专利名称：：一种生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药复方制剂生脉胶囊的指纹图谱检测技术及其在生脉胶囊生产质量控制中的应用。具体地说，即利用指纹图谱技术控制生脉胶囊的药品质量。
背景技术：
：生脉散是我国传统著名古方，一般认为出自《内外伤辩惑论》(1213年)。近年经有关专家考证，认为生脉散最早出自1186年的《医学启源》，至今已821年。生脉散包括人参，麦冬，五味子三味药材。具有益气生津、敛阴止汗的功能。主治热伤元气、阴液亏耗的气阴两虚，证见汗多、口渴、咽干、喘急欲脱、形体倦惰、脉虚无力、舌干红无律，或久病心肺两虚、气阴不足、咳呛少痰、短气自汗、口干舌燥和脉象虚软。本方经长期临床实践疗效确切，至今仍广为应用。从70年代初开始至今医药界对此方进行了大量研究，临床应用范围不断扩大，己用于治疗心血管病中的抗休克、抗心衰、抗心肌缺血等方面病症；药理研究也己有百余篇报道。80年代以来国内先后开发研制了生脉散口服液、颗粒剂、胶囊、针剂等新制剂。生脉胶囊系在传统古方"生脉散"的基础上，用现代科学先进工艺提炼精制而成的一种纯天然中药制剂，广泛用于治疗冠心病、心绞痛、心脑血栓，提高机体适应能力等。生脉胶囊包括人参，麦冬，五味子三味药材，方中人参以补肺益气为主，辅以麦冬养阴生津，五味子敛肺止汗，三药合用，一补一清一敛，能共奏益气复脉，养阴生津之功效。药理研究证明，本方具有增加冠脉血流量，增强心肌收縮力，提高心肌对缺血缺氧的耐受性，降低耗氧量的作用。临床研究表明(临床研究批件申请编号2002浙中保申临字第5号)生脉胶囊治疗中医证属气阴两虚所致胸痹(冠心病心绞痛)，心悸(病毒性心肌炎)均有很好的临床疗效，且安全无明显毒副作用。在治疗中医证属气阴两虚所致胸痹(冠心病心绞痛)的随机对照试验中，试验组46例完成最终试验，总体评价(疾病疗效)显效率为13.0%，总有效率为69.6%;中医证候疗效试验组总有效率93.5%;心绞痛疗效试验组显效率为34.8%，总有效率80.4%;心电图疗效试验组总有效率63.0%。开放试验有87例完成最终试验，总体评价(疾病疗效)显效率为14.9%，总有效率为65.5%;中医证候疗效总有效率为89.7%;心绞痛疗效总有效率为73.6%;心电图疗效总有效率为67.8%，提示生脉胶囊对上述各指标有一定疗效。临床试验总的结果证实生脉胶囊治疗气阴两虚所致胸痹(冠心病心绞痛)的临床疗效确切。在治疗中医证属气阴两虚所致心悸(病毒性心肌炎)随机对照试验表明，试验组41例完成最终试验，总体评价(疾病疗效)显效率为22.0%，总有效率为73.2%;中医证候疗效试验组总有效率85.4%;早搏疗效试验组总有效率65.9%。在治疗中医证属气阴两虚所致心悸(病毒性心肌炎)幵放试验有80例完成最终试验，总体评价(疾病疗效)显效率为45.0%，总有效率为91.3%;早搏疗效总有效率为83.8%;中医证候疗效总有效率为95.0%;临床试验结果证实生脉胶囊治疗气阴两虚所致心悸(病毒性心肌炎)的临床疗效显著。但是，令人遗憾的是，疗效确切的生脉胶囊实际临床应用经常表现为疗效不稳定，极大阻碍了该产品的临床应用。经过我们大量研究发现，造成这种现象的主要原因是产品质量不稳定，现有生脉胶囊质量标准(WS3-B-1312-93)中仅对方中人参成分进行薄层色谱鉴别，而五味子、麦冬成分连薄层色谱鉴别都没有。显然上述标准并不能客观反映生脉胶囊整体质量状况，很难有效控制生脉胶囊质量。国际上常采用指纹图谱对植物药进行质量控制，效果显著，如韩国、外国-日本、外国(德国)等。他们比较重视对植物药的开发和利用，外国(德国)用指纹图谱技术控制质量的银杏制剂，在全球-国际上具有很强的竞争力。加入世贸组织之后，生产植物药的大国也都将进入我国进行竞争，我国的中药企业面临着严峻的挑战。中药指纹图谱有两个特点一是通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪或产地；二是通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的制定，能有效控制产品的质量，确保产品质量的相对一致。目前，指纹图谱已成为全球-国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效的手段。国内从事中药指纹图谱研究最早可以追踪到60年代，如采用薄层色谱、紫外光谱、红外光谱制定中药材的指纹图谱等。但当时人们对此重视不够，研究速度与成果相对发达国家有一定的差距。近年来，随着中药现代化、全球-国际化的深入发展，政府、企业和研究人员越来越清醒地认识到，控制中药的质量是我们亟待解决的关键技术之一，而中药指纹图谱则是控制原药材、半成品、最终产品真实性、一致性和稳定性的可行而有效的手段。由于中药注射剂的特殊性，目前国内大量的指纹图谱研究基本集中在中药注射剂方面，较少开展对中药口服制剂的指纹图谱研究工作。目前已有大量涉及中药注射液及中药材指纹图谱研究的报道，高阳等人发表了人参药材指纹图谱分析方法研究(中成药，Vol.28，No.4，p473)，共标示出人参药材图谱中的18个共有峰；陈洪轩等(河南大学学报(医学科学版)，Vol.22，No.3，pl7)、冯伟等(中成药，Vol.28，No.4，p477)、冯雪松等(化学与生物工程，Vol.23，No.5，p60)及范卓文等(东北师大学报自然科学版，Vol.36，No.2，p50)都对五味子的药材指纹图谱分析方法进行了研究；由于复方制剂的指纹图谱并不是几个药材指纹图谱的简单叠加，对人参或五味子单个药材的指纹图谱检测技术基本上无法直接用于复方制剂的指纹图谱检测。夏晶等人发表了生脉注射液HPLC指纹图谱的研究，标准指纹图谱由20个特征峰组成(中成药，Vol.28，No.8，pl093)。中国专利CN1836717A在2006年9月27日公开了生脉注射液的质量控制方法，该方法包括指纹图谱测试、鉴别和含量测定；制定了以红参和麦冬成分特征为主的指纹图谱和以五味子成分特征为主的指纹图谱来全面控制注射剂的质量，其采用的方法是每个药材图谱逐个比对，步骤多，实际药品大生产时质量控制不方便，不利于工业化生产质量控制使用。生脉胶囊与生脉注射液虽然都是从传统古方"生脉散"的基础上演变而成，但两者有很大区别，详见下表l:生脉胶囊与生脉注射液比较表。从表l我们很容易得出结论，生脉胶囊和生脉注射液无论从日用生药量还是制法来说，都有较大差异，单从人参角度来说，生脉胶囊含大量人参原药材生药粉，而生脉注射液中则只有人参的乙醇提取物并不含人参原药材生药粉，因而生脉胶囊和生脉注射液的物质基础显然是不同的，生脉注射液的指纹图谱测试方法不能直接应用于生脉胶囊。长期以来，获得一种有效控制生脉胶囊质量的技术一直是业内追求的目标。我们曾经尝试增订五味子、麦冬的薄层色谱鉴别和君药人参的液相色谱含量测定来控制产品质量，但是效果仍然不能令人满意。经过努力，我们结合液相色谱指纹图谱技术发展的潮流，找到了合适的生脉胶囊指纹图谱检测技术，包括将生脉胶囊样品用溶剂提取制备样品的供试液，在一定的色谱条件下测试供试液液相色谱指纹图谱，利用计算机辅助相似度评价软件计算生脉胶囊供试液指纹图谱的相似度，获得指纹图谱相似度数值，从而达到控制生脉胶囊药品质量的目的。实验证明，本发明的指纹图谱检测技术对生脉胶囊的生产能起到很好的质量控制作用，是一种评价中药复方制剂生产质量的关键技术。表l:生脉胶囊与生脉注射液比较表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>
发明内容生脉胶囊包括人参、麦冬、五味子三味药材。方中人参主要成分为人参皂苷类，麦冬中主要含有黄酮类、皂苷类等，五味子主要含有五味子醇甲、五味子甲素等木脂素类成份，以上三味药材的主要成分均有紫外或紫外末端吸收。本发明的生脉胶囊指纹图谱检测技术，包括将生脉胶囊样品用溶剂提取制备样品的供试液，在一定的色谱条件下测试供试液指纹图谱，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算机辅助相似度评价软件(国家药典委员会主持，浙江大学制药工程等单位开发的中药指纹图谱相似度计算软件)计算指纹图谱相似度，获得指纹图谱相似度数值。依据相似度数值，将指纹图谱检测技术用于生脉胶囊的质量控制。供试液的制备方法，包含如下步骤取生脉胶囊内容物约lg，精密称定，加50.0ml甲醇回流提取2h，过滤，精密量取续滤液25.0ml减压浓縮至近干，加甲醇溶解并定容至2.0ml，10000rpm离心10min，上清液供测试备用。所使用的一定的色谱条件，包括如下因素色谱柱；流动相；线性梯度洗脱程序；柱温30。C;流速为O.8ml/min;紫外检测器检测；检测波长为203nm;进样量io叱；运行90min。对照指纹图谱的获取方法为取10批次生脉胶囊样品，按上述供试液的制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件获取10批次生脉胶囊HPLC指纹图谱，以该10批次生脉胶囊平均指纹图谱为对照指纹图谱。色谱柱选用的是C18柱，包括AgilentZorbaxSB-C18、XDB-C18或Inertsil0DS-3其中的一种。流动相，指的是乙腈(B相)一水(A相)体系或乙腈(B相)一0.03%磷酸水(A相)体系。线性梯度洗脱程序，具体条件如下流动相水(A)-乙腈(B)，0min2%B，35min35%B，45min40%B，60min55%B，75min100%B。经过研究，采用了如下的供试品溶液的制备方法取生脉胶囊内容物约lg，精密称定，加50.0ml甲醇回流提取2h，过滤，精密量取续滤液25.Oml减压浓缩至近干，加甲醇溶解并定容至2.0ml，10000rpm离心10min，上清液备用。经过研究，采用了如下的色谱条件色谱柱:AgilentZorbaxSB-C18(250mmX4.6画i.d.，5to);流动相水(A)-乙腈(B)，线性梯度洗脱程序Omin2%B，35min35%B，45min40%B，60min55%B，75min100B%，运行90min;》充速0.8ml/min;检测波长203nm;柱温3(TC;进样量IO叱。在此色谱条件下获取的生脉胶囊对照指纹图谱见图l。通过我们的研究表明生脉胶囊指纹图谱具有32个特征峰，图谱总长度为90min，显著不同于生脉注射液(夏晶等人发表的生脉注射液HPLC指纹图谱的研究，标准指纹图谱由20个特征峰组成，图谱总长度100min(中成药，Vol.28,No.8，pl093))。研究表明，其中峰6、峰7、峰8、峰9、峰10、峰ll、峰12、峰13、峰14、峰15、峰16、峰17、峰18、峰19、峰20、峰21、峰22、峰23、峰25、峰27、峰29、峰31、峰32的色谱峰保留时间及光谱图与人参指纹图谱中的色谱峰一致，该23个色谱峰归属于人参药材；峰l、峰4、峰24的色谱峰保留时间及光谱图与五味子指纹图谱中的色谱峰一致，该3个色谱峰归属于五味子药材；指纹图谱中保留时间为28.Omin的色谱峰保留时间及光谱图与麦冬指纹图谱中的色谱峰一致，该色谱峰来源于麦冬药材。应用本发明，我们按合格产品的指纹图谱相似度应大于O.90为检验质控标准，将生脉胶囊指纹图谱检测技术成功应用于生脉胶囊的生产检验质量控制，所得产品质量稳定可靠，疗效的不一致性有望基本解决，真正达到安全有效，质量可靠。生脉胶囊指纹图谱分析方法建立及质量稳定性评价具体情况如下1.1仪器与试剂仪器AgilentllOO型高效液相色谱仪，配脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、紫外检测器(Agilent公司)；AlltechELSD2000蒸发光散射检测器(Alltech公司)。试剂乙腈、甲醇为色谱纯(MERCK公司)，其余试剂均为分析纯，水为Milli-Q纯净水。生脉胶囊(正大青春宝药业有限公司，批号0505001、0506001、0507001、0509001、0509002、0510001、0511002、0512002、0512003、0602001)。1.2色谱条件优化1.2.1色谱柱选择在同一色谱条件下，分别比较了phenomenex(250mmX4.6鹏i.d.，4|%)、AgilentZorbaxSB-C18(250ramX4.6mmi.d.，5陶)、AgilentZorbaxXDB-C18(250mmX4.6mmi.d.，5Wn)、迪马的Inertsil0DS—3(250腿X4.0mmi.d.，5Pm)四根色谱柱色谱分离情况，结果见图2。phenomenex柱分离效果不佳，峰有拖尾现象，AgilentZorbaxSB-C18、XDB-C18及Inertsil0DS-3色谱柱均呈现较好的分离效果，峰形对称，但以ZorbaxSB-C18分离效果较好。检出峰数多，故选择AgilentZorbaxSB-C18(250mmX4.6mmi.d.，5Mm)为生脉胶囊指纹图谱分析用色谱柱。1.2.2检测波长选择考虑到生脉胶囊中主要成分为人参皂苷类，麦冬中主要含有黄酮类、皂苷类、糖类化合物，五味子主要含有五味子醇甲、五味子甲素、乙素、五味子酯甲等木脂素类成份及有机酸类成分，检测波长的选择应兼顾各类化学组分，文献报道皂苷类成分均只有末端吸收，黄酮类成分最大吸收波长为230、280nm，而五味子中木脂素类成分的最大吸收波长为254nm，同时考察了203、230、250、280nm波长下的生脉胶囊样品色谱图，结果如图3，以203nm波长下的色谱图色谱峰数最多。230、250、280nm波长下的生脉胶囊样品色谱图中许多峰缺失。选择203nm为生脉胶囊分析用检测波长。1.2.3流动相体系选择比较甲醇一水、乙腈一水、乙腈一0.03%磷酸水体系，所得色谱图见图4。结果甲醇一水体系在203nm波长下，色谱图基线波动及漂移较大，峰的分离效果较差，而乙腈一水体系、乙腈—0.03%磷酸水体系下的色谱图峰分离较好，二者均基线平稳，分离情况在色谱图不同时间段略显差异，各有优劣，考虑实验条件以简化为佳，选择乙腈一水体系为生脉胶囊色谱分离用流动相体系。1.2.4柱温选择在20、25、30、35、4(TC柱温下分析生脉胶囊，所得色谱图见图5，结果柱温升高，柱压下降，4070min区域内的色谱峰保留时间大多后移，色谱峰分离度稍有改善，但无显著差异。柱温升高，柱压下降，有利于色谱柱的保护，但柱温过高，对色谱柱中填料会有不利影响，也易引起样品中不稳定成分的变化，综合考虑各方面因素，色谱分析柱温选择3(TC。1.2.5流速的选择考察了O.6、0.8、1.Oml/min的流速对分离的影响，结果如图6，以O.8ml/min的流速分离效果较佳。1.2.6流动相梯度选择采用AgilentZorbaxSB-C18(250腿X4.6mmi.d.，5Pm)色谱柱；流速0.8ml/min;检测波长203nm;柱温30。C;进样量IO叱；以水为A相，乙腈为B相，考察了多种梯度洗脱条件，其中的四个线性梯度条件为(1)Omin5%B，10min10%B，30min35%B，50min55%B，70min100B%，运行90min;(2)Omin5%B，10min8%B，50min55%B，70min100B%，运行90min;(3)Omin10%B，lOmin10%B，60min55%B，80tnin100B%,运行90min;(4)Omin2%B，35min35%B，45min40%B，60min55%B,75min100B%,运行90min;对应的色谱图见图7;以梯度(4)得到的色谱图分离较好而且谱峰较多，可给出较大的信息量，故选定以梯度(4)作为生脉胶囊指纹图谱分析的色谱条件。1.2.7不同检测器考察为了考察不同检测器对指纹图谱的影响，寻找能给出较大信息量的检测方法，在同一色谱条件下，分别采用紫外检测器、蒸发光散射检测器进行检测。紫外检测器参数检测波长203nm;ELSD参数雾化气为氮气，雾化气流量2.0L/min，漂移管温度为105。C。所得色谱图见图8。从图中可以发现，蒸发光散射检测所得生脉胶囊指纹图谱的色谱峰数目明显少于紫外检测结果，给出的信息较少，因此，选择紫外检测器进行检测。1.3生脉胶囊样品制备方法优化1.3.1提取方法选择由于在生脉胶囊工艺中，人参采用75%乙醇渗漉，麦冬、五味子采用水提醇沉法提取，在最后制剂过程中还混入部分人参原药材粉末制成胶囊，据此分析，在生脉胶囊中所含有的组分以醇溶性成分为主，尚含少量水和醇中均能溶解的强极性成分，且因在胶囊中掺入了部分人参原药材粉末，样品制备过程中既要考虑对三味药材提取物的溶出，又要考虑对人参原药材中人参皂苷类成分的提取。综合考虑以上工艺因素，首先选择甲醇为提取溶剂，分别考察回流和超声提取二种方法间的差异。具体比较方法如下取同一批次生脉胶囊内容物约lg，精密称定，精密加入50.0ml甲醇，分别采用回流和超声提取方法提取2h，过滤，精密量取续滤液25.Oml减压浓縮至近千，加甲醇溶解并定容至2.0ml，10000rpm离心10min，取上清液，进行色谱分析，结果见图9。回流提取方法提取更完全，选择回流提取方式进行生脉胶囊样品制备。1.3.2提取溶剂考察取同一批次生脉胶囊内容物约lg，精密称定，分别精密加入50.0ml甲醇/乙醇/60%甲醇/60%乙醇，回流提取2h，过滤，精密量取续滤液25.Oml减压浓縮至近干，加甲醇溶解并定容至2.0ml，10000rpm离心10min，取上清液，进行色谱分析，结果见图IO。以甲醇为溶剂提取的峰数量较多，峰面积最高，提取出的强极性杂质少。选择甲醇为提取溶剂。1.3.3提取溶剂量考察取同一批次生脉胶囊内容物约lg，精密称定，分别精密加入25.0、50.0、75.0、100.Oml甲醇，回流提取2h，过滤，精密量取提取总量一半的续滤液，减压浓縮至近干，加甲醇溶解并定容至2.0ml，10000rpm离心10min，取上清液，进行色谱分析，结果见图ll。当提取溶剂量^50ml时，提取液色谱图中各峰峰面积大小无显著差异，从减少有机溶剂用量及成本角度考虑，提取溶剂量选择50ml。1.3.4提取时间考察取同一批次生脉胶囊内容物约lg，精密称定，精密加入50.0ml甲醇，分别回流提取l.5、2h、2.5h，过滤，精密量取续滤液25.Oml减压浓縮至近干，加甲醇溶解并定容至2.Oml,10000rpm离心10min,取上清液，进行色谱分析，结果见图12。提取时间^2.0h时，能提出较多的成分，提取较完全。提取时间选择2h。1.4生脉胶囊指纹图谱方法论证1.4.1仪器精密度取同一生脉胶囊供试品溶液，连续进样6次，结果见表l、图13。结果各峰保留时间RSD小于0.06X，单峰面积大于总峰面积1X的峰峰面积RSD小于2.32%。以第一次分析所得指纹图谱为对照，其他5次分析所得色谱图与对照指纹图谱比较，相似度计算结果为1.000、1.000、1.000、1.000、1.000，仪器精密度良好。表l-l精密度实验结果(峰面积)峰号A-1A-2A-3A-4A-5A-6平均值RSD(%)1108051099711011112941108510992110311.44241414079409140674115408840970.65356355615576158615706570257131.574105411054710520105861057410472105400.395131301320613308133771341613452133150.94615921612161116131623162816130.77815831599165916551638160316231.97107247227327387287327290.78128708768638668738808710.73177767767757827837857800.561815731580159015951598160415900.722113301334133513421351135413410.7322150415081493149815031500簡0.352325252524253025352536254325320.2825852腳8698788788888711.542923312335235523662377238623580.943218991892191619171926191719110.68表l-2精密度实验结果(保留时间)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>1.4.2方法重现性取同一批次生脉胶囊内容物6份，分别按供试品制备方法制成供试品溶液，进样分析，结果见表2、图14。结果各峰保留时间RSD小于0.30X，单峰面积大于总峰面积1^的峰峰面积RSD小于4.210/^。以其中一色谱图为标准指纹图谱，其他色谱图与该指纹图谱比较，相似度分别为0.999、0.999、0.998、0.999、0.998，均大于0.998，表明该方法具良好重现性。表2-l重现性实验结果(峰面积)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2266.9967.0466.9766.8866.8266.8166.920.142367.6767.7267.6567.5667.5067.5067.600.132469.9969.9870.0069.9869.9669.9669.980.022570.3270.3170.3370.3270.30YO-30YO-310.022670.9670.9870.9470.8870.84YO.84YO.910.092771.6271.6271.6271.6071.5971.5971.610.022872.7072.6972.7272.7172.7072.7072.700.012976.7876.7676.8076.8076.8176.8176.800.033077.3777.3477.3977.4077.4177.4177.390.033177.7677.7377.7877.7977.8077.8077.780.043279.3579.3279.3979.4179.4379.4279.390.061.4.3样品稳定性取同一生脉胶囊供试品溶液，分别在室温放置0、2、4、8、12、18、24h后进样分析，结果见表3、图15。结果各峰保留时间RSD小于0.34X，单峰面积大于总峰面积1^的峰峰面积RSD小于2.93X。以0时分析所得指纹图谱为对照，其他时间分析所得色谱图与该指纹图谱比较，相似度分别为l.OOO、1.000、1.000、0.999、0.999，均大于O.999，表明生脉胶囊供试品溶液在室温24h内样品稳定性良好。表3-l稳定性实验结果(峰面积)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>1.4.4方法耐用性1.4.4.1同一类型色谱柱间色谱重现性比较用三根同一类型AgilentZorbaxSB-C18(250mmX4.6mmi.d.，5Mm)色i普柱(SN号分别为USCL013112、USCL013107、USCL012253)分析同一批次生脉胶囊样品，结果见图16。以其中一根色谱柱(SN:USCL012253)测定的指纹图谱为参照，计算另二根色谱柱(SN:USCL013112、USCL013107)所得指纹图谱的相似度，结果为0.999、0.971，表明采用同一类型色谱柱分析的指纹图谱重现性良好。1.4.4.2不同仪器间生脉胶囊指纹图谱重现性比较比较3台Agilent1100液相色谱仪记录的同一批生脉胶囊指纹图谱，结果见表4、图17。可以发现，不同仪器测定的指纹图谱整体上相似，但是谱峰保留时间不同，稍有偏差。以其中l台Agilent1100色谱仪为参照，计算同一批生脉胶囊在另2台Agilent1100仪器上所测指纹图谱的相似度，结果为0.945、0.990。这是由不同仪器间流速精度差异、梯度滞后时间不同等因素造成的。但本方法运用于不同仪器所获指纹图谱，谱峰保留时间虽稍有漂移，各色谱峰间分离度影响不大，表明所建立的生脉胶囊色谱指纹图谱方法有良好的耐用性。表4不同仪器间生脉胶囊指纹图谱保留时间比较<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>经过上述研究，容物约lg,精密称定我们采用了如下的供试品溶液的制备方法取生脉胶囊内，加50.0ml甲醇回流提取2h，过滤，精密量取续滤液25.Oml减压浓縮至近干，加甲醇溶解并定容至2.0ml，10000rpm离心10min，上清液备用。经过上述研究，本发明采用了如下的色谱条件色谱柱AgilentZorbaxSB-C18(250mmX4.6醒i.d.，5Mm);流动相水(A)-乙腈(B)，线性梯度洗脱程序Omin2%B，35min35%B，45min40%B，60min55%B，75min100B%，运行90min;流速0.8ml/min;检测波长203nrn;柱温30。C;进样量IO叱。图l生脉胶囊对照指纹图谱图2不同色谱柱对生脉胶囊色谱分离的影响图3检测波长选择图4流动相体系比较图5柱温对生脉胶囊色谱分离的影响图6流速对生脉胶囊色谱分离的影响图7不同梯度条件下所得生脉胶囊色谱图图8UV与ELSD检测的指纹图谱比较图9提取方法的选择回流提取色谱图图IO提取溶剂的选择图ll提取溶剂量的选择图12提取时间的选择图13仪器精密度实验结果图14方法重现性实验结果图15样品稳定性实验结果图16不同批号色谱柱对生脉胶囊指纹图谱影响图17不同仪器对生脉胶囊指纹图谱的影响图18十批次生脉胶囊HPLC指纹图谱图19生脉胶囊和人参药材指纹图谱对照图图20缺人参生脉胶囊和生脉胶囊指纹图谱图21生脉胶囊和麦冬药材指纹图谱对照图图22生脉胶囊与五味子指纹图谱对照图图23连续5批次生脉胶囊指纹图谱对照实验结果具体实施例方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明。实施例l对照指纹图谱的获取及质量稳定性评价；取10批次(批号0505001、0506001、0507001、0509001、0509002、0510001、0511002、0512002、0512003、0602001)生脉胶囊样品，按"A"项下供试品溶液制备方法制成生脉胶囊供试品溶液，按"B"项下色谱条件分析，获取10批次生脉胶囊HPLC指纹图谱(图1S)，以该10批次生脉胶囊平均指纹图谱为对照指纹图谱(图l),分别计算各批次生脉胶囊指纹图谱与对照指纹图谱比较的相似度，结果，各批次生脉胶囊指纹图谱相似度分别为O.995、0.996、0.996、0.989、0.999、0.989、0.987、0.991、0.989、0.981。相似度均大于O.98，结果表明正大青春宝药业有限公司生产的生脉胶囊各批次间质量均一、稳定。(A)供试品溶液的制备方法取生脉胶囊内容物约lg，精密称定，力口50.0ml甲醇回流提取2h，过滤，精密量取续滤液25.0ml减压浓縮至近干，加甲醇溶解并定容至2.Oml，10000rpm离心10min，上清液备用。(B)色谱条件色谱柱AgilentZorbaxSB-C18(250腿X4.6画i.d.，5to);流动相水(A)-乙腈(B)，线性梯度洗脱程序Omin2%B，35min35%B，45min鄉B，60min55%B，75min100B%，运行90min;流速0.8ml/min;检测波长203nm;柱温30°C;进样量10叱。实施例2生脉胶囊指纹图谱与人参药材指纹图谱相关性1.1人参供试品溶液制备精密称取人参粗粉0.4g，照生脉胶囊制备工艺，用75%乙醇浸渍24小时，渗漉，收集渗漉液，减压回收乙醇至近干，6(TC减压干燥成浸膏粉，加0.6g人参粗粉混匀，加50.0ml甲醇回流提取2h，过滤，精密量取续滤液25.0ml减压浓縮至近干，加甲醇溶解并定容至2.0ml，10000rpm离心10min，上清液备用。1.2人参指纹图谱及其与生脉胶囊指纹图谱相关性按实施例l"B"项下色谱条件，精密量取人参供试品溶液10"L，注入液相色谱仪，记录色谱图，与同一色谱条件下获取的生脉胶囊指纹图谱中各色谱峰保留时间和光谱图比较，生脉胶囊指纹图谱中峰6、峰7、峰8、峰9、峰IO、峰ll、峰12、峰13、峰14、峰15、峰16、峰17、峰18、峰19、峰20、峰21、峰22、峰23、峰25、峰27、峰29、峰31、峰32的色谱峰保留时间及光谱图与人参指纹图谱中的色谱峰一致，推测生脉胶囊指纹图谱中该23个色谱峰来源于人参药材(图19)。1.3缺人参生脉胶囊指纹图谱的获取1.3.1缺人参生脉胶囊供试品溶液制备称取麦冬10g、五味子5g分别粉碎成粗粉，将五味子粗粉蒸馏提取，残渣与麦冬加水煎煮二次，滤过，合并滤液，浓縮至适量，加乙醇使含醇量达60%，静置24小时，滤过，减压回收乙醇至近干，6(TC减压干燥成浸膏粉备用。取相当于lg生脉胶囊内容物的上述浸膏粉，精密称定，加50.0ml甲醇回流提取2h，过滤，精密量取续滤液25.Oml减压浓缩至近干，加甲醇溶解并定容至2.0ml，10000rpm离心10min，上清液备用。1.3.2按实施例l"B"项下色谱条件，分别精密吸取生脉胶囊供试品溶液、缺人参生脉胶囊供试品溶液10yL，注入液相色谱仪，记录色谱图，生脉胶囊与缺人参生脉胶囊供试品溶液指纹图谱见图20，由图可见，缺人参生脉胶囊指纹图谱中保留时间在3050min的峰缺失，表明生脉胶囊中保留时间在3050min的峰多数来自人参。实施例3麦冬药材指纹图谱与生脉胶囊指纹图谱相关性1.1麦冬供试品溶液制备称取麦冬2g粉碎成粗粉，按生脉胶囊提取工艺，加水煎煮二次，滤过，合并滤液，浓缩至适量，加乙醇使含醇量达60%，静置24小时，滤过，减压回收乙醇至近干，加50.0ml甲醇回流提取2h，过滤，精密量取续滤液25.Oml减压浓縮至近干，加甲醇溶解并定容至2.0ml，10000rpm离心10min，上清液备用。1.2麦冬指纹图谱及其与生脉胶囊指纹图谱相关性按实施例l"B"项下色谱条件，精密量取麦冬供试品溶液10uL，注入液相色谱仪，记录色谱图，与同一色谱条件下获取的生脉胶囊指纹图谱中各色谱峰保留时间和光谱图比较，生脉胶囊指纹图谱中保留时间为28.Omin的色谱峰保留时间及光谱图与麦冬指纹图谱中的色谱峰一致，推测生脉胶囊指纹图谱中该色谱峰来源于麦冬药材(图21)。实施例4生脉胶囊指纹图谱与五味子药材指纹图谱相关性1.1五味子供试品溶液制备精密称取五味子粗粉lg，加水煎煮三次，滤过，合并滤液，浓縮至适量，加乙醇使含醇量达60%，静置24小时，滤过，减压回收乙醇至近干，加50.0ml甲醇回流提取2h,过滤，精密量取续滤液25.Oml减压浓縮至近干，加甲醇溶解并定容至2.0ml，10000rpm离心10min，上清液备用。1.2五味子指纹图谱及其与生脉胶囊指纹图谱相关性按实施例l"B"项下色谱条件，精密量取五味子供试品溶液10uL，注入液相色谱仪，记录色谱图，与同一色谱条件下获取的生脉胶囊指纹图谱中各色谱峰保留时间和光谱图比较，生脉胶囊指纹图谱中峰l、峰4、峰24、的色谱峰保留时间及光谱图与五味子指纹图谱中的色谱峰一致，推测生脉胶囊指纹图谱中该3个色谱峰来源于五味子药材(图22)。^ML匕不同时期5个批次的生脉胶囊指纹图谱对照实验取连续生产的生脉胶囊5批(正大青春宝药业有限公司生产，批号0602003、0602004、0603001、0603002、0603003)，分别按实施例l"A"项下供试品制备方法制成供试品溶液，按实施例l"B"项下色谱条件，进样分析，结果见图23。该图中线l为对照指纹图谱，线2-6依次为批号0602003、0602004、0603001、0603002、0603003。各批次色谱图与对照指纹图谱比较，经计算相似度分别为0.999、0.998、0.999、0,999、0.998，均大于O.99，表明连续生产的生脉胶囊质量均一、稳定，说明该生脉胶囊的质量控制方法方便有效。本发明所要求保护的具体技术方案，不限于上述实施例所表达的技术方案的具体组合。权利要求1、一种生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用。包括将生脉胶囊样品用溶剂提取制备样品的供试液，在一定的色谱条件下测试供试液指纹图谱，供试液指纹图谱与对照指纹图谱经计算机辅助相似度评价软件计算指纹图谱的相似度，获得相似度数值，依据指纹图谱相似度应大于0.90作为质控标准来控制生脉胶囊的质量。2、权利要求l所述的生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用，所述的供试液的制备方法，包含如下步骤取生脉胶囊内容物约lg，精密称定，加50.0ml甲醇回流提取2h，过滤，精密量取续滤液25.0ml减压浓縮至近干，加甲醇溶解并定容至2、Oral,10000rpm离心10min，上清液供测试备用。3、权利要求l所述的生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用，所述的一定的色谱条件，包括如下因素色谱柱；流动相；线性梯度洗脱程序；柱温30°C;流速为0.8ml/min;紫外检测器检测；检测波长为203nm;进样量10ML;运行90min。4、权利要求3所述的生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用，所述的一定的色谱条件中的色谱柱选用的是C18柱。5、权利要求4所述的生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用，所述的一定的色谱条件中的色谱柱，指的是AgilentZorbaxSB-C18、XDB-C18或InertsilODS-3其中的一种。6、权利要求5所述的生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用，所述的一定的色谱条件中的色谱柱，指的是AgilentZorbaxSB-C18。7、权利要求3所述的生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用，所述的一定的色谱条件中的流动相，指的是乙腈(B相)一水(A相)体系或乙腈(B相)一0.03%磷酸水(A相)体系。8、权利要求7所述的生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用，所述的一定的色谱条件中的流动相，指的是乙腈(B相)一水(A相)体系。9、权利要求3所述的生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用，所述的一定的色谱条件中的线性梯度洗脱程序，具体条件如下流动相水(A)-乙腈(B)，0min2%B，35min35%B，45min40%B，60min55%B，75min10(FoB。10、权利要求1或3所述的生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用，所述的一定的色谱条件如下色谱柱AgilentZorbaxSB-C18(250鹏X4.6mmi.d.，5Mm);流动相水(A)-乙腈(B)，线性梯度洗脱程序0min2%B，35min35%B，45min40%B,60min55%B，75min100%B，运行90min;流速0.8ml/min;检测波长203nm;柱温30°C;进样量10叱。11、权利要求10所述的生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用，所述的对照指纹图谱的获取方法为取10批次生脉胶囊样品，按权利要求2所述方法制备供试品溶液，按一定的色谱条件分析，获取IO批次生脉胶囊HPLC指纹图谱，以该IO批次生脉胶囊平均指纹图谱为对照指纹图谱。12、权利要求ll所述的生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用，所述的对照指纹图谱具有32个特征峰，图谱总长度为90min。13、权利要求12所述的生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用，所述的对照指纹图谱具有32个特征峰，其中峰6、峰7、峰8、峰9、峰IO、峰ll、峰12、峰13、峰14、峰15、峰16、峰17、峰18、峰19、峰20、峰21、峰22、峰23、峰25、峰27、峰29、峰31、峰32该23个色谱峰归属于人参药材。14、权利要求12所述的生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用，所述的对照指纹图谱具有32个特征峰，其中峰l、峰4、峰24该3个色谱峰归属于五味子药材。15、权利要求12所述的生脉胶囊指纹图谱检测技术的应用，所述的对照指纹图谱中保留时间为28.Omin的色谱峰来源于麦冬药材。全文摘要本发明涉及一种中药复方制剂生脉胶囊的指纹图谱检测技术及其在生脉胶囊生产质量控制中的应用。包括将生脉胶囊样品用溶剂提取制备样品的供试液，在一定的色谱条件下测试供试液液相色谱指纹图谱，利用计算机辅助相似度评价软件计算生脉胶囊供试液指纹图谱的相似度，依据指纹图谱相似度应大于0.90，从而达到控制生脉胶囊药品质量的目的。实验证明，本发明的指纹图谱检测技术对生脉胶囊的生产能起到很好的质量控制作用，是一种评价中药复方制剂生产质量的关键技术。文档编号G01N33/15GK101101280SQ20071006990公开日2008年1月9日申请日期2007年7月10日优先权日2007年7月10日发明者凌益平,张建兵,柴建国,沈培强,许振宇,黎豫杭申请人:正大青春宝药业有限公司