专利名称：氨(离子)诊断/测定试剂盒及氨(离子)的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种氨(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨 (离子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应 用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。
扩散法是标本碱化后，释放出NH3，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler 反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成 造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前己很少应用；离子交换法比 扩散法更准确，CV为8X 13X;离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表 面，引起电极的PH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5X 4.8X，回收 率高。结合具体实际，应以酶法测定为实用。
检索中国专利，仅查出87105593.7专利申请公开了一种血氨测定速冻杯， 却未发现比较理想的血氨测定方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量还原型 烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定氨(离 子)浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的氨(离子)诊断/ 测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分 析仪上进行氨(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得
4到切实的推广应用。
本发明氨(离子)浓度测定方法原理如下
氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+
腺苷二磷酸+磷酸根 磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶
甘油酸-l，3-双磷酸+还原型辅酶 这种方法应用谷氨酰按合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2)酶(偶) 联甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; EC 1.2丄59)酶促反应终点法。谷氨酰按合成酶酶解氨(离子)反应产生磷酸根， 再通过(偶)联合甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没 有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原 型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度， 可以测算氨(离子)的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无 论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明氨(离子)诊断/测定试剂
盒较为理想
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
谷氨酰按合成酶 10000 U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000 U/L
谷氨酸 8 mmol/L腺苷三磷酸 3 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 5 mmol/L
本发明的氨(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酰按合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、谷 氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酰按合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。 辅酶、谷氨酰按合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘 油醛-3-磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、谷氨酰按合成酶。辅酶、谷氨酰按合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘 油醛-3-磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉 状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定氨(离子)浓度的方法，其辅酶 可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
谷氨酰按合成酶 10000 U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000 U/L
谷氨酸 8 mmol/L
腺苷三磷酸 3 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 5 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度 《0.1，测试主波长340腦，测试副波长405nm，舉测氨(离子)样品与试剂 的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间0分钟，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪
下，检测主波长340nrn吸光度上升的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大 小。
实施例二
本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括-
试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
辅酶
腺苷三磷酸
甘油醛-3-磷酸
50 mmol/L
3 mmol/L
8 mmol/L
3 mmol/L
mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
谷氨酰按合成酶 甘油醛-3-磷酸脱氢！
10000 U/L
12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37-C，反应时间10分钟，起始吸光度 《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨(离子)样品与试剂 1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间0分钟，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小。
实施例三
本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括
试剂l
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂
腺苷三磷酸
甘油醛-3-磷！
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
甘油醛-3-磷酸脱氢酶
试剂3
励mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 8 mmol/L 3 mmol/L 5 mmol/L
謂薩ol/L 500 mmol/L 12000 U/L
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
谷氨酰按合成酶
10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用,领i淀氨(离子)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时 间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被 测氨(离子)样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方 向为正反应(上升反应)，延迟时间O分钟，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大 小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达 到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0015;吸光 度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围 可达2mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过士 5%;试剂测试 的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.68 ± 0.12 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广 应用。
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权利要求
1. 一种酶比色法及酶联法的氨(离子)的浓度测定方法，其方法原理如下氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸 <u>谷氨酰胺合成酶</u> 谷氨酰胺+ 腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶 <u>甘油醛-3-磷酸脱氢酶</u> 甘油酸-1，3-双磷酸+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，测算出氨(离子)的浓度大小测定结果。
2. —种氨(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20——500 mmol/L稳定剂1———4000 mmol/L辅酶1—6 mmol/L谷氨酰按合成酶1000———80000 U/L甘油醛-3-磷酸脱氢酶1000-——80000 U/L谷氨酸1—50 mmol/L腺苷三磷酸l一50 mmol/L甘油醛-3-磷酸1—50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范 围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酰按合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、谷氨 酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酰按合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、谷氨 酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定 剂、辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成；试剂2，由缓冲液、 稳定剂、谷氨酰按合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成。辅酶、谷氨酰按合 成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸在试剂 l或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酰按合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、谷氨 酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成多剂试剂；试剂l,由缓冲液、稳定齐U、辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰 按合成酶组成。辅酶、谷氨酰按合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、谷氨酸、 腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括 稳定剂l一OOO mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的氨(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸、谷氨酰按合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464341SQ20071019213
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司