专利名称：水体中微囊藻毒素的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种能快速灵敏检测水体中微囊藻毒素(MC)的检测方法，用于自然环 境中水体、饮用水中微囊藻毒素含量的检测。
背景技术：
日趋严重的水体富营养化使水体污染成为全球性的环境问题，蓝绿藻是我国多数淡水 湖泊中形成水华的优势藻种，这些藻类可产生具有明显肝毒性的肽类物质，称为微囊藻毒 素。其毒性在自然界已知的毒素中排名第二，仅次于二恶英。微囊藻毒素有多种不同的异 构体，其中MC—LR是目前已知的毒性最强、急性危害最大的一种淡水蓝藻毒素。
水体中微囊藻毒素的检测方法主要有生物分析法、化学分析法、生化分析法以及免疫
分析法等。生物分析法是利用小鼠腹腔注射或口腔灌喂评价微囊藻毒素的毒性，该法操作 简单，但灵敏度较差，且无法确定毒素类型及结构；化学分析法是目前应用最多的方法， 主要包括气相色谱(GC)、薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱/质谱分 析(LC/MS)及毛细管电泳(CE)等，此类方法有良好的灵敏度和选择性，但仪器体积庞 大、价格昂贵、需要环境条件较高的室内环境，以及专门的技术人员操作，检测费用昂贵； 生化分析法，主要包括酶活性抑制检测技术，其原理是利用微囊藻毒素对蛋白憐酸酶活性 的抑制程度通过比色法检测，此法灵敏度太低，且存在内源性酶的干扰。免疫分析法是美 国国家环保局优先推选的检测微囊藻毒素的方法，最常用的是竞争性非匀相酶联免疫检测 法，该法操作简单，但反应时间长，不能定量，灵敏度偏低，不能现场检测结果。
发明内容
本发明的目的在于克服上述各方法的不足，提供一种基于纳米磁免疫技术的、灵敏度 高、反应时间短、仪器设备便宜、可用于现场检测水体中微囊藻类毒素的检测方法。 本发明的目的通过如下技术方案完成
1) 微囊藻毒素全抗原的合成及鉴定以戊二醛作为双功能交联试剂，按常规方法分 别将BSA、 KLH与藻毒素MC—LR进行偶联，得到微囊藻毒素的全抗原MC—LR—BSA 以及MC—LR—KLH，并利用紫外分光光度计进行鉴定；
2) 多克隆抗体的制备与纯化以MC—LR""KLH作为免疫原，免疫新西兰兔，按常 规方法制备多克隆抗体并以硫酸铵纯化；得到兔抗MC—LR—KLH的IgG。
3) 免疫磁珠的制备将MC—LR—BSA与纳米磁珠偶联，制备含MC—LR—BSA的 免疫磁珠；具体方法是吸取适量磁珠至小试管中，置于磁场中使磁珠与贮存液分离，MES 清洗缓冲液清洗并重悬磁珠，将尽可能小体积的碳化二亚胺(EDC)和N—羟基琥珀酰亚 胺(NHS)加入磁珠溶液中，使EDC与NHS的分子比为1: 1 1: 3，并使之分子数量为 磁珠表面羧基的5 19倍，37'C震荡孵育1小时，分别用MES清洗缓冲液及硼酸清洗缓 冲液清洗磁珠，随后将适量MC—LR—BSA加入至磁珠悬液中，使蛋白质在磁珠中达到一 定浓度，37'C震荡孵育1小时，用硼酸清洗缓冲液清洗磁珠，将磁珠转移至新管，弃掉硼 酸清洗缓冲液，并用偶联缓冲液重悬浮，用定量加样装置将已经标记有MC—LR—BSA抗 原的磁珠加入磁珠偶联垫；
4) 包埋抗体至硝酸纤维素膜用喷膜仪将准备包被的目的抗体载于硝酸纤维素膜上， 使目的抗体达到一定量，与磁标抗原之间的反应达到最佳，室温干燥。用3%牛血清蛋白 一磷酸缓冲液(BSA—PBS)，室温封闭60分钟；用0.01%十二烷基硫酸钠一磷酸缓冲液
(SDS—PBS)洗涤15分钟，共三次，室温干燥后，保存于4一2(TC。
5) 检测测试板的制作分别将磁标MC—LR—BSA的偶联垫、包埋多克隆抗体的硝 酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、覆盖膜、测试板外卡组成测试板(此装置与金标装置相 似)。
6) 样品检测将不同浓度的标准品以及检测样品加入测试板上样孔，样品通过层析 作用从试纸条上流过，室温下反应3 5分钟以后，将测试板放入磁信号检测仪进行检测， 并且此检测仪器可以将已经转化成磁场信号的生物学反应信号进一步以电信号的方式输 出；绘制标准曲线后，依据标准曲线求出待测样品内微囊藻毒素含量的具体值。
本发明是基于一种纳米磁免疫技术进行水体中微囊藻类毒素的检测方法、它具有灵敏 度高、反应时间短、仪器设备便宜、可用于现场检测等特点。
图1是本发明所述的检测方法工艺流程框图。
图2是本发明所用测试板结构示意图。
图3是本发明的MC-LR的浓度为0. OOlppb测试结果图。
图4是本发明的MC-LR的浓度为0. lppb测试结果图。
图5是本发明的MC-LR的浓度为lppb测试结果图。
图6是本发明的MC-LR的浓度为50ppb测试结果图。
图7是本发明当MC-LR的浓度为0. 001-50 ppb时磁信号强度的标准曲线图。
具体实施例方式
下面将结合附图及具体实施例对本发明作详细的介绍如图1所示，本发明所述的水 体中微囊藻类毒素的检测方法是
1) 微囊藻毒素全抗原的合成及鉴定以戊二醛作为双功能交联试剂，按常规方法分 别将BSA、 KLH与藻毒素MC—LR进行偶联，得到微囊藻毒素的全抗原MC—LR—BSA 以及MC—LR—KLH，并利用紫外分光光度计进行鉴定；波谱扫描显示MC-LR-BSA与0. 2% BSA相比，吸收峰发生蓝移现象，说明我们己有的材料中，MC-LR与BSA巳经偶联。
2) 多克隆抗体的制备与纯化以MC—LR—KLH作为免疫原，免疫新西兰兔，按常 规方法制备多克隆抗体并以硫酸铵纯化；SDS-PAGE电泳结果显示具备抗体特异性条带。
3) 免疫磁珠的制备将MC—LR—BSA与纳米磁珠偶联，制备含MC—LR—BSA的 免疫磁珠。具体方法吸取20微升磁珠至小试管中，置于磁场中使磁珠与贮存液分离， 用40微升MES清洗缓冲液清洗磁珠两次，重悬浮磁珠于20微升MES清洗缓冲液中。分 别将60微克左右的碳化二亚胺(EDC)和80微克左右N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入至 磁珠溶液中，37'C震荡孵育1小时。随后分别用40微升MES清洗缓冲液清洗磁珠两次， 用20微升硼酸清洗缓冲液清洗磁珠两次后，重悬浮磁珠于20微升硼酸清洗缓冲液中。将 5微升左右的MC-LR-BSA (8毫克/毫升)加入至磁珠悬液中，37"震荡孵育3小时；再加 入3微升的10%牛血清白蛋白封闭液，37'C震荡孵育1小时；用20微升硼酸清洗缓冲液 清洗磁珠两次，并将磁珠转移至新管中；弃掉硼酸清洗缓冲液，用15微升偶联缓冲液重 悬浮磁珠；用定量加样装置将己经标记有MC-LR-BSA抗原的磁珠加入磁珠偶联垫。
4) 包埋抗体至硝酸纤维素膜用喷膜仪将准备包被的目的抗体载于硝酸纤维素膜上， 使目的抗体达到一定量，室温下干燥。用3%牛血清蛋白一磷酸缓冲液(BSA—PBS)，室 温封闭60分钟；用0.01%十二烷基硫酸钠一磷酸缓冲液(SDS—PBS)洗涤15分钟，共三 次，室温干燥后，保存于4—2(TC。
5) 检测测试板的制作将磁标MC—LR—BSA的偶联垫、包埋多克隆抗体的硝酸纤 维素膜、样品垫、吸水垫、覆盖膜、测试板外卡组成测试板(此装置与金标装置相似)。
6) 样品检测将不同浓度的标准品以及检测样品加入测试板上样孔，样品通过层析 作用从试纸条上流过，室温下反应3—5分钟后，将测试板放入磁信号检测仪进行检测，
并且此检测仪器可以将已经转化成磁场信号的生物学反应信号进一步以电信号方式输出； 绘制标准曲线后，依据标准曲线求出待测样品的具体值。
纯净水样品检测其具体检测结果与0. OOlppb基本一致，具体如图3所示。
不同浓度MC-LR标准参考品检测具体如图3、 4， 5， 6所示。
待测样品检测用明确的阴性样品以及不同浓度的阳性样本进行测试，测试线的峰值 高低与阳性样品的浓度呈现一定的相关性，具体如图7。分别取太湖不同水域的水体样本 进行测试，明显可以看出在2007年5-6月份的太湖水样存在严重的污染。而且出水口的水 质稍好于进水口。
本发明的其它实施例在上述范围内可以任意选择，并且本领域的技术人员在了解本发 明内容的基础上，结合现有公开的技术，如专利公报等，能够充分实施本发明。
权利要求
1、一种水体中微囊藻毒素的检测方法，该方法是1)微囊藻毒素全抗原的合成及鉴定以戊二醛作为双功能交联试剂，按常规方法分别将BSA、KLH与藻毒素MC-LR进行偶联，得到微囊藻毒素的全抗原MC-LR-BSA以及MC-LR-KLH，并利用紫外分光光度计进行鉴定；2)多克隆抗体的制备与纯化以MC-LR-KLH作为免疫原，免疫新西兰兔，按常规方法制备多克隆抗体并以硫酸铵纯化；3)免疫磁珠的制备将MC-LR-BSA与纳米磁珠偶联，制备含MC-LR-BSA的免疫磁珠；4)包埋抗体至硝酸纤维素膜用喷膜仪将准备包被的目的抗体载于硝酸纤维素膜上，使目的抗体达到一定量，室温下干燥；用3％牛血清蛋白-磷酸缓冲液(BSA-PBS)，室温封闭60分钟；用0.01％十二烷基硫酸钠-磷酸缓冲液(SDS-PBS)洗涤15分钟，共三次，室温干燥后，保存于4～20℃；5)检测测试板的制作将磁标MC-LR-BSA的偶联垫、包埋多克隆抗体的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、覆盖膜、测试板外卡组成测试板；6)样品检测将不同浓度的标准品以及检测样品加入测试板上样孔，样品通过层析作用从试纸条上流过，室温下反应3～5分钟后，将测试板放入磁信号检测仪进行检测，并且此检测仪器可以将已经转化成磁场信号的生物学反应信号进一步以电信号方式输出；绘制标准曲线后，依据标准曲线求出待测样品的具体值。
2、 根据权利要求1所述的体中微囊藻类毒素的检测方法，其特征在于所述的免疫磁 珠的制备是吸取20微升磁珠至小试管中，置于磁场中使磁珠与贮存液分离，用40微升 MES清洗缓冲液清洗磁珠两次，重悬浮磁珠于20微升MES清洗缓冲液中；分别将60微克 左右的碳化二亚胺(EDC)和81微克N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入至磁珠溶液中，37°C 震荡孵育1小时。随后分别用40微升MES清洗缓冲液清洗磁珠两次，用20微升硼酸清洗 缓冲液清洗磁珠两次后，重悬浮磁珠于20微升硼酸清洗缓冲液中；将5微升左右的 MC-LR-BSA (8毫克/毫升)加入至磁珠悬液中，37。C震荡孵育3小时；再加入3微升的10% 牛血清白蛋白封闭液，37'C震荡孵育1小时；用20微升硼酸清洗缓冲液清洗磁珠两次， 并将磁珠转移至新管中；弃掉硼酸清洗缓冲液，用30微升偶联缓冲液重悬浮磁珠；用定 量加样装置将巳经标记有MC-LR-BSA抗原的磁珠加入磁珠偶联垫。
全文摘要
一种水体中微囊藻毒素的检测方法，它是1)微囊藻毒素全抗原的合成及鉴定；2)多克隆抗体的制备与纯化以微囊藻毒素全抗原MC-LR-KLH作为免疫原，免疫新西兰兔，按常规方法制备多克隆抗体并以硫酸铵纯化；3)免疫磁珠的制备，将微囊藻毒素全抗原MC-LR-BSA与纳米磁珠偶联，制备含MC-LR-BSA的免疫磁珠；4)包埋抗体至硝酸纤维素膜；5)检测测试板的制作，将磁标MC-LR-BSA的偶联垫、包埋多克隆抗体的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、覆盖膜、测试板外卡组成测试板；6)样品检测，将不同浓度的标准品以及检测样品分别加入测试板上样孔，样品通过层析作用从试纸条上流过，室温下反应3-5分钟以后，将测试板放入磁信号检测仪进行检测，并且此检测仪器可以将已经转化成磁场信号的生物学反应信号进一步以电信号的方式输出；绘制标准曲线后，依据标准曲线求出待测样品微囊藻毒素含量的具体值。
文档编号G01N33/544GK101169414SQ20071007027
公开日2008年4月30日 申请日期2007年8月9日 优先权日2007年8月9日
发明者孟凡国, 李海龙, 王叶菁, 胡卫江 申请人:嘉兴博泰生物科技发展有限公司