细胞电生理集成芯片和制作方法

专利名称：细胞电生理集成芯片和制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞生理学，细胞传感器以及集成芯片技术，具体涉及一 种细胞电生理集成芯片和制作方法。
背景技术：
传统的神经电生理检测基本采用微电极进行细胞内记录，或者应用膜
片钳(patch clamp)技术，将内装电极的玻璃毛细管紧贴于细胞膜，在吸 破细胞膜后进行全细胞记录。微电极和膜片钳所存在的问题主要在于用 微电极刺入细胞或者钳制细胞，都会对细胞造成一定的损害，并导致细胞 在很短的时间内死亡，限制了对动作电位以及离子通道电流记录的实时检 测；同时，可供选择采集信号的细胞数较少，并且难以确定突触的确切位 置，所记录到的信号难以具有代表性；另外，由于技术上的限制，膜片钳 技术目前仍难以实现对多个神经元进行同步测量。胞外信号检测方法由于 可以实现无损，长时程的测量而受到越来越多的关注，但是，在进行细胞 生理实验时，对单一参数的监测往往只能从某一方面反映出细胞的生理活 动，而测试环境的复杂性(各种噪声源、长期测试后培养液对电极的腐蚀 等)会干扰测试的结果，所以对细胞生理活动的机理的揭示则需要同时对 多种相关的生理参数进行综合分析才能完成。目前，现有仪器或器件功能 单一，指标不够稳定(信噪比较低，参考对照方法较少)，且不能实现多 参数同时检测，成为快速细胞生理分析发展的瓶颈。

发明内容
本发明的目的是提供一种细胞电生理集成芯片和制作方法，将细胞生 化参数和电生理参数检测集成于一体，克服细胞生理参数的同时测试的难题。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下
1、 一种细胞电生理集成芯片 在Si基底正面中间集成MEA微电极阵列，在MEA微电极阵列两侧分别 集成IDA叉指电极和LAPS光寻址电位传感器，在MEA微电极阵列另外 两侧分另ij对称设置参考电极。
所述的IDA叉指电极为梳状的叉指电极对，单个叉指电极中间为暴
露出的Au电极以及下面Cr黏附层，周围高出部分为Si02或Si3N4绝缘 保护层，下面依次分别为SiCb层和Si基底。
所述的MEA微电极阵列为6排正方形电极孔阵列，单个微电极结构 与前所述IDA叉指电极的单个叉指电极结构相同。
所述的LAPS光寻址电位传感器结构分为4层，依次分别为Si3N4层， SiCb层，Si基底以及Al层。
2、 一种细胞电生理集成芯片的制作方法
MEA微电极阵列制备过程为采用标准半导体制作工艺，先溅射 300nm的Au到硅片基底上，再采用剥离技术形成Au电极，为了和绝缘 层贴合需加一层30nm的Ti、 Cr或Ni层，最后做Si3N4或聚酰亚胺绝缘 保护层，并蚀刻出电极孔；
IDA叉指电极制备过程为采用多层光刻工艺加工电极，电极表面 的叉指对为暴露出的Au电极，引线部分除了焊盘外均覆盖由等离子体气 相沉积技术形成的Si02的绝缘层，并刻蚀出有效细胞贴附区；
LAPS光寻址电位传感器制备过程为在Si基片上采用深法刻蚀技 术将LAPS区域的氧化层干法刻蚀掉，然后采用等离子体气相沉积技术先 后生长一层Si02层和Si3N4层；将基底Si基片背面的氧化层用HF溶液 腐蚀掉，正面用光刻胶进行保护；然后在硅片背面溅射一层Al层作欧姆 接触，完成集成芯片LAPS光寻址电位传感器的制作；
参考电极制备过程为采用标准半导体制作工艺，先溅射300nm的 Au到硅片基底上，再采用剥离技术形成金电极，为了和绝缘层贴合需加 -一层30nm的Ti、 Cr或Ni层，最后做Si3N4或聚酰亚胺绝缘保护层，并 蚀刻出参考电极。
在集成芯片上分别集成了微电极阵列传感器(microelectrode array, MEA)，光寻址电位传感器(light-addressable potentiometric sensor,LAPS) 和叉指型细胞-阻抗传感器(interdigital sensor, IDA)三种传感器。集成 芯片各部分同时工作，通过表面处理在集成芯片上培养了心肌细胞、嗅觉 细胞等具有电生理活性的细胞，配合流动注射技术连续监测细胞从正常生 理状态到药物剌激下的形态变化、动作电位以及代谢物质的改变。
本发明具有的有益效果是 本集成芯片能同时检测细胞在器件上的贴壁生长状态，动作电位及细胞新 陈代谢产物中多种离子的浓度，用于实现多参数的同时并行检测，解决了
集成细胞传感器芯片设计、加工的核心技术难题，为集成化细胞传感器技
术的便携化及仪器化发展拓展了新的应用领域。


图1是本发明的集成芯片装配图2是本发明的集成芯片的结构图3是本发明的MEA和IDA芯片的剖面结构图4是本发明的LAPS芯片的剖面结构图5是本发明的系统连接示意图6是本发明的微电极阵列(直径30)im)在PBS溶液中的器件稳定 性测试图7是本发明的微电极器件没有细胞耦合的电极噪声输出；
图8是本发明的微电极器件培养心肌细胞后，在药物作用下的响应信
号；
图9是本发明的IDA电极与细胞的耦合示意图； 图IO是本发明的贴有肾细胞的器件随时间的阻抗相对变化率图； 图11是本发明的p型Si3N4 LAPS器件于不同pH溶液下的i-V特性 曲线；
图12是本发明的p型Si3N4 LAPS器件于不同pH溶液下的pH值和 偏压的对应变化曲线；
图13是本发明的p型Si3N4LAPS片测试的3种pH溶液在6个不同 频率下测试的I-V曲线的灵敏度。
图中1、 PCB底座，2、集成芯片，2.1、 IDA叉指电极，2丄1、 Si 基底，2.1.2、 Si02， 2.1.3、 Si02或Si3N4绝缘保护层，2,1.4、 Cr黏附层， 2.1.5、 Au电极，2.2、 MEA微电极阵列，2.3、 LAPS光寻址电位传感器， 2.3.1、 Al层，2.3.2、 Si02层，2.3.3、 SisN4层，2.4、参考电极，3、腔体 槽，4、密封盖。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
如图2所示，本发明是在Si基底2正面中间集成MEA微电极阵列 2.2，在MEA微电极阵列2.2两侧分别集成IDA叉指电极2.1和LAPS光 寻址电位传感器2.3，在MEA微电极阵列2.2另外两侧分别对称设置参考 电极2.4。
如图3所示，所述的叉指电极2.1为梳状的叉指电极对，单个叉指电
极中间为暴露出的Au电极2丄5以及下面Cr黏附层2丄4，周围高出部 分为Si02或Si3N4绝缘保护层2.1.3,下面依次分别为Si02层2丄2和Si 基底2.1.1。
如图2所示，所述的ME A微电极阵列2.2为6排正方形电极孔阵列， 单个微电极结构与前所述IDA叉指电极2.1的单个叉指电极结构相同。 如图4所示，所述的LAPS光寻址电位传感器2.3结构分为4层，依次分 别为SigN4层2.3.3， Si02层2.3.2， Si基底2.1.1以及Al层2.3.1 。
l.芯片制备
(l)MEA微电极阵列器件的制备
MEA器件设计成6排等间距阵列，过多的电极将造成引线困难和干扰的 增大，寄生效应的增加，以及多路并行分析技术的复杂性。间距设置应该 既能监测细胞网络，又不对周围细胞起到干扰作用。电极边长分别为 70)im， 50(im和30^im，适用于各种尺度的细胞培养。同时，不同的电极 直径易于进行电学特性仿真，判断几何尺寸对于细胞动作电位和电生理的 影响。在制作过程中，本方法采用标准半导体制作工艺，步骤简述为溅 射300nm的Au到硅基底上，采用剥离技术形成金电极，为了和绝缘层贴 合需加一层30nm的Ti、 Cr或Ni。最后做Si3N4或聚酰亚胺等绝缘保护 层，并蚀刻出电极孔。
(2) IDA叉指电极器件的制备 叉指电极对的数量选择中，如果叉指电极对数量过少，则自身的体阻 抗较大，且大大降低了细胞与其贴附的概率；如果叉指电极对数量过多， 虽然体阻抗会降低，且增大了电极与细胞接触的有效面积，但由于电极并 联的关系，检测灵敏度也会相应降低。电极的宽度应与细胞尺度相近，且 叉指对选择的数目合适，总体设计原则是在保证器件较小体阻抗的情况下 提高测试的精度。叉指电极的基底一般为玻璃或硅基底。在本方法中，为 了考虑多个传感单元的集成芯片并行设计，采用了硅基底。目前，IDA 的有效电极区面积为4 25mn^左右，本方法设计的有效电极面积为8.4 mm2。其中，单个叉指电极的宽度和间距均为50pm，长度为7mm，所加 工的IDA电极由12对微带电极组成。采用多层光刻工艺加工电极时，电 极表面的叉指对为暴露出的金电极，引线部分除了焊盘外均覆盖了 Si02 绝缘层，同时暴露出面积为8.4mr^的有效细胞贴附区。(3) LAPS光寻址电位传感器器件的制备 集成芯片上的LAPS光寻址电位传感器制备工艺歩骤为(l)在基片上光刻出LAPS区域；(2)由于在制作MEA与IDA单元时采用PECVD沉积了 500nm 厚的Si02层，所以LAPS单元需要将该部分氧化层去除，采用深法刻蚀技术将 该部分氧化层干法刻蚀掉。(3)在LAPS区域采用等离子气相沉积先后生长一层 30nm的Si02层和60nm的SisN4层；(4)将基底硅片背面的氧化层用HF溶液腐 蚀掉，正面用光刻胶进行保护，避免将正面图形破坏；然后在硅片背面溅射一 层0.2)im厚的A1层作欧姆接触，完成LAPS光寻址电位传感器的制作。在集 成芯片2完成制作后，将其粘在制作好的PCB底座1上，然后将腔体槽3盖 在集成芯片2上，暴露出三个传感器测量区域，最后加上密封盖4，完成装配， 如图1所示。芯片测试系统的连接示意图如图5所示。 2.集成芯片测试(1) .使用聚丙二甲基硅氧垸(PDMS)膜将各单元分隔，单元间通过 宽度100pm的微通道相连，并用密封垫圈等形成密封细胞测试腔，在芯 片上培养具有电活性的细胞，并将培养液和药物按顺序流过测试单元。培 养液或药物首先流过IDA单元，通过电阻抗测试细胞在培养液或药物环 境下的生长状况，然后流入中间的MEA区域，进行细胞动作电位的检测； 最后进入LAPS区域进行代谢产物中各种离子的浓度变化检测，通过检测 细胞在器件上的贴壁生长状态，动作电位以及细胞新陈代谢产物中多种离 子的浓度，用于实现多参数的同时并行检测。(2) .选材心肌细胞实验取1 3天龄的小鼠，用70%乙醇消毒。剪 开胸壁，取心室肌。用PBS冲洗三次。将心室肌剪成lmn^左右的小块。 消化、离心后，用培养液悬浮沉淀细胞，调整细胞浓度至5xl()S个/ml， 接种到集成芯片表面的培养腔中。根据细胞生长情况，每隔2 3天换液 一次。(3) .选材嗅觉细胞将新生乳鼠剪取鼠头，取下嗅球，置于PBS液中， 在解剖显微镜下剥离被膜并剪成1 mmS左右的组织块，在0.25%胰蛋白 酶3 7 t:中消化并于2 ml加有浓度为10 ng/1 NGF的DMEM培养液吹打成 细胞悬液，接种于集成芯片表面的培养腔中，培养第3天滴加5-FU以抑 制胶质细胞生长。培养7天后可进行检测。(4) .为了促使细胞和器件的贴合，本方法采用的表面处理过程简述如 下室温下将器件浸入含有100吗/ml的多聚鸟氨酸的磷酸盐缓冲液中
24h。冲洗后，再浸入含有8ng/ml层粘素的磷酸盐缓冲液中24h， 37°C， 5%(302环境下。这层膜 4nm，因为多聚鸟氨酸和层粘素含有正电荷而 使心肌细胞等细胞粘附在器件上，同时还防止了硅片上Si02的水合。(:5).MEA器件特性测试 为了测试每个系统中通道是否工作良好，将MEA器件的培养腔内注入pH =7.3的PBS溶液，以直径O.lmm的螺旋状铂丝作为对电极接地，选用 MEA器件上一排直径均为3(Him的8个电极阵列，并行接入到8通道放 大器上。将器件浸浴在PBS溶液中，连续浸泡2d，观察器件在PBS溶液 的连续浸泡下，输出的噪声变化情况。可以看出，在6h测量范围内，各 通道的输入噪声变化幅度不大可以看出每个通道的噪声幅度波动不是很 大,基本保持在一定范围内，说明了系统8通道噪声的量级大致相同(图 6)。(6).MEA细胞动作电位测试 MEA器件经表面处理后，可培养上团状的心肌细胞。为了初步验证基于 MEA的细胞芯片的可行性，我们选用PBS液配制10吗/ml的去甲肾上腺 素(NE)，作为细胞的刺激底物。鉴于去甲肾上腺素可以引起心肌兴奋性， 所以被选为心肌细胞的兴奋性刺激底物，用以检测MEA细胞芯片的敏感 性。将细胞在芯片上培养2d后，用显微镜观察有细胞生长的电极并进行 编号。将未加入药物的培养液泵入细胞培养测试腔，根据电极编号进行多 通道测试。在无细胞耦合的电极上，主要为一些环境噪声和系统噪声输出， 该记录信号可以看作是测试基线，如图7中波形。泵入NE后，耦合有心肌细胞的电极得到如图8波形所示的电位信号 改变即出现幅度大约为30 40 |dV的峰值改变，在ls内出现2 3次搏 动，动作电位时程为200ms左右，细胞自发放电明显。由于其余通道没 有耦合上细胞，均为噪声信号，所以不作记录。对记录得到的单个波形进 行分析得出，所测得信号有上升峰和下降峰，复极化时间较长。上升峰占 整个信号幅度的10% 30%左右，负向峰持续时间为100ms左右。该信 号与经典的膜片钳测量的波形不同，这主要与细胞一器件耦合情况、刺激、 细胞类型有很大关系。根据这种差异，有研究者针对记录胞外电生理芯片 的特点已采集了大量数据进行统计分析，认为胞外信号在芯片上测得的较 长复极化时间可能是由于测量过程中的心肌细胞胞外C^+浓度的缓慢增
强以及细胞一芯片间的耦合层电容的逐渐放电过程所共同造成的。从研究结果得出，心肌细胞对于药物的刺激响应表现在细胞放电频率 和幅度的改变，肾上腺素会影响细胞放电过程，这个结果同膜片钳电生理研究的诸多结果吻合，进一步验证了 MEA细胞芯片应用于细胞电生理研究的可行性。(7) .IDA器件细胞贴壁性测试为测试在细胞贴壁培养后的细胞一阻抗变化影响，我们将肾细胞培养在叉 指电极上。由于肾细胞属于贴壁性、繁殖力较强的细胞，在叉指电极上未进行表面处理，直接进行培养。经2d培养后，肾细胞在叉指电极上生长 情况良好，细胞与器件的耦合示意图如图9所示。5-氟尿嘧啶(5-Fluororacil)是一种抗癌药物，具有较强细胞毒性作 用，尤其会影响细胞自身新陈代谢，如糖代谢、氧代谢等。为了测试肾细 胞在给药或物理性的伤害下细胞贴壁程度对阻抗的影响，本实验在器件上 培养了肾细胞后，采用了浓度为100pg/mL的5-氟尿嘧啶注射液作用于培 养了肾细胞的多个叉指电极上，连续观察系统的输出阻抗值随时间的变化 曲线。将培养2d的肾细胞从培养箱中取出后，分别选择工作频率于6kHz、 8kHz、 10kHz进行测试。对肾细胞在药物刺激前，首先于室温下(20°C) 静置lh后进行扫频阻抗测试；然后再隔lh加入100吗/mL的5-氟尿嘧啶， 间隔lh进行扫频阻抗测试，得到如图IO的时间一阻抗平均相对变化率曲 线(n二5)。在曲线中，可以看出细胞于静置状态下lh内阻抗的相对变 化率在6% 8%左右，说明温度及C02等因素对细胞的贴壁性影响是较 大的，而在加药后的lh内在lOkHz下的阻抗相对变化率最大，达到8% 左右，这可能是由于细胞在药物毒性的作用下凋亡或漂浮在溶液中造成 的，在后2h内阻抗变化率在4%左右，阻抗变化已不太明显，而在显微 镜下镜检时，这些细胞也从透明鼓起状变为皱縮状，说明药物对细胞毒性 是较强的，在本实验中所引起的阻抗变化率范围在12% 16%左右，且 10kHz是较好的工作点频率。由于目前实验结果只是初步的测试，应进一 步将实验结果定量化。当然，从以上实验结果可看出，基于IDA的ECIS 阻抗器件作为一种评价细胞生理状态的器件是具有显著意义的。(8) . LAPS器件的测试:为了对LAPS的H标准曲线进行测试，我们取p型Si3N4片LAPS测量四
种不同pH的标准溶液的I-V曲线(pH6 pH9)，如图11所示。将这四条S形 特征曲线的下降沿用最小二乘法对其进行线性回归，可得出LAPS的线性工作 区为-1.5V 0.5V，取归一化后的斜率在0.5处的点进行测试比较，发现传感器 的灵敏度S为50.65mV/pH，即溶液pH变化一个单位，若光生电压(电流) 要保持不变，偏置电压需变化50.65mV。 pH的改变量和偏压的对应线性曲线 如图12所示，线性度为0.9978，有良好的响应曲线。由于整个线性区的范围 大于700mV，所以可以测试14个pH变化范围。在测量药物的酸化率时，应 固定偏置电压在工作点，则当光生电压上升50.65mV， pH减少一个单位。为直观地比较在不同光源频率下，LAPS上检测不同pH值溶液的灵敏度， 本设计将3种pH溶液于6个频率下测试同一 LAPS的响应曲线灵敏度用柱状 图进行比较，如图13所示，各个pH的灵敏度基本相近，但6kHz和8kHz左 右得到的结果较好，所以在考虑多光源对器件检测时，所采用的频率应选择在 该范围内能达到较理想的结果，且能达到相近的灵敏度。
权利要求
1、一种细胞电生理集成芯片，其特征在于在Si基底(2.1.1)正面中间集成MEA微电极阵列(2.2)，在MEA微电极阵列(2.2)两侧分别集成IDA叉指电极(2.1)和LAPS光寻址电位传感器(2.3)，在MEA微电极阵列(2.2)另外两侧分别对称设置参考电极(2.4)。
2、 根据权利要求1所述的一种细胞电生理集成芯片，其特征在于 所述的IDA叉指电极(2.1)为梳状的叉指电极对，单个叉指电极中间为暴 露出的Au电极(2丄5)以及下面Cr黏附层(2丄4)，周围高出部分为Si02 或Si3N4绝缘保护层(2丄3)，下面依次分别为Si02层(2丄2)和Si基底 (2丄1)。
3、 根据权利要求1所述的一种细胞电生理集成芯片，其特征在于 所述的MEA微电极阵列(2.2)为6排正方形电极孔阵列，单个微电极结构 与前所述IDA叉指电极(2.1)的单个叉指电极结构相同。
4、 根据权利要求1所述的一种细胞电生理集成芯片，其特征在于 所述的LAPS光寻址电位传感器(2.3)结构分为4层，依次分别为Si3N4层 (2.3.3)， SK)2层(2.3.2)， Si基底(2丄1)以及Al层(2.3.1)。
5、 一种细胞电生理集成芯片的制作方法，其特征在于(1) . MEA微电极阵列制备过程为采用标准半导体制作工艺，先溅 射300nm的Au到硅片基底上，再采用剥离技术形成Au电极，为了和绝 缘层贴合需加一层30nm的Ti、 Cr或Ni层，最后做Si3N4或聚酰亚胺绝 缘保护层，并蚀刻出电极孔；(2) .IDA叉指电极制备过程为采用多层光刻工艺加工电极，电极表 面的叉指对为暴露出的Au电极，引线部分除了焊盘外均覆盖由等离子体 气相沉积技术形成的Si02的绝缘层，并刻蚀出有效细胞贴附区；(3) . LAPS光寻址电位传感器制备过程为在Si基片上采用深法刻 蚀技术将LAPS区域的氧化层干法刻蚀掉，然后采用等离子体气相沉积技术先后生长一层Si02层和SigN4层；将基底Si基片背面的氧化层用HF溶液腐蚀掉，正面用光刻胶进行保护；然后在硅片背面溅射一层Al层作 欧姆接触，完成集成芯片LAPS光寻址电位传感器的制作；(4) .参考电极制备过程为采用标准半导体制作工艺，先溅射300nm 的Au到硅片基底上，再采用剥离技术形成金电极，为了和绝缘层贴合需 加一层30nm的Ti、 Cr或Ni层，最后做Si3N4或聚酰亚胺绝缘保护层， 并蚀刻出参考电极。
全文摘要
本发明公开了一种细胞电生理集成芯片和制作方法。在Si基底正面中间集成MEA微电极阵列，在MEA微电极阵列两侧分别集成IDA叉指电极和LAPS光寻址电位传感器，在MEA微电极阵列另外两侧分别对称设置参考电极。本集成芯片能同时检测细胞在器件上的贴壁生长状态，动作电位及细胞新陈代谢产物中多种离子的浓度，用于实现多参数的同时并行检测，解决了集成细胞传感器芯片设计、加工的核心技术难题，为集成化细胞传感器技术的便携化及仪器化发展拓展了新的应用领域。
文档编号G01N33/48GK101158677SQ200710156360
公开日2008年4月9日 申请日期2007年10月29日 优先权日2007年10月29日
发明者辉 余, 刘清君, 莹 徐, 斯 朱, 平 王, 华 蔡 申请人:浙江大学