含有由无核血细胞制成的具核红细胞成分的基准对照组合物的制作方法

专利名称：含有由无核血细胞制成的具核红细胞成分的基准对照组合物的制作方法
含有由无核血细胞制成的具核红细胞成分的基,照组合物技术领域001本发明涉及一种含有具核红细胞成分的基准对照组合物，并且涉及制造和使用该基准对照组合物以用于在血液分析仪上測定血样中具核红细胞的方法。〖002在临床血液学上，质量对照一直是必需和常规的程序，多种类型的血细胞计数中的精 确性，部分地取决于适当的对照产物的使用和使用该对照产物的方法。随着目前有许多型号 的设备可用于颗粒计数，通过利用对照产物进行质量对照是必需的，因为仪器故障的可能性 总是存在的。保持自动颗粒计数设备的质量对照程序的传统方法一直包括提供新鲜的人类血 液作为全血标准。然而，该新鲜血液仅可用一天，因此，人们已开发出多种具有较长产物使 用寿命的被制备的对照产物。
具核红细胞(NRBCs)或有核红细胞，是未成熟的红细胞。它们通常存在于骨髓，但 是不存在于外周血中，然而，在某些疾病比如贫血和白血病中，具核红细胞也存在于外周血 中》因此，测量NRBCs具有临床重要性。近年来，人们已报告了数种检测方法，用于测量在 血液仪器上的血样中的具核红细胞，美国专利No. 5,559,037 (Kim等)公开了一种用于具核 红细胞和白细胞的流式细胞计数分析的方法。该方法使用了荧光、低角度光散射和轴光损失 测量法，以便从白色血样中辨别出NRBCs。美国专利No.5,879邻0 (Kim等)进一歩地公开 了一种辨别NRBCs、白细胞和受损白细胞的方法，以及通过流式细胞仪提供血液样品中的白 细胞差别的方法。006美国专利No. 5,874,310和5,917,584 (U等》公开了一种通过测量血液样品的两个光 散射信号的角度来辨别具核红细胞的方法，并且进一歩公开一种通过測量光散射和直流电 (DC)阻抗信号来辨别具核红细胞的方法。美国专利No. 6,410,330和6,673,618 (Li等)公 开一种通过使用DC阻抗测量法来确定NRBC的方法。美国专利No. 6,472,215 (ftio等)公 开了一种通过阻抗测量结合三维DC、 RF和光散射测量法来辨别具核红细胞的方法。
美国专利No. 6,187，5卯和5,858,7卯(Kini等)公开了一种血液学对照物，其包括由 经分解的和被國定的鸟类或鱼类红细胞、或者经分解的和被國定的人类淋巴细胞制成的具核 红细胞(NRBC)类似物，美国专利No. 6,187,590和5,858,790进一歩公开制备该NRBC类 似物的方法，其使用分解试剂将鸟类或鱼类红细胞分解！~5分钟、接着用固定剂在60 70。C 下固定剩余的细胞核直至W分钟。009美国专利No. 6,406,915、 6,403,377、 6,399,388、 6,221,668和6,200,500 (Ry肌等)公 开了一种包含来源于具核鸟类血细胞的NRBC类似物的血液学对照物。该方法包括在缓沖 溶液中洗涤鸟类比如火鸡的红细胞、或者小鸡的红细胞，并用戊二醛磷酸盐溶液國定洗涤后 的细胞。美国专利No. 6,448,085 (Wang等)公开了一种血液学对照物，其包含具核红细胞 (NRBC)类似物，该类似物是被固定的商品具核小鸡红细胞。
美国专利No. 6,653,137和6,723,563 (Ryan)公开了制备用于血液学对照物的具核红 细胞成分的方法，其通过固定化含有细胞核的血细胞来实现或者通过从具核血细胞中分解 和除去细胞质但保留在细胞核周围的细胞膜的通常结构、然后固定该经处理的具核血细胞来 实现。0U所有上述参考文献皆公开了使用具核红细胞以便制备具核红细胞成分的技术，该具核 红细胞成分用于测量血液样品中具核红细胞所用的基准对照物。
美国专利申请公开No. 2005/0136409 (Jacobs等)公开了一种含有具核红细胞成分的 血液学对照物，及其制备方法。该对照物包括颗粒，比如未固定的马、羊或牛的细胞，该颗 粒具有附着于颗粒表面的核酸(DNA或RNA)用于模拟具核红细胞，该方法公开了将RNA 共价交联于未固定的红细胞表面，其中该红细胞可以是具核细胞也可以是无核细胞，该覆盖 有RNA的无核红细胞可以用于使用荧光测量法的具核红细胞的测量。Jacobs等还公开了，由
覆盖有RNA的马红细胞制成的NRBC类似物可以通过阻抗测暈法和光散射测量法来进行測量。013]此外，某些无核的红细胞，比如人类、火鸡和鲨鱼红细胞，已经被用于制备用于血液 学基准对照物的白细胞亚群，如美国专利No,4,704,364所述，〖014人们期望能够使用较宽范围的血细胞来源以便用于制备NRBC类似物，尤其使用那些 易于获得的无核血细胞。发明内容015
一方面，本发明的目的在于提供一种含有具核红细胞成分的基准对照组合物，其包括 由用于模拟血样中具核红细胞的被固定的无核血细胞所制成的具核红细胞成分以及适合将 该成分递送至血液分析仪用于测量该具核红细胞的悬浮介质。该无核血细胞具有与待测量的 血液样品中的具核红细胞的细胞核尺寸基本近似的天然细'胞尺寸。适合本发明目的的无核血 细胞包括马、羊、牛、猫、犬、猪的红细胞或其组合物，另外，该具核红细胞成分是基本上 不含核酸。016此外，该基准对照组合物可以进一歩包含白细胞、红细胞、血小板和网织红细胞成分。017]另一方面，本发明的目的在于提供一种制造含有具核红细胞成分的基准对照组合物的 方法。该方法包括如下歩骤提供具有与待测量的具核红细胞的细胞核尺寸基本近似的天然 细胞尺寸的无核血细胞用画定介质固定无核血细胞；并且在悬浮液介质中悬浮被固定的无 核血细胞，从而形成基准对照组合物。该方法可以进一歩包括在画定之前，用球形化试剂 接触该无核血细胞接触以使该无核血细胞球形化。
本发明的一个方面在于提供一种含有具核红细胞(NRBC)成分的基准对照组合物， 并且提供一种制备具核红细胞成分和该基准对照组合物的方法。026更具体地说，在本发明的一种实施方式中，基准对照组合物包括由用于模拟血样中 具核红细胞的被固定的无核血细胞所制成的具核红细胞成分以及一种适合将该成分递送至 血液分析仪用于测量该具核红细胞的悬浮介质。为本发明的目的，该具核红细胞成分、以及 其他细胞类型成分，也被称作类似物，例如，NRBC类似物，
—种合适的洗液是磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS),也可以使用已为本领域技术人员所 熟知的其他洗液。另外，在固定之前，可以在该洗液中添加球形化试剂，用于使无核血细胞 球形化。作为另一种选择，在固定之前，可以用单独的球形化试剂处理洗涤后的血细胞。合 适的球形化试剂的例子包括但不限于阴离子表面活性剂，其包括全氟烷基羧酸铵(可在 市场上买到的例如Fhiorad，FC-143, 3M公司，StPaul,美国明尼苏达州)、月桂酰十四酰 乳酸钠(可在市场上买到的例如PationicMl38C, RITA公司，Woodstock,伊利诺斯州) 非离子型表面活性剂，其包括十二烷基-P-D-麦芽糖苷、N,N-二 (3-D-葡糖酰氨基丙基)胆 酰胺、聚氧化丙烯-聚氧化乙烯嵌段共聚物、N冲四烷基-P-D-麦芽糖苷、癸酰基N-甲基-葡糖 酰胺、N-十二烷基-一 D-吡喃型葡糖苷、N-癸基-P-D-吡喃型葡糖苷、硬脂酸聚乙二醇酯、乙 氧基化椰油单甘油酯、辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇、乙氧基化辛基苯酚、以及直链醇 或者阳离子表面活性剂，其包括椰油羟乙基咪唑啉、十二烷基三甲基氯化铵、癸基三甲基 溴化铵、辛基三甲基溴化铵或者两性离子表面活性剂，其包括十二酰胺丙基甜菜碱、N-十四烷基-N，N-二甲基3-氨合-l-丙烷磺酸盐、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-氨合4-丙烷磺酸盐、 揶油酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺磺化甜菜碱、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-贫合小丙烷磺酸盐 以及N-十四烷基-NW-二甲基-3 ,合4-丙烷磺酸盐。032该固定介质包括固定剂和用于为固定介质提供适当渗透性的渗透性调节剂。基于所用 的特定无核血细胞和类似物的所需性能，测定固定介质的渗透性。渗透性调节剂合适的例子 包括但不限于碱金属磷酸盐、碱金属氯化物和碱金属硫酸盐。固定剂包括但不限于醛类、恶 晚烷、醇类、环状脲或其组合物。合适的例子包括但不限于甲醛，多聚甲醛，戊二醛，二 偶氮烷基脲(DU),咪唑烷基脲(roU) , 二羟甲基脲，二羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲，2-溴-2-硝基丙烷-U-二醇，5-羟甲基小氮杂-3，7- 二氧杂双环(3.3.0)辛烷，5-羟基多亚甲基 氧基-甲基小氮杂-3,7- 二氧杂双环(3.3.0)辛烷，羟甲基氨基乙酸钠，及其混合物。在一种 优选实施方式中，使用醛类固定剂比如多聚甲醛、甲醛、戊二醛、或其组合物。在固定介质 中，该醛类固定剂的浓度可以约0.1%~2.0%。033〗如果该无核红细胞的天然细胞尺寸大于待模拟的具核红细胞细胞核的尺寸，则该固定 介质具有比等渗的天然细胞环境更高的渗透性，从而在固定处理期间縮小细胞尺寸，并且得 到尺寸极类似待模拟的具核红细胞的细胞核尺寸的NRBC类似物。相反，如果无核红细胞的 天然细胞尺寸小于待模拟的具核红细胞细胞核的尺寸，该画定介质具有比等渗天然细胞环境 更低的渗透性，从而在画定处理期间细胞尺寸会增大，并且得到尺寸极类似待模拟的具核红 细胞的细胞核尺寸的NRBC类似物。034〗该固定处理可以进行约4~24小时，典型地，该无核红细胞在该國定介质中轻轻搅拌 下培宵约10~16小时。035〗悬浮介质的一个合适例子包括磷酸盐缓冲盐水溶液和血號物质的水溶液，按照此处的 限定，血浆物质的水溶液包括血清物质、血清物质与血浆蛋白质的组合、及其混合物的水溶 液。按照此处的进一歩限定，血浆蛋白质包括血浆中所含的一种或多种蛋白质。优选这样的 血浆蛋白包括白蛋白、脂蛋白、球蛋白、纤维蛋白原、及其泡合物。这些介质可以含有其 他已为本领域技术人员所熟知的成分，以使其具有长期稳定性。实施例1提供了该悬浮介质 的两种示例性配方。其他合适的介质例子大多在美国专利No. 4^13,876、4^99,726、4，358,394、 3,873,467、 4,704,364、 5,320,964、 5,512,485和6,569,682中进行了描述，在此将其全部内容 引入本文以供参考，036实施例1示意了使用马红细胞制备NRBC类似物的示例性工艺。实施例2示意了使用 羊红细胞制备NRBC类似物的示例性工艺。通过使用在此描述的工艺而生产的NRBC类似物 在悬浮介质中的稳定期超过6个月。
037研究发现，通过使用所述工艺固定无核动物红细胞而产生的NRBC类似物可以抗分解 试剂，所述分解试剂用来制备用于在自动血液分析仪上測量白细胞和具核红细胞的血样棍合 物。该NRBC类似物在分解条件下基本上保持其尺寸或体积，当在样品混合物中測量时，该 NRBC类似物在分解条件下会类似于血样中的具核红细胞，基本上为它们的细胞核体积，因 此，应当理解，虽然NRBC类似物由无核血细胞制成，但它在测量条件下具有类似于血样中 具核虹细胞的某些性能。与本技术领域已知的NRBC类似物不同，本发明的NRBC类似物基 本上不含核酸。 一方面，由无核血细胞制成的瞬时NRBC类似物不包含细胞核，另一方面， 该瞬时NRBC类似物不包含覆盖在细胞膜表面上、或以化学方法联接细胞膜表面上、或注入 细胞膜内的天然或合成的核酸，因此，优选能够通过简单的生产工艺使用足够的无核动物红 细胞可以生产本发明的NRBC类似物，038〗在另一种实施方式中，基准对照组合物进一歩包括可以模拟白细胞(WBC)的白细胞 成分。在存在白细胞成分时，在NRBC成分和白细胞成分之间的比率可以用于报告每100个 白细胞的NRBC数量,该数量是与在临床实验中报告血样中具核红细胞所用单位相同的单位， 优选白细胞成分或其类似物具有类似于一个主要的白细胞亚群(比如粒性白细胞或淋巴细胞) 的性能。039此外，该白细胞成分可以包含一种以上白细胞亚群成分或者类似物，例如，两种、三 种、四种或五种白细胞亚群类似物，以便模拟白细胞亚群而用于示差分析。白细胞类似物的 合适例子包括被稳定化并固定的晡乳动物白细胞、以及经处理的和/或固定的人类和动物红细 胞，这已为本技术领域所熟知。在一种实施方式中，该白细胞类似物可以由经处理的鹅和鳄 鱼红细胞制成，用于使用阻抗测量和光散射测量组合的示差分析，如同在美国专利No. 5,320,964和5,512,485所公开的那样，在此将其全部内容引入本文以供参考，在另一个实施 方式中，该白细胞类似物可以由经处理的鸟类和人红细胞制成，用于使用阻抗测量的示差分 析，这在美国专利No.4,704,364中被公开，在此将其全部内容引入本文以供参考。在另一种 实施方式中，该白细胞类似物可以由被固定的哺乳动物白细胞制成，在白细胞类似物的制备 期间，在分解全血中的红细胞之前固定哺乳动物的白细胞。
任选地，可以通过在制备白细胞类似物的处理期间与脂蛋白相接触而进一歩地处理哺 乳动物白细胞和红细胞。与脂蛋白的接触可以发生在固定白细胞或红细胞之前还可以发生 在固定后以及在悬浮介质中保存期间，这在美国专利No. 5,320,964、 5,512,485、 6,406,915、 6,403,377、 6,399,388、 6,221,668和6 200,500中被公开，现将其全部内容引入本文作为参考，
实施例3示意了一种基准对照组合物的制备方法，该基准对照组合物含有通过使用实 施例1中所述工艺由马红细胞制成的NRBC类似物、单一群体白细胞成分、红细胞成分和血 小板成分。实施例4进一歩示意了一种基准对照组合物的制备方法，该基准对照组合物含有 本发明的具核红细胞成分、多个白细胞亚群的类似物、红细胞成分和血小板成分。 〖047可以利用含有本发明具核红细胞成分的基准对照组合物，用于采用多种测量方法的具 核红细胞測量。实施例3示意了使用含有具核红细胞成分的基准对照组合物以用于采用DC 阻抗测量法、或DC和VCS组合测量法的具核红细胞的测量的方法。在此使用的术语的"VCS 测量法或者检测方法"，指的是一种三维测定技术，其测量直流(DO和射频(RF) P且抗、 以及当血细胞经过流动池时的光散射信号。该VCS检测方法a经在美国专利No. 5,125,737 中进行了详细描述，在此将其全部内容并入本文以作为参考。该方法通过使用DC和VCS的
组合測量法来测量具核红细胞，这已经在美国专利No. 6,472,215中进行了全面描述，在此将 其全部内容并入本文以作为参考，048典型地，在自动血液分析仪上，几个等分血样分别地进行处理，用于测量不同的血细 胞亚群。在Coulter GE1^S或LH750血液分析仪(贝克曼考尔特公司，FuUerton,加利福尼 亚)，以不同的分析模式并行地分析几个等分血样，用血液稀释剂稀释第一等分血样，以形 成第一祥品混合物，并且通过DC阻抗测量法来测量红细胞和血小板，以得到红细胞和血小 板参数。同时，将第二等分血样与血液稀释剂和第一分解试剂混合，以形成第二样品混合物， 并且通过DC阻抗測量法来测量第二样品混合物，以得到白细胞数，同时将白细胞区分为三 个亚群，并且分析具核红细胞。将第三等分血样与第二分解试剂混合，随后再与固定化试剂 混合，从而形成第三样品混合物。将第三样品混合物输送至流动池，并且通过VCS检测方法 进行测量，以将白细胞示差异分析为五个亚群，并且分析具核红细胞，049〗

图1A和2A分别显示了从含有约27 NRBC/100白细胞的第二等分正常全血样品和临 床全血样品中得到的DC直方图，这在实施例3中进行了更全面的描述，如图1A和2A所示, 临床血液样品中的具核红细胞在直方團的左边大部分显示出不同的峰，同时正常的血液样品 在相同的区域没有细胞群。〖050图1B和2B显示了从在图1A和2A中所示第三等分正常血样和临床血样得到的DC 对RLS分布图，如图所示，临床血样中的具核红细胞位于分布图的底部左侧，同时正常血样 中在相同的区域没有明显的细胞数量，应注意，RLS是术语"旋转光散射"的缩写，其定义 为中等角度光散射信号和DC阻抗信号的函数。051图3A和3B分别显示了从第二等分血样得到的DC直方图和从实施例3的第三等分的 基准对照组合物得到的DC对RLS分布图。如图3A所示，由被阖定的马红细胞制成的NRBC 类似物位于直方图的左侧大部分，其极类似人类具核红细胞，如图3B所示，位于分布图底 部左侧的NRBC类似物与人类具核红细胞处于相同区域并且在DC直方图和DC对RLS分 布图中，被固定的鹅红细胞极类似人类淋巴细胞。如图所示，实施例3的基准对照组合物可 以用于单独的DC测量，也可以用于DC和VCS的组合测量，052]虽然实施例3示意了采用DC和VCS测量法的基准对照組合物的应用，但因为本发明 的具核红细胞成分具有极类似具核红细胞的细胞核尺寸的类似尺寸，故该基准对照组合物可 以基于细胞尺寸的测量而与多种检测方法一起使用，这些测量方法包括但不限于阻抗、光散 射和轴向光损失测量法。
在测量方法和测试设备的一个合适例子中，可以利用本发明的基准对照组合物作为用 于测量具核红细胞的基准对照物，这已经在美国专利No. 5,874,310和5,917,584中进行了详 细描述，在此将其全部内容引入本文以供参考。更具体地讲，具核红细胞的测量是通过测量 两个角度的光散射信号而进行的。在一种实施方式中，该两个角度的光散射信号都是低角度 光散射信号，其检测角度是从入射光起小于10°,优选约0°至约4°。在另一个实施方式中， 第一光散射信号是低角度光散射信号；而第二光散射信号是介质光散射信号或直角光散射信 号。另外，具核红细胞的测量还可以通过测量光散射和DCP且抗信号来进行。056在测量方法和测试设备的另一个合适例子中，可以利用本发明的基准对照组合物作为 用于测量具核红细胞的基准对照物，这已经在待审的专利申请序列号No. 11/048,086和 11/338,229中进行了详细描述，在此将其全都内容引入本文以供参考。更具体地讲，专利申 请序列号11/048,(586所述的方法可通过下述测量方法来测量具核红细胞测量轴向光损失和 低角度光散射信号；轴向光损失和DC阻抗信号或者轴向光损失、DC阻抗和低角度光散射 信号。专利申请序列号11/338,229所述的方法可通过下述测量方法来測量具核红细胞测量 轴向光损失、DC阻抗、中等角度光散射信号轴向光损失、低角度光散射信号和中等角度光 散射信号；或者轴向光损失、DC阻抗、低角度光散射信号和中等角度光散射信号。低角度光 散射信号优选以约尸~7°的角度测量，而中等角度光散射信号优选以约20"M5。的角度测量。
使用马红细胞制备NRBC类似物的工艺歩骤-1. 在含有抗凝血剂的容器中收集50mL马的全血,将马全血离心，并且除去包含白细胞、 血小板和血浆的上层。2. 用磷酸盐缓冲盐水溶液(pbs)洗涤叠集的马红细胞三次，并且在剩余量的ras中再悬浮洗涤后的叠集的细胞，细胞洗涤歩骤是在1200rpn下15分钟的一系列离心，接着除去 上清液，并且用PBS再悬浮叠集的细胞，3. 将1 mL叠集的马红细胞加入含有49mL类似物固定介质1的试管中，并且通过倒覽 进行较好的混合，从而形成细胞处理悬浮液。4. 将试管放置在滚筒机上，并且在室温下低速混合过夜。5. 按歩骤(2)中所述，用PBS洗涤经处理的细胞三次。 6.在悬浮介质1或2中再悬浮经处理的细胞，从而形成用于在血液分析仪上进行分析的 NRBC基准对照组合物。 实施例062由羊红细胞制成的具核红细胞成分收集50mL羊全血，并且按照与实施例1中所述相同的工艺歩骤进行处理，所不同的是， 在歩骤3中使用如下所示的类似物固定介质2,将经处理的羊红细胞再悬浮于悬浮介质1中, 从而形成另一种NRBC基准对照组合物-类似物圃定介质2戯七水磷酸氢二钠-磷酸二氢钠氯化钠戊二醛(25%) -用适量蒸馏水补充至1升:含暈(g/L) 2.0 g 0.2 g 9.4 g 40raLpH约7.4;渗透性320mOsm/kgH20实施例3含有具核红细胞成分、白细胞成分、以及红细胞成分和血小板成分的基准对照组合物063]制备工序1. 提供预定量的实施例1中的悬浮介质1。2. 将预定量的固定化人红细胞加入该介质，按照美国专利No. 4胃9,726和4,358,394所 述的方法处理固定化人红细胞。3. 在含有固定化人红细胞的悬浮介质中加入预定量的血小板成分。该血小板成分是按照 美国专利No. 4,264,470、 4,389,4卯和4，邻5,719中所述的方法由被画定的山羊红细胞制成的。4. 将预定量的由被固定的鹅红细胞制成的白细胞成分加入该含有固定化人红细胞和血 小板成分的悬浮介质中。5. 将预定量的实施例1中被固定的马红细胞加入到含有固定化人红细胞、血小板成分和 白细胞成分的悬浮介质中，6. 轻轻混合所形成的基准对照组合物。
配制红细胞、白细胞和血小板成分的细胞浓度，以便模拟人全血样品的相应细胞浓度, 配制具核红细胞成分的细胞浓度，以模拟含有特定水平具核红细胞的临床样品，优选具核红 细胞水平的范围为1~50NRBC/100白细胞。065在Coulter LH750血液分析仪(贝克喿考尔特公司制造，Fiilterton,加利福尼亚州)上 分析了由上述方法得到的基准对照组合物。该Co逾erLH750血液分析仪具有，RBC槽，其 采用了三个非聚焦流动光園(加n-focused flow apertures)和DC阻抗检测器，用于测量红细 胞；WBC槽，采用了三个非聚焦流动光圈和DC阻抗检测器，用于测量白细胞数，并且用于 将白细胞区分为三个亚群和分析具核红细胞以及流动池，其具有VCS检测系统，用于将白 细胞区分为五个亚群。该VCS检测系统可以测量DC阻抗、射频阻抗和穿过流动池的细胞的 中等角度光散射信号。[066通过CoulterLH750血液分析仪吸出血液样品或基准对照组合物，以6250:1的稀释比， 用等渗血液稀释剂LH700 Series Diluent稀释第一等分的1.6 n，样品，从而形成第一样品混合 物。第一祥品混合物经三个一组的光圈由真空源抽出。当血细胞穿过光圏时，通过DC阻抗 检测器测量每个血细胞，以得到红细胞参数，用6 mL的LH7TO Series Diiueirt稀释第二等分 的2一样品，然后与1 raL的第一分解试剂Lyse S III d淑混合，从而形成第二样品混合物。 第二样品混合物经三个一组的光豳由真'空麵抽出，并且进行测量，以得到白细胞数，将白细 胞区分为三个亚群并分析具核红细胞。将第三等分的34jil样品与540jtl的第二分解试剂 Erythrolyse⑧II混合，以分解红细胞，并且随后与218^1的固定化试剂StaWlyse混合，从而形 成第三样品混合物。将第三样品棍合物供至流动池，用于将白细胞示差分析为五个亚群，并 且分析具核红细胞。在约18~28 。C的温度下进行测量。分析了由测量第二等分试样和测量第 三等分试样得到的数据，从而报告出具核红细胞。所有上述试剂皆为贝克曼考尔特公司的产 品。067图1A显示了根据如上所述程序由分析第二等分正常全血样而得到的DC直方圉，如 图所示，分布在(M00fL范围内的三个白细胞亚群，并且在白细胞左侧未出现细胞群，图1B 显示了由第三等分相同的血液样品得到的DC对RLS分布图。如图所示，在分布图底部没有 出现明显量的细胞。〖068图2A显示了根据如上所述程序.由分析第二等分临床全血样品而得到的DC直方图， 该临床全血样品含有约27NRBC/100白细胞，如图所示，在该直方图的左侧大部分，具核红 细胞显示为独特的峰，掘2B显示了由第三等分相同的临床样品得到的DC对RLS分布圉。 如圉所示，具核红细胞位于该分布图的底部左侧。069圉3A和3B分别是由如上所述第二和第三等分基准对照组合物得到的DC直方图和 DC对RLS分布图。如图所示，在DC直方图的左恻大部分，被固定的马红细胞显示为独特 的峰，并且位于DC对RLS分布图的底部左侧；因此，它们在DC和DC对RLS测量方面极 类似人类具核红细胞。另一方面，被圃定的鹅红细胞类tl人类淋巴细胞。实施例4含有NRBC成分、多个白细胞亚群类似物、红细胞成分和血小板成分的血液基准对照组 合物。070〗用于制备这种基准对照组合物的工序与如上所述实施例3的工序基本相同，所不同的 是，在歩骤4中将预定量的多个白细胞亚群类似物加入到含有固定化人红细胞、血小板成分 和实施例1或2中所制NRBC成分的悬浮介质内，071〗按照美国专利No. 5,320,964和5,512,485所述工序制备多个白细胞亚群类似物。基准 对照组合物的储存周期可以超过45天。072该基准对照组合物可以用于采用DC阻抗测量和VCS测量的组合测量法的具核红细胞 分析，这已在美国专利No. 6,472,215中进行了详细描述。073〗以上对本发明进行了详细描述，并且在附图上进行了图示，但不应将这些内容看作是 对本发明保护范围的限制，而应视为其优选实施方式的示例.然而，很明显在上述说明书中 以及附后的权利要求中所述的本发明精神和保护范围内可以做出多种改进和变化，并且它们 在法律意义上讲是等价的。在本文引用的所有专利及其他公开文献并入本文以供参考。
权利要求
1. 一种含有具核红细胞成分的基准对照组合物，其包括(a)由用于模拟血样中具核红细胞的经固定的无核血细胞所制成的具核红细胞成分；以及(b)适合于将所述成分输送至血液分析仪以用于测量所述具核红细胞的悬浮介质。
2. 如权利要求1所述的基准对照组合物，其特征在于，所述无核血细胞具有与所述血液 样品中所述具核红细胞的细胞核尺寸基本坻似的天然细胞尺寸。
3. 如权利要求2所述的基准对照组合物，其特征在于，所述无核血细胞包括马、羊、牛、 猫、犬、猪的红细胞或其组合物。
4. 如权利要求2所述的基准对照组合物，其特征在于，所述经固定的无核血细胞基本上 不含核酸。
5. 如权利要求1所述的基准对照组合物，其特征在于，还包含白细胞成分。
6. 如权利要求1所述的基准对照组合物，其特征在于，还包含红细胞成分。
7. 如权利要求1所述的基准对照组合物，其特征在于，还包含血小板成分。
8. 如权利要求1所述的基准对照组合物，其特征在于，还包含网织红细胞成分，
9. 一种制备含有具核红细胞成分的基准对照组合物的方法，包括如下歩骤a) 提供无核血细胞，其具有与待测量的具核红细胞的细胞核尺寸基本近似的天然细胞尺寸b) 用固定介质固定所述无核血细胞；以及c) 使步骤(b)中得到的经画定的无核血细胞悬浮于悬浮介质中，从而形成基准对照组 合物。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述无核血细胞包括马、羊、牛、猫、犬、 猪的红细胞或其组合物，
11. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述经固定的无核血细胞基本上不含核酸。
12. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述处理溶液包含固定剂和滲透性调节剂。
13. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括在步骤(b)之前，用球形化试剂 接触所述无核血细胞使之球形化。
14. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括在所述悬浮介质中加入白细胞成分、 红细胞成分、血小板成分、网织红细胞成分或其组合物。
15. —种使用含有具核红细胞成分的基准对照组合物的方法，包括下述歩骤-a) 提供含有具核红细胞成分的基准对照组合物，所述具核红细胞成分由用于模拟待测量 血样中具核红细胞的被國定的无核血细胞所制成；b) 提供适合于测量血样中具核红细胞的血液分析仪c) 在所述血液分析仪上分析所述基准对照组合物，并且测量所述具核红细胞成分以及d) 报告所述基准对照组合物中的所述具核红细胞成分。
16. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述测量所述具核红细胞成分是通过测量 DC阻抗信号来进行的，
17. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述测量所述具核红细胞成分是通过测量 两个角度的光散射信号来进行的。
18. 如权利要求17所述的方法,其特征在于,所述两个角度的光散射信号都是在小于10° 的角度下检测的低角度光散射信号。
19. 如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述两个角度的光散射信号是一个低角度 光散射信号、和一个中等角度光散射信号或直角光散射信号，
20. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述测量所述具核红细胞成分是通过测量 DC阻抗和光散射信号来进行的，
21. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述测量所述具核红细胞成分是通过测量 轴向光损失和DC阻抗信号来进行的。
22. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述测量所述具核红细胞成分是通过测量 轴向光损失和光散射信号来进行的。
23. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述光散射信号是低角度光散射信号，
24. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述光散射信号是中等角度光散射信号。
25.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述测量所述具核红细胞成分是通过下述 测量法而进行测量所述血液样品的第一等分试样的第一DC阻抗信号，测量所述血液样品 的第二等分试样的第二DC阻抗信号、射频阻抗信号和光散射信号，
全文摘要
公开了一种含有具核红细胞成分的基准对照组合物及其制备方法。该基准对照组合物包含由被固定的无核血细胞制成的具核红细胞成分，以及悬浮介质。该无核血细胞具有与所述血液样品中所述具核红细胞基本近似的细胞核尺寸的天然细胞尺寸。该具核红细胞成分可以由马、羊、牛、猫、犬、或猪的红细胞制成；并且基本上不含核酸。该基准对照组合物还可以包括白细胞成分、红细胞成分、血小板成分、网织红细胞成分或其组合。另外，进一步公开了使用该基准对照组合物用于在血液分析仪上测量具核红细胞的方法。
文档编号G01N31/00GK101400996SQ200780008322
公开日2009年4月1日 申请日期2007年2月23日 优先权日2006年3月16日
发明者内里·奥尔蒂斯, 桑德拉·索卡拉斯, 西奥多·J·盖鲁洛 申请人:贝克曼考尔特公司