogoA抗体11C7治疗二周后在脊髓中损伤水平(T8)处的前20位基因表达变化1376828一at1395848at1375549—at1396214—at1382354at1396280at0.0458580.70.0228950.0356890.0186710.0210590.036851.31374589at0.0319090.81.30.80.80.8类似于视黄酸诱导蛋白3(LOC312790)，mRNA类似于唐氏综合征候选区1样蛋白2(LOC362627)，mRNA类似于Vezatin(LOC299738)，mRNA遍在蛋白特异性蛋白酶2kit酉己体类似于Ab2-008(LOC290270),mRNA类似于T54蛋白质(LOC302560),mRNA表7在T8数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称途径来源探针组q值富集方向氧化磷酸化KEGG648.76E-0911C7Sebastian454.52E-07IgG电子运输Cclera891.03E-0511C7离子运输Celera2622.84E-0511C7核苷、核苷酸及核酸代谢13253.54E-05IgG凝血Cckra公105.67E-05IgG用在T8数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称途径来源探针组q值富集方向阳离子运输Cdcra2035.79E-0511C7氧化磷酸化Celera555.79E-0511C7前mRNA力口工1699.62E-05IgG突触传递Cdera819.62E-0511C7未指定于途径的表达的探针4曰7048NANA核糖体KEGG510.00027511C7胆固醇生物合成Celer3公胡110.0003511C7凝固:抗凝固乂干JSebastian180.00035IgG对脂类、脂肪酸及类固醇代Cclcra170.00038611C7谢的调节坤申经元活小生Celera2270.00053611C7补体及凝固级联KEGG240.000687IgG凝固:促凝固Sebastian270.000687IgG神经一神经突触传递Celera240.00068711C7mRNA剪接1100.000885IgGmRNA转录调节5210.00106IgG凝血Celera300.00194IgGATP合成KEGG200.0019811C7细胞黏着2300.00221IgG细胞通信3880.00409IgG凝固:抗凝固抗凝固Sebastian80.0042IgG免疫及防御Celera4460.00858IgGDNA重组130.00958IgGmhci-介导的免疫150.010911C7蛋白质代谢及修饰Celera14200.014IgG前列腺素及白三烯代谢KEGG110.015IgG表7<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>#^77-7f接近:f橫務卑在入比较IgG治疗组与11C7治疗组的Welcht-检验产生在分别治疗一周和二周后566种和579种差异性表达的基因。前100个最大倍数变化的平均倍数变化在治疗一周后是1.43±0.17并且在治疗二周后是1.56±0.98。治疗一周后的前20位基因表达变化列于表8中并且在治疗二周后的前20位基因表达变化列于表9。在11C7治疗一周后的最大变化再现了损伤部位中观察到的主题前20位变化中的8个变化与ECM(腔蛋白聚糖、胶原lal-2及5al、纤蛋白2、四连蛋白、基质糖蛋白SC1/ECM2)有关并且在以11C7治疗后下调。在治疗二周后，倍数变化比治疗1周后略高。最大变化中的一些变化与编码在:林巴细胞中所表达蛋白质的转录物下调有关。基因簇富集分析(GSEA)鉴定了治疗一周后35条途径中的显著富集(表10),以及治疗二周后3条途径中的显著富集(表11;q<0.05;32p<0.05)。受影响最显著的途径在一周后是ECM介导的信号传导、脂类代谢和生长因子稳态，并且在治疗二周后是离子运输、生长因子稳态和mRNA转录终止。表8在用小鼠单克隆抗NogoA抗体11C7治疗一周后在脊髓中Tl-7(接近于损探针组IDE;伤部位)处的前20位基因表达变化值(Welch检验)mRNAL85成对Ig样受体-B(Pirb)mRNA，完整编码区类似于类血小板衍生生长因子受体(LOC290771)，mRNA0.0488030.56腔蛋白聚糖0.041710.56降钓素/降钓素相关多肽a0.0428240.57编码免疫球蛋白a重链(部分)的部分mRNA,完整恒定区0.0280171.74血浆铜蓝蛋白0.0242120.58I型胶原，al0.0155140.58类似于胞外基质蛋白2前体(基1396733at0.0129991370493aat4.38E-041374616at0.0292710.551367749一at1370775—a一at1374334_at1368420—at1370864at1393210atCpCollal在基因名称基因符号l419oco仏mt于似7c11治疗后的倍数变化781表8在用小鼠单克隆抗NogoA抗体11C7治疗一周后在脊髓中Tl-7(接近于损探针组ID&伤部位)处的前20位基因表达变化值(Welcht-检验)1387854—at1377452at0.0235090.0471281370150_a—at0.0217571388116—at0.0477491371400_at0.0153381395333_at0.0350541368418一a一at0.0268481369955—at0.0085151389533一at0.0483181397180at0.0224560.590.601.620.631.590.661.490.680.690.701385430at0.022451.42质糖蛋白C1/ECM2)(LOC291018)，mRNAI型前胶原，a2Colla2类似于四连蛋白—(LOC316099)，mRNA甲状腺素应答蛋白ThrspI型胶原，alCollal甲状腺素应答蛋白Thrsp类似于髓磷脂P2蛋白-小鼠(LOC361918),mRNA血浆铜蓝蛋白CpV型胶原，alCol5al纤蛋白2Fbln2类似于map激酶磷酸酶样蛋白—MK-STYX(LOC360792),mRNA类似于高尔基体巻曲螺旋蛋白…GCC185(LOC309798),mRNA在基因名称基因符号一7c11治疗后的倍数化变70探针组ID伤部位)处的前20位基因表达变化p-值在基因名称11C7(Welcht誦检验)1370394at1369304_at1368073_at1368472at1.26E-040.0275470.021049基因符号治疗后的倍数变化1388272at0.0086040.131371262at0.0195970.160.010890.171387卯2aat0.006790.201388149at0.0335281.861398265at0.0367311.521.511.501.50类似于Ig，2B链C区(LOC299352),mRNA用于免疫球蛋白重链可变区(IGHV基因)的部分mRNA，克隆MZ180117大鼠抗乙酰胆碱受体的抗体基—因，重排的Ig，2a链，VDJC区，完整编码区大鼠抗乙酰胆碱受体的抗体基—-因，K-链，VJC区，完整编码区转运蛋白1的ATP结合盒亚家Tapl族B(MDR/TAP)ATP结合盒亚家族Abcc9C(CFTR/MRP)成员96-丙酮酰四氢蝶呤合酶pts干扰素调节因子lIrfl钙黏着蛋白EGFLAG七次跨膜Celsr3G-类型受体3于一傳1±脊二厶口、，/7c11体l抗Ao收抗鼠、一表9在用小鼠单克隆抗NogoA抗体11C7治疗二周后在脊髓中Tl-7(接近于损探针组ID伤部位)处的前20位基因表达变化p画值在基因名称Welch11C7t-检验)治疗后的倍数变化1369885at0.0145861.46浮见前调节因子-1基因符号Porfl1387242at0.0126091.45干扰素诱导的双链RNA依赖性Prkr1390340aat0.0276970.691368000_13847341395248atatat0.0128050.005840.0337830.690.700.70C3Ncam21378219—at0.0279760.711375765一at0.022590.711382691—at0.0068340.721384946at0.0133691.39类似于真核翻译起始因子4GI(LOC287986)，mRNA补体組分3神经细胞黏着分子2类似于ER降解增强性类a甘露糖苷酶；A130059K23Rik(LOC297504)，mRNA具有三十四肽重复序列2的谷氨Sgt2酰胺丰富的小蛋白神经视锥蛋白样Ca^结合蛋白2Nvjp2型剪接因子3b亚基l，155kDSf3bl类似于toll样受体—1(LOC305354)，mRNA表9在用小鼠单克隆抗NogoA抗体11C7治疗二周后在脊髓中Tl-7(接近于损伤部位)处的前20位基因表达变化探针组IDp-值在基因名称基因(Welch11C7符号t-检验)治疗后的倍数变化1391566—at0.0417490.73类似于Sentrin特异性蛋白酶画—8(Sentrin/SUMO特异性蛋白酶SENP8)(LOC315723),mRNA表10在Tl-7数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径0><0.05)途径名称途径来源探针q值富集方丝未指定于途径的表达的探针组6854NANA胞外基质蛋白介导的信号传导Celera371.11E-07IgG脂类、脂肪酸及类固醇代谢Celera3447.12E-0711C7生长因子稳态70.000505IgG糖酵解Celera320.00068711C7糖酵解/糖异生KEGG280.00091311C7蛋白质代谢及修饰Celera13800.0026711C7碳固定KEGG130.0026711C7糖类代谢Celera2210.0031111C7阿尔茨海默氏病KEGG300.0039711C7胞内蛋白质运输Celera6160.0039711C7胞吞作用氨基酸代谢免疫及防御运输细胞通信应激反应氨基酸运输Jak-stat级联嘌呤代谢小分子运输细胞l^着介导的信号传导细胞结构胞吐作用丙氨酸及天冬氨酸代谢多方面的PDGF信号途径阿尔茨海默氏病-早老蛋白途径信号传导:褐家鼠:疾病:类风湿性关节炎:gh信号途径磷酸戊糖途径途径信号传导:褐家鼠:疾病阿尔茨海默氏病:淀粉状蛋白p肽信号途径受调节的胞吐作用凝血亨廷顿舞蹈病噤呤代谢氨基酸生物合成1620.0042311C71210.0042311C73880.0047611C7Cclcra4690.0056511C7Cclera3600.00565IgG660.0061511C7Cclcra320.0074811C7Celcra370.0074811C7560.0077611C7600細1611C71230.013IgG2610.015511C71330.015511C7KEGG110.016111C7Cclcra240.017611C7C!ekra公160.019411C7用Clekra公320.027911C7用Pathart40.0285IgGKEGG130.029311C7Pathart200.033211C7500.03811C7Cclcra250.038IgGKEGG230.044311C7KEGG380.044311C7Celera330.048511C7表ll在Tl-7数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗二周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称途径来源探针组p值q值富集方向离子运输Celera2580.0002520.0406IgG生长因子稳态Celera70.0002780.040611C7mRNA转录终止Celera了0.0003080.040611C7#鑀/^-5(^远庠務務命在)。比较IgG治疗组与11C7治疗组的Welcht-检验产生在分别治疗一周和二周后1303种和1301种差异性表达的基因。前100个最大倍数变化的平均倍数变化在治疗一周后是1.72±0.5并且在治疗二周后是1.91±2.0。治疗一周后的前20位基因表达变化列于表12中并且在治疗二周后的前20位基因表达变化列于表13。在11C7治疗一周后的最大变化再现了损伤部位中观察到的主题前20位变化中的8个变化与ECM(腔蛋白聚糖、胶原lal-2及5al、纤蛋白2、四连蛋白、基质糖蛋白SC1/ECM2)有关并且在以11C7治疗后下调。在治疗二周后，倍数变化比治疗1周后略高。最大变化中的一些变化与编码在淋巴细胞中所表达蛋白质的转录物下调有关基因簇富集分析(GSEA)鉴定了治疗一周后151条途径中的显著富集(表14)，以及治疗二周后116条途径中的显著富集(表15)。极其有趣的是，免疫及防御相关性途径在治疗二周后在IgG治疗的方向上高度显著地富集(在11C7治疗后下调)，而突触传递、神经元活性及神经递质释》文的相关途径中的转录物在11C7治疗后显著富集(上调)。表12用单克隆小鼠抗NogoA抗体11C7治疗一周后在脊髓Ll-5(损伤部位远端)处前20种基因表达的变化，滥s,，二t國test)变化—类似于IGGAMMA-2C1384218_at0.0488064.6CHAINCREGION—(LOC362795),mRNA1367998_at0.0362223.8分泌性白细胞蛋白酶抑制剂Slpi1369801at0.0369953.5选择蛋白，淋巴细胞Sell1368441_at0.031552.9mesothelinMsln1374070_—at0.0332382.9谷胱甘肽过氧化物酶2Gpx21387868_—at0.023132.7脂多糖结合蛋白Lbp1384580一一at0.0253952.3补体成分6C61368448_at0.0461042.3潜在的转化生长因子e结合蛋白2Ltbp21387011_at0.0303642.3脂笼蛋白2Lcn21385397_—at0.021582.2Abl-219mRNA，完整cds—1398589—at0.0443632.1类似于细胞表面受体FDF03(LOC288568),mRNA—1368卯0_at0.0085632.1血栓调节蛋白Thbd1374779__at0.0086262.0凝固因子XIIIaF13a1387655——at0.011321.9趋化因子(C-X-C基序)配体12Cxcl121393891——at0.021卯11.9类似于胶原otl(VIII)链前体(LOC304021),mRNA—1369301—陽at0.0327841.9类血管紧张素受体lAgtrll1367712—_at0.0433481.8金属蛋白酶组织抑制剂1Timpl1368394，t0.040731.8分泌的巻曲相关蛋白4Sfrp41372889一at0.0201391.8基质蛋白F/G1Matrl1374626—，t0.0101981.8类似于富亮氨酸a-2-糖蛋白(LOC367455),mRNA—表13用单克隆小鼠抗NogoA抗体11C7治疗两周后在脊髓Ll-5(损伤部位远端)处前20种基因表达的变化探针组名称p誦值11C7基因名称常用名(Welch后的T画检验)倍数<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>1368565at1384878_at1370972xat0.021720.60.0368610.0162361.61.5类似于BAG-家族分子侣伴…蛋白调节子-3(结合BCL-2的athanogene-3)(BAG画3)(Bcl-2-结合蛋白Bis)(LOC293524)，mRNA突触孔蛋白Synpr不均一细胞核核糖核蛋白HnrpmM表14在Ll-5数据集上实施的GSEA。在gG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q〈0.05)途径名称途径来源探针丝q值富集方鱼未指定于途径的表达的探针组6794NANA免疫及防雄卩3933.44E-4011C7信号转导13365.02E-1511C7细胞通信Celera3505.14E-1511C7核糖体KEGG513.23E-1211C7蛋白质代谢及修饰Cckra13584.63E-1211C7Jak-stat级联385.02E--0911C7巨噬细胞介导的免疫525.02E--0911C7整联蛋白信号途径Celera公田485.02E--0911C7中胚层发育用1615.02E.-0911C7突触传递842.13E-08IgG细胞结构及运动性Celera4172.13E.■0811C7胞外基质蛋白介导的信号转导Celera362.75E-■0811C7细胞表面受体介导的信号转导5151.24E■0711C7B细胞及抗体介导的免疫Celera301.35E-■0711C7表14在Ll-5数据集上实施的GSEA。在gG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q〈0.05)途径名称途径来源探针丝d值化:血管紧张素信号途径蛋白质生物合成骨骼发育凋亡信号途径凋亡神经-神经突触传递补体介导的免疫干扰素介导的免疫发育过程肿瘤发生其它的多糖代谢细胞黏着介导的信号传导T-细胞介导的免疫神经元活性核苷、核苷酸及核酸代谢细胞结构toll受体信号途径CeleraCdcra公用CeleraCeleraCelcraCelcraCeleraCclcraGeleraCelera公用207294622826152950728052120492301255258142.60E-063.58E-063.59E-063.59E-065.35E-065.53E-066.32E-061.46E-051.61E-052.76E-053.07E-054.35E-054.35E-054.43E-056.22E-056.44E-05富集方鱼补体及凝固级联KEGG173.46E-0711C7细胞因子及趋化因子介导的信号途錄Celera587.40E-0711C71工Sebastian377.99E-0711C7粒细胞介导的免疫188.20E-0711C7凝血248.89E-0711C7蛋白水解3768.89E-0711C7信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬Pathart271.24E-0611C711C711C711C711C7IgG11C711C711C711C711C711C711C7IgG11C711C711C7表14在Ll-5数据集上实施的GSEA。在gG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称配体介导的信号传导信号传导:褐家鼠:生理:生长及分化:NGF信号途径信号传导:褐家鼠:生理:生长及分化:TGFp信号途径凝固:促凝固血管发生mapk信号途径TGF-p信号途径:生理骨骼发B细胞活化信号传导褐家;育:FGF信号途径蛋白质修饰pi3激酶途径信号传导:褐家鼠疾病肥胖症:应答基因信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬化:ldl信号途径由趋化因子及细胞因子信号途径介导的炎症toll样受体信号途径造血途径来源PathartPathartSebastianCelera公用KEGGCclcrsi公用Cdcrii公用PathartCcleraCelcraCelera公用PathartPathartCelera公用KEGGCelera探针1313355821725q值9.47E-050.0001350.0003080.0004010.000433富集方11C711C7150.00014811C7240.00016311C7570.00016311C7900.00024611C7290.00024911C7260.00025711C7200.00028711C711C711C711C7160.00043911C7150.0004411C7460.00045311C7270.00055211C7480.0005611C7表14<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>表14在Ll-5数据集上实施的GSEA。在sG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称NF-kB级联脂类、脂肪酸及类固醇代谢阿尔茨海默氏病-早老蛋白途径凝血蛋白质糖基化离子运输凋亡诱导胞吞作用一般的小泡运输信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬化:胰岛素信号途径p53途径凋亡fas信号途径胞内蛋白质运输信号传导:褐家鼠生理生长及分化:PDGF信号途径胞内信号级联信号传导:褐家鼠疾病肥胖症:瘦蛋白信号途径其它的免疫及防御slit-robo介导的轴突导向途径来源CclcraCclcra公用Celera公用CeleraCclcraCclcraPathartCelera公用KEGGCclcr3公用PathartCeleraPathartCeleryCelera公用探针2934131q值0.003890.003890.00433富集方鱼11C711C711C70.0043311C7830.0044311C72570.00464IgG970.0051311C71610.0054111C71780.0054811C770.0058611C7110.0059211C7310.006411C7150馬611C76110.0071811C780.0071811C74200.0088211C7240.0088211C7290.0088611C730.0090911C7表14在Ll-5数据集上实施的GSEA。在gG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称信号传导:褐家鼠疾病:II型糖尿病:ffa信号途径信号传导:褐家鼠生理生长及分化:FGF2信号途径神经递质释放应激反应信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬化:ill信号途径信号传导:褐家鼠:生理凋亡:NGF信号途径信号传导:褐家鼠生理凋亡:FGF信号途径氧化应激反应蛋白质二硫键异构酶反应帕金森病信号传导:褐家鼠:疾病:阿尔茨海默氏病:igfl信号途径糖酵解/糖异生T-细胞活化其它的运输癌基因前列腺素及白三烯代谢PDGF信号途径途径来源PathartPathartCelera公用Celera公用PathartKEGGCelera公用CclcraKEGGCelera公用探针q值13648427290.01360.0143富集方Pathart130.0093211C7Pathart110.0093211C7Celera190.00962IgGCelera650.0098511C7Pathart100.010211C7170.011211C780.011211C70.013611C711C711C70.015211C70.016511C70.016511C7260.016911C7540.016911C770.016911C7150.017311C7表14在Ll-5数据集上实施的GSEA。在gG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称mRNA剪接信号传导:褐家鼠:疾病:肥胖症:cntf信号途径细胞因子/趋化因子介导的免疫糖类代谢卟啉及叶绿素代谢肌病毒病n-聚糖生物合成信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬化:亚油酸信号途径信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬化:aif介导的途径凝固:促凝固杰克森实验室出血小其它的凋亡亨廷顿舞蹈病信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬化:PDGF信号途径烟碱型乙酰胆碱受体信号途径维生素/辅因子运输wnt信号途径信号传导:褐家鼠:疾病:阿尔茨海默氏病:过氧化氢信号途径其它的肿瘤发生细胞周期途径来源PathartSebastianCderaCclcra公用PathartCelera公用KEGGPathartCeleraCelera公探针丝q值富集方Celera1070.017711C7Pathart60.017911C7Celera230.020311C7Celera2150.020311C7KEGG70.020311C7KEGG60.021911C7KEGG80.023111C7Pathart30.023411C750.023611C70.02711C790.02711C7440.027711C780.027811C7230.029611C790.029611C7580.030311C780.031911C7440.03211C750.03211C7表14在Ll-5数据集上实施的GSEA。在gG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>表14在Ll-5数据集上实施的GSEA。在sG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称途径经hif激活的低氧应答精氨酸及脯氨酸代谢糖酵解信号传导:褐家鼠:疾病阿尔茨海默氏病:NGF信号途径信号传导:褐家鼠:疾病阿尔茨海默氏病:icaml信号途径途径来源Cclcr3公用KEGGCclcraPathartPathart探针丝13q值富集方鱼0.046511C7200.046511C7320.046511C780.047311C750.047311C7在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗二周后具有富集基因的途径fq0.05)途径名称途径来源探针q值富集方組鱼免疫及防雄卩Celera3930IgG未指定于途径的表达的探针组6794NANA细胞通信Celera3505.49E-11IgG突触传递Celera841.15E-1011C7蛋白质代谢及修饰Celera13581.92E-10IgG胞外基质蛋白介导的信号传导Celera361.08E-09IgG神经元活性2301.89E-0911C7信号转导Celera13362.28E-08IgGB细胞及抗体介导的免疫Cdcra305.37E-08IgG表15在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗二周后具有富集基因的途径fq0.05)途径名称途径来源探针q值富集方丝鱼巨噬细胞介导的免疫Celera525.72E-08IgGT-细胞介导的免疫491.66E-07IgG凝血246.46E-07IgG整联蛋白信号途径Celera公阳488.72E-07IgG补体及凝固级联乂tjKEGG178.79E-07IgG癌基因542.21E-06IgG阳离子运输1974.01E-0611C7肺瘤发生Cclcra2806.38E-06IgG离子运输2576.92E-0611C7蛋白水解Cdcra3761.24E-05IgGSebastian372.01E-05IgG细胞因子及趋化因子介导的信号途Celera582.40E-05IgG径神经递质释方文192.40E-0511C7蛋白质修饰5588.85E-05IgG凋亡2288.85E-05IgG细胞黏着介导的信号传导Cclcra1209.26E-05IgG神经活性配体-受体相互作用KEGG52O扁lll11C7mhcii-介导的免疫Cclcra100.000115IgG其它的多糖代谢520.000144IgG核苷、核苷酸及核酸代谢12550.000191IgG神经-神经突触传递Cdera260.00024511C7表15在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗二周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称补体介导的免疫离子型谷氨酸受体途径T-细胞活化配体介导的信号传导骨駱发育中胚层发育凋亡信号途径由趋化因子及细胞因子信号途径介导的炎症生长因子稳态蛋白质糖基化p53途径凋亡的抑制toll受体信号途径Jak陽stat级联NF-kB级联B-细力包活4匕途径来源探针q值CeleraGelera公用Celera公用C!dcra公用Celera公用GdcraCcleraCelera公用Celer8公用CeleraCclcr3公用丝152413129161460.0002450.0002450.0002450.0002820.0002960.000296富集方IgG11C7290.000245IgGIgGIgGIgGIgG460.000304IgG70.000316IgG830細341IgG110.000393IgG540.000439IgG140.000465IgG380.000533IgG290.000538IgG260.000611IgG<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>表15在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗二周后具有富途径名称集基因的途径(qO,05)途径来源的:fcerl信号途径n-聚糖生物合成信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬化:tnf信号途径其它的凋亡代谢型谷氨酸受体组iii途径经hif激活的低氧应答mRNA转录调节信号传导:褐家鼠生理生长及分化:NGF信号途径TGF-p信号途径帕金森病血管发生信号传导:褐家鼠:疾病:II型糖尿病:illb信号途径电子运输胰岛素-igf途径-促分裂原激活的蛋白激酶激酶-map激酶级联KEGGPathartCeler3公用Celera公用PathartOlera公用KEGGGdcra公用PathartCdcm公用探针d值富集方丝鱼80.00736IgG100.00752IgG90.00783IgG190.0078311C7130.00806IgG4800層21IgG330.00998IgG290.0112IgG160.011211C7570.0114IgG90.0117IgG890.013111C7140.0133IgG表15在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗二周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬化:Idl信号途径自然杀伤细胞介导的免疫slit-robo介导的轴突导向单糖代谢淀粉及蔗糖代谢应激反应脂类、脂肪酸及类固醇代谢凝血肌醇磷酸代谢胞外运输及输入mRNA剪接信号传导:褐家鼠疾病肥胖症:应答基因pi3激酶途径信号传导:褐家鼠:疾病:阿尔茨海默氏病:淀粉状蛋白p肽信号途径受体蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶信号途径MAPKKK级联途径来源探针q值富集方丝鱼Pathart150.0136IgGCelera110.0138IgGCelera公30.0139IgG用Gelera270.0141IgGKEGG200.0141IgGCelera650.0141IgG3410.0142IgGCelera公70.0144IgG用KEGG220.0144IgGCckra350.014411C7Celera1070.0152IgGPathart160.0152IgGCelera公250.016IgG用Pathart190.0165IgGCelera280.0165IgGCelera1110.0178IgG表15<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>表15在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗二周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称途径来源探针q值Pathart信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬化:亚油酸信号途径凝固:促凝固可能的正调节物血小Sebastian板聚集凝固:促凝固:合成及运输信号传导:褐家鼠:生理:炎症:ill信号途径磷脂代谢信号传导:褐家鼠:生理:生长及分化:akt介导的途径SebastianPathartCeleraPathart丝3325240.03560.03970.04030.04030.0456富集方鱼IgG30.0387IgGIgGIgGIgGIgG运动-#4发^。比较IgG治疗组与11C7治疗组的Welcht-检验产生在分别治疗一周和二周后1303种和1301种差异性表达的基因。前100个最大倍数变化的平均倍数变化在治疗一周后是1.72±0.5并且在治疗二周后是1.91±2.0。治疗一周后的前20位基因表达变化列于表12中并且在治疗二周后的前20位基因表达变化列于表13。在11C7治疗一周后的最大变化再现了损伤部位中观察到的主题前20位变化中的8个变化与ECM(腔蛋白聚糖、胶原lal-2及5al、纤蛋白2、四连蛋白、基质糖蛋白SC1/ECM2)有关并且在以11C7治疗后下调。在治疗二周后，倍数变化比治疗1周后略高。最大变化中的一些变化与编码在淋巴细胞中所表达蛋白质的转录物下调有关。基因簇富集分析(GSEA)鉴定了治疗一周后151条途径中的显著富集(表14),以及治疗二周后116条途径中的显著富集(表15)。受影响最显著的途径在一周后是ECM介导信号传导、脂代谢和生长因子稳态，并且在治疗二周后是离子运输、生长因子稳态和mRNA转录终止。实施例3由基因蔟富集分析(GSEA)所鉴定的具有显著基因富集的途径列表表16在T8数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称来源探针组q值富集方i未指定于途径的表达的探针组7048NANA免疫及防御4461.94E-2111C7细胞因子及趋化因子介导的信号Celera692.47E-1211C7途径Jak-stat级联Celera428.52E-1011C7蛋白质代谢及修饰14201.56E-0911C7干扰素介导的免疫Cclcra321.17E-0811C7巨噬细胞介导的免疫581.77E-0811C7凋亡的抑制611.48E-0711C7核苷、核苷酸及核酸代谢13254.38E-0711C7NF画kB级联Celera335.42E-0611C7B细胞及抗体介导的免疫Celera351.97E-0511C7粒细胞介导的免疫Cclcra214.45E-0511C7胞内蛋白质运输Cclcra6234.45E-0511C7toll样受体信号途径KEGG294.45E-0511C7自然杀伤细胞介导的免疫Cdcra135.94E-0511C7凋亡Celera2478.75E-0511C7蛋白水解4000.0003211C7外胚层发育1530.00032IgG细月包运动小生990.0003711C7细胞因子/趋化因子介导的免疫Cclcra310.00041911C7凋亡信号途径Celera510.00041911C7表16在T8数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗一周后具有富集基<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>表16在T8数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)来源探针组途径名称q值富集方向细胞结构Cdcra2670.0097IgG信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样Pathart40.013211C7硬化:y干扰素信号途径糖酵解340.013711C7信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样Pathart280.013711C7硬化:血管紧张素信号途径信号传导:褐家鼠:生理:生长及分Pathart120.013711C7化:FGF2信号途径信号传导:褐家鼠生理细胞黏Pathart190.0137IgG着:整联蛋白信号途径细胞周期调控Celera1850.014611C7蛋白质二硫键异构酶反应Cclcra0.015511C7pi3激酶途径Celera240.015711C7公用信号传导:褐家鼠:生理:凋亡:tnfPathart80.015711C7信号途径信号传导:褐家鼠:疾病:类风湿性Pathart30.016411C7关节炎:白细胞介素信号途径环核苷酸代谢Cclcra230.0164IgG非脊推动物过程120.0164IgGPDGF信号途径190.016511C7公用齿状核红核苍白球丘脑下部核萎KEGG120.017711C7缩(drpla)淀粉及蔗糖代谢KEGG250.017911C7slit-robo介导的轴突导向Cclcra30.018311C7公用生长因子稳态Cclcr380.0187IgG96表16在T8数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称来源探针组q值富集方-其它的核苷、核苷酸及核酸代谢Cclera180.020411C7信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样Pathart30.021611C7硬化:nfkb信号途径信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样Pathart170.021611C7硬化:ldl信号途径糖酵解/糖异生KEGG290.022311C7神经-神经突触传递Cclcra240.0223IgG糖鞘脂代谢KEGG90.022311C7信号传导褐家鼠生理其它Pathart130.023611C7的:fcerl信号途径胞内信号级联4380.025211C7信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样Pathart50.0262IgG硬化:凝血调节蛋白信号途径由趋化因子及细胞因子信号途径480.028111C7介导的炎症公用信号传导褐家鼠生理凋Pathart230.029111C7亡:TGFp+秀导的凋亡前/后才莫式形成50.0293IgG其它的多糖类代谢Cclera560.030211C7突触传递810.0308IgGn-聚糖生物合成KEGG80.031711C7信号传导:褐家鼠:疾病:多发性硬Pathart30.03211C7化:应答基因p53途径公用120.03211C7信号传导褐家鼠生理凋Pathart50.03411C7亡:trail介导的凋亡DNA重组Celera130.037811C7表16<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>表17<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>表17在T8数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗二周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称途径来源探针组q值富集方向用阳离子运输Celera2035.79E-0511C7氧化磷酸化555.79E-0511C7前mRNA加工Cclcra1699.62E-05IgG突触传递Celera819.62E-0511C7未指定于途径的表达的探针4曰7048NANA核糖体KEGG510.00027511C7胆固醇生物合成Celera公110.0003511C7凝固:抗凝固乂"Sebastian180.00035IgG对脂类、脂肪酸及类固醇代谢Celera170.00038611C7的调节坤申经元活性Cckra2270.00053611C7补体及凝固级联KEGG240.000687IgG凝固:促凝固Sebastian270.000687IgG神经-神经突触传递Celera240.00068711C7mRNA剪接Celera1100.000885IgGmRNA转录调节Celera5210.00106IgG凝血300.00194IgGATP合成KEGG200.0019811C7细胞黏着2300.00221IgG细胞通信Cdcra3880.00409IgG凝固:抗凝固抗凝固Sebastian80.0042IgG免疫及防御Cckra4460.00858IgGDNA重组Celera130.00958IgGmhci-介导的免疫Cckra150.010911C7蛋白质代谢及修饰Celera14200.014IgG表17在T8数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗二周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称途径来源探针组q值富集方向前列腺素及白三烯代谢KEGG110.015IgG应、激反应680.0155IgG类固醇生物合成KEGG140.017311C7辅酶及辅基代谢Celera440.0173IgGmRNA转录7040.0213IgGmhcii-介导的免疫100.021811C7维生素/辅因子运输Cdcra100.0218IgG蛋白质糖基化Celera880.024IgGJak-stat级联Celera420.0246IgG信号传导:褐家鼠疾病动脉Pathart110.0275IgG粥样硬化:tnf信号途径嘧咬代谢Cdera320.0284IgG运输4810.033711C7细胞因子及趋化因子介导的Celera690.0342IgG信号途径烟碱型乙酰胆碱受体信号途Cclcr3公230.037311C7径用中胚层发育Celera1710.0373IgG凝固:促凝固:凝固Sebastian40.0377IgG表18在Tl-7数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(qQ.05)途径名称途径来源探针ci值富集方丝鱼未指定于途径的表达的探针组gSea6854NANA胞外基质蛋白介导的信号传导Celera371.11E-07IgG表18在Tl-7数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称途径来源探针q值富集方丝鱼脂类、脂肪酸及类固醇代谢Celera3447.12E-0711C7生长因子稳态70.000505IgG糖酵解Cdera320.00068711C7糖酵解/糖异生KEGG280.00091311C7蛋白质代谢及修饰Cckra13800.0026711C7碳固定KEGG130.0026711C7糖类代谢Cclcra2210.0031111C7阿尔茨海默氏病KEGG300.0039711C7胞内蛋白质运输6160細9711C7胞吞作用1620細2311C7氨基酸代谢Cdcra1210.0042311C7免疫及防御Cckra3880.0047611C7运输Gelera4690.0056511C7细胞通信3600.00565IgG应、激反应Cclcra660.0061511C7氨基酸运输320.0074811C7Jak-stat级联370.0074811C7噤呤代谢560.0077611C7小分子运输Cclera600.0081611C7细胞黏着介导的信号传导1230.013IgG细胞结构Celera2610.015511C7胞吐作用Celcra1330.015511C7丙氨酸及天冬氨酸代谢KEGG110.016111C7多方面的240.017611C7PDGF信号途径Gdcra公田160.019411C7阿尔茨海默氏病-早老蛋白途径用Celera公320.027911C7表18<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>表19<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>表20<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>表20<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>表20在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称凋亡神经-神经突触传递补体介导的免疫干扰素介导的免疫发育过程胂瘤发生其它的多糖类代谢细胞勦着介导的信号传导T-细胞介导的免疫神经元活性核苷、核苷酸及核酸代谢细胞结构toll受体信号途径配体介导的信号传导信号传导:褐家鼠:生理生长及分化:NGF信号途径信号传导:褐家鼠生理生长及分化:TGFp信号途径凝固:促凝固血管发生mapk信号途径TGF-卩信号途径B细胞活化途径来源探针q值富集方丝用2283.59E-0611C7Cclera265.35E-06IgGCclcra155.53E-0611C7Cclera296.32E-0611C75071.46E-0511C7Celera2801.61E-0511C7Celera522.76E-0511C7Celera1203.07E-0511C7Cclcra494.35E-0511C7Cclcra2304.35E-05IgGCclcra12554.43E-0511C72586.22E-0511C7Cclcrs公146.44E-0511C7用1319.47E-0511C7Pathart330.00013511C7Pathart150.00014811C7Sebastian240.00016311C7Celer3公570.00016311C7用KEGG卯0.00024611C7Celera公290.00024911C7用Cdcra公260.00025711C7表20在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗一周后具有富集途径名称基因的途径(q0.05)途径来源信号传导褐家鼠生理骨骼发育:FGF信号途径蛋白质修饰细胞勦着pi3激酶途径信号传导:褐家鼠疾病:肥胖症:应答基因信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬化:ldl信号途径由趋化因子及细胞因子信号途径介导的炎症toll样受体信号途径造血信号传导:褐家鼠:生理:凋亡:TGF卩诱导的凋亡Jak-stat信号途径mRNA转录调节自然杀伤细胞介导的免疫生长因子稳态信号传导:褐家鼠:生理细胞黏着整联蛋白信号途径TGF-P信号途径信号传导:褐家鼠疾病:II型糖尿病:illb信号途径用PathartCeleraCdcraCelera公用PathartPathartC!clcm公用KEGGPathartCelera公用CderaPathartKEGGPathart探针ci值富集方丝鱼200.00028711C755821725274820480117180.0003080.0004010.0004330.0005520.000560.0006860.0007680.000860.001150.0012811C711C711C7160.00043911C7150.0004411C7460.00045311C711C711C711C760.00076811C711C711C711C711C7250.001511C790.001511C7表20在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径fq〈0.05)<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>表20在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称信号途径氧化应激反应蛋白质二硫键异构酶反应帕金森病信号传导:褐家鼠:疾病阿尔茨海默氏病:igil信号途径糖酵解/糖异生T-细力包活4匕其它的运输癌基因前列腺素及白三烯代谢PDGF信号途径mRNA剪接信号传导:褐家鼠:疾病:肥胖症:cntf信号途径细胞因子/趋化因子介导的免疫糖类代谢卟啉及叶绿素代谢肌病毒病n-聚糖生物合成信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬化:亚油酸信号途径信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬途径来源Celera公用Celera公用PathartKEGGOlcra公用KEGGCelera公用Pathart10760.01770.0179丝鱼130.013611C760.013611C7480.014311C740.015211C7270.016511C7290.016511C7260.016911C7540.016911C770.016911C7150.017311C711C711C7230.020311C7Celera2150.020311C7KEGG70.020311C7KEGG60.021911C7KEGG80.023111C7Pathart30.023411C7Pathart50.023611C7表20在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)途<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>表20在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗一周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称信号传导:褐家鼠:生理:炎症:ill信号途径其它蛋白质代谢EGF受体信号途径信号传导:褐家鼠:疾病:II型糖尿病己糖胺介导的途径y-六氯代环己烷降解代谢型谷氨酸受体组ii途径吞噬作用信号传导:褐家鼠:生理:凋亡:wnt信号途径信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬化:Y干扰素信号途径受体蛋白质丝氨^/苏氨酸激酶信号途径经hif激活的低氧应答精氨酸及脯氨酸代谢信号传导:褐家鼠:疾病阿尔茨海默氏病:NGF信号途径信号传导:褐家鼠:疾病阿尔茨海默氏病icaml信号途径途径来源探针q值丝PathartCelera公用PathartKEGGCelera公用CckraPathartPathartCelera公用KEGGPathartPathart富集方鱼20.040411C7270.0404IgG360.040511C7160.042311C740.042911C790.043111C7160.044311C770.045811C720.045811C7280.04611C7130.046511C7200.046511C7320.046511C780.047311C750.047311C7表21在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗二周后具有富集基因的途径(q〈0.05)途径名称途径来源探针q值富集方鱼免疫及防御Celera3930IgG未指定于途径的表达的探针组6794NANA细胞通信3505.49E-11IgG突触传递Celera841.15E-1011C7蛋白质代谢及修饰13581.92E-10IgG胞外基质蛋白介导的信号传导Celera361.08E-09IgG碎申经元活性Cclcra2301.89E-0911C7信号转导13362.28E-08IgGB细胞及抗体介导的免疫Olera305.37E-08IgG巨噬细胞介导的免疫Celera525.72E-08IgGT-细胞介导的免疫Celera491.66E-07IgG凝血Celera246.46E-07IgG整联蛋白信号途径Cckra公488.72E-07IgG补体及凝固级联用KEGG178.79E-07IgG癌基因Celera542.21E-06IgG阳离子运输Cdcra1974.01E-0611C7肺瘤发生2806.38E-06IgG离子运输Olera2576.92E-0611C7蛋白水解Celera3761.24E-05IgGSebastian372.01E-05IgG细胞因子及趋化因子介导的信号途認Celera582.40E-05IgG仁神经递质释方文192.40E-0511C7蛋白质修饰Gelera5588.85E-05IgG凋亡Cckra2288.85E-05IgG细胞黏着介导的信号传导Celera1209.26E-05IgG表21在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗二周后具有富集基因的途径(q0.05)T-细胞活化配体介导的信号传导骨骼发育中胚层发育凋亡信号途径由趋化因子及细胞因子信号途径介导的炎症生长因子稳态蛋白质糖基化p53途径凋亡的抑制toll受体信号途径Jak-stat级联NF-kB级联B细力包活化用Celera公用CeleraCclcraCckraCelera公用Celera公用CeleraCelera公用CeleraCclcr3公用CeleraCeleraCelera公13129161460扁2450.0002820扁2960.00029683110扁3160.0003410.0003933829260.0005330扁5380.000611途径名称途径来源探针q值富集方丝神经活性配体-受体相互作用KEGG520.00011111C7mhcii-介导的免疫Celera100.000115IgG其它的多糖类代谢Celera520細144IgG核苷、核苷酸及核酸代谢Cdcra12550.000191IgG神经-神经突触传递Cclcra260.00024511C7补体介导的免疫Celera150.000245IgG离子型谷氨酸受体途径Celera公240.00024511C7290.000245IgGIgGIgGIgGIgG460.000304IgGIgGIgGIgG540.000439IgG140.000465IgGIgGIgGIgG表21在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗二周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称途径来源探针q值富集力用鱼信号传导:褐家鼠:生理:细胞黏着:整Pathart180.000633IgG联蛋白信号途径细胞l^着Cdcra2170細卯5IgG烟酸及烟酰胺代谢KEGG160.000962IgG胰岛素-igf途径-蛋白激酶b信号传Celera公180.00119IgG导级联用氧化磷酸化KEGG650.0013911C7细胞结构及运动性Cdera4170.00145IgG氧化磷酸化Cdera560.0015111C7前mRNA加工1620.00158IgG凝固:抗凝固Sebastian130.00192IgG细月包运动小生940.00256IgG凝固:促凝固Sebastian240.00375IgG蛋白质二硫键异构酶反应60.00375IgGtoll样受体信号途径KEGG270.00421IgG粒细胞介导的免疫180.00473IgG凋亡KEGG310.00588IgG信号传导:褐家鼠:疾病:类风湿性关Pathart40.00611IgG节炎:gh信号途径信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬Pathart270.00652IgG化:血管紧张素信号途径运输Celera4640.006911C7信号传导褐家鼠生理其它Pathart120.0071IgG的:fcerl信号途径n-聚糖生物合成KEGG80.00736IgG表21在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗二周后具有富集途径名称基因的途径(q0.05)途径来源探针q值信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬化:tnf信号途径其它的凋亡代谢型谷氨酸受体组iii途径经hif激活的低氧应答mRNA转录调节信号传导:褐家鼠生理:生长及分化:NGF信号途径TGF-p信号途径帕金森病血管发生信号传导褐家鼠疾病:II型糖尿病:illb信号途径电子运输胰岛素-igf途径-促分裂原激活的蛋白激酶激酶-map激酶级联信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬化:ldl信号途径自然杀伤细胞介导的免疫slit-robo介导的轴突导向单糖类代谢淀粉及蔗糖代谢PathartCeleraCelera公用Celera公用PathartCelera公用KEGGCelera公用PathartCeleraCelera公用PathartCckraCdcra公用CeleraKEGG100.0075211327200.01380.01390.01410.0141富集方鱼IgG90.00783IgG190.0078311C7130.00806IgG4800.00921IgG330.00998IgG290.0112IgG160.011211C7570.0114IgG90.0117IgG890.013111C7140.0133IgG150.0136IgGIgGIgGIgGIgG表21在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗二周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称应激反应脂类、脂肪酸及类固醇代谢凝血肌醇磷酸代谢胞外运输及输入mRNA剪接信号传导:褐家鼠:疾病:肥胖症:应答基因pi3激酶途径信号传导:褐家鼠:疾病阿尔茨海默氏病:淀粉状蛋白p肽信号途径受体蛋白质丝氨l苏氨酸激酶信号途径MAPKKK级联fas信号途径，代谢核糖体胞内信号级联蛋白质生物合成白细胞介素信号途径凝固:抗凝固抗凝固信号传导:褐家鼠:生理:凋亡:TGF|5诱导的凋亡途径来源探针q值富集方丝鱼Cclcra650.0141IgGCelera3410.0142IgGCdcr3公70.0144IgG用KEGG220.0144IgG350.014411C71070.0152IgGPathart160.0152IgGCelera公250.016IgG用Pathart190.0165IgGCckra280.0165IgGCclcra1110.0178IgGCelera公150.0179IgG用KEGG90.0188IgGKEGG510.02IgGCelera4200.023IgGCelera2070.0232IgGCckrs公230.0249IgG用Sebastian60.0253IgGPathart200.0256IgG表21在Ll-5数据集上实施的GSEA。在IgG治疗或11C7治疗二周后具有富集基因的途径(q0.05)途径名称途径来源探针q值富集方丝鱼其它的免疫及防御Cclcra290.0266IgG信号传导:褐家鼠:疾病:肥胖症:瘦蛋Pathart240.0273IgG白信号途径胆汁酸生物合成KEGG100.0277IgG糖类代谢2150.0288IgG信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬Pathart0.0327IgG化:胰岛素信号途径凋亡诱导970.0332IgG经coa连接的苯甲酸降解KEGG190.0334IgG吞噬作用Cdcra160.0337IgG细胞表面受体介导的信号转导5150.0351IgG信号传导:褐家鼠:疾病:动脉粥样硬Pathart30.0356IgG化:亚油酸信号途径凝固:促凝固可能的正调节物血小Sebastian30.0387IgG板聚集凝固:促凝固:合成及运输Sebastian30.0397IgG信号传导:褐家鼠:生理:炎症:ill信Pathart20.0403IgG号途径磷脂代谢520.0403IgG信号传导:褐家鼠生理生长及分Pathart40.0456IgG化:akt介导的途径实施例4在三种或多种组织中具有显著的基因簇富集的途径表22.在三种或多种组织中具有显著的基因簇富集的途径.途径名称途径来源组织富集方向途径名称途径来源组织富集方向CeleraT81wk11C7凋亡KEGGT81wk11C7L1-51wk11C7CeleraLl誦52wkIgGCelera公用T81wk11C7凋亡4言号途径Celera公用Ll國51wk11C7Celera公用Ll画52wkIgGCdcraT81wk11C7B细胞及抗体介导的免疫L1-51wk11C7OleraLl画52wkIgGL151wk11C7凝血Ll-52wkIgGCelera公用T82wkIgGKEGGT82wkIgG补体及凝固级联KEGGL1-51wk11C7KEGGLl誦52wkIgGT81wk11C7细胞因子及趋化因子介导的信号途径CdcmL1-51wk11C7Ll-52wkIgGTl-71wkIgG胞外基质蛋白介导的信号传导L151wk11C7Ll-52wkIgGTl-71wkIgG生长因子稳态Ll画51wk11C7CeleraLl-52wkIgG血液2wkIgG免疫及防御T81wk11C7L1-51wk11C7CdcraLl画52wkIgG干扰素介导的免疫血液1wk11C7OleraT81wk11C7途径名称途径来源组织富集方向CeleraL1-51wk11C7Celera血液2wkIgG胞内蛋白质运输Celera血液1wk11C7CeleraT81wk11C7CeleraT81wk11C7L151wk11C7Jak-stat级联CdcraLl-52wkIgGCelera公用T81wk11C7Celera公用L1-51wk11C7CeleraT81wk11C7巨噬细胞介导的免疫CeleraL1-51wk11C7CeleraLl画52wkIgGT82wk11C7神经-神经突触传递CdcraLl國51wkIgGLl-52wk11C7CdcraT81wkIgG一申经元活性CeleraT82wk11C7L151wkIgGCdcraLl-52wk11C7Cckm血液2wkIgGT81wk11C7核苷、核苷酸及核酸代谢CeleraT82wkIgGCeleraLl誦51wk11C7U-52wkIgGCelera血液2wkIgG肿瘤发生CeleraL151wk11C7CeleraLl-52wkIgGKEGGT82wk11C7氧化磷酸化T82wk11C7KEGGLl画52wk11C7KEGGMCx1wkIgG途径名称蛋白质代谢及修饰蛋白质修饰蛋白水解突触传递T-细胞介导的免疫toll受体信号途径途径来源组织富集方向血液2wkIgGT81wk11C7Ll國51wk11C7Ll-52wkIgG血液2wkIgGT81wk11C7Ll誦51wk11C7Ll隱52wkIgGT81wk11C7L1-51wk11C7Ll-52wkIgGT82wk11C7L1-51wkIgGLl-52wk11C7T81wk11C7L1-51wk11C7Ll-52wkIgGL1-51wk11C7Ll-52wkIgGT81wk11C7L1-51wk11C7GekraCeleraCdcraCdcraCdcraCdcraCclcraCeleraCelcraCderaCelera公用Celera公用KEGGKEGG实施例5由GSEA鉴定的受抗NOGOA抗体治疗影响的轴突导向和生长因子途径表23.由GSEA鉴定受抗Nogo-A抗体疗法影响的轴突导向和生长因子途径途径名称途径来源组织富集方向slit-robo介导的轴突导向Celera7>用T81wk11C7L1-51wk11C7途径名称EGF受体信号途径FGF信号途径NGF信号途径途径来源Celera公用Celera公用Pathart组织Tl画71wkMotorcx2wkMotorcx2wkMotorCx2wk富集方向11C7IgGIgGIgG实施例6受SV129及BL6小鼠纯系中NOGOA敲除和大鼠脊髓损伤模型中抗NOGOA抗体治疗协调性地影响的途径及基因族Nogo-A(200kDa，1163aa)因插入一个787aa的大外显子(外显子3)而与Nogo-B(55kDa，357aa)相异。Nogo-A敲除小鼠通过如Simonen等(20(B)所述的同源重组而产生。嵌合型Nogo-A敲除小鼠与Svl29小鼠或BL/6小鼠回交至少10代。在回交期间使用快速同类品系标记分析法(Markel等，1997)。快速同类育种或标记辅助同系生产法使用微卫星标记以追踪每一品系染色体节段的遗传性。通过对于每一品系的标记的最高水平而选择最佳育种小鼠(breedermice)。本研究中所用小鼠根据其标记镨具有100%纯的C57BL/6背景，并且对于129Xl/SvJ品系具有>99%纯的背景。对于每个品系及基因型，将来自3只天然的、未损伤的、野生型和敲除小鼠(3月龄)的腰脊髓解剖并立即在液氮中冷冻。对于损伤微阵列实验，每个基因型及品系的5只雌性小鼠(6-7周龄)借助小的虹膜切开剪(fineiridectomyscissors)进行脊髓损伤以产生背索和背外侧索和背角的双侧损伤。损伤6日后，开展敞箱运动的Basso小鼠尺度行为分析(BassoMouseScalebehavioralanalysisforopen-fieldlocomotion)并且选择每类另'J中具有最相似得分的5只小鼠用于微阵列分析。损伤一周后，解剖在中央具有损伤部位的1cm脊髓并将它立即在液氮中冷冻。对于探针制备，遵循Affymetrix(SantaClara，CA)基因芯片分析手册中所述的方法。生物素化cRNA杂交到Affymetrix洗涤工作站450中的代表>45，000个探针组的AffymetrixMouseGenome4302.0阵列上，并且芯片随后用AffymetrixScanner3000扫描。每个芯片用于与总数28份样品中分离自单个动物的一份脊髓样品的cRNA杂交。结果随后使用AffymetrixMicroarraySuite5,然后用GeneSpring7.2(SiliconGenetics,RedwoodCity,CA)分析。为鉴定在脊髓损伤后1周于损伤动物及非损伤动物的天然和敲除型Svl29小鼠脊髓及BL/6小鼠脊髓中差异性表达的基因，对当前命令(presentcall)预筛选后，应用统计过滤(ANOVAp<0.05)和倍数变化阈值(>1.2/<0.66或>2/<0.5)。如此鉴定在脊髓损伤一周后在Svl29敲除小鼠和BL/6敲除小鼠以及在大鼠SCI模型共同受到影响的途径和基因族，即在敲除动物与天然动物间，并且在大鼠SCI模型中在对照(IgG)治疗的动物与11C7抗NogoA抗体治疗的动物间，比较在双向比较中所鉴定的差异性表达的基因。鉴定了113个共同受到影响的基因族。它们列于表24。表24协调性地受SV129及BL6小鼠纯系中NOGOA敲除和大鼠脊髓损伤模型中抗NOGOA抗体治疗影响的113个途径及基因族<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table>数据的统一以上数据进一步由2D凝胶和/或同位素-编码亲和标签法(ICAT)(isotope-codedaffinitytag)证实。在表25中提供了认为是最相关的在抑制或下调Nogo-A后受差异性调节的基因列表。表25.最相关基因的列表<table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table>其它前列腺素E合酶Ptges苯并二氮杂革受体Bzrp双糖链蛋白聚糖Bgn等同方案本发明不因本申请中所述的具体实施方案受到限制，其中所述的具体实施方案仅意图说明本发明的各个方面。可以进行本发明的众多修改和变型而不脱离本发明的精神和范围，如本领域技术人显而易见。除了本文中列举的那些方法和装置外，本领域技术人员将从前面的描述中轻易知道在本发明范围内的功能等同方法和装置。此类修改和变型意图处于所附;f又利要求的范围内。本发明将仅受所附权利要求以及这些权利要求的等同权利要求的完整范围的限制。权利要求1、用于预测受试者对包含抗Nogo-A抗体的药物的应答的方法，其中在施用包含抗Nogo-A抗体的所述药物之前和之后评估表25中至少一种基因的表达，并且其中将在施用包含抗Nogo-A抗体的所述药物后表25的所述至少一种基因的所述表达与在所述施用包含抗Nogo-A抗体的药物之前所述基因的表达进行比较。2、权利要求l所述的方法，其中在施用包含抗Nogo-A抗体的药物后表25中至少一种基因的所述表达与所述施用包含抗Nogo-A抗体的药物之前所述基因的表达比较时的失调表明对包含抗Nogo-A抗体的药物的所述施用的阳性应答(应答者)。3、权利要求l所述的方法，其中在施用包含抗Nogo-A抗体的药物后表25中至少一种基因的所述表达与所述施用包含抗Nogo-A抗体的药物之前所述基因的表达比较时缺乏失调表明缺少对包含抗Nogo-A抗体的药物的所述施用的应答(非应答者)。4、权利要求2或3所述的方法，其中在施用包含抗Nogo-A抗体的药物后表25中至少一种基因的所述表达与所述施用包含抗Nogo-A抗体的药物之前所述基因的表达比较时的失调是大于或等于1.2倍并且统计学显著(p<0.05，斯氏t检验)的表达改变。5、权利要求l-4所述的方法，其中评估了黏着基因族、细胞骨架基因族及信号传导基因族的每个族中至少一种基因的表达，其中所述的翻着基因族由钙勦着蛋白11、钙縣着蛋白2、钙黏着蛋白8、钩翱着蛋白22、Eph受体A3、Eph受体A4、肝配蛋白A3、肝配蛋白B2、Eph受体B2、脑信号蛋白4A、脑信号蛋白4D、脑信号蛋白4F、脑信号蛋白6A、脑信号蛋白6B、semaF胞质结构域相关蛋白3及丛蛋白B2组成，其中所述的细胞骨架基因族由加帽蛋白(细肌丝)类凝溶胶蛋白、酪蛋白激酶18、中心体肌动蛋白、凝溶胶蛋白、微管相关蛋白质T及神经丝68组成，并且其中所述的信号传导基因族由Rho-GDP解离抑制物1、二氢嘧啶酶相关蛋白2、二氢嘧啶酶相关蛋白1、二氢嘧啶酶相关蛋白5组成。6、权利要求l-5所迷的方法，其中评估表25中全部基因的表达。7、权利要求1所述的方法，其中在施用包含抗Nogo-A抗体的药物后表25中至少一种基因的所述表达与所述施用包含抗Nogo-A抗体的药物之前所述基因的表达比较时的失调表明中枢神经系统再生。8、权利要求l-7所迷的方法，其在体外进行。9、抗Nogo-A抗体在制造用于在患者群中治疗中枢神经系统损伤的药物的用途，其中通过权利要求1-8的方法选择所述患者群。10、权利要求9所述的用途，其中抗Nogo-A抗体是与人Nogo-A片段的从第342-357位氨基酸的表位结合的完全的人单克隆抗体(IgG4/K)。11、用于在受试者中治疗中枢神经系统损伤的方法，其包括步骤(a)对具有中枢神经系统损伤的受试者施用抗Nogo-A抗体；(b)根据权利要求l-8的方法确定受试者的基因表达i普；和(c)或者(i)如果生物标记的基因表达表明中枢神经系统再生，那么继续抗Nogo画A抗体疗法，或(ii)如果生物标记的基因表达不表明中枢神经系统再生，那么4f止或减少抗Nogo-A抗体疗法。12、用于在受试者中诊断中枢神经系统再生的方法，其包括步骤(a)对受试者施用抗Nogo-A抗体；(b)根据权利要求l-8的方法确定受试者的基因表达傳；和(c)确定生物标记的基因表达是否表明中枢神经系统再生。13、用于进4亍权利要求1-12的方法的试剂盒，其包含至少两种探针，每种探针能够特异检测表25中一种基因的表达，其中所述至少两种探针不检测相同基因的表达。全文摘要本公开的内容在基因表达水平证实受损脊髓和皮层运动区作为鞘内应用的抗Nogo-A抗体治疗的主要作用部位。该公开也提供用于通过评估选自如下至少一种基因的表达而监测受试者对包含抗Nogo-A抗体的药物应答的方法钙黏着蛋白2、8、11或22；肝配蛋白A3或B2；Eph受体A3或A4；脑信号蛋白4A、4D、4F、6A或6B；丛蛋白B2；加帽蛋白(细肌丝，类凝溶胶蛋白)；酪蛋白激酶1δ；中心体肌动蛋白；凝溶胶蛋白；微管相关蛋白质τ；神经丝68；肌纤蛋白；嗅介蛋白1或3；γ干扰素；Rho-GDP解离抑制物1、二氢嘧啶酶相关蛋白(CRMP)1、2或5；突触核蛋白；淀粉状蛋白β(A4)PP结合性A1；淀粉状蛋白β(A4)前体样蛋白1或2；前列腺素E合酶；苯并二氮杂受体或双糖链蛋白聚糖。文档编号G01N33/50GK101310183SQ200680042608公开日2008年11月19日申请日期2006年11月14日优先权日2005年11月16日发明者A·K·米尔,A·金努宁,L·施内尔,L·蒙塔尼,L·迪穆,M·E·施瓦布申请人:诺瓦提斯公司;苏黎世大学