专利名称：：一种人类胃疾病及动物模型组织芯片的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，涉及在片基上固定有组织心片。二、
背景技术：
随着组织学、病理学的发展，人们对人体或其他动植物的认识，从解剖学上的器官水平向组织、细胞水平发展。但由于完整的器官很难用显微镜观察，因此需要把器官切成很薄的切片进行染色观察，为了解决这个问题，出现了组织学技术。该方法的原理是通过把器官切成小块组织，用福尔马林固定后，利用酒精脱去该组织中的水分，再浸入二甲苯或苯溶液脱去酒精，最后组织块浸入熔化石蜡溶液中脱去二甲苯，放入模具内用石蜡溶液进行包埋，冷却后形成石蜡块。该石蜡块利用切片机进行切片，把蜡片裱于玻璃片上，再进行烤片、脱蜡，染色、封片后就可以用显微镜进行观察研究。目前，组织学技术不仅是单纯染色显微镜观察，还出现了各种特殊染色、免疫组织化学技术、原位杂交技术、原位PCR技术。近年来随着基因组学、蛋白组学研究发展，人们研究的生理和疾病已逐步从分子水平向细胞水平及组织水平发展，因此，如何利用组织开展研究，是目前研究中所要解决问题之一。采用传统组织技术的研究方法，由于组织标本需要量大，实验工作量大，难以适应研究的学要。近年来，出现了组织微阵列芯片技术，解决了上述问题。该技术将数十个、数百个乃至上千个小的组织片整齐地排列在某一载体上(通常是载玻片)而制作成微縮组织切片，其基本操作程序(如图1所示)包括设计并拟定组织芯片的分类系列、核对组织或有关疾病的病理诊断、组织定位、阵列蜡块的制作、再从源蜡块上钻取组织并转移到空白石蜡块的相应位置、组织芯片切片。组织芯片的特点有体积小、信息含量大、高通量;减少或避免了对原始组织蜡块的破坏；组织样本的定位准确，减少无效组织;批量制作及可能的结果分析自动化；不同来源的病例的处理、染色和分析条件相同。胃部疾病是一组常见、多发行的疾病。胃癌的起因目前虽然还不明确，但是大致与以下几种因素有关1、.慢性胃炎慢性胃炎，特别是慢性萎縮性胃炎与胃癌的发生关系密切，因为慢性萎縮性胃炎常合并有肠腺化生形成息肉，更增加了恶变的可能性，因此，常常把萎縮性胃炎作为癌前病变来看待。2、幽门螺旋杆菌感染我们以往通常把胃溃疡的成因归结为神经内分泌等因素。现在已经证实，胃溃疡是由幽门螺旋杆菌引起的。对胃溃疡病人进行系统的正规治疗，对预防胃癌的发生有非常积极的意义。3.胃息肉胃息肉属于胃的良性肿瘤，胃息肉中的上皮增生性腺瘤极易恶变成癌，被认为是癌前病变。如发现这种疾病，应该积极治疗以消除隐患。4.吸烟及饮酒吸烟及长期饮酒，特别是酗酒者一般都有慢性胃炎，而正是慢性胃炎可能发生间变，甚至恶变成胃癌，所以说远离烟酒也是预防胃癌的一个重要环节。5.饮食因素6.遗传因素胃癌有很明显的家庭倾向性。早期胃癌可分为以下各型(1990年WHO分类)①腺癌包括乳头状腺癌、管状腺癌、与粘液腺癌(恶性度高于前两者)，再根据分化程度又分为高分化、中分化与低分化3种；②未分化癌(恶性度最高)；③粘液细胞癌(即印戒细胞癌)；④特殊类型癌包括腺鳞癌、鳞癌、类癌、绒癌、癌肉瘤和神经内分泌癌等。还有一些罕见的癌肝癌样胃癌、壁细胞癌、髓样癌等。各种疾病存在一个动态发展的变化原位癌(原发癌限于粘膜层未累及粘膜固有层)；肿瘤侵及粘膜下层；肿瘤侵及肌层；肿瘤侵及浆膜层；侵及邻近器官；胃镜活检证实为癌，但切除标本组织学检查未发现癌；肿瘤浸润深度无法判定；无区域淋巴结转移；淋巴结转移局限于肿瘤边缘3cm以内的胃周淋巴结；淋巴结转移超出肿瘤边缘3cm以外，包括胃左动脉、肝总动脉、脾及腹腔周围淋巴结；淋巴结转移情况无法确定；无远处转移等。1994年世界卫生组织属下的国际肿瘤研究机构将幽门螺杆菌列为引起胃癌的第I类(肯定)致癌原。幽门螺杆菌如何引发肿瘤的发生发展是目前研究的难点和热点。寻找一种有效可靠的研究工具，从分子、细胞、组织水平上观察这些疾病的发生、发展的整个过程从而找到有意义的基因和表达的蛋白质，是目前急需解决的问题。三、
发明内容本发明的目的是提供一种高效、简便和低成本的人与感染幽门螺旋杆菌胃癌易感基因的动物的胃组织混合微阵列芯片，从而可以在分子、细胞、组织水平上研究胃癌疾病与幽门螺杆菌在人体以及动物体内的发生、发展的整个过程。通过该芯片亦可筛选出特异性、有意义的基因和及其表达的蛋白质作为诊断和治疗的潜在用途。该胃组织微阵列芯片，包括片基、片基上连接有特异性组织点。片基可以是玻璃、生物膜、硅芯片、聚二氟乙烯膜或硝酸纤维膜，片基可以是经过防脱片处理的。片基上组织点所需不同大小直径可为0.6mm，l.Omm，1.5mm，2.0mm，2.5mm，3.0mm，3.5mm，4.0mm，4.5mm，5.0mm，5.5mm,6.0mm等。密度为500个点/平方厘米1个点/平方厘米，每张片基上可有1000点10点不等。可以矩阵列方式、圆形方式或其他形状排列。所述组织点至少选自以下正常或疾病病变的人体胃组织和动物模型胃组织人体胃组织(包括胃底、胃体、胃小弯、胃大弯、幽门、贲门)正常组织，慢性浅表性胃炎，单纯型萎縮性胃炎，胃溃疡，肠化型萎縮性胃炎完全性结肠化生，肠化型萎縮性胃炎不完全性结肠化生，肠化型萎縮性胃炎完全性小肠化生，肠化型萎縮性胃炎不完全性小肠化生，胃不典型增生，胃管状腺瘤，胃绒毛状腺瘤，胃管状绒毛状腺瘤，ZoHinge广Ehison综合征，胃脉管瘤，胃平滑肌瘤，胃平滑肌肉瘤，胃神经鞘瘤，胃恶性神经鞘瘤，胃乳头状腺癌，胃管状腺癌，胃粘液腺癌，胃印戒细胞癌，胃腺鳞癌，胃鳞癌，胃小细胞癌，胃未分化癌，胃恶性淋巴瘤等；动物模型的正常以及病变的胃组织首先建立幽门螺杆菌感染动物胃模型。通过给研究动物如蒙古沙鼠喂食含有幽门螺杆菌株的饲料而发生感染，在1周，2周或3周等不同的时间段宰杀动物获取胃组织，研究动物在经过一系列的环境因素诱导引起胃组织发生病变的整个过程，最终导致胃癌发生。选取的组织包括:胃(包括胃底、胃体、胃小弯、胃大弯、幽门、贲门)正常组织，炎症组织，癌前病变组织及癌变组织。下面结合实施例具体阐述本
发明内容一、人与动物胃癌发病机理及发展全过程组织芯片人与动物胃癌发病机理及发展全过程组织芯片阵列中每个点的组织类型信息如表格一所示，排列后形成的组织芯片效果图如图2所示1为经过防脱片处理的在玻片，2为碳芯标记点(标记阵列读取顺序)，3为排列的组织样本。点的直径为l.Omm，点之间的间距为0.4mm。每行10个点，共12行。下面结合表格一详叙阵列中排列点的组织类型在芯片左上角有一个碳芯标记点(Maker)用于给阵列的排列方向进行定位。Al、A2、为感染ATCC菌株3周的雄性蒙古沙鼠胃组织；A3、A4、为感染ATCC菌株3周的雌性蒙古沙鼠胃组织；A5、A6、A7、A8、为感染ATCC菌株8周的雄性蒙古沙鼠胃组织A9、A10为对照组未感染菌且饲养8周的蒙古沙鼠胃组织。Bl、B2、B3、B4为感染感染ATCC菌株3周的雄性蒙古沙鼠胃组织；A3、A4、为感染ATCC菌株3周的雌性蒙古沙鼠胃组织；A5、A6、A7、A8、为感染ATCC菌株8周的雄性蒙古沙鼠胃组织C5、C6、为对照组未感染菌且饲养20周的蒙古沙鼠胃组织；C7、C8、C9、C10为感染HP161菌株8周的雄性蒙古沙鼠胃组织。Dl、D2、为感染HP161菌株8周的雄性蒙古沙鼠胃组织；D3、D4、为对照组未感染菌且词养8周的蒙古沙鼠胃组织；D5、D6、D7、D8、为感染HP161菌株8周的雌性蒙古沙鼠胃组织；D9、D10为对照组未感染菌且饲养8周的蒙古沙鼠胃组织。El、E2、为感染HP161菌株20周的雄性蒙古沙鼠胃组织；E3、E4、为对照组未感染菌且饲养20周的蒙古沙鼠胃组织；E5、E6、E7、E8、为感染HP161菌株20周的雌性蒙古沙鼠胃组织；E9、E10为未对照组未感染菌且词养20周的蒙古沙鼠胃组织。Fl、F2、F3、F4，分别为胃(贲门)，胃(大弯)，胃(小弯)，胃(窦)正常组织；F5，F6，F7分别为慢性浅表性胃炎发展过程中轻度，中度，重读三个阶段的病变组织；F8、F9、F10分别为单纯型萎縮性胃炎发展过程中轻度，中度，重度三个阶段的病变组织；Gl为胃溃疡病变组织；G2，G3，G4，G5分别为肠化型萎縮性胃炎不同病因完全性结肠化生，不完全性结肠化生，完全性小肠化生，不完全性小肠化生四种病变组织；G6、G7、G8分别为胃不典型增生三个不同发展阶段轻度，中度，重度的病变组织；G9、GIO、Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7分别为胃管状腺瘤，胃绒毛状腺瘤，胃管状绒毛状腺瘤，ZoHinge「Ehison综合征，胃脉管瘤，胃平滑肌瘤，胃平滑肌肉瘤，胃神经鞘瘤，胃恶性神经鞘瘤癌变组织；H8、H9、HIO、II分别为两例患有胃乳头状腺癌患者的肿瘤组织和肿瘤旁组织；12、B、14、15分别为两例患有胃管状腺癌患者的肿瘤组织和肿瘤旁组织；16、17、18、19分别为两例患有胃粘液腺癌患者的肿瘤组织和肿瘤旁组织；110、Jl、J2、J3分别为两例患有胃印戒细胞癌患者的肿瘤组织和肿瘤旁组织；J4、J5、J6、J7分别为两例患有胃腺鳞癌患者的肿瘤组织和肿瘤旁组织；J8、J9、JIO、Kl分别为两例患有胃鳞癌患者的肿瘤组织和肿瘤旁组织；K2、K3、K4、K5分别为两例患有胃小细胞癌患者的肿瘤组织和肿瘤旁组织；K6、K7、K8、K9分别为两例患有胃未分化癌患者的肿瘤组织和肿瘤旁组织；KIO、Ll、L2、L3分别为两例患有胃恶性淋巴瘤患者的肿瘤组织和肿瘤旁组织；L4为一个碳芯标记点(Marker)用于标记阵列排列的结束位置。这一张含有反映人与动物胃癌不同发病机理及发展全过程的正常及癌变对照组织的芯片用于免疫组化，原位杂交，免疫荧光等不同试验研究。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>图1为组织芯片制作基本流程。图2为组织芯片示意图其中1为经过防脱片处理的在玻片；2为碳芯标记点(标记阵列读取顺序)；3为排列的组织样本。应理解，本说明书之题目及本说明书所述及之实施例仅用于说明本发明而不用于对本发明的范围进行限制。权利要求1.一种组织微阵列芯片，包括片基和组织点，组织点以点阵方式排列并附于片基之上，其特征在于所述组织点由正常人类正常胃组织、人类胃疾病病变部组织、蒙古沙鼠正常胃部组织、感染幽门螺杆的蒙古沙鼠胃部组织构成。2、根据权利要求1所述的一种组织微阵列芯片，其特征在于所述片基可以是玻璃、胶片、生物膜、硅芯片、聚二氟乙烯膜或硝酸纤维膜。3、根据权利要求2所述的一种组织微阵列芯片，其特征在于所述片基可以是经过防脱片处理。4、根据权利要求1所述的一种组织微阵列芯片，其特征在于，所述组织点直径为0.6毫米，1.0毫米，1.5毫米，2.0毫米，2.5毫米，3.0毫米，3.5毫米，4.0毫米，4.5毫米，5.0毫米，5.5毫米，6.0毫米。5、根据权利要求1所述的一种组织微阵列芯片，其特征在于所述点阵方式可以为矩阵列方式或园形方式排列，密度为500至1个点/平方厘米，数量为1000点至10点。6、根据权利要求1所述的一种组织微阵列芯片，其特征在于所述及的人类正常胃组织至少包括人类胃贲门、胃小弯、胃大弯、胃窦部组织。7、根据权利要求1所述的一种组织微阵列芯片，其特征在于所述及的胃疾病至少包括慢性浅表性胃炎、单纯性胃炎、萎縮性胃炎、胃溃疡、胃不典型增生、胃管状腺瘤、胃绒毛状腺瘤、胃管状绒毛状腺瘤、ZoHinger^Ehison综合征、胃脉管瘤、胃平滑肌瘤、胃平滑肌肉瘤、胃神经鞘瘤、胃恶性神经鞘瘤、胃乳头状腺癌、胃管状腺癌、胃粘液腺癌，胃印戒细胞癌，胃腺鳞癌，胃鳞癌，胃小细胞癌，胃未分化癌和胃恶性淋巴瘤。8、根据权利要求1所述的一种组织微阵列芯片，其特征在于所述及的感染幽门螺杆蒙古沙鼠的胃部组织包括感染ATCC菌株的蒙古沙鼠胃部组织和感染HP161菌株的蒙古沙鼠胃部组织。9根据权利要求8所述的一种组织微阵列芯片，其特征在于所述及的感染ATCC菌株蒙古沙鼠胃部组织包括感染ATCC菌株3周的雄性蒙古沙鼠胃组织、感染ATCC菌株3周的雌性蒙古沙鼠胃组织、感染ATCC菌株8周的雄性蒙古沙鼠胃组织。10、根据权利要求8所述的一种组织微阵列芯片，其特征在于所述感染HP161菌株蒙古沙鼠胃部组织包括感染HP161菌株8周的雄性蒙古沙鼠胃组织、感染HP161菌株8周的雄性蒙古沙鼠胃组织、感染HP161菌株8周的雌性蒙古沙鼠胃组织、感染HP161菌株20周的雄性蒙古沙鼠胃组织、、感染HP161菌株20周的雌性蒙古沙鼠胃组织。全文摘要本发明公开了一种组织微阵列芯片，该芯片上组织点由人和动物正常胃组织、感染幽门螺杆菌的胃组织和胃疾病病变部组织构成，从而可以在分子、细胞、组织水平上研究胃疾病的发生、发展的整个过程与幽门螺杆菌感染之间的关系。该芯片亦可筛选出特异性、有意义的基因和及其表达的蛋白质。文档编号G01N33/48GK101275941SQ20071003847公开日2008年10月1日申请日期2007年3月26日优先权日2007年3月26日发明者琼周,萧树东,郜恒骏申请人:上海芯超生物科技有限公司