专利名称：：高灵敏标志物分析和分子检测的方法和组合物的制作方法高灵敏标志物分析和分子4企测的方法和组合物交叉引用本申请是2005年1月28日提交的11/048660号申请的部分继续申请，以上申请通过引用整体引入本申请，且本申请基于35USC§120要求其优先权。11/048660号专利申请则要求2004年9月28日提交的美国临时申请60/613881号、2004年10月27日提交的美国临时申请60/624785号和2004年12月13日提交的60/636158号的利益。本申请还基于35USC§119要求2006年4月4日提交的60/789304号美国临时申请、2006年4月19日才是交的60/793664号美国临时申请、2006年5月26日提交的60/808662号美国临时申请、2006年11月28日提交的60/861498号美国临时申请和2006年12月4日提交的60/872986号美国临时申请的优先权，以上所有申请通过引用整体引入本申请。
背景技术：
：在生物医学、医疗诊断、预后、监测和治疗的选择、生物恐怖检测及其它涉及分析多样品中低容量和浓度的分析物的领域中获得的进展已经导致开发出能够灵敏地检测样品中浓度日益降低的颗粒的样品分析系统。美国专利4793705和5209834号描述了已经达到才及灵敏的检测的在先系统。本发明在该领域中进行了进一步的发展。
发明内容在一个方面中，本发明涉及一种设备。在该设备的一些实施方式中，本发明涉及用于检测样品中的单蛋白质分子的分析系统试剂盒，所述试剂盒包括分析仪和至少一种包含焚光结构和所述蛋白质分子的结合伴体的标记物，且其中所述分析仪包括a)用于激发荧光结构的电磁辐射源；b)供标记物穿过的毛细管流动池；c)用于在毛细管流动池中移动标记物的动力源；d)在毛细管流动池中形成的用于接收电磁源发射的电磁辐射的探询空间(interrogationspace);和e)可操作地与探询空间连接的用于测量受到激发的荧光结构的电磁特征的电磁辐射检测器；其中，所述荧光结构子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在本发明的设备的一些实施方式中，所述分析系统包括不超过一个探询空间。在本发明的设备的一些实施方式中，所述电磁辐射源是激光器，且其中激光器具有至少约3、5、10或20mW的功率输出。在本发明的设备的一些实施方式中，所述荧光结构包括荧光分子。在一些实施方式中，荧光分子为染料分子。在一些实施方式中，染料分子包括至少一个取代的吲。呆総环系统，该吲哚鐵环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。在一些实施方式中，荧光结构是量子点(quantumdot)。在本发明的设备的一些实施方式中，所述电磁辐射源是连续波电磁辐射源。在一些实施方式中，连续波电磁辐射源是发光二极管或连续波激光。在本发明的设备的一些实施方式中，所述动力是压力。在本发明的设备的一些实施方式中，所述检测器是雪崩光电二极管检测器。在本发明的设备的一些实施方式中，所述分析系统进一步包括用于折射激光束到探询空间上和使激发的染料分子成像的共焦光学装置，其中共焦光学装置包括具有至少约0.8的数值孔径的物镜。在本发明的设备的一些实施方式中，所述分析系统进一步包括能够对多个样品进行自动釆样并在样品容器和探询空间之间提供流体连通的采样系统。在本发明的设备的一些实施方式中，所述分析系统进一步包括与^!笨询空间构成流体连通的样品回收系统，其中该回收系统能够回收基本上所有样品。在一些实施方式中，本发明包括用于测定样品中的物质浓度的分析仪，其中该分析仪能够在至少大约105的动态浓度范围上测定浓度。在一些实施方式中，所述动态范围为从大约1毫微微摩尔到大约100皮摩尔。在另一个方面中，本发明包括方法。在一些实施方式中，本发明包括确定生物样品中是否存在蛋白质的单分子的方法，该方法包括用标记物标记所述分子和在单分子^f企测器中检测所述标记物是否存在，其中，标记物包括能够在受到其激发波长的激光器发射的光激发时发射至少约200个光子的荧光结构，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，所述单分子检测器包括不超过一个探询空间。在本发明的方法的一些实施方式中，样品中单分子的检测极限小于约10、1、0.1、0.01或0.001毫微微摩尔。在一些实施方式中，检测极限小于约1毫微微摩尔。在本发明的方法的一些实施方式中，在单分子^f全测器中^t全测标记物是否存在包括检测由荧光结构发射的电磁辐射。在本发明的方法的一些实施方式中，所述方法进一步包括将所述荧光结构暴露于电磁辐射。在一些实施方式中，电磁辐射由激光器提供。在一些实施方式中，激光器以低于约20mW的功率输出激发所述结构。在一些实施方式中，激光器激发所述结构持续时间小于约1000、250、100、50、25或10微秒。在本发明的方法的一些实施方式中，所述标记物进一步包括特异性结合所述分子的结合伴体。在一些实施方式中，结合伴体是抗体。在本发明的方法的一些实施方式中，所述荧光结构包括荧光染料分子。在一些实施方式中，染料分子包括至少一个取代的吲哚鐵环系统，该吲哚総环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。在一些实施方式中，染料分子为选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor647、AlexaFluor680或AlexaFluor700的AlexaFluor分子。在一些实施方式中，染料分子为AlexaFluor647染料分子。在一些实施方式中，荧光结构包括多个AlexaFluor647染料分子。在一些实施方式中，多个AlexaFluor647染料分子包括约2-4个AlexaFluor647分子。在一些实施方式中，荧光结构是量子点。在本发明的方法的一些实施方式中，所述方法进一步包括测量样品中的蛋白质的浓度。在本发明的方法的一些实施方式中，检测标记物是否存在包括(i)使一部分所述样品通过探询空间；和(ii)使探询空间暴露于电磁辐射，如果标记物存在的话，电磁辐射足以激发荧光结构发射光子；和(iii)检测在步骤(ii)的暴露过程中发射的光子。在本发明的方法的一些实施方式中，所述方法进一步包括检测探询空间中的背景光子水平，其中背景水平代表探询空间中没有标记物的情况下以步骤(ii)中的相同方式进行电磁辐射照射时探询空间的平均光子发射。在本发明的方法的一些实施方式中，所述方法进一步包括将步骤(iii)中检测的光子的量与阈光子水平比较，其中所述阈光子水平是所述背景光子水平的函数，其中步骤(iii)中检测的光子的量高于阈水平表明标记物的存在，而步骤(iii)中检测的光子的量等于或低于阈水平表明标记物不存在。在一些实施方式中，本发明涉及用于确定检测对象是否存在一种生物状态的方法，包括a)对来自所述对象的样品进行免疫分析，其中免疫分析包括将标志物的多个标记物结合到样品中的多个标志物分子上，其中标记物对所述标志物是特异性的且一个标记物结合到一个标志物分子上，和其中所述标记物包括与荧光结构结合的抗体，该荧光结构能够在受到其激发波长的激光器发射的光激发时发射至少约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳；b)检测标记物，其中所述检测包括用单分子检测器检测单个的标记物；和c)基于步骤b)中检测的标记物的数目测定样品中标志物的浓度。在本发明的方法的一些实施方式中，所述方法进一步包括将步骤b)中获得的浓度与已知指示所述生物状态是否存在的标志物浓度或浓度范围进行比较。在本发明的方法的一些实施方式中，所述对象是人。在一些实施方式中，样品是血液、血清、血浆、尿或呼出的气体的冷凝物。在另一个方面中，本发明提供组合物。在一些实施方式中，本发明提供用于检测生物分子的标记物，包括与荧光结构结合的生物分子结合伴体，其中荧光结构能够在受到其激发波长的激光器发射的光激发时发射至少约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指可1到该点上的总能量不超过约3微焦耳，其中所述结构包括大约2到4个荧光体。在本发明的组合物的一些实施方式中，所述生物分子是蛋白质或小分子。在一些实施方式中，生物分子是蛋白质。在一些实施方式中，荧光体包括荧光染料分子。在一些实施方式中，荧光染料分子包括至少一个取代的吲哚鐵环系统，该吲咮鐵环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。在一些实施方式中，染料分子为可能是AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor647、AlexaFluor680或AlexaFluor700的AlexaFluor分子。在一些实施方式中，染料分子为AlexaFluor647染料分子。在本发明的方法的一些实施方式中，所述染料分子包括第一型和第二型染料分子。在一些实施方式中，第一型和第二型染料分子具有不同的发射光谱。在一些实施方式中，第一型与第二型染料分子的数目的比率为4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3或1:4。在本发明的方法的一些实施方式中，所述结合伴体是抗体。在一个方面中，本发明提供方法。在一些实施方式中，本发明提供通过i)测定从第一群体获得的生物样品中所述标志物的浓度范围建立生物状态的标志物的方法，其中所述测定包括通过检测所述标志物的单个分子测量所述生物样品中所述标志物的浓度。在一些实施方式中，所述第一群体是不表现出所述生物状态的群体。在一些实施方式中，该方法进一步包括测定从第二群体获得的生物样品中所述标志物的水平范围，其中所述第二群体的成员表现出所述生物状态，且其中所述测定包括通过检测所述标志物的单个分子测量所述生物样品中所述标志物的水平。在一些实施方式中，第一和第二群体是不同的。在一些实施方式中，所述第二群体的至少一个成员是所述第一群体的成员，或者所述第一群体的至少一个成员是所述第二群体的成员。在一些实施方式中，基本上所有第二群体的成员是已形成所述生物状态的第一群体的成员。在一些实施方式中，检测所述标志物的单分子是采用对所述标志物的检测极限小于样品中约1000、100、50、20、10、5、1或0.5毫微微摩尔的所述标志物的方法进行的。在一些实施方式中，所述生物状态是表型状态、对生物体产生影响的状况、发育状态、年龄、健康状态、病变、疾病、疾病进程、疾病分期、感染、中毒、或对化学、环境或药物因子的响应(如药物响应表型、药物毒性表型或药物效力表型)。在一些实施方式中，生物状态是病变。在一些实施方式中，标志物是多肽或小分子。在一些实施方式中，所述状态是疾病状态，如癌症、心血管疾病、炎性疾病、自体免疫疾病、神经疾病、传染病和妊娠相关病症。在一些实施方式中，所述状态是疾病分期状态。在一些实施方式中，疾病分期状态是癌症分期状态。在一些实施方式中，所述状态是治疗反应状态。在一些实施方式中，所述治疗是药物治疗。在一些实施方式中，所述反应选自治疗作用和副作用。在一些实施方式中，所述反应是治疗作用。在一些实施方式中，所述反应是副作用，如不良反应。在一些实施方式中，检测包括用包含荧光结构的标记物标记所述标志物，该荧光结构能够在受到其激发波长的激光器发射的光激发时发射至少约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，所述焚光结构包括包含至少一个取代的吲哚鑰环系统的分子，该吲哚鑰环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质基团。在一些实施方式中，所述焚光结构包括选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor647、AlexaFluor680或AlexaFluor700的染料。在一些实施方式中，所述荧光结构包括AlexaFluor647。在一些实施方式中，所述标记物进一步包括所述标志物的结合伴体。在一些实施方式中，所述结合伴体包括对所述标志物特异性的抗体。在一些实施方式中，所述抗体包括多克隆抗体。在一些实施方式中，所述抗体为单克隆抗体。在一些实施方式中，所述方法进一步包括基于所述第一和第二范围确定所述标志物的阈水平，其中在来自个体的生物样品中所述标志物的存在水平超过上述阈水平表明所述个体中出现该生物状态的可能性大大增加。在一些实施方式中，本发明提供用于检测生物体中一种生物状态是否存在的方法，包括i)测量来自所述生物体的生物样品中标志物的浓度，其中所述标志物是通过包括测定从第一群体获得的生物样品中所述标志物的浓度范围的方法建立的标志物，其中所述测定包括通过检测所述标志物的单个分子测量所述生物样品中所述标志物的浓度；和ii)基于所述生物体中所述标志物的所述浓度确定所述生物状态是否存在。在另外的实施方式中，本发明提供用于检测生物体中是否存在一种生物状态的方法，包括i)测量来自所述生物体的多个生物样品中标志物的浓度，其中所述标志物是通过包括测定从第一群体获得的生物样品中所述标志物的浓度范围的方法建立的标志物，其中所述测定包括通过检测所述标志物的单个分子测量所述生物样品中所述标志物的浓度；和ii)基于所述多个样品中所述标志物的所述浓度确定所述生物状态是否存在。在一些实施方式中，所述样品为不同类型的。在一些实施方式中，所述生物状态的确定是基于所述不同类型的样品中所述标志物的浓度的比较。在一些实施方式中，样品是相同类型的，且样品是间隔一段时间采取的。在一些实施方式中，生物样品是血液、血浆或血清。在一些实施方式中，本发明提供一种商业方法，包括使用与生物体的生物状态相关的权利要求1的系统鉴别一种或多种标志物；及使所述的一种或多种标志物在诊断中商业化以检测所述生物体中所述生物状态是否存在。在一些实施方式中，权利要求36的商业方法其中所述一种或多种标志物为多肽或小分子。在一些实施方式中，一种或多种标志物为新的化学个体。在一些实施方式中，所述商业方法进一步包括进行收费的诊断服务。在一些实施方式中，所述商业方法进一步包括出售基于所述一种或多种标志物的诊断产品。在一些实施方式中，本发明提供一种商业方法，包括使用包括测定从第一群体获得的生物样品中所述标志物的浓度范围的方法鉴别一种或多种标志物，其中所述测定包括通过检测与生物体的生物状态相关的所述标志物的单个分子测量所述生物样品中所述标志物的一些实施方式中，所述诊断服务是由CLIA认证的实验室提供的。在一些实施方式中，所述诊断服务提供给保健服务提供商、保险商或病人。在一个方面中，本发明提供组合物。在一些实施方式中，本发明提供用于检测标志物的标记物，其中所述标记物包括所述标志物的结合伴体和荧光结构，其中该荧光结构能够在受到其激发波长的激光器发射的光激发时发射至少约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，荧光结构包括荧光分子。在一些实施方式中，荧光分子包括多个荧光分子。在一些实施方式中，标记物包括大约2-10、2-8、2-6、2-4、3-10、3-8、3-6个荧光分子。在一些实施方式中，标记物包括大约2-4个荧光分子。在一些实施方式中，荧光染料分子包括至少一个取代的吲哚総环系统，该吲哚鐵环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。在一些实施方式中，焚光分子选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor647、AlexaFluor680或AlexaFluor700。在一些实施方式中，荧光分子选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor680或AlexaFluor700。在一些实施方式中，结合伴体包括抗体。在一些实施方式中，所述抗体为单克隆抗体。在一些实施方式中，所述抗体为多克隆抗体。在一些实施方式中，所述抗体为炎症标志物特异性的。在一些实施方式中，所述抗体为对选自趋化因子、生长因子、蛋白酶及抑制剂、细胞粘附分子、干细胞因子、信号转导和凋亡分子、神经营养因子和发育蛋白的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体为对生长因子特异性的。在一些实施方式中，抗体为对细胞因子特异性的。在一些实施方式中，细胞因子选自IL-12p70、IL-IO、IL-la、IL-3、IL-12p40、IL-lra、IL-12、IL-6、IL-4、IL-18、IL-10、IL-5、嗜酸性细胞活化趋化因子(eotaxin)、IL-16、MIG、IL-8、IL-17、IL-7、IL-15、IL-13、IL-2R(可溶性的)、IL-2、LIF/HILDA、IL画1卩、Fas/CD95/Apo-l或MCP-1。在一些实施方式中，熒光结构包括荧光分子。在一些实施方式中，荧光结构包括多个荧光分子。在一些实施方式中，标记物包括大约2-10、2-8、2-6、2-4、3-10、3-8或3-6个荧光分子。在一些实施方式中，标记物包括大约2-4个荧光分子。在一些实施方式中，荧光染料分子包括至少一个取代的吲哚総环系统，该吲哚鑰环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。在一些实施方式中，荧光分子选自AlexaFluor488、AlexaFl匿532、AlexaFluor647、AlexaFluor680或AlexaFluor700。在一些实施方式中，焚光分子选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor680或AlexaFluor700。在一些实施方式中，荧光分子为AlexaFluor647分子。通过引用引入本说明书中提到的所有出版物和专利申请通过引用引入本申请，就象各项出版物和专利申请特别地和单独地表明通过引用引入一样。附图简要说明本发明的新特征在所附的权利要求中详细地给出。可以通过参照下面对示例性实施方式的详细说明和附图得到对本发明的特征和优势的更好的理解，这些实施方式利用了本发明的原理。附图中图1A和图IB.单颗粒分析仪的部件排列的示意图。图1A显示了包括一个电磁源和一个电磁检测器的分析仪；图1B显示了包括两个电磁源和一个电磁检测器的分析仪。图2A和图2B.单颗粒分析仪的毛细管流动池示意图。图2A显示了包括一个电^t源的分析仪的流动池；而图2B显示了包括两个电》兹源的分析4义的流动池。图3A和图3B.显示单颗粒分析仪的激光器和检测器光学部件的传统(A)和共焦(B)定位的示意图。图3A显示了具有一个电》兹源和一个电磁检测器的分析仪的配置；图3B显示了具有两个电磁源和两个电磁检测器的分析仪的配置。图4.cTnl浓度范围的线性化标准曲线。图5.cTnl的生物阈(临界浓度)为7pg/ml的cTnl浓度，其确定为具有相应的10。/oCV的第99百分位数。图6.采用本发明的分析系统确定的cTnl分析结果与国家标准技术研究所(NationalInstituteofStandardsandTechnology)提供的标准测量值的相关性(R2=0.9999)。图7.从患有胸痛的急诊病人获得的系列血清样品中cTnl的检测。采用本发明的分析系统进行的测量与采用商用测试系统进行的测量进行比專交。图8.cTnl的正常生物浓度和从出现胸痛的病人获得的血清样品中cTnl浓度的分布。图9.LTE4的竟争曲线。LOD确定为1.5pg/mlLTE4。图10.显示Aktl浓度的标准曲线的曲线图。LOD计算为25pg/mlAktl。图11.显示TGF(3浓度的标准曲线的曲线图。LOD计算为350pg/mlTGF(3。图12.包括用于检测样品中的单个蛋白质分子的分析系统和至少一种包含荧光结构和所述蛋白质分子的结合伴体的标记物的试剂盒，其中分析仪包括用于激发荧光结构的电磁辐射源；供标记物通过的毛细管流动池；用于在毛细管流动池中移动标记物的动力源；在所述毛细管流动池中形成的用于接收所述电磁源发射的电磁辐射的探询空间；和可操作地与所述探询空间连接的用于测量所述受到激发的荧光结构的电磁特征的电磁辐射检测器，其中，所述荧光结构能够在受到其激发波长的激光器发射的光的激发时发射至少约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。图13.在为单颗粒分析系统开发的夹心(sandwich)分子免疫分析中测得的TREM-1标准曲线。分析的线性范围为100-1500fM。图14A-F.IL-6和IL-8的检测。A-B)IL-6的标准曲线。A)IL-6标准，按照商用试剂盒(R&DSystems,Minneapolis,MN)稀释得到0.1-10pg/ml之间的线性反应。B)1pg/ml以下的IL-6标准曲线。C)在血库献血者EDTA样本中确认的IL-6和IL-8分布。D)任何分析物的低浓度检测范围都可以通过将分析仪的检测方式从分子计数(数字信号)转换为检测在高浓度分析物时产生的光子总量(模拟信号)而扩展到较高浓度。单颗粒分析仪具有6个数量级(log)的扩展的线性动态范围。E)基于从数字检测到模拟检测的转换的6个数量级的检测范围。F)非线性化的标准曲线，显示了通过对个别颗粒发射的光子进行计数(数字信号)确定的IL-6的低浓度范围(0.1fg/ml-10fg/ml)和IL-6的高浓度范围(10fg/mN1pg/ml)。图15.本发明的分析与常规分析的对比。具体实施方式提纲I引言II通过本发明的方法和组合物进行灵敏检测的分子A.扭克i仑B.标志物III标记物A.结合伴体1.抗体B.荧光结构1.染料2.量子点C.结合伴体-焚光结构组合物IV分子的高灵敏分析A.样品B.样品制备C.目标分子的检测和浓度的测定V适用于分子的高灵敏分析的仪器和系统A.i殳备/系统B.单颗粒分析仪1.电》兹辐射源2.毛细管流动池3.动力4.检测器C.采样系统D.样品制备系统E.才羊品回收VI使用分子的高灵敏分析的方法A.方法B.典型的标志物1.心脏损伤2.传染病3.细胞因子4.炎症纟示志物5.疾病状态(关节炎)的标志物6.TGF(37.Aktl8.Fas酉己lC.商业方法VII试剂盒I引言本发明提供用于样品中单个分子的高灵敏检测和分子浓度的测定的仪器、试剂盒、组合物和方法。本发明的仪器、组合物、方法和有合适的波长和功率输出的电磁源、合适的探询空间尺寸、高数值孔径透镜、能够检测单光子的检测器和对单个分子进行计数的数据分析系统的因素的组合达到。本发明的仪器被称为"单分子检测器"或"单颗粒检测器，，，也包括在术语"单分子分析仪"或"单颗粒分析仪"的范围内。本发明的试剂盒和方法的灵敏度和精度在某些实施方式中通过利用本发明的仪器并连同选自(但不限于)分子标记物和在这里描述的仪器中分析该标记物的方法的组合而达到，所述分子标记物表现出使得该分子能够在单分子的水平被检测的特性。本发明的仪器、试剂盒和方法尤其用于单个蛋白质分子或小分子的灵敏和精确的检测，并用于测定样品中所述分子的浓度。因此，本发明在一些实施方式中提供用于通过检测单分子进行分子的灵敏检测和浓度测定的仪器和试剂盒、用于这种检测和测定的标记物及在样品的分析中使用这种仪器和标记物的方法。特别是，本发明的仪器、试剂盒和方法的灵敏度和精度使得对极低浓度(如低于约100、10、1、0.1、0.01或0.001毫微微摩尔的浓度)的分子(如生物状态的标志物)进行检测和浓度测定成为可能。在进一步的实施方式中，本发明的仪器和试剂盒能够在大的动态浓度范围上测定物质(如分子)的浓度而不需要稀释或对样品进行其它处理，如在大于105倍、106倍或107倍的浓度范围上。本发明的仪器、试剂盒和方法的高灵敏度使得能够利用先前因为缺乏检测灵敏度而不可能使用的标志物(如生物标志物)及建立新的标志物。有许多目前可得到的标志物虽然可潜在地用于确定生物状态，但由于它们的较低范围未知而在目前不能得到实际的利用。在某些情况下，标志物的异常高水平可被现有的方法检测到，但正常范围还没有确定。在某些情况下，标志物的较高正常水平可被检测到，但较低的正常水平或低于正常的水平检测不到。在某些情况下，例如对胂瘤特异性的标志物或感染标志物，标志物的任何水平都表明生物状态可能存在，而提高检测灵敏度有利于早期诊断。在某些情况下，标志物浓度在多个时间点上的变化速率或没有发生变化提供了最有用的信而这时通常是这种状态最好治疗的时候。在某些情况下，标志物可能仅能通过在临床环境中不实用或不可用的繁瑣的方法(例如需要复杂的样品处理和费时的分析的方法)以在临床上有用的水平进4亍#r测。另外，也有一些以足够低的浓度存在的潜在的生物状态标志物，它们的存在通过目前的方法进行检测仍然是极其困难的或是不可能的。本发明的分析方法和组合物提供了使得能够对先前不可能检测到标志物的浓度的生物状态标志物进行检测的灵敏度、精度和稳定性水平，因此使得能够将这些标志物从确认标志物或仅可在受限的研究环境中使用的标志物"转化(repurposing)"为诊断、预后、治疗指导标志物或其它类型的可用于临床环境和/或大规模临床环境(如临床试验)中的标志物。这些方法使得能够确定这些标志物的正常和异常范围。如此转化的标志物可被用于，例如，正常状态(正常范围)的检观'J、反应者Z非反应者(例如，对如施用药物的治疗的反应)的检测，早期疾病或病变的检测(如最早期阶段的癌症的检测、心肌缺血的早期检测)，疾病(如癌症)分期，疾病监测(如糖尿病监测、治疗后癌症复发的监测)，疾病机理的研究和中毒(如药物治疗的中毒)的治疗研究。因此本发明提供了用于标志物的灵敏检测的方法和组合物，和进一步的确定标志物的正常和异常水平值的方法。在进一步的实施方式中，本发明提供了基于标志物的确定值进行诊断、预后和/或治疗的选择的方法。本发明还提供在这些方法中使用的组合物，例如用于标志物的超灵敏检测的检测试剂。II通过本发明的方法和组合物进行灵敏检测的分子本发明的仪器、试剂盒和方法可用于许多不同类型的单分子的灵敏检测和浓度测定。特别是，该仪器、试剂盒和方法可用在生物状态标志物的灵敏检测和浓度测定中。这里所用的术语"单分子检测"指的是直接的和间接的检测两者。例如，单分子可以用荧光标记物标记，且该分子-标记物复合体在这里描述的仪器中进行检测。可选择地，单分子可以用荧光标记物标记，然后荧光标记物与单分子脱离，且该标记物在这里描述的仪器中进行检测。单分子检测的术语涵盖了这两种检测形式。A.概论可以采用本发明的分析仪和相关方法检测的分子的例子包括如蛋白质、核酸、碳水化合物的生物聚合物和小分子(有机的和无机的两种)。特别是，这里描述的仪器、试剂盒和方法可用在生物样品中蛋白质和小分子的单分子检测中和用在样品中这类分子的浓度测定中。术语"蛋白质"、"多肽"、"肽"和"寡肽"在这里可互换使用，并包括任何含有通过肽键联结在一起的两个或多个氨基酸的复合物。可以理解，多肽可以包含通常被称为20种天然产生的氨基酸的那20种氨基酸之外的氨基酸。另外，多肽可以包括一个或多个通过现有技术中已知的方式(不管是天然的或非天然的)修饰的氨基酸(包括末端氨基酸)。多肽修饰的例子包括，例如糖基化作用或其它翻译后修饰。可以在本发明的多肽中存在的修饰包括，但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价连结、血红素结构的共价连结、多核苷酸或多核苷酸衍生物的共价连结、脂或脂类衍生物的共价连结、磚脂酰肌醇的共价连结、交联、环化、形成二硫键、脱甲基、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、曱酰化、？羧化、糖化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、曱基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊烯化、消旋化、硒基化(selenoylation)、A乾酸化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸，如精氨酰化(arginylation)和泛素化。本发明的仪器、试剂盒和方法检测的分子可以是游离的或是复合体(如抗体-抗原复合体，或更一般地说，如肌钙蛋白复合体的蛋白-蛋白复合体)的一部分。B.生物状态的标志物在一些实施方式中，本发明提供用于生物标志物的灵敏检测和用于该标志物在诊断、预后和/或确定治疗方法中的用途的组合物和方法。本发明的标志物可以是，例如，任何与生物体的生物状态(举例说，如疾病或非疾病的状况)相关的合成物和/或分子，或合成物和/或分子的复合体。标志物可以是，例如，小分子、多肽、核酸(如DNA和RNA)、脂类(如磷脂或胶束)、细胞组分(如线粒体或叶绿体)等。本发明预想的标志物可以是先前已知的或未知的。例如，在一些实施方式中，这里的方法可以识别可用作所关注的生物状态或所关注的状况的标志物的新的多肽，而在其它的实施方式中，已知的多肽被识别为所关注的生物状态或状况的标志物。采用本发明的系统，观察到仅以低浓度存在的那些在确定生物体的生物状态中非常可能有用的标志物(如多肽)是可能的，如从疾病组织中"漏出的"标志物。其它具有高度的利用潜能的标志物或多肽可以是与疾病相关的那些标志物，例如，那些在肿瘤-宿主环境中产生的标志物。任何合适的提供关于生物状态的信,包、的标志物都可以用在本发明的方法和组合物中。这里所用的术语"标志物"涵盖任何可以在来自生物体的样品中检测到的分子，且其检测或定量提供了关于该生物体的生物状态的信息。生物状态包括，但不限于表型状态、影响生物体的状况，发育状态，年龄，健康状态，病变，疾病检测、进程或分期，感染，中毒，或对化学、环境或药物因子的反应(如药物响应表型、药物毒性表型或药物效力表型)。这里所用的术语"生物体"指的是任何由至少一个细胞构成的活的生物。生物体可以简单到如单细胞生物或复杂到如哺乳动物。本发明的生物体优选为哺乳动物。这种哺乳动物可以是，例如，人类或如灵长类(例如猴、黑猩猩等)、驯养动物(例如狗、猫、马等)、农畜(例如山羊、绵羊、猪、牛等)或实验动物(例如小鼠、大鼠等)的动物。优选地，生物体是人。在一些实施方式中，本发明的方法和组合物涉及几类标志物，如细胞因子、生长因子、肿瘤标志物、炎症标志物、内分泌标志物、自身免疫标志物、曱状腺标志物、心血管标志物、糖尿病标志物、传染病标志物、神经标志物、呼吸标志物、胃肠标志物、肌肉骨骼标志物、皮肤病标志物和代谢标志物。下面的表l提供了已用本发明的方法和组合物测量的标志物的这些类别的实例，并提供了通过本发明的方法和组合物检测的标志物的浓度和通过本发明的单颗粒分析系统计算的特定标志物的颗粒数。表1标志物类别和这些类别中的典型标志物<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>细胞因子对于研究和诊断两方面，细胞因子都可用作许多状况、疾病、病变等的标志物，且本发明的组合物和方法包括用于对细胞因子进行检测和定量的标记物和采用这些标记物确定细胞因子的正常和异常水平的方法，以及基于这些水平进行诊断、预后和/或确定治疗方案的方法。目前有超过100种细胞因子/趋化因子，其协调的或不协调的调节作用具有临床意义。为使特定的疾病过程与细胞因子水平发生联系，理想的途径需要针对给定的细胞因子或多种细胞因子对样品进行高灵敏度的分析。目前用于标志物组(markerpanel)中且可以在本发明的方法和组合物中使用的典型细胞因子包括，但不限于BDNF、CREBpS133、总CREB、DR-5、EGF、ENA-78、嗜酸性细胞活化趋化因子、脂肪酸结合蛋白、碱性FGF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、GCP-2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF(GM-CSF)、生长相关致癌基因-角质化细胞(GRO-KC)、HGF、ICAM-1、IFN-a、IFN-p白介素IL-IO、IL-11、IL-12、IL-12p40、IL-12p40/p70、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、1L-18、IL-l(x、IL-1(3、IL-lra、IL-1ra/IL-1F3、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、干扰素诱导蛋白(10IP-IO)、JE/MCP-1、角质化细胞(KC)、KC/GROa、LIF、淋巴细胞趋化因子(Lymphotacin)、M-CSF、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、MCP-1(MCAF)、MCP-3、MCP-5、MDC、MIG、巨噬细胞炎症蛋白(MIP-la)、MIP-1(3、MIP-ly、MIP-2、MIP-3卩、OSM、PDGF-BB、活化时调节的正常T细胞表达和分泌的细月包因子(RANTES)、Rb(pT821)、Rb(总)、RbpSpT249/252、Tau(pS214)、Tau(pS396)、Tau(总)、组织因子、月中瘤坏死因子a(TNF-oc)、TNF画卩、TNF-RI、TNF-RII、VCAM-1和VEGF。在一些实施方式中，细胞因子为IL-12p70、IL-IO、IL-la、IL-3、IL-12p40、IL-lra、IL-12、IL-6、IL-4、IL画18、IL画IO、IL-5、嗜酸性细胞活化趋化因子、IL-16、MIG、IL-8、IL-17、IL-7、IL-15、IL-13、IL-2R(可溶的)、IL-2、LIF/HILDA、IL-1(3、Fas/CD95/Apo-l或MCP-1。生长因子生长因子包括EGF配体，如双调蛋白、LRIG3、(3纟田月包素、神经调节蛋白(Neuregulin)-1/NRG1、EGF、神经调节蛋白-3/NRG3、表皮生长因子(Epigen)、TGF-a、表皮调节素(Epiregulin)、TMEFFl/Tomoregulin-l、HB-EGF、TMEFF2、LRIG1;EGFR/ErbB受体家族，如EGFR、ErbB3、ErbB2、ErbB4;FGF家力美，如FGF配体酸性FGF、FGF-12、碱性FGF、FGF-13、FGF-3、FGF-16、FGF-4、FGF-17、FGF-5、FGF-19、FGF-6、FGF-20、FGF画8、FGF画21、FGF-9、FGF画22、FGF-IO、FGF-23、FGF-ll、KGF/FGF-7,FGF受体FGFRl画4、FGFR3、FGFRl、FGFR4、FGFR2、FGFR5,FGF调节剂FGF-BP;刺猬(Hedgehog)基因家族沙漠刺猬(DesertHedgehog)、索尼克刺猬(SonicHedgehog)、印度刺猬(IndianHedgehog);刺猬基因相关分子及调节剂BOC、GLI-3、CDO、GSK-3a/(3、DISPl、GSK-3a、Gasl、GSK-3p、GLI-1、Hip、GLI-2;IGF家族IGF配体IGF-I、IGF-II,IGF-I受体(CD221)IGF-1R和IGF结合蛋白(IGFBP)家族ALS、IGFBP-5、CTGF/CCN2、IGFBP-6、Cyr61/CCN1、IGFBP-LI、内皮细胞特异性分子(Endocan)、IGFBP-rpl/IGFBP-7、IGFBP-l、IGFBP-rP10、IGFBP-2、NOV/CCN3、IGFBP-3、WISP-1/CCN4、IGFBP-4;受体酪氨酸激酶Axl、FGFR4、ClqRl/CD93、FGFR5、DDRl、Flt-3、DDR2、HGFR、Dtk、IGF-IR、EGF、RIGF-IIR、Eph、INSRR、EphAl、胰岛素R7CD220、EphA2、M-CSFR、EphA3、Mer、EphA4、MSPR/Ron、EphA5、MuSK、EphA6、PDGFRa、EphA7、PDGFRp、EphA8、Ret、EphBl、RTK样孤儿受体1/ROR1、EphB2、RTK样孤儿受体2/ROR2、EphB3、SCFR/c-kit、EphB4、Tie-l、EphB6、Tie-2、ErbB2、TrkA、ErbB3、TrkB、ErbB4、TrkC、FGF、R1-4VEGFR、FGFR1、VEGFRl/Flt-1、FGFR2、VEGFR2/KDR/Flk-1、FGFR3、VEGFR3/Flt-4;蛋白多糖及调节剂蛋白多糖聚合素(ProteoglycansAggrecan)、Mimecan、集聚蛋白(Agrin)、NG2/MCSP、双糖链蛋白多糖、Osteoadherin、核心蛋白多糖(Decorin)、Podocan、DSPG3、5-肌聚糖、内皮细胞特异性分子、多配体蛋白聚糖(Syndecan)-1/CD138、四聚糖(Endoglycan)、多配体蛋白聚糖-2、Endorepellin/串珠素、多配体蛋白聚糖-3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2、多配体蛋白聚糖-4、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、睾素(Testican)1/SPOCKl、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5、睾素2/SPOCK2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖6、睾素3/SPOCK3、基膜聚糖(Lumican)、多功能蛋白聚糖，蛋白多糖调节剂芳基硫酸酯酶A/ARSA、葡糖胺(N-乙酰)-6-硫酸酯酶/GNS、Exostosin样2/EXTL2、HS6ST2、Exostosin样3/EXTL3、艾杜糖2-硫酸酯酶/IDS、GalNAc4S-6ST;SCF、Fit-3配体及M-CSFFlt画3、M-CSFR、Flt画3配体、SCF、M-CSF、SCFR/c-kit;TGF-卩超家族(如炎症标志物所列的一样)；VEGF/PDGF家族神经毡蛋白(Neuropilin)-1、P1GF、神经毡蛋白-2、PlGF-2、PDGF、VEGF、PDGFRouVEGF-B、PDGFR(3、VEGF-C、PDGF-A、VEGF-D、PDGF-AB、VEGFR、PDGF-B、VEGFRl/Flt-1、PDGF-C、VEGFR2/KDR/Flk-1、PDGF-D、VEGFR3/Flt-4;Wnt相关分子Dickkopf蛋白及Wnt抑制剂Dkk-l、Dkk-4、Dkk-2、Soggy-1、Dkk-3，WIF-1巻曲及相关蛋白Frizzled-l、Frizzled-8、Frizzled-2、Frizzled-9、Frizzled-3、sFRP-1、Frizzled-4、sFRP-2、Frizzled-5、sFRP-3、Frizzled-6、sFRP-4、Frizzled-7，MFRPWnt配体Wnt-1、Wnt-8a、Wnt-2b、Wnt-8b、Wnt-3a、Wnt-9a、Wnt-4、Wnt-9b、Wnt-5a、Wnt-10a、Wnt-5b、Wnt-10b、Wnt-7a、Wnt-11、Wnt-7b;其它Wnt相关分子APC、Kremen-2、Axin-l、LRP-1、p-连环蛋白(Catenin)、LRP-6、Dishevelled-1、Norrin、Dishevelled-3、PKC(31、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、Pygopus-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5、Pygopus-2、GSK-3a/(3、R-Spondinl、GSK-3a、R-Spondin2、GSK-3p、R-Spondin3、ICAT、RTK样孤儿受体1/ROR1、Kremen-l、RTK样孤儿受体2/ROR，和其它生长因子CTGF/CCN2、卩-NGF,Cyr61/CCN1、Norrin、DANCE、NOV/CCN3、EG-VEGF/PK1、骨织素(Osteocrin)、生肝素(Hepassocin)、PD-ECGF、HGF、颗粒蛋白前体(Progmnulin)、LECT2、血栓形成素(Thrombopoietin)、LEDGF、WISP-1/CCN4。炎症标志物炎症标志物包括ICAM-1、RANTES、MIP-2、MIP-1-|3、MIP-l-a和MMP-3。更多的炎症标志物包括粘附分子，如整联蛋白aipi、a2(31、a3pi、a4pi、a5|31、a6卩l、a7(31、a8(31、a9(31、aVpl、a4卩7、a6(34、aD卩2、aL(32、aM卩2、aV(33、aV卩5、aV(36、aV(38、aX卩2、allb(33、口IELb卩7、卩-2整联蛋白、(3-3整联蛋白、P-2整联蛋白、P-4整联蛋白、P-5整联蛋白、p-6整联蛋白、(3-7整联蛋白、(3-8整联蛋白、a-l整联蛋白、a-2整联蛋白、a-3整联蛋白、a-4整联蛋白、a-5整联蛋白、a-6整联蛋白、a-7整联蛋白、a-8整联蛋白、a-9整联蛋白、a-D整联蛋白、a-L整联蛋白、a-M整联蛋白、a-V整联蛋白、a-X整联蛋白、a-lib整联蛋白、a-IELb整联蛋白；整联蛋白相关分子，如(3IG-H3、贝美噻嗪(Melusin)、CD47、MEPE、CD151、骨桥蛋白、IBSP/骨唾液酸糖蛋白II、RAGE、IGSF8;选择蛋白，如E-选择蛋白、P-选择蛋白、L-选择蛋白；配体，如CD34、GlyCAM-l、MadCAM-l、PSGL-1、玻璃粘附蛋白(vitronectic)、玻璃粘附蛋白受体、纤连蛋白、玻璃粘附蛋白(vitronectin)、胶原、层粘连蛋白，ICAM-1、ICAM-3、BL-CAM、LFA画2、VCAM-1、NCAM、PECAM。更多的炎症标志物包括细胞因子，如IFN-ouIFN-(3、IFN-s、-k、-t和-；、IFN-oo、IFN-y、IL29、IL28A和IL28B、IL-1、IL-1口和.口、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、TCCR/WSX-1。更多的炎症标志物包括细胞因子受体，如公用卩链、IL-3Ra、IL-3RP、GM-CSFR、IL-5Ra、公用y链/IL画2Ry、IL-2Ra、IL-9R、IL-2R卩、IL-4R、IL-21R、IL-15Ra、IL-7Ra/CD127、IL-1ra/IL-1F3、IL-1R8、IL-1RI、IL-1R9、IL-1RII、IL-18Ra/IL-1R5、IL-1R3/IL-1RAcP、IL-18R卩/IL-1R7、IL-1R4/ST2SIGIRR、IL-1R6/IL-1Rrp2、IL-11Ra、IL-31RA、CNTFRa、瘦素R、G-CSFR、LIFRa、IL-6R、OSMR卩、IFN-a/(3Rl、IFN-a/|3R2、IFN-yR1、固-yR2、IL-10Ra、IL-10R(3、IL-20Ra、IL-20R(3、IL-22R、IL-17R、IL-17RD、IL-17RC、IL-17BR、IL-13Ra2、IL-23R、IL-12RfH、IL-12R(32、TCCRAVSX-1、IL-13Ral。更多的炎症标志物包括趋化因子，如CCL-1、CCL-2、CCL-3、CCL-4、CCL-5、CCL-6、CCL-7、CCL-8、CCL-9、CCL-IO、CCL-ll、CCL-12、CCL-13、CCL-14、CCL-15、CCL-16、CCL-17、CCL-18、CCL-19、CCL-20、CCL-21、CCL-22、CCL-23、CCL-24、CCL-25、CCL-26、CCL-27、CCL-28、MCK-2、MIP-2、CINC-1、CINC-2、KC、CINC-3、LIX、GRO、胸腺趋化因子-1、CXCL-1、CXCL-2、CXCL-3、CXCL-4、CXCL-5、CXCL-6、CXCL-7、CXCL-8、CXCL-9、CXCL-IO、CXCL-ll、CXCL-12、CXCL-13、CXCL-14、CXCL-15、CXCL-16、CXCL-17、XCL1、XCL2、凯莫瑞(Chemerin)。更多的炎症标志物包括趋化因子受体，如CCR-1、CCR-2、CCR-3、CCR-4、CCR画5、CCR画6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR-IO、CXCR3、CXCR6、CXCR4、CXCR1、CXCR5、CXCR2、ChemR23。更多的炎症标志物包括肿瘤坏死因子(TNF)，如TNFa、4画1BB酉己体/TNFSF9、LIGHT/TNFSF14、APRIL/TNFSF13、淋巴毒素、BAFF/TNFSF13B、淋巴毒素卩/TNFSF3、CD27酉己体/TNFSF7、OX40酉己体/TNFSF4、CD30酉己体/TNFSF8、TL1A/TNFSF15、CD40酉己体/TNFSF5、TNF-a/TNFSFIA、EDA、TNF-(3/TNFSFIB、EDA-A2、TRAIL/TNFSF10、Fas酉己体/TNFSF6、TRANCE/TNFSF11、GITR配体/TNFSF18、TWEAK/TNFSF12。更多的炎症标志物包括TNF超家族受体，如4-1BB/TNFRSF9、NGFR/TNFRSF16、BAFFR/TNFRSF13C、骨保护素(Osteoprotegerin)/TNFRSFl1B、BCMA/TNFRSF17、OX40/TNFRSF4、CD27/TNFRSF7、RANK/TNFRSF11A、CD30/TNFRSF8、RELT/TNFRSF19L、CD40/TNFRSF5、TACI/TNFRSF13B、DcR3/TNFRSF6B、TNFRI/TNFRSF1A、DcTRAILR1/TNFRSF23、TNFR1I/TNFRSF1B、DcTRAILR2/TNFRSF22、TRAILR1/TNFRSF10A、DR3/TNFRSF25、TRAILR2/TNFRSF10B、DR6/TNFRSF21、TRAILR3/TNFRSF10C、EDAR、TRAILR4/TNFRSF10D、Fas/TNFRSF6、TROYZTNFRSF19、GITR/TNFRSF18、TWEAKR/TNFRSF12、HVEM/TNFRSF14、XEDAR。更多的炎症标志物包括TNF超家族调节剂，如FADD、TRAF-2、R1P1、TRAF-3、TRADD、TRAF-4、TRAF-1、TRAF-6。更多的炎症标志物包括急性期反应物和急性期蛋白。更多的炎症标志物包括TGF-(3超家族配体，如活化素(Activin)，活化素A、活化素B、活化素AB、活化素C、BMP(骨形成蛋白)，BMP-2、BMP-7、BMP-3、BMP-8、BMP-3b/GDF-10、BMP-9、BMP-4、BMP-10、BMP-5、BMP-15/GDF-9B、BMP-6，Decapentaplegic，生长/分化因子(GDF)，GDF-1、GDF-8、GDF-3、GDF-9GDF-5、GDF-ll、GDF-6、GDF甲15、GDF-7,GDNF家族配体，Artemin、Neurturin、GDNF、Persephin、TGF-(3、TGF-卩、TGF-(33、TGF-131、TGF-卩5、LAP(TGF-(31)、潜在TGF-(3bpl、潜在TGF-|31、潜在TGF-(3bp2、TGF-卩1.2、潜在TGF画(3bp4、TGF-卩2、Lefty、MIS/AMH、Lefty-l、Nodal、Lefty-A、活化素RIA/ALK-2、GFRa-l/GDNFRa-l、活化素RIB/ALK-4、GFRa-2/GDNFRa-2、活化素RIIA、GFRa-3/GDNFRa画3、活化素RIIB、GFRa画4/GDNFRa-4、ALK-1、MISRII、ALK-7、Ret、BMPR-IA/ALK-3、TGF-(3RI/ALK-5、BMPR-IB/ALK-6、TGF-(3RII、BMPR-II、TGF-(3R!Ib、内皮因子(Endoglin)/CD105、TGF-(3RI11。更多的炎症标志物包括TGF-(3超家族调节剂，如无羊膜(A腿ionless)、NCAM-1/CD56、BAMBI/NMA、成头蛋白(Noggin)、BMP-1/PCP、NOMO、Caronte、PRDC、Cerberus1、SKI、腱蛋白(Chordin)、Smadl、腱蛋白样1、Smad2、月建蛋白样2、Smad3、COCO、Smad4、CRIM1、Smad5、Cripto、Smad7、翅无横脉(Crossveinless)-2、Smad8、隐义(Cryptic)、SOST、DAN、潜在TGF-(3bpl、核心蛋白聚糖、潜在TGF-(3bp2、FLRG、潜在TGF-(3bp4、滤泡稳定蛋白(Follistatin)、TMEFFl/Tomoregulin-1、滤泡稳定蛋白样1、TMEFF2、GASP-1/WFIKKNRP、TSG、GASP-2層IKKN、TSK、Gremlin、Vasorin。更多的炎症标志物包括EGF配体，如双调蛋白、LRIG3、乙胞素(Betacellulin)、神经调节蛋白-1/NRG1、EGF、神经调节蛋白-3/NRG3、表皮生长因子、TGF-a、表皮调节素、TMEFFl/Tomoregulin-l、HB-EGF、TMEFF2、LRIG1。更多的炎症标志物包括EGFR/ErbB受体家族，如EGFR、ErbB3、ErbB2、ErbB4。更多的炎症标志物包括纤维蛋白原。更多的炎症标志物包括SAA。更多的炎症标志物包括神经月交质标志物，如a.l-抗胰蛋白酶、C-反应蛋白(CRP)、(x2-巨球蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、Mac-1、F4/80。更多的炎症标志物包括髓过氧物酶。更多的炎症标志物包括补体标志物，如C3d、Clq、C5、C4d、C4bp和C5a-C9。更多的炎症标志物包括主要组织相容性复合体(MHC)糖蛋白，如HLA-DR和HLA-A、D、C。更多的炎症标志物包括微胶质(Microglial)标志物，如CR3受体、MHCI、MHCII、CD31、CDlla、CDllb、CDllc、CD68、CD45RO、CD45RD、CD18、CD59、CR4、CD45、CD64和CD44。更多的炎症标志物包括a2-巨球蛋白受体、成纤细胞生长因子、FcyRI、FeyRII、CD8、LCA(CD45)、CD18()、CD59、ApoJ、成簇蛋白(clusterin)、2型纤溶酶原激活物抑制剂、CD44、巨噬细胞集落刺激因子受体、MRP14、27E10、4-羟壬烯醛-蛋白质结合物、I.k.B、NF.k，B、cPLA.sub.2、COX-2、基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinase)、膜脂质过氧化和ATP酶活性。HSPC228、EMP1、CDC42、TLE3、SPRY2、p德BP、HSPC060或NAB2，或HSPA1A、HSPA1B、MAPRE2和OAS1表达的下调，TACE/ADAM17、a-l-酸性糖蛋白、血管位蛋白(Angiopoietin)-1、MEF、血管位蛋白-2、CD14、(3-防卫蛋白(Defensin)2、MMP-2、ECF-L/CHI3L3、MMP-7、EGF、MMP-9、EMAP-II、MSP、EN-RAGE、一氧化氮、内皮素(Endothelin)-1、骨活素(Osteoactivin)/GPNMB、FPR1、PDGF、FPRL1、五聚体蛋白(Pentraxin)3/TSG-14、FPRL2、Gas6、PLUNC、GM-CSF、RAGE、S100A10、S100A8、S100A9、HIF-1a、P物质、TFPI、TGF-(31、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、TLR4、LBP、TREM-1、白三烯A4、水解酶TSG-6、脂质运载蛋白(Lipocalin)-l、uPA、M-CSF和VEGF。肺瘤标志物包括EGF、TNF-a、PSA、VEGF、TGF-卩1、FGFb、TRAIL和TNF-RI(p55)。内分泌功能标志物包括17(3-雌二醇(E2)、DHEA、ACTH、胃泌素和生长激素(hGH)。自身免疫标志物包括GM-CSF、C-反应蛋白和G-CSF。曱状腺功能标志物包括环AMP、降钙素和曱状旁腺激素。心血管标志物包括心肌肌4丐蛋白I、心肌肌4丐蛋白T、B-利钠肽、NT-proBNP、C-反应蛋白HS和卩-血小板球蛋白(betatrhrorriboglobulin)。糖尿病标志物包括C-肽和瘦素。传染病标志物包纟舌IFN-y和IFN-a。代谢标志物包括生物学全段PTH(l-84)和PTH。生物状态的标志物标志物可以表明所关注的特定表型状态的存在。表型状态的例子包括由环境改变、药物治疗、基因操作或突变、损伤、饮食变化、老化或者单个生物体或一类或一小类生物体的任何其它特性导致的表型。在一些实施方式中，所关注的表型状态是临床诊断的疾病状态。这种疾病状态包括，例如，癌症、心血管疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、神经系统疾病、传染病和妊娠相关疾病。可选冲奪地，健康状态可以使用标志物进^于;险测。本发明的一些方面包括癌症表型。这里癌症的例子包括，但不限于乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、及喉、胆嚢、胰腺、直肠、甲状旁腺、甲状腺、肾上腺、神经组织、头和颈、结肠、胃、支气管、肾的癌症、基底细胞癌、溃疡型和乳头型两种类型的鳞状细胞癌、皮肤转移癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、网状细胞肉瘤(veticulumcellsarcoma)、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺肿瘤、非小细胞肺癌胆石、胰岛细胞瘤、原发性脑瘤、急性和慢性淋巴细胞和粒细胞瘤、毛细胞瘤(hairy-celltumor)、腺瘤、过度增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤(mucosalneuronms)、肠一申经节纟田月包瘤(intestinalganglioneuromas)、增生斗生角月莫神经瘤、高石黄酸体质瘤(marfanoidhabitustumor)、肾母细胞瘤(Wilm'stumor)、4青原细月包瘤、卵巢肿瘤、平滑月几瘤(leiomyomatertumor)、子宫颈非典型增生和原位癌、成神经细胞瘤、成^L网膜细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌瘤、局部皮肤损伤、蕈类肉牙肿(mycosisfungoide)、横紋肌肉瘤、卡波济氏肉瘤、骨原性和其它肉瘤、肿瘤性高钙血症(malignanthypercalcemia),肾细月包月中瘤、真性红细月包增多症(polycythermiavera)、腺癌、多形性胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforma)、白血病、淋巴瘤、恶性黑色素瘤、表皮样癌及其它癌和肉瘤。本发明的其它应用可以包括心血管疾病。心血管疾病的例子包括，但不限于充血性心力衰竭、高血压、心律失常、动脉粥样^_化、胆固醇、预激综合征、长QT综合征、心绞痛、心动过速、心动过緩、心房纤颤、心室纤颤、充血性心力衰竭、心肌缺血、心肌梗塞、心压塞、心月几炎、心包炎、心律失常性右心室发育不良、肥厚型心肌病、威廉斯综合征、心脏瓣膜疾病、心内膜炎、细菌性的、肺动脉闭锁、主动脉瓣狭窄、雷诺氏病、雷诺氏病、胆固醇栓塞、瓦伦贝格综合征、希-林二氏病和毛细管扩张。本发明的其它实施方式可以包括炎性疾病和自身免疫疾病。炎性疾病和自身免疫疾病的例子包括，但不限于风湿性关节炎、非特异性关节炎、喉部炎性疾病、炎症性肠病、牛皮癣、曱状腺机能减退(如桥本曱状腺炎)、结肠炎、l型糖尿病、骨盆炎症性疾病、中枢神经系统炎性疾病、颞动脉炎、风湿性多肌痛、关节强硬性脊推炎、结节性多动脉炎、莱特尔综合征、硬皮病、系统性红斑狼疮。本发明的方法和组合物还可以提供有关传染病标志物的实验室信息，传染病标志物包括腺病毒、百日咳杆菌(Bordellapertussis)、肺炎衣原体(Chlamydiapneumoiea)、沙3艮衣原体(Chlamydiatrachomais)、霍舌L毒素、霍乱毒素(3、空肠弯曲菌、巨细胞病毒、白喉毒素(DiptheriaToxin)、EB(Epstein-Barr)NA、EBEA、EBVCA、幽门螺杆菌、乙型肝炎病毒(HBV)核心、乙型肝炎病毒(HBV)包膜、乙型肝炎病毒(HBV)表面(Survace)(Ay)、丙型肝炎病毒(HCV)核心、丙型肝炎病毒(HCV)NS3、丙型肝炎病毒(HCV)NS4、丙型肝炎病毒(HCV)NS5、曱型肝炎(HepititisA)、丁型肝炎(HepititisD)、戊型肝炎病毒(HEV)orf23KD、戊型肝炎病毒(HEV)orG6KD、戊型肝炎病毒(HEV)orf33KD、人体免疫缺陷病毒(HIV)-1p24、人体免疫缺陷病毒(HIV)-1gp41、人体免疫缺陷病毒(HIV)-1gp120、人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱渗病毒HSV-1/2、单纯疱渗病毒HSV-1gD、单纯疱渗病毒HSV-2gG、人T细胞白血病病毒(HTLV)-1Z2、流感A、流感AH3N2、流感B、杜氏利什曼原虫、莱姆病、流行性腮腺炎、肺炎支原体、结核分枝杆菌(M.teberculosis)、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、巨细胞性包含体病毒(Rubella)、麻渗、链球菌溶血素O、破伤风毒素、梅毒螺旋体15kd、梅毒螺旋体p47、克氏锥虫、弓形体和水痘带状疱渗(VaricellaZoater)的标志物。III标记物在一些实施方式中，本发明提供了包括用于分子(如标志物)的高灵敏4全测和定量的标"i己物的方法和组合物。本领域技术人员可以认识到，可以采用许多的策略标记目标分子从而能够在颗粒混合物中对它们进行一全测和辨别。标记物可以通过任何已知的手段进行连接，包括利用标记物和目标之间的非特异性或特异性相互作用的方法。标记物可以提供可检测的信号或影响颗粒在电场中的移动性。另外，标记可以直接完成或通过结合伴体完成。在一些实施方式中，标记物包含对目标分子的结合伴体，其中结合伴体与焚光结构连结。本发明的组合物和方法可以利用高焚光结构，例如在受到该结构的激发波长的激光器发射的光激发时能够发射至少约200个光子的结构，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。适用于本发明的组合物和方法的结构下面进行更详细的i兌明。在一些实施方式中，本发明提供用于检测生物分子的标记物，其包受到该结构的激发波长的激光器发射的光激发时能够发射至少约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，所述结构包括多个焚光体，例如大约2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10或3-5、3-6、3-7、3-8、3-9或3-10个焚光体。在一些实施方式中，生物分子是蛋白质或小分子。在一些实施方式中，生物分子是蛋白质。荧光体可以是荧光染料分子。在一些实施方式中，荧光染料分子包括至少一个取代的吲哚鐵环系统，其中该吲咮鐵环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。在一些实施方式中，染料分子为选自AlexaFl駆488、AlexaFluor532、AlexaFluor647、AlexaFluor680或AlexaFluor700的AlexaFluor分子。在一些实施方式中，染料分子为AlexaFluor647染料分子。在一些实施方式中，染料分子包括第一型和第二型染料分子(如两种不同的AlexaFluor分子)，其中，例如第一型和第二型染料分子具有不同的发射光语。第一型与第二型染料分子的数目的比率可以为，例如4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3或1:4。结合伴体可以是，例如抗体。在一些实施方式中，本发明提供用于标志物的检测的标记物，其中该标记物包含标志物的结合伴体和荧光结构，其中所述荧光结构能约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，荧光结构包括多个荧光分子，例如大约2-10、2-8、2-6、2-4、3-10、3-8、3-6个荧光分子。在一些实施方式中，标记物包括约2-4个荧光分子。在一些实施方式中，荧光染料分子包括至少一个取代的吲哚鐵环系统，其中该吲哚鑰环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。在一些实施方式中，荧光分子选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor647、AlexaFluor680或AlexaFluor700。在一些实施方式中，荧光分子选自选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor680或AlexaFluor700。在一些实施方式中，结合伴体包括抗体。在一些实施方式中，抗体为单克隆抗体。在一些实施方式中，抗体为多克隆抗体。抗体可以是对任何合适的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体对选自细胞因子、生长因子、肺瘤标志物、炎症标志物、内分泌标志物、自身免疫标志物、曱状腺标志物、心血管标志物、糖尿病标志物、传染病标志物、神经标志物、呼吸标志物、胃肠标志物、肌肉骨骼标志物、皮肤病标志物和代谢标志物的标志物具有特异性。在一些实施方式中，抗体是对作为细胞因子的标志物具有特异性的。在一些实施方式中，细胞因子选自BDNF、CREBpS133、CREBTotal、DR-5、EGF、ENA-78、嗜酸性细胞活化趋化因子、脂肪酸结合蛋白、碱性FGF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、GCP-2粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF(GM-CSF)、生长相关致癌基因-角质化细胞(GRO-KC)、HGF、ICAM-l、IFN-a、IFN-y、白介素IL-10、IL-ll、IL-12、IL-12p40、IL-12p40/p70、IL画12p70、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-la、IL-1(3、IL-lm、IL-lra/IL-lF3、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、干扰素诱导蛋白(10IP-10)、JE/MCP-1、角质化细胞(KC)、KC/GROa、LIF、淋巴细胞趋化因子、M-CSF、单核细胞趋化蛋白-l(MCP-l)、MCP-1(MCAF)、MCP-3、MCP-5、MDC、MIG、巨噬细胞炎症蛋白(MIP-la)、MIP-1(3、MIP画ly、MIP画2、MIP-3卩、OSM、PDGF-BB、活化时调节的正常T细胞表达和分泌的细胞因子(RANTES)、Rb(pT821)、Rb(总)、RbpSpT249/252、Tau(pS214)、Tau(pS396)、Tau(总)、组织因子、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、TNF-(3、TNF-RI、TNF-RII、VCAM-1和VEGF。在一些实施方式中，细胞因子选自IL-12p70、IL-IO、IL陽la、IL-3、IL-12p40、IL-lra、IL-12、IL-6、IL-4、IL-18、IL-IO、IL-5、嗜酸性细胞活化趋化因子、IL-16、MIG、IL-8、IL-17、IL-7、IL-15、IL-13、IL-2R(可溶的)、IL-2、LIF/HILDA、IL-1(3、Fas/CD95/Apo-l和MCP-1。在一些实施方式中，抗体为对作为生长因子的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体对作为TGF-P的标志物是特异性的。在一些实施方式中，生长因子为GF配体，如双调蛋白、LRIG3、(3纟田月包素、神经调节蛋白-1/NRG1、EGF、神经调节蛋白-3/NRG3、表皮生长因子TGF-a、表皮调节素、TMEFFl/Tomoregulin-1、HB-EGF、TMEFF2、LRIG1;EGFR/ErbB受体家力矣，^口EGFR、ErbB3、ErbB2、ErbB4;FGF家力矣，长口FGF配体酸性FGF、FGF-12、碱性FGF、FGF-13、FGF-3、FGF-16、FGF-4、FGF-17、FGF-5、FGF-19、FGF-6、FGF-20、FGF-8、FGF-21、FGF-9、FGF-22、FGF-IO、FGF-23、FGF-11、KGF/FGF-7,FGF受体FGFR1-4、FGFR3、FGFR1、FGFR4、FGFR2、FGFR5,FGFi周节剂FGF-BP;刺猬基因家族沙漠刺猬、索尼克刺猬、印度刺猬；刺猬基因相关分子及调节剂BOC、GLI-3、CDO、GSK-3a/(3、DISP1、GSK-3a、Gasl、GSK-3(3、GLI-1、Hip、GLI-2;IGF家族IGF配体IGF-I、IGF-II，IGF-1受体(CD221)IGF-IR和IGF结合蛋白(IGFBP)家族ALS、IGFBP-5、CTGF/CCN2、IGFBP-6、Cyr61/CCN1、IGFBP-L1、内皮细胞特异性分子(Endocan)、IGFBP-rpl/IGFBP-7、IGFBP-1、IGFBP-rP10、IGFBP-2、NOV/CCN3、IGFBP-3、WISP-1/CCN4、IGFBP-4;受体酪氨酸激酶Axl、FGFR4、ClqR1/CD93、FGFR5、DDR1、Flt-3、DDR2、HGFR、Dtk、IGF-1R、EGF、RIGF-IIR、Eph、INSRR、EphAl、胰岛素R/CD220、EphA2、M-CSFR、EphA3、Mer、EphA4、MSPR/Ron、EphA5、MuSK、EphA6、PDGFRouEphA7、PDGFR卩、EphA8、Ret、EphBl、RTK样孤儿受体1/ROR1、EphB2、RTK样孤儿受体2/ROR2、EphB3、SCFR/c画kit、EphB4、Tie-l、EphB6、Tie-2、ErbB2、TrkA、ErbB3、TrkB、ErbB4、TrkC、FGF、Rl-4VEGFR、FGFR1、VEGF、Rl/Flt國l、FGFR2、VEGFR2/KDR/Flk-1、FGFR3、VEGFR3/Flt-4;蛋白多糖及调节剂蛋白多糖聚合素、Mimecan、集聚蛋白、NG2/MCSP、双糖链蛋白多糖、Osteoadherin、核心蛋白多糖、Podocan、DSPG3、5-肌聚糖、内皮细胞特异性分子(Endocan)、多配体蛋白聚糖-l/CD138、四聚糖多配体蛋白聚糖-2、Endorepellin/串珠素、多配体蛋白聚糖-3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2、多配体蛋白聚糖-4、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、睾素1/SPOCKl、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5、睾素2/SPOCK2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖6、睾素3/SPOCK3、基膜聚糖、多功能蛋白聚糖，蛋白多糖调节剂芳基硫酸酯酶AZARSA、葡糖胺(N-乙酰)-6-硫酸酯酶/GNS、Exostosin样2/EXTL2、HS6ST2、Exostosin样3/EXTL3、艾杜糖2-硫酸酯酶ZIDS、GalNAc4S-6ST;SCF、Fit-3配体及M-CSFFlt-3、M-CSFR、Fit-3配体、SCF、M-CSF、SCFR/c-kit;TGF-(3超家族(如炎症标志物所列的一样)；VEGF/PDGF家族神经毡蛋白-1、P1GF、神经毡蛋白-2、PlGF-2、PDGF、VEGF、PDGFRa、VEGF-B、PDGFR|3、VEGF-C、PDGF-A、VEGF-D、PDGF-AB、VEGFR、PDGF-B、VEGFR融-l、PDGF-C、VEGFR2/KDR/Flk-1、PDGF-D、VEGFR3/Flt-4;Wnt相关分子Dickk叩f蛋白及Wnt抑制剂Dkk-l、Dkk-4、Dkk-2、Soggy-l、Dkk-3，WIF-1巻曲及相关蛋白Frizzled-l、Frizzled-8、Frizzled-2、Frizzled-9、Frizzled-3、sFRP-l、Frizzled-4、sFRP-2、Frizzled-5、sFRP-3、Frizzled-6、sFRP-4、Frizzled-7，MFRPWnt配体Wnt-l、Wnt-8a、Wnt-2b、Wnt-8b、Wnt画3a、Wnt-9a、Wnt-4、Wnt-9b、Wnt-5a、Wnt-10a、Wnt-5b、Wnt-10b、Wnt-7a、Wnt-ll、Wnt-7b;其它Wnt相关分子APC、Kremen-2、Axin-l、LRP-1、(3-连环蛋白、LRP-6、Dishevelled-1、Norrin、Dishevelled-3、PKC卩1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、Pygopus-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5、Pygopus-2、GSK-3a/(3、R-Spondinl、GSK-3a、R-Spondin2、GSK-3p、R-Spondin3、ICAT、RTK样孤儿受体1/ROR1、Kremen-l、RTK样孤儿受体2/ROR，和其它生长因子CTGF/CCN2、(3-NGF,Cyr61/CCN1、Norrin、DANCE、NOV/CCN3、EG-VEGF/PK1、骨织素、生肝素、PD画ECGF、HGF、颗粒蛋白前体、LECT2、血栓形成素、LEDGF或WISP-1/CCN4。在一些实施方式中，抗体对作为癌症标志物(肿瘤标志物)的标志物是特异性的。在一些实施方式中，抗体对作为本身是EGF的癌症标志物的标志物是特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是TNF-a的癌症标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是PSA的癌症标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是VEGF的癌症标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是TGF-卩的癌症标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是FGFb的癌症标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是TRAIL的癌症标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是TNF-RI(p55)的癌症标志物的标志物特异性的。在进一步的实施方式中，抗体是对作为曱胎蛋白的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为ER(3/NR3A2的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为ErbB2的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为激肽释放酶(Kallikrein)3ZPSA的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为ERd/NR3Al的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为孕酮R/NR3C3的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为A33的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为MIA的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为AuroraA的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为MMP-2的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为Bcl-2的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为MMP-3的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为钙粘素(Cadherin)-13的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为MMP-9的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为E-钙粘素的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为NEK2的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为碳酸酐酶IX的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为巢蛋白(Nestin)的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为(3-连环蛋白的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为NG2/MCSP的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为组织蛋白酶D的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为骨桥蛋白的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为CD44的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为p21/CIPl/CDKNlA的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为CEACAM-6的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为p27/Kipl的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为Cornulin的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为p53的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为DPPA4的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为促乳素的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为ECM-1的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为PSP94的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为EGF的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为S100B的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为EGFR的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为S100P的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为EMMPRIN/CD147的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为SCFR/c-kit的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为成纤维细胞激活蛋白a/FAP的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)E1/PAI-1的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为酸性FGF的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为血清淀粉样蛋白(SemmAmyloid)A4的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为碱性FGF的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为存活素(Survivin)的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为半乳糖凝集素(Galectin)-3的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为TEM8的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为TIMP-1的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为HIN-l/食管鳞癌分泌素(Secretoglobulin)3A1的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为TIMP-2的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IGF-1的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为TIMP-3的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IGFBP-3的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为TIMP-4的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-6的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为TNF-a/TNFSFlA的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为激肽释放酶6ZNeurosin的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为TRAF-4的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为M-CSF的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为uPA的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为蛋白裂解酶(Matriptase)/ST14的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为uPAR的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为间皮素(Mesothelin)的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为VCAM-1的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为曱硫氨酸氨肽酶的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为VEGF的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为曱硫氨酸氨肽酶2的癌症标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为炎症标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是ICAM-1的炎症标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是RANTES的炎症标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是MIP-2的炎症标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是MIP-1p的炎症标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是MIP-1a的炎症标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是MMP-3的炎症标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为内分泌功能标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是17(3-雌二醇(E2)的内分泌功能标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是DHEA的内分泌功能标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是ACTH的内分泌功能标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是胃泌素的内分泌功能标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是生长激素的内分泌功能标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为自身免疫疾病标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是GM-CSF的自身免疫疾病标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是C-反应蛋白(CRP)的自身免疫疾病标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为本身是G-CSF的自身免疫疾病标志物的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对曱状腺功能标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为环AMP的曱状腺功能标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对曱状腺功能标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为降4丐素的曱状腺功能标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对曱状腺功能标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为甲状旁腺素的甲状腺功能标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对心血管功能标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为B-利钠肽的心血管功能标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为NT-proBNP的心血管功能标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为C-反应蛋白，HS的心血管功能标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为P-血小板球蛋白的心血管功能标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为心肌肌4丐蛋白的心血管功能标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为心肌肌钩蛋白I的心血管功能标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为心肌肌钙蛋白T的心血管功能标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对糖尿病标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为C-肽的糖尿病标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为瘦素的糖尿病标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对传染病标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IFN-y的传染病标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IFN-a的传染病标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为TREM-1的传染病标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对代谢标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为生物学全段PTH(l-84)的代谢标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为PTH的代谢标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-lp的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为TNF-a的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-6的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为Tnl(心肌肌钙蛋白I)的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-8的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为Ap40的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为A(342的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为cAMP的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为FAS配体的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为碱性FGF的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为GM-CSF的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IFN-a的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IFN-Y的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-la的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-2的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-4的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-5的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-7的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-12的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-13的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-17的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为MCP-1的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为MIP-la的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为RANTES的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为VEGF的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为ACE的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为活化素A的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为脂连蛋白(adiponectin)的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为脂肪细胞蛋白酶(adipsin)的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为AgRP的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为AKT1的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为白蛋白的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为乙胞素的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为铃蟾肽的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为CD14的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为CD-26的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为CD-38的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为CD-40L的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为CD-40s的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为CDK5的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为补体C3的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为补体C4的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为C-肽的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为CRP的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为EGF的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为E-选择蛋白的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为FAS的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为FASLG的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为胎球蛋白A的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为纤维蛋白原的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为生长素释放肽(ghrelin)的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为胰高血糖素的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为生长激素的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为结合球蛋白的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为肝细胞生长因子的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为HGF的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为ICAM1的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IFNG的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IGF1的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-1RA的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为Il-6sr的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-8的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-10的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-18的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为ILGFBP1的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为ILGFBP3的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为胰岛素样生长因子1的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为LEP的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为M-CSF的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为MMP2的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为MMP9的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为NGF的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为PAI-1的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为RAGE的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为RSP4的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为抵抗素的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为性激素结合球蛋白的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为S0CX3的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为TGF(3的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为促凝血酶原激酶的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为TNFRl的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为VCAM-1的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为VWF的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为TSH的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为EPITOME的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为心肌肌钙蛋白I的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为TREM-1的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-6的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为IL-8的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为白三烯T4的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为Aktl的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为TGF-P的标志物特异性的。在一些实施方式中，抗体是对作为Fas配体的标志物特异性的。在一些实施方式中，荧光结构包括荧光分子。在一些实施方式中，荧光结构包括多个荧光分子，例如大约2-10、2-8、2-6、2-4、3-10、3-8或3-6个荧光分子。在一些实施方式中，标记物包括大约2-4个荧光分子。在一些实施方式中，荧光分子包括至少一个取代的吲哚鎰环系统，其中该吲咮鐵环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质基团。在一些实施方式中，荧光分子选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFl匿647、AlexaFluor680或AlexaFluor700。在一些实施方式中，焚光分子选自选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor680或AlexaFluor700的AlexaFluor分子。在一些实施方式中，荧光分子为AlexaFluor647分子。A.结合伴体可以使用任何对待检测的分子(如标志物)的形式具有必要的特异性的合适的结合伴体。如果该分子(如标志物)具有几种不同的形式，结合伴体的各种不同特异性是可能的。合适的结合伴体在现有技术中是已知的，并且包括抗体、适体(aptamer)、凝集素和受体。有利的和通用类型的结合伴体是抗体。1.抗体因此在一些实施方式中，结合伴体是对待检测的分子特异性的抗体。这里所用的术语"抗体"是一个广义的术语并且在它的一般意义上使用，体、嵌合的、双功能的和人源化的抗体，及其抗原结合片段。可以理解，对？i发抗体的表位或分子部位的选择决定其特异性，例如对于分子的不同形式(如果存在)的特异性或对于全体(如所有或基本上所有分子)的特异性。产生抗体的方法早已建立。本领域技术人员可以认识到，产生抗体可以采用许多的方法，例如在Antibodies,ALaboratoryManual,EdHarlow和DavidLane,ColdSpringHarborLaboratory(1988),ColdSpringHarbor,N.Y中描述的方法。本领域技术人员也可以理解，模拟抗体的结合片段或Fab片,殳也可以利用各种方法(AntibodyEngineering:APracticalApproach(Borrebaeck，C,ed.)，1995,OxfordUniversityPress,Oxford;J.Immunol.149,3914-3920(1992))通过遗传信息制备。对分子(如蛋白质和标志物)的单克隆和多克隆抗体也可以从商业途径获得(RandDSystems,Minneapolis,Minnesota;HyTest,HyTestLtd.,TurkuFinland;AbeamInc.,Cambridge,MA,USA;LifeDiagnostics,Inc.,WestChester,PA，USA;FitzgeraldIndustriesInternational,Inc.,Concord,MA01742-3049USA;BiosPacific,Emeryville,CA)。在一些实施方式中，抗体是多克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体。可以在本发明的实施方式中利用捕获结合伴体(Capturebindingpartner)和冲全测结合伴体(detectionbindingpartner)对，例如捕获和斗企测抗体对。因此在一些实施方式中，采用异相分析方案，其中通常使用两种结合伴体，如两种抗体。一种结合伴体是捕获伴体，通常固定在固体载体上，而另一种结合伴体是检测结合伴体，通常具有连接的可检测标记物。这种抗体对可以从上述的来源得到，如BiosPacific，Emeryville,CA。也可以通过现有技术中已知的方法设计和制备抗体对。本发明的组合物包括其中抗体对的一个成员是这里所述的标记物而另一个成员是捕获抗体的抗体对。抗体或检测抗体之一或两者是有利的。这种实施方式包括通过测定(例如)作为心脏损害的标志物的心肌肌4丐蛋白向血液的释放测量药物毒性。交叉反应抗体使得能够在一种物种(如非人类物种)上进行毒性研究并在分析试剂中使用相同的抗体或抗体对将研究结果直接转用到另一种物种(如人类)的研究或临床观察上，因此降低了分析试验之间的变异性。因此在一些实施方式中，一种或多种用作标志物(例如，如心肌肌钙蛋白I的中，抗体与来自选自人类、猴、狗和小鼠的至少两种物种的标志物(如心肌肌钙蛋白)发生交叉反应。在一些实施方式中，抗体与来自人类、猴、狗和小鼠全体的标志物(如心肌肌钙蛋白)发生交叉反应。B.荧光结构在本发明使用的标记物的一些实施方式中，结合伴体(如抗体)连接到荧光结构上。该结构的荧光足以在单分子检测器(如这里所述的单分子检测器)中冲全测到。这里所用的术语"荧光结构"包括一个或多个荧光体，其总体荧光使得该结构可以在这里所述的单分子检测器中检测到。因此，荧光结构可以包括单个焚光体(如量子点或焚光分子)或多个焚光体(如多个荧光分子)。可以理解，这里所用的术语"结构"指的是一组荧光体(如多个荧光染料分子)时，各单个荧光体可以独立地连接到结合伴体上或多个荧光体可以一起连接到结合伴体上，只要作为一组的荧光体能够提供足以检测的荧光。通常，该结构的荧光需要量子效率与光漂白(photobleaching)缺乏的组合，从而足以使该结构在单分子检测器中能够在背景水平之上检测到，具有达到理想的检测极限、分析的准确度和精密度所必需的相容性。例如，在一些实施方式中，荧光结构的荧光使得能够以低于约10、5、4、3、2、1、0.1、0.01、0.001、0.00001或0.000001pg/ml的检测极限和以低于约20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%或更低的变异系数(如大约10%或更低)在这里描述的仪器中进行分子(如标志物)的检测和/或定量。在一些实施方式中，荧光结构的荧光使得能够以低于约5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001pg/ml的检测极限和以低于约10%或更低的变异系数在这里描述的仪器中进行分子(如标志物)的冲全测和/或定量。这里所用的术语"检测极限"包括能够确认样品包含目标物质的分子的最低浓度，如第一非零值。它可以通过标准曲线的零位变化和斜率定义。例如，分析测试的4企测;〖及限可以通过建立标准曲线、确定标准曲线零值并向该值加上两倍标准差而确定。产生等于该值的信号的目标物质浓度是"检测下限"浓度。另外，该结构具有与其在所选择的分析测试中的应用一致的性质。在一些实施方式中，分析测试是免疫分析，其中焚光结构连接到抗体上；该结构必须具有不与其它抗体或蛋白质发生聚集，或不发生比符合分析所需的准确度和精密度的聚集更多的聚集的性质。在一些实施方式中，优选的荧光结构是具有l)高吸收系数、2)高量子产额、3)高光稳定性(低光漂白)和4)与标记目标分子(如蛋白质)的相容性的组合的荧光结构(如染料分子)，从而可以使用本发明的分析仪和系统进行分析(例如，不引起目标蛋白质的沉淀或该结构连接的蛋白质的沉淀)。多个荧光染料分子)可以通^t其在]受到EM辐射激发时的光子发射特性^定义。例如，在一些实施方式中，本发明利用能够在受到该结构的激发波长的激光器发射的光激发时发射平均至少约10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、350、400、500、600、700、800、900或1000个光子的焚光结构(如包括单个荧光染料分子或多个荧光染料分子的结构)，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。可以理解，总能量是通过激光器的功率输出和染料结构的照射时间长度的许多不同组合实现的。例如，lmW功能输出的激光器可以应用3ms的时间，3mW应用1ms，6mW应用0.5ms，12mW应用0.25ms等等。在一些实施方式中，本发明采用能够在受到该结构的激发波长的激光器发射的光激发时发射平均至少约50个光子的荧光染料结构(如单个荧光染料分子或多个荧光染料分子)，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指？1到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，本发明采用能够在受到该结构的激发波长的激光器发射的光激发时发射平均至少约100个光子的荧光染料结构(如单个荧光染料分子或多个荧光染料分子)，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，本发明采用能够在受到该结构的激发波长的激光器发射的光激发时发射平均至少约150个光子的荧光染料结构(如单个荧光染料分子或多个荧光染料分子)，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，本发明采用能够在受到该结构的激发波长的激光器发射的光激发时发射平均至少约200个光子的荧光染料结构(如单个荧光染料分子或多个荧光染料分子)，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，本发明采用能够在受到该结构的激发波长的激光器发射的光激发时发射平均至少约300个光子的荧光染料结构(如单个荧光染料分子或多个荧光染料分子)，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，本发明采用能够在受到该结构的激发波长的激光器发射的光激发时发射平均至少约500个光子的荧光染料结构(如单个荧光染料分子或多个焚光染料分子)，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，焚光结构包括平均至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个荧光体(如荧光分子)。在一些实施方式中，荧光结构包括平均不超过约2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个焚光体(如焚光分子)。在一些实施方式中，荧光结构包括平均大约1至11个、或大约2至10个、或大约2至8个、或大约2至6个、或大约2至5个、或大约2至4个、或大约3至10个、或大约3至8个、或大约3至6个、或大约3至5个、或大约4至10个、或大约4至8个、或大约4至6个、或大约2、3、4、5、6个或大约6个以上焚光体。在一些实施方式中，荧光结构包括平均大约2至8个连接的荧光体。在一些实施方式中，平均大约2至6个荧光体。在一些实施方式中，荧光结构包括平均大约2至4个荧光体。在一些实施方式中，荧光结构包括平均大约3至10个荧光体。在一些实施方式中，荧光结构包括平均大约3至8个荧光体。在一些实施方式中，荧光结构包括平均大约3至6个荧光体。"平均"意思是在作为本发明的一组标记物的代表性样品的给定样品(其中该样品包含多个结合伴体-荧光结构合伴体的摩尔比对应于指定的数值或范围。例如，在标记物包括作为抗体的结合伴体和本身包含多个具有特定吸收率的焚光染料分子的荧光结构的实施方式中，可以采用其中标记物溶液稀释到适当水平且280nm的吸收率用于确定蛋白质(抗体)的摩尔浓度和在如650nm(对于AlexaFluor647)的吸收率用于确定焚光染料分子的摩尔浓度的分光光度(spectr叩hometric)分析。后一摩尔浓度与前一摩尔浓度的比率代表了连接到各抗体的荧光结构中荧光体(染料分子)的平均数。1.染料在一些实施方式中，本发明利用包括荧光染料分子的荧光结构。在一些实施方式中，本发明利用能够在受到荧光染料分子的激发波长的激光器发射的光激发时发射平均至少约50个光子的荧光染料分子，其中激光聚焦于包含该分子的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，本发明利用能够在受到荧光染料分子的激发波长的激光器发射的光激发时发射平均至少约75个光子的荧光染料分子，其中激光聚焦于包含该分子的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，本发明利用能够在受到荧光染料分子的激发波长的激光器发射的光激发时发射平均至少约100个光子的荧光染料分子，其中激光聚焦于包含该分子的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，本发明利用能够在受到荧光染料分子的激发波长的激光器发射的光激发时发射平均至少约150个光子的荧光染料分子，其中激光聚焦于包含该分子的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指？1到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，本发明利用能够在受到荧光染料分子的激发波长的激光器发射的光激发时发射平均至少约200个光子的荧光染料分子，其中激光聚焦于包含该分子的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。可在本发明的荧光结构中使用的焚光体的部分(non-inclusive)清单在下面表2中给出。在一些实施方式中，荧光染料选自AlexaFlour488、532、647、700、750、萸光素、B-藻红蛋白、别藻蓝蛋白、PBXL-3和Qdot605。在一些实施方式中，焚光染料选自AlexaFlour488、532、700、750、荧光素、B-藻红蛋白、别藻蓝蛋白、PBXL-3和Qdot605。表2荧光体<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>Dapoxyl37322,000551362.83二曱氨基香豆素-4-乙酸37522,000470344.32Marinablue36519,000460367.268-苯胺基萘-l-磺酸372480C^isc3d6blue37623,000420607.42AlexaFluor40540235,0004211028.26Cascadeblue40029，000420607.42Cascadeyellow40224,000545563.54Pacificblue41046,000455339.21PyMPO41526,000570582.41Alexa43043315,000539701.75Atto-425438486NBD46522,000535391.34Alexa48849573,000519643.41荧光素49479,000518376.32OregonGreen48849676,000524509.38A加495495522Cy2489150,000506713.78DY-480-XL50040，000630514.60DY-485-XL48520,000560502.59DY-490-XL48627,000532536.58DY-500-XL50590,000555596.68DY-520-XL52040,000664514.60AlexaFluor53253181,000554723.77BODIPY530/55053477,000554513.316-HEX53598,000556680.076-JOE52275,000550602.34若丹明6G525108,000555555.59Atto-520520542Cy3B558130，000572658.00AlexaFluor610612138,000628AlexaFluor633632159,000647ca.1200AlexaFluor647650250,000668ca.1250BODIPY630/650625101,000640660.50Cy5649250,000670791.99AlexaFluor660663IIO，OOO690AlexaFluor680679184,000702AlexaFluor700702192,000723AlexaFluor750749240,000782B-藻红蛋白546，5652,410,000575240,000R-藻红蛋白480，546，5651,960，000578240,000别藻蓝蛋白650700,000660700,000PBXL-1545666PBXL-3614662AU()-tec染冲牛名称Ex(nm)EmQY□(ns)(腿)Atto4254364860.93.5Atto4954955220.452.4Atto5205205420.93.6Atto5605615850.923.4Atto5905986340.83.7Atto6106056300.73.3Atto6556656900.31.9A加6806807020.31.8DyomicsFluors标记物Ex(nm)摩尔光吸收*Em(nm)分子量#_[g'mor1]DY-495/549570,000520489.47DY-495/649570,000520489.47DY-495X/549570，000520525.95DY-495X/649570,000520525.95DY-505/550585，000530485.49DY-505Z650585,000530485.49DY-505X/550585,000530523.97DY-505X/650585,000530523.97DY-550553122,000578667.76DY-555555ioo扁580636.18DY-61060981.000629667.75DY-615621200.000641578.73DY-630636200.000657634.84DY-631637185扁658736.88DY-633637180.000657751.92DY-635647175.000671658.86DY-636645190.000671760.91DY-650653170.000674686.92DY-651653160.000678888.96DYQ-660660117,000-668.86DYQ-661661116,000-770.90DY-675674110.000699706.91DY-676674145扁699807.95DY-680690125.000709634.84DY-681691125.000708736.88DY-70070296扁723668.86DY-701706115.000731770.90DY匿730734185扁750660.88DY-731736225扁759762.92DY-750747240.000776712.96DY-751751220扁779814.99DY-776771147.000801834.98DY-780-OH77070扁810757.34DY-780-P77070.000810957.55DY-78178398.000訓762.92DY-782782102扁800660.88EVOblue-lO651101.440664389.88EVOblue-30652102.000672447.51量子点Qdot525，565,585，605,655,705，800用于本发明的合适的染料包括改良羰花青染料。羰花青染料的改良包括对羰花青染料的吲哚鑰环进行修饰以在3位允许有反应基团或偶联物质。吲哚鑰环的修饰使得在蛋白质、核酸和其它生物聚合体上产生比用具有相似结构的通过1位的氮原子结合的羰花青染料标记的偶联物均染料更强的荧光发射及在与生物高聚物偶联后在吸收光谱上减少假象外，改良的羰花青染料在峰吸收波长下具有比结构相似的染料更好的光稳定性和更高的吸收率(吸光系数)。因此，改良的羰花青染料在使用改良的染料及其偶联物的分析测试中得到更高的灵敏度。优选的改良染料包括具有至少一个取代的吲咮鐵环系统的化合物，其中吲哚鑰环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。其它染料化合物包括引入吲哚鑰(azabenzazolium)环结构和至少一个磺酸结构的化合物。可以在本发明的各种实施方式中用于检测个体分子的改良羰花青染料在美国专利6977305中进行了描述，在这里通过引用将该文献全文引入。因此在一些实施方式中，本发明的标记物采用包括取代的吲哚鐵环系统的焚光染料，。引哚総环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质基团。在一些实施方式中，标记物包括具有一种或多种Alexa染料(MolecularProbes,Eugene,OR)的焚光结构。Alexa染泮牛在美国专利6,977,305、6,974,874、6,130,101和6,974,305中进行了描述,在这里通过引用将该文献全文引入。本发明的一些实施方式采用选自AlexaFluor647、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor555、AlexaFluor610、AlexaFluor680、AlexaFluor700和AlexaFluor750的染料。本发明的一些实施方式采用选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor647、AlexaFluor700和AlexaFluor750的染料。本发明的一些实施方式采用选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor555、AlexaFluor610、AlexaFluor680、AlexaFluor700和AlexaFluor750的染料。本发明的一些实施方式采用AlexaFluor647分子，其在大约650和660nm之间具有吸收最大值和在大约660和670nm之间具有发射最大值。AlexaFluor647染料单独使用或与其它AlexaFluor染料组合使用。另外，当前可得到的有机荧光染料(fluors)可以通过添加如聚乙烯化的有机荧光染料(如AlexaFluor647染料)可以通过使其两性离子化而具有更低的酸性。在免疫分析中用改良的染料标记的颗粒(如抗体)可能性更小地非特异性地结合表面和蛋白质，因此使得分析具有更高的灵敏度和更低的背景。出于提高对单颗粒进行检测的系统的灵敏度的目的对荧光染料的性质进行改良和改进的方法是现有技术中已知的。优选地，改良在保持高量子产额的同时改善斯托克斯频移。2.量子点在一些实施方式中，用于利用本发明的分析系统检测样品中的分子的荧光标记结构是量子点。量子点(QD)，也称作半导体纳米晶体或人造原子，是包含大约100-1000电子和在2-10nm的范围内的半导体晶体。某些QD直径在10-20nm之间。QD具有高量子产额，这使得它们特别利于光学应用。QD是通过形成激子而发荧光的荧光团，激子可以被认为是传统荧光团的激发态，但具有长得多的寿命(最高可达200毫微秒。这一特性为QD提供了低的光漂白性。QD的能量水平可以通过改变QD的大小和形状及QD电位深度进行控制。小的激发QD的一种光学特性是呈色效应，其由量子点的大小决定。点越大，颜色越红，或者越趋向于荧光光谱的红端。点越小，颜色越蓝或越趋向于蓝端。决定荧光的能量而因此决定荧光的颜色的带隙能与QD大小的平方成反比。越大的QD具有更紧密地分隔的更多的能量水平，因此使得QD能够吸收含有更低能量的光子，即更接近于光谱的红端的光子。因为量子的发射频率依赖于带隙，因此有可能极精确地控制量子点的输出波长。在一些实施方式中，用单颗粒分析系统检测的蛋白质用QD进行标记。在一些实施方式中，单颗粒分析仪用于检测用一种QD标记的蛋白质，并使用滤光器使得能够在不同的波长下检测不同的蛋白质。QD具有宽的激发和窄的发射特性，这使得在使用色彩过滤的情况下对于单个样品中的多个目标的多重分析仅需要单一的电磁源以解析各个信号。因此，在一些实施方式中，分析系统包括一个连续波激光器和各用一种QD标记的颗粒。制备成胶态的QD自由浮动且可以通过金属配位官能团连接到多种分子上。这些基团包括，但不限于硫醇、胺、腈、膦、氧化膦、膦酸、羧酸或其它配体。通过键合适当的分子到表面上，量子点可以分散或溶解在几乎任何溶剂中或引入到各种无机或有机薄膜中。量子点(QD)可以通过马来酰亚胺酯偶联反应直接与抗生物素蛋白链菌素偶联或通过马来酰亚胺-硫醇(meleimide-thiol)偶联反应与抗体偶联。这产生了具有共价连接到表面上的生物分子的材料，该生物分子产生具有高比活性的偶联物。在一些实施方式中，利用单颗粒分析仪检测的蛋白质用一个量子点标记。在一些实施方式中，量子点直径在10-20nm之间。在其它的实施方式中，量子点直径在2-10nm之间。可用的量子点包括QD605、QD610、QD655和QD705。特别优选的量子点是QD605。C.结合伴体-荧光结构组合物本发明的标记物一般包含结合到提供在这里描述的仪器中进行检测和定量必需的荧光的荧光结构上的结合伴体(如抗体)。任何适合在这里描本发明的标记物。在一些实施方式中，本发明提供生物状态标志物的标记物，其中该标记物包括该标志物的抗体和荧光结构。该标志物可以是上面描述的任何标志物。该抗体可以是上面描述的任何抗体。荧光结构可以被连接以使得标记物能够在受到该结构的激发波长的激光器发射的光激发时发射平均至少约50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、350、400、500、600、700、800、900或1000个光子，其中激光聚焦于包含该标记物的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，荧光结构可以是能够在受到该结构的激发波长的激光器发射的光激发时发射平均至少约50、100、150或200个光子的荧光结构，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指《1到该点上的总能量不超过约3微焦耳。荧光结构可以是包括一个或多个染料分子的荧光结构，所述染料分子具有包括取代吲哚鑰环系统的结构，其中吲哚鐵环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质基团。标记物组成可以包括包含一个或多个选自AlexaFluor488、532、647、700或750的染料分子的荧光结构。标记物组成可以包括包含一个或多个选自AlexaFluor488、532、700或750的染料分子的荧光结构。标记物组成可以包括包含一个或多个AlexaFluor488染料分子的荧光结构。标记物组成可以包括包含一个或多个AlexaFluor555染料分子的荧光结构。标记物组成可以包括包含一个或多个AlexaFluor610染料分子的荧光结构。标记物组成可以包括包含一个或多个AlexaFluor647染料分子的荧光结构。标记物组成可以包括包含一个或多个AlexaFluor680染料分子的荧光结构。标记物组成可以包括包含一个或多个AlexaFluor700染料分子的荧光结构。标记物组成可以包括包含一个或多个AlexaFluor750染料分子的焚光结构。在一些实施方式中，本发明提供了用于检测生物状态标志物的组合物，包括连接到对所述标志物特异性的抗体上的AlexaFluor分子(如选自上述组中的AlexaFluor分子)，例如AlexaFluor647分子。在一些实施方式中，组合物包括平均1至11个、或大约2至10个、或大约2至8个、或大约2至6个、或大约2至5个、或大约2至4个、或大约3至10个、或大约3至8个、或大约3至6个、或大约3至5个、或大约4至10个、或大约4至8个、或大约4至6个、或大约2、3、4、5、6个或大约6个以上连^l妄到标志物抗体上的AlexaFluor647分子。在一些实施方式中，本发明提供用于检测生物状态标志物的组合物，包括连接到对所述标志物特异性的抗体上的平均1至11个、或大约2至10个、或大约2至8个、或大约2至6个、或大约2至5个、或大约2至4个、或大约3至10个、或大约3至8个、或大约3至6个、或大约3至5个、或大约4至10个、或大约4至8个、或大约4至6个、或大约2、3、4、5、6个或大约6个以上AlexaFluor647分子。在一些实施方式中，本发明提供用于检测生物状态标志物的组合物，包括连接到对所述标志物特异性的抗体上的平均大约2至10个AlexaFluor647分子。在一些实施方式中，本发明提供用于检测生物状态标志物的组合物，包括连接到对所述标志物特异性的抗体上的平均大约2至8个AlexaFluor647分子。在一些实施方式中，本发明提供用于检测生物状态标志物的组合物，包括连接到对所述标志物特异性的抗体上的平均大约2至6个AlexaFluor647分子。在一些实施方式中，本发明4是供用于检测生物状态标志物的组合物，包括连接到对所述标志物特异性的抗体上的平均大约2至4个AlexaFluor647分子。在一些实施方式中，本发明提供用于检测生物状态标志物的组合物，包括连接到对所述标志物特异性的抗体上的平均大约3至8个AlexaFluor647分子。在一些实施方式中，本发明提供用于检测生物状态标志物的组合物，包括连接到对所述标志物特异性的抗体上的平均大约3至6个AlexaFluor647分子。在一些实施方式中，本发明提供用于检测生物状态标志物的组合物，包括连接到对所述标志物特异性的抗体上的平均大约4至8个AlexaFluor647分子。荧光结构或构成荧光结构的荧光体与结合伴体(如抗体)的连接可以是合适的方式，这种方法是现有技术中已知的，并且在实施例中给出了示例性的方法。在一些实施方式中，在荧光结构连接到结合伴体上形成在本发明的方法中使用的标记物之后和在将该标记物用于标记目标蛋白质之前，进行过滤步骤是有利的。例如，抗体-染料标记物可以在使用之前例如通过0.2微米的过滤器或任何合适的过滤器进行过滤以去除聚集体。其它用于本发明的分析的试剂也可以例如通过0.2微米的过滤器或任何合适的过滤器过滤。并没有受到理论的约束，据认为这种过滤去除了一部分例如抗体-染料标记物的聚集体。由于这种聚集体将作为一个单元结合到目标蛋白上，但在洗脱緩沖液中释放时很可能解聚，因此可能造成假阳性，即将从结合到仅一个目标蛋白上的一个聚集体检测出几个标记物。与理论无关，已发现过滤降低了后续分析中的假阳性并提高了准确度和精密度。可以理解，免疫分析通常采用夹心模式，其中使用了针对相同分子(如标志物)的结合伴体对(如抗体)。本发明也包含结合伴体对(如抗体)，其中两种抗体都对同一分子(如同一标志物)具有特异性，且其中该对中的至少一个成员是这里所述的标记物。因此，对于任何包括结合伴体和荧光结构的标记物，本发明还包含结合伴体的对，其中第一结合伴体(如抗体)是标记物的部分，而第二结合伴体(如抗体)通常是未标记的并用作捕获结合伴体。另外，结合伴体对经常用于FRET分析中。可用于本发明的FRET分析在美国专利申请11/048660中公开，其通过引用全文引入，因而本发明还包含各包括FRET标记的结合伴体对。IV分子的高灵敏分析在一个方面中，本发明提供了通过i)使用标记物对可能存在的分子进行标记和ii)检测标记物是否存在来确定样品中是否存在单个分子(如生物状态标志物的分子)的方法，其中标记物存在的检测结果表明样品中存在该单个分子。在一些实施方式中，所述方法能够以低于大约100、80、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005或0.001毫孩t孩吏摩尔的检测极限检测分子。在一些实施方式中，该方法能够以低于大约100毫微微摩尔的检测极限检测分子。在一些实施方式中，该方法能够以低于大约10毫微微摩尔的检测极限检测分子。在一些实施方式中，该方法能够以低于大约1毫孩t微摩尔的检测极限^H则分子。在一些实施方式中，该方法能够以低于大约0.1毫微微摩尔的检测极限^r测分子。在一些实施方式中，该方法能够以低于大约0.01毫微微摩尔的检测极限检测分子。在一些实施方式中，该方法能够以低于大约0.001毫微微摩尔的检测极限检测分子。；险测极限可以通过利用合适的标准物确定，例如国家标准4支术研究所参考标准材料。所述方法还提供通过检测样品中分子的单个分子测定样品中分子(如生物状态标志物)的浓度的方法。单分子的"检测"包括直接或间接检测分子。在直接检测的情况下，可以检测到对应于单个分子的标记物(如已经连接到单个分子上的标记物)。在一些实施方式中，本发明提供确定生物样品中存在蛋白质的单个分子的方法，包括用标记物对所述分子进行标记和在单分子检测器中检测所述标记物是否存在，其中所述标记物包括荧光结构，其能够在受到该结构的激发波长的激光器发射的光激发时发射至少约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，单分子检测器可以包括不超过一个探询空间。样品中单个分子的检测极限可以低于大约10、1、0.1、0.01或0.001毫微微摩尔。在一些实施方式中，检测极限低于约1毫微微摩尔。检测步骤可以包括检测所述荧光结构发射的电磁辐射。该方法可以进一步包括使所述荧光结构暴露于电磁辐射，如由激光器(例如，具有约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20mW功率输出的激光器)提供的电磁辐射。在一些实施方式中，激光器向探询空间提供持续约10-1000微秒、或者约1000、250、100、50、25或IO微秒的光。在一些实施方式中，标记物进一步包括特异性结合所述分子(如抗体)的结合伴体。在一些实施方式中，荧光结构包括荧光染料分子，如包括至少一个取代的p引哚総环系统的染料分子，其中该吲哚総环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。在一些实施方式中，染泮+分子为选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor647、AlexaFluor680或AlexaFluor700的AlexaFluor分子。在一些实施方式中，染料分子是AlexaFluor647分子。在一些实施方式中，荧光结构包括多个AlexaFluor647分子。在一些实施方式中，该多个AlexaFluor647分子包4舌大约2-4个AlexaFluor647分子或约3-6个AlexaFluor647分子。在一些实施方式中，荧光结构是量子点。该方法可以进一步包括测量样品中所述蛋白质的浓度。在一些实施方式中，检测所述标记物是否存在包括(i)使所述样品的一部分通过探询空间；(ii)将所述探询空间暴露于电磁辐射，所述电磁辐射足以激发所述荧光结构发射光子，如果所述标记物存在的话；和(iii)检测步骤(ii)的所述暴露期间发射的光子。该方法可以进一步包括测定所述探询空间中的背景光子水平，其中所述背景水平代表所述探询空间中没有标记物的情况下以步骤(ii)中的相同方式进行电磁辐射照射时所述探询空间的平均光子发射。该方法可以进一步包括将步骤(iii)中检测的光子的量与阈光子水平比较，其中所述阈光子水平是所述背景光子水平的函数，其中步骤(iii)中检测的光子的量高于阈水平表明所述标记物的存在，而步骤(iii)中检测的光子的量等于或低于阈水平表明所述冲示^己物不存在。A.样品样品可以是任何合适的样品。通常，样品是生物样品，如生物流体。这种流体包括，i^旦不限于支气管肺泡灌洗液(BAL)、血液、血清、血浆、尿液、鼻拭子、脑脊液、胸膜液、滑液、腹膜液羊水、胃液、淋巴液、间质液、组织匀浆、细胞抽提物、唾液、痰液、粪便、生理分泌物、泪液、粘液、汗液、乳汁、精液、精液流体部分(seminalfluid)、阴道分泌物、来自溃疡或其它表面突出物的流体、水泡和脓肿，及包括正常、肿瘤和可疑组织的活体切片和任何其它可能含有所关注的目标颗粒的身体组分的组织提取物。其它类似的样本(如细胞或组织培养物或培养肉汤)也受到关注。在一些实施方式中，样品是血液样品。在一些实施方式中，样品是血浆样品。在一些实施方式中，样品是血清样品。在一些实施方式中，样品是尿液样品。在一些实施方式中，样品是鼻拭子。B.才羊品制备一般，可以使用制备对应于希望测量的目标分子(如生物状态标志物)的标记物的任何样品制备方法，其中标记物可在这里描述的仪器中检测到。如现有技术中已知的，标记物被加到一种或多种分子上的样品制备过程可以以均相或异相方式进行。在一些实施方式中，样品制备以均相方式进行。在釆用均相方式的分析系统中，未结合的标记物不从样品中除去。参见，如美国专利申请11/048660号。在一些实施方式中，一种或多种目标颗粒通过添加结合该一种或多种目标颗粒的一种或多种抗体进4亍才示i己。在一些实施方式中，采用异相分析方式，其中通常采用除去未结合的标记物的步骤。这种分析方式是现有技术中公知的。一种特别有用的分析方式是夹心分析，如夹心免疫分析。在该方式中，目标颗粒(如生物状态标志物)使用捕获结合伴体捕获在例如固体载体上。不需要的分子和其它物质然后任选地可以洗掉，随后使包括检测结合伴体和可检测的标记(如荧光结构)的标记物结合。进一步的清洗去除未结合的标记物，然后可检测的标记释放出来，尽管通常没有必要还连接在检测结合伴体上。在可选4奪的实施方式中，样品和标记物加入到捕获结合伴体上而在这之间(如加入的同时)不进行清洗。其它的变化形式对本领域技术人员是显而易见的。在一些实施方式中，检测目标分子(如生物状态标志物)的方法采用以抗体(如单克隆抗体)为捕获结合伴体的夹心分析。该方法包括将样品中的结合到分子上以形成"夹心"复合体。标记物包括检测抗体和如这里所述的荧光结构，其利用例如本发明的单分子分析仪进行检测。捕获和检测抗体两者逐一地与所述分子结合。许多夹心免疫分析的实例是已知的，其中的一些在Grubb等人的美国专利4168146号和Tom等人的美国专利4366241号中进行了描述。针对特定的标志物的进一步的实例在实施例部分中进行描述。捕获结合伴体可以连接到固体载体(如微滴定板或顺磁性微球)上。在一些实施方式中，本发明提供连接到顺磁性微球上的目标分子(如生物状态标志物)的结合伴体。可以使用任何对希望捕获的分子特异性的合适的结合伴体。结合伴体可以是抗体，如单克隆抗体。抗体的产生和来源在本文的其它地方进行说明。可以理解，这里确认为可用作捕获抗体的抗体也可以用作4全测抗体，反之亦然。结合伴体(如抗体)与固体载体的连接可以是共价的或非共价的。在一些实施方式中，连接是非共价的。现有技术中公知的非共价连接的一个例子是生物素-亲和素/抗生蛋白链菌素相互作用。因此，在一些实施方式中，固体载体(如微滴定板或顺磁性微球)通过非共价连接(如生物素-亲和素/抗生蛋白链菌素相互作用)连接到捕获结合伴体(如抗体)上。在一些实施方式中，连接是共价的。因此，在一些实施方式中，固体载体(如微滴定板或顺磁性微球)通过共价连接连接到捕获结合伴体(如抗体)上。别有利的。例如，在一些实施方式中，可以使用其中结合伴体(如抗体)的连接为定向连接(如共价定向连接)的固体载体(如微滴定板或顺磁性微颗粒)。用于抗体与固体载体的定向连接的示例性方案如下igG溶解于0.1M乙酸钠缓沖液(pH5.5)中以达到1mg/ml的终浓度。加入等体积的溶于0.1M乙酸钠(pH5.5)中的冰预冷的20mM高石典酸钠。IgG在冰上氧化1/2小时。通过加入0.15体积的1M甘油消除过量的高;典酸试剂。氧化反应的低分子量副产物通过超滤除去。氧化的IgG成分稀释到合适的浓度(通常每升0.5微克IgG)并与酰肼活化的多孔板在室温下反应至少两小时。未结合的IgG通过用硼酸盐緩冲盐水或另一种合适的緩冲液清洗多孔板除去。如果需要，该板可以进行千燥储存。如果微球材料适用于这种连接，可以对樣^求采取相似的方案。在一些实施方式中，固体载体是微滴定板。在一些实施方式中，固体载体是顺磁性微球。示例性的顺磁性微球是抗生蛋白链菌素C1(Dynal，650.01-03)。其它合适的微球对于本领域技术人员是显而易见的。抗体与顺磁性微球的连接方法是本领域公知的。在实施例2中给出了一个实例。目标分子与捕获结合伴体(如固定在固体载体上的抗体)接触。可以采用一些样品制备过程，例如从血液样品制备血清或在样品接触捕获抗体之前的浓缩过程。在免疫分析中用于蛋白质结合的方案是现有技术中公知的，且包括在本发明的实施例中。用于结合的时间依据条件的不同而变化，很明显，在某些情况下希望更短的结合时间，特别是在临床环境下。采用例如顺磁性微球可以缩短结合所需的时间。在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合的时间短于大约12、10、8、6、4、3、2或1小时，或者短于大约60、50、40、30、25、20、15、10或5分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合的时间短于大约60分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合的时间短于大约40分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合的时间短于大约30分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合的时间短于大约20分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合的时间短于大约15分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合的时间短于大约10分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合的时间短于大约5分钟。在一些实施方式中，在肌4丐蛋白颗粒与捕获结合伴体(如捕获抗体)结合后，可能非特异性结合的颗粒以及样品中其它不需要的物质被清洗掉，以基本上仅遗留下特异性结合的肌钙蛋白颗粒。在其它的实施方式中，在样品和标记物之间不进行清洗；可以理解，这进一步缩短了样品制备时间。因此，在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合和标记物与目标分子的结合的总时间短于大约12、10、8、6、4、3、2或1小时，或者短于大约60、50、40、30、25、20、15、10或5分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合和标记物与目标分子的结合的总时间短于大约60分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合和标记物与目标分子的结合的总时间短于大约40分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合和标记物与目标分子的结合的总时间短于大约30分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合和标记物与目标分子的结合的总时间短于大约20分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合和标记物与目标分子的结合的总时间短于大约15分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合和标记物与目标分子的结合的总时间短于大约IO分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与捕获结合伴体(如抗体)的结合和标记物与目标分子的结合的总时间短于大约5分钟。某些包括用于测量目标分子的捕获和信号抗体的免疫分析诊断试剂可能源自动物血清。具有与其它物种的免疫球蛋白结合的能力的内源性人异嗜性抗体或人抗动物抗体存在于10%以上病人的血清或血浆中。这些循环系统的异嗜性抗体可能干扰免疫分析测量。在夹心免疫分析中，这些异嗜性抗体可能桥接捕获和检测(诊断)抗体，因而产生假阳性信号，或者它们可能阻止诊断抗体的结合，因而产生假阴性信号。在竟争免疫分析中，异嗜性抗体可以与分析抗体结合并抑制其与肌钙蛋白的结合。它们也可能阻止或增强抗体-肌4丐蛋白复合体与游离肌4丐蛋白的分离，特别是在分离系统中使用抗物种抗体(antispeciesantibody)的时候。因而，这些异嗜性抗体干扰的影响难于预料。因此，阻止任何异嗜性抗体的结合将是有利的。在本发明的一些实施方式中，免疫分析包括使用一种或多种异嗜性抗体阻断剂耗竭样品中的异嗜性抗体的步骤。用于从将要在免疫分析中测试的样品中除去异嗜性抗体的方法是已知的，并包括在90。C温度下乙酸钠緩冲液(pH5.0)中加热样本15分钟并在1200g离心10分钟，或者异嗜性抗体可以采用聚乙二醇(PEG)沉淀；使用蛋白A或蛋白G从样品中免疫提取干扰性的异嗜性免疫球蛋白；或者加入未免疫小鼠品。可以确定预处理方法的适当性。用于使异嗜性抗体导致的免疫分析干扰最小化的生物化学药剂为商购得到。例如，称为MAK33的产品(其为对h-CK-MM的IgGl单克隆抗体)可以从BoehringerMannheim得到。MAK33+产品包含IgGl和IgGl-Fab的组合。聚MAK33包含与IgGl聚合的IgGl-Fab，而聚MAC2b/2a包含与IgG2b聚合的IgG2a-Fab。中和异嗜性抗体的生物化学药剂的第二个商业来源是由BioreclamationInc，EastMeadow,NY4,向市场的免疫J求蛋白抑制试剂(ImmunoglobulinInhibitingReagent)。这一产品是来自多种物种的免疫球蛋白(IgG和IgM)制剂，主要是来自Balb/c小鼠的鼠IgG2a、IgG2b和IgG3。在一些实施方式中，异嗜性抗体可以使用现有技术中已知的方法，例如通过将干扰性抗体与蛋白质A或G结合从样品中耗竭异嗜性抗体，从样品中免疫提取异嗜性抗体。在一些实施方式中，异嗜性抗体使用一种或多种异嗜性抗体阻断剂进行中和。异嗜性阻断剂可以选自抗同种型异嗜性抗体阻断剂、抗独特型异嗜性抗体阻断剂和抗-抗独特型异嗜性抗体阻断剂。在一些实施方式中，可以使用异嗜性抗体阻断剂的组合。标记物在加入样品并清洗的同时或之后加入。用于抗体和其它免疫标记与蛋白质和其它分子结合的方案是现有技术中公知的。如果标记结合步骤与捕获结合分离，则在例如临床情况下用于标记结合的时间可能是重要的。在一些实施方式中，用于目标分子与标记物(如抗体-染料)结合的时间短于大约12、10、8、6、4、3、2或1小时，或者短于大约60、50、40、30、25、20、15、10或5分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与标记物(如抗体-染料)结合的时间短于大约60分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与标记物(如抗体-染料)结合的时间短于大约40分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与标记物(如抗体-染料)结合的时间短于大约30分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与标记物(如抗体-染料)结合的时间短于大约20分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与标记物(如抗体-染料)结合的时间短于大约15分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与标记物(如抗体-染料)结合的时间短于大约IO分钟。在一些实施方式中，用于目标分子与标记物(如抗体-染料)结合的时间短于大约5分钟。过量的标记物通过清洗除去。然后标记物从目标蛋白质上洗脱。优选的洗脱緩冲液有效地释放标记物而不产生显著的背景。如果洗脱緩沖液是抑菌的，这也是有利的。本发明中使用的洗脱緩冲液包括离液剂，如脲或胍化合物；緩沖液，如硼酸盐緩冲盐水；蛋白质载体，如白蛋白(如人、牛或鱼白蛋白)，或IgG，以包被^^测仪器中的毛细管壁；和表面活性剂，如离子或非离子去污剂，经选择产生相对低的背景，如Tween20、TritonX-100和SDS。加样到单分子检测器中的洗脱緩冲液/标记物部分称为"处理样品"，以与取自个体的原始样品区分。在另一实施方式中，固相结合分析可以采用竟争结合分析模式。一种这样的方法包括a)将i)样品中的目标分子(如生物状态标志物)和ii)包含可检测标记的分子(检测试剂)的标记类似物竟争性地与固定在结合表面上的捕获抗体结合，及b)使用单颗粒分析仪测量标记物的量。另一种这样的方法包括a)将i)样品中的目标分子(如生物状态标志物)和ii)固定在结合表面上的分子的类似物(捕获试剂)与具有可检测标记的抗体(检测试剂)竟争性结合，及b)使用单颗粒分析仪测量标记物的量。这里，"分子的类似物"指的是与结合捕获抗体的分子竟争的物质。竟争性免疫分析的例子在Deutsch等人的美国专利4，235，601号、Liotta的美国专利4，442，204号和Buechler等人的美国专利5,208,535号中进行了说明，这些文献通过引用全部引入本申请。C.目标分子的4企测和浓度的测定洗脱之后，标记物在例如緩沖液中通过单分子检测器。处理样品可能不包含标记物、包含一个或多个标记物。标记物的数目对应于目标分子(如在捕获步骤中捕获的生物状态标志物)的数目或与其成比例(如果使用样品的稀释液或部分)。可以使用任何能够检测与目标分子一起使用的标记物的合适的单分子检测器。这里对合适的单分子检测器进行了说明。通常检测器是包括用于对制备样品进行采样的自动采样器和任选的用于回收样品的回收系统的系统的一个部分。在一些实施方式中，处理样品在采用毛细管流系统并包括毛细管流动池、照射毛细管中供处理样品通过的探询空间的激光、4全测由探询空间发射的辐射的检测器和通过探询空间移动处理样品的动力源的单分子分析仪中进行分析。在一些实施方式中，单分子分析仪还包括收集由处理样品通过探询空间时发射的光的显微镜物镜，例如高数值孔径的显微镜物镜。在一些实施方式中，激光器和检测器形成共焦排列。在一些实施方式中，激光器是连续波激光器。在一些实施方式中，检测器是雪崩光电二极管检测器。在一些实施方式中，动力源是提供压力的泵。在一些实施方式中，本发明提供包括能够自动采集多个样品和在样品容器与探询空间之间提供流体连通的采样系统的分析系统。在一些实施方式中，探询空间具有大约0.001至500pL的容积，或者具有大约O.OlpL至100pL、大约O.OlpL至10pL、大约O.OlpL至5pL、大约O.OlpL至0.5pL的容积，或者大约0.02pL至大约300pL、大约0.02pL至大约50pL、大约0.02pL至大约5pL、大约0.02pL至大约0.5pL、大约0.02pL至大约2pL的容积，或者大约0.05pL至大约50pL、大约0.05pL至大约5pL、大约0.05pl」至大约0.5pL、大约0.05pL至大约0.2pL的容积，或者大约0.1pL至大约25pL的容积。在一些实施方式中，探询空间具有大约0.004pL至100pL的容积。在一些实施方式中，探询空间具有大约0.02pL至50pL的容积。在一些实施方式中，探询空间具有大约0.001pL至10pL的容积。在一些实施方式中，探询空间具有大约0.001pL至lOpL的容积。在一些实施方式中，探询空间具有大约0.01pL至5pL的容积。在一些实施方式中，:探询空间具有大约0.02pL至5pL的容积。在一些实施方式中，探询空间具有大约0.05pL至5pL的容积。在一些实施方式中，探询空间具有大约0.05pL至10pL的容积。在一些实施方式中，探询空间具有大约0.5pL至大约5pL的容积。在一些实施方式中，纟笨询空间具有大约0.02pL至大约0.5pL的容积。流系统，并包括毛细管流动池、照射毛细管中处理样品通过的^笨询空间的连续波激光器、收集由处理样品通过探询空间时发射的光的高数值孔径的显微镜物镜、检测由探询空间发射的辐射的雪崩光电二极管检测器和提供压力以通过探询空间移动处理样品的泵，其中探询空间在大约0.02pL至大约50pL之间。在一些实施方式中，本发明的方法使用的单分子检测器利用毛细管流系统，并包括毛细管流动池、照射毛细管中的处理样品通过的探询空间的连续波激光器、收集由处理样品通过探询空间时发射的光的高数值孔径的显微镜物镜，其中该透镜具有至少大约0.8的数值孔径、检测由探询空间发射的辐射的雪崩光电二极管检测器和提供压力以移动处理样品通过探询空间的泵，其中探询空间在大约0.004pL至大约100pL之间。在一些实施方式中，本发明的方法使用的单分子检测器利用毛细管流系统，并包括毛细管流动池、照射毛细管中的处理样品通过的探询空间的连续波激光器、收集由处理样品通过探询空间时发射的光的高数值孔径的显微镜物镜，其中该透镜具有至少大约0.8的数值孔径、检测由探询空间发射的辐射的雪崩光电二极管检测器和提供压力以移动处理样品通过探询空间的泵，其中探询空间在大约0.05pL至大约10pL之间。在一些实施方式中，本发明的方法使用的单分子检测器利用毛细管流系统，并包括毛细管流动池、照射毛细管中的处理样品通过的探询空间的连续波激光器、收集由处理样品通过探询空间时发射的光的高数值孔径的显微镜物镜，其中该透镜具有至少大约0.8的数值孔径、检测由探询空间发射的辐射的雪崩光电二极管检测器和提供压力以移动处理样品通过探询空间的泵，其中探询空间在大约0.05pL至大约5pL之间。在一些实施方式中，本发明的方法使用的单分子检测器利用毛细管流系统，并包括毛细管流动池、照射毛细管中的处理样品通过的探询空间的连续波激光器、收集由处理样品通过探询空间时发射的光的高数值孔径的显微镜物镜，其中该透镜具有至少大约0.8的数值孔径、检测由探询空间发射的辐射的雪崩光电二极管检测器和提供压力以移动处理样品通过探询空间的泵，其中探询空间在大约0.5pL至大约5pL之间。在这些实施方式中的任一种中，分析仪可以包含不超过一个探询空间。在一些实施方式中，单分子检测器能够测定样品中目标分子的浓度，其中样品浓度范围可能在至少大约100倍、1000倍、10000倍、100000倍、300000倍、1000000倍、10000000或30000000倍的范围内。在一些实施方式中，本发明的方法利用能够检测31入检测器中的第一样品和第二样品之间的小于大约50%、40%、30%、20%、15%或10%的分析物浓度差异的单分子检测器，其中引入分析仪中的第一样品和所述第二样品的体积小于大约100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、5、4、3、2或l|ul，且其中分析物以低于大约100、90、80、70、60、850、40、30、20、15、10、5、4、3、2或1毫微樣i摩尔的浓度存在。在一些实施方式中，本发明的方法利用能够检测《1入检测器中的第一样品和第二样品之间的小于大约50%的分析物浓度差异的单分子检测器，其中引入分析仪中的第一样品和所述第二样品的体积小于大约100pl，且其中分析物以低于大约100毫微微摩尔的浓度存在。在一些实施方式中，本发明的方法利用能够检测引入检测器中的第一样品和第二样品之间的小于大约40%的分析物浓度差异的单分子检测器，其中引入分析仪中的第一样品和所述第二样品的体积小于大约50^1，且其中分析物以低于大约50毫微微摩尔的浓度存在。在一些实施方式中，本发明的方法利用能够检测？1入检测器中的第一样品和第二样品之间的小于大约20%的分析物浓度差异的单分子检测器，其中引入分析仪中的第一样品和所述第二样品的体积小于大约20^1,且其中分析物以低于大约20毫微樣l摩尔的浓度存在。在一些实施方式中，本发明的方法利用能够检测引入检测器中的第一样品和第二样品之间的小于大约20%的分析物浓度差异的单分子检测器，其中引入分析仪中的第一样品和所述第二样品的体积小于大约10)al，且其中分析物以低于大约10毫微微摩尔的浓度存在。在一些实施方式中，本发明的方法利用能够检测？1入检测器中的第一样品和第二样品之间的小于大约20%的分析物浓度差异的单分子检测器，其中引入分析仪中的第一样品和所述第二样品的体积小于大约5^1,且其中分析物以低于大约5毫微微摩尔的浓度存在。下面会对单分子检测器和系统进行更详细的说明。可在本发明的方法中使用的单分子分析仪的进一步的实施方式，如具有超过一个探询窗口(interrogationwindow)的检测器、采用电动或电泳流的检测器等等，可以在美国专利申请11/048,660中找到，该文献通过引用全部引入本申请。可以在多次运行之间对仪器进行清洗。在一些实施方式中可以使用保持样品的盐浓度和表面活性剂浓度的清洗緩沖液以保持毛细管的状态，即在不同样品之间保持毛细管表面相对恒定从而降低变异性。有利于本发明的仪器和方法达到灵敏度的特征是检测标记物和对标记物进行计数的方法，标记物在一些实施方式中连接到待;险测的单个分子，或者更典型地对应于待检测的单个分子。简而言之，流经毛细管的处理样品通过使毛细管的给定的探询空间经受预定时间的来自激光器的EM辐射，并检测在该段时间内发射的光子而被有效地分成一系列检测事件，该激光器以适于标记物中使用的焚光结构的激发波长发射光。各个预定的时间段为"箱元(bin)"。如果在给定的箱元中检测到的光子的总数超过预定的阈水平，则对该箱元记录为纟全测事件，即4企测到标记物。如果光子的总数未达到预定的阈水平，则不记录检测事件。在一些实施方式中，处理样品浓度充分稀释，从而对于大多数的检测事件，检测事件表示仅一个标记物通过窗口，其对应于原始样品中的单个目标分子，也就是说，很少的检测事件表示单个箱元中的超过一个标记物。在一些实施方式中，应用进一步的精制处理以在需要精确检测的处理样品中得到标记物的更高浓度，即两个或多个标记物检测为单个检测事件的机率不再是无关紧要的浓度。虽然可以采用其它的箱元时间而不脱离本发明的范围，但在本发明的一些实施方式中，箱元时间选自大约1微秒至大约5毫秒的范围。在一些实施方式中，箱元时间大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000或5000樣i秒。在一些实施方式中，箱元时间小于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000或5000微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约1至IOOO微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约1至750微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约1至500樣i秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约1至250孩i秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约1至100微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约1至5(H敬秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约1至40微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约1至30微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约1至500微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约1至2(H敬秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约1至1CM数秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约1至50(H数秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约1至5微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约5至500微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约5至250微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约5至100微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约5至50微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约5至20微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约5至l(H鼓秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约10至500微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约10至250微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约10至IOO微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约10至50微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约10至30微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约IO至20微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约5微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约5微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约6微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约7微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约8微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约9微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约10微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约ll微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约12微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约13微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约14微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约5微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约15微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约16微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约17微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约18^:秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约19微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约20微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约25^:秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约30微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约40微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约50微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约100微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约250孩么秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约50(H鼓秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约750微秒。在一些实施方式中，箱元时间为大约IOOO微秒。在一些实施方式中，背景噪音水平由平均噪音水平或均方根噪音确定。在其它情况下，选择典型噪音值或统计值。在大多数情况下，噪音预计呈泊松分布。因此，在一些实施方式中，测定样品中颗粒-标记物复合体的浓度包括测定背景噪音水平。因此，随着标记物流过毛细管流动池，它被激光束激发以产生光子脉沖。通过仅对能量高于预定阈能量水平的光子脉沖进行考察将由标记物发射的光子与背景光或背景噪音发射区分开，预定阈能量水平说明了存在于样品中的背景噪音。背景噪音通常包括由例如存在于样品、緩冲液或用于制备分析样品的稀释剂中的非标记颗粒的固有荧光产生的低频率发射、拉曼散射和电子噪声。在一些实施方式中，赋予背景噪音的值计算为在多个箱元中检测的平均背景信号噪音，这是在预定长度的时间内在探询空间中检测到的光子信号的量度。因此在一些实施方式中，对于各样品，背景噪音分别计算为对该样品特定的数。给定背景噪音的值，则可以指定阈能量水平。如上所述，阈值确定为区分真实信号(由于标记物的荧光产生)和背景噪音。必须仔细地选^^阈值以使得来自随机噪音的假阳性信号的数目最小化，同时排除的真实信号的数目也最小化。选择阈值的方法包括测定高于噪音水平的固定值并基于噪音信号的分布计算阈值。在一种实施方式中，阈设定为高于背景水平的标准差的固定数值。假定噪音为泊松分布，就可以采用这种方法估算试验的整个时间过程内假阳性信号的数目。在一些实施方式中，阈水平计算为高于背景噪音的4ci值。例如，给定200光子的平均背景噪音水平，则分析系统确定高于200光子的4V5而的阈水平至256光子的平均背景/噪音水平。因此，在一些实施方式中，测定样品中的标记物的浓度包括确定阈水平，在该阈水平之上的光子信号表示标记物的存在。反之，能量不高于阔水平能量的光子信号表示标记物不存在。进行多个箱元测量以测定样品的浓度，并对各个箱元测量以确定标85记物是否存在。通常，在一分钟内可以进行60000或更多的测量(例如，在箱元大小为lms的实施方式中一对于更小的箱元大小，测量的数目相应地增大，如对于l(H鼓秒的箱元大小，每分钟进行6000000个测量)。因此，单个的测量不是关键的，且该方法提供了高的误差限度。确定为不包含标记物的箱元("非"箱元)被忽略，而仅在确定为包含标记物的箱元("是，，箱元)中进行的测量在确定处理样品中的标记物浓度时进行考虑。忽略在"非"箱元或无标记物的箱元中进行的测量增大了信噪比和测量的精度。因此，在一些实施方式中测定样品中的标记物的浓度包括检测反映标记物存在的箱元测量。分析系统的信噪比或灵敏度可以通过使检测颗粒-标记物复合体的箱元测量过程中检测背景噪音的时间最小化而得到提高。例如，在持续1毫秒的箱元测量中，其中一个颗粒-标记物复合体在25(H鼓秒内通过^笨询空间时被检测到，1毫秒内的750微秒花费在检测背景噪音发射上。信噪比可以通过缩短箱元时间^提高。在一些实施方式中，箱元时间是l毫秒。在其它的实施方式中，箱元时间是750、500、25CM鼓秒、100微秒、50微秒、25微秒或10微秒。其它的箱元时间如这里所述。其它影响测量的因素为荧光结构的亮度或暗度(dimness)、流速和激人员是显而易见的。在一些实施方式中，对箱元时间进行调整而不改变流速。本领域技术人员可以理解，随着箱元时间减少，定向到纟笨询空间上的激光器功率输出必须增加以维持在箱元时间内施加到探询空间上的总能量恒定。例如，如果箱元时间从1000微秒减小到250微秒，作为第一近似，激光器功率输出必须增加大约四倍。这些设置使得能够在250ns内检测与先前的设置中在lOOOps内检测的光子数目相同数目的光子，并且使得能够以较低的背景和因此更高的灵敏度更快地对样品进行分析。另外，可以调整流速以加快处理样品的速度。这些数值仅是示例性的，有经验的实施者可以对参数进行必要的调整以获得希望的结果。在一些实施方式中，探询空间包括样品流的整个横截面。当探询空间包括样品流的整个横截面时，计算处理样品中标记物的浓度仅需要在设定的时间段内计数得到的标记物的数目和通过样品流的横截面的体积。在一些实施方式中，探询空间可以限定为小于样品流的横截面，例如通过激光束照射的点的大小对探询进行限定。在一些实施方式中，探询空间可以通过调整分析仪的孔306(图1A)或358和359(图1B)并减小由物镜传输到检测器上的照射体积而进行限定。在探询空间限定得小于样品流的横截面的实施方式中，标记物的浓度可以通过将复合体发射的信号插入使用一个或多个已知标准浓度的样品得到的标准曲线而确定。在更多的其它实施方式中，标记物的浓度可以通过将测量的颗粒与内标标准进行比较而确定。在对稀释样品进行分析的实施方式中，在计算原始样品中目标分子的浓度时需要考虑稀释因子。如上所述，当探询空间包括样品流的整个横截面时，仅需要在设定的时间段(箱元)内通过样品流的横截面的计数的标记物的数目和在该箱元中检测的样品的体积来计算样品的浓度。确定在"是"箱元中包含的标记物的总数，并使其与用于测定处理样品中标记物的浓度的分析中所使用的箱元的总数代表的样品体积关联。因此，在一种实施方式中，测定处理样品中标记物的浓度包括确定检测的"是"箱元的标记物总数并使检测的标记物的总数与分析的总样品体积关联。分析的总样品体积是在指定的时间段内通过毛细管流动池并越过探询空间的样品体积。可选择地，样品中的标记物复合体的浓度通过将多个箱元中标记物发射的信号插入通过确定包含已知浓度的标记物的标准样品在同样数目的箱元中标记物发射的信号得到的标准曲线而确定。在一些实施方式中，在箱元中检测到的个体标记的数目与处理样品中颗粒的相对浓度有关。在相对低的浓度下，例如在低于大约10—16M的浓度下，标记物的数目与在箱元中检测到的光子信号成比例。因此，在低标记物浓度下，光子信号为数字信号。在相对较高的浓度下，例如在高于大约10"M的浓度下，光子信号与标记物丧失了比例性，因为两个或多个标记物在大致相同的时间越过探询空间因而被计为一个标记物的可能性变得很大。因此，在一些实施方式中，浓度高于大约1(T"M的样品中的个体颗粒通过缩短箱元测量的时间长度而得到分辨。可选择地，在其它的实施方式中，检测由存在于任何一个箱元中的多个颗粒发射的光子信号的总和。这些实施方式可被本发明的单分子检测器采用，其中动态范围至少为3、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8或高于8个数量级。这里所用的术语"动态范围"指的是在不需要稀释或其它处理以改变具有不同浓度的系列样品的浓度的情况下就可以通过仪器定量的样品浓度的范围，其中浓度以适于预定用途的精度进行测定。例如，如果微滴定板在一个孔中包含具有1毫微微摩尔浓度目标分析物的样品，在另一个孔中包含具有10000毫微微摩尔浓度目标分析物的样品和在第三个孔中包含具有100毫微微摩尔浓度分析物的样品，则具有至少4个数量级的动态范围和1毫微微摩尔定量下限的仪器能够精确地定量所有这些样品的浓度而不需要进行进一步的调整浓度的处理，如稀释。精度可以通过标准方法确定，例如使用一系列跨越动态范围的浓度标准并建立标准曲线。标准测量与所获得的标准曲线的拟合度(fit)可以用作精度的量度，如大于约0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.91、0,92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98或0.99的r"直。通过改变检测器数据的分析方式和/或在检测器和探询空间之间使用衰减器获得增大的动态范围。在该范围的低端，其中处理样品经充分稀释以使得各个检测事件(即箱元中高于阈水平的各个光子脉沖，"事件光子")很可能仅代表一个标记物，数据分析时将检测事件计为单个分子。也就是说，如上所述，对于标记物的存在各个箱元被分为简单的"是"或"非"。对于浓度更高的处理样品，其中两个或多个标记物占据单个箱元的可能性变得很大，在众多数目的箱元中事件光子的数目实质上大于预想的单个标记物的数目，例如，在众多数目的箱元中事件光子的数目相当于预想的单个标记物的事件光子的数目的两倍、三倍或更高。对于这些样品，仪器改变其数据分析方法为综合该处理样品的箱元中事件光子的总数的一种方法。这一总数与所有箱元中标记物的总数成比例。对于浓度进一步增加的处理样品，其中在大多数箱元中存在多个标记物，背景噪音变成各箱元的总信号中无关紧要的部分，因而仪器改变其数据分析方法为计算每个箱元的总光子(包括背景)的一种方法。在浓度大到使得到达检测器的光的强度超过检测器精确计数光子的能力(即使检测器饱和)时，动态范围的进一步增大可以通过在流动池和检测器之间使用衰减器而获4寻。仪器可以包括从检测器接收输入并确定对运行的样品合适的分析方法，及输出基于这种分析的值的数据分析系统。如果在仪器中包括衰减器，则数据分析系统可以进一步输出使用或不使用衰减器的指令。通过采用这些方法，仪器的动态范围可以得到极大的增加。因此，在一些实施方式中，仪器能够在大于大约1000(3个数量级)、10000(4个数量级)、100000(5个数量级)、350000(5.5个数量级)、1000000(6个数量级)、3500000(6.5个数量级)、10000000(7个数量级)、35000000(7.5个数量级)或100000000(8个数量级)的动态范围上测量样品浓度。在一些实施方式中，仪器能够在大于大约100000(5个数量级)的动态范围上测量样品浓度。在一些实施方式中，仪器能够在大于大约1000000(6个数量级)的动态范围上测量样品浓度。在一些实施方式中，仪器能够在大于大约10000000(7个数量级)的动态范围上测量样品浓度。在一些实施方式中，仪器能够在从大约1-10毫微微摩尔到至少大约1000、10000、100000、350000、1000000、3500000、10000000或35000000毫樣￡微摩尔的动态范围上测量样品浓度。在一些实施方式中，仪器能够在从大约1-10毫微微摩尔到至少大约10000毫微微摩尔的动态范围上测量样品浓度。在一些实施方式中，仪器能够在从大约1-10毫微微摩尔到至少大约100000毫微微摩尔的动态范围上测量样品浓度。在一些实施方式中，仪器能够在从大约1-10毫微微摩尔到至少大约1000000毫微微摩尔的动态范围上测量样品浓度。在一些实施方式中，仪器能够在从大约1-10毫微孩i摩尔到至少大约10000000毫微微摩尔的动态范围上测量样品浓度。在一些实施方式中，本发明的分析仪或分析系统能够以低于1纳摩尔、或1皮摩尔、或1毫孩t孩傳尔、或1微微^鼓摩尔或1仄(zepto)摩尔的检测极限检测分析物(如生物标志物)。在一些实施方式中，当样品中生物标志物以低于1纳摩尔、或1皮摩尔、或1毫微微摩尔、或1微微微摩89尔或1仄(zepto)摩尔的浓度存在时和当各样品的量小于大约100、50、40、30、20、10、5、2、10.1、0.01、0.001或0.0001|til时，分析仪或分析系统能够4全测从一个样品到另一个样品的小于大约0.1、1、2、5、10、20、30、40、50、60或80%的分析物浓度变化。在一些实施方式中，当分析物以低于约1皮摩尔的浓度存在时和当各样品的量小于大约50pl时，分析仪或分析系统能够检测从第一样品到第二样品的小于大约20%的分析物浓度变化。在一些实施方式中，当分析物以低于约100毫微微摩尔的浓度存在时和当各样品的量小于大约50^1时，分析仪或分析系统能够检测从第一样品到第二样品的小于大约20%的分析物浓度变化。在一些实施方式中，当分析物以低于约50毫微微摩尔的浓度存在时和当各样品的量小于大约5(^1时，分析仪或分析系统能够检测从第一样品到第二样品的小于大约20。/)的分析物浓度变化。在一些实施方式中，当分析物以低于约5毫微微摩尔的浓度存在时和当各样品的量小于大约5(^1时，分析仪或分析系统能够检测从第一样品到第二样品的小于大约20%的分析物浓度变化。在一些实施方式中，当分析物以低于约5毫微微摩尔的浓度存在时和当各样品的量小于大约时，分析仪或分析系统能够检测从第一样品到第二样品的小于大约20。/。的分析物浓度变化。在一些实施方式中，当分析物以低于约1毫微微摩尔的浓度存在时和当各样品的量小于大约5^1时，分析仪或分析系统能够检测从第一样品到第二样品的小于大约20%的分析物浓度变化。V适用于分子的高灵敏分析的仪器和系统本发明的方法采用高灵敏度的分析仪器，如单分子检测器。这种单分子检测器包括这里描述的实施方式。在一些实施方式中，本发明提供用于检测样品中的单个蛋白质分子的分析系统试剂盒，所述系统包括用于检测样品中的单个蛋白质分子的分析系统和至少一种包含荧光结构和蛋白质分子的结合伴体的标记物，其中分析仪包括用于激发荧光结构的电磁辐射源；供标记物通过的毛细管流动池；用于在毛细管流动池中移动标记物的动力源；在毛细管流动池中形成的用于接收电磁源发射的电磁辐射的探询空间；和可操作地与探询空间连接的用于测量受到激发的荧光结构的电磁特征的电磁辐射检测器，其中荧光结构能够在受到其激发波长的激光器发射的光的激发时发射至少约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指？1到该点上的总能量不超过约3微焦耳。本发明的分析试剂盒的一种实施方式如图12中所示。该试剂盒包括蛋白质分子的标记物，其包括蛋白质分子的结合伴体和荧光结构。试剂盒进一步包括用于检测单个蛋白质分子的分析系统(300),其包括用于激发荧光结构的电^i辐射源301、供标记物通过的毛细管流动池313、用于在毛细管流动池中移动标记物的动力源(未显示)、在毛细管流动池中形成的用于接收电磁源发射的电磁辐射的探询空间314(图2A)和可操作地与探询空间连接的用于测量所述受到激发的荧光结构的电磁特征的电磁辐射检测器309,其中焚光结构能够在受到其激发波长的激光器发射的光的激发时发射至少约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指？1到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，来自电磁辐射源301的波束311通过显微镜物镜315聚焦以在毛细管流动池313内形成一个探询空间314(图2A)。在一些实施方式中显微镜物镜可以具有等于或大于0.7、0.8、0.9或1.0的数值孔径。在该分析系统试剂盒的一些实施方式中，分析仪包括不超过一个探询空间。在一些实施方式中，电磁辐射源是具有至少约3、5、10或20mW的功率输出的激光器。在一些实施方式中，荧光结构包括荧光分子。在一些实施方式中，荧光分子为染料分子，如包括至少一个取代的吲咪総环系统的染料分子，该。引哚鐵环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。在一些实施方式中，荧光结构为量子点。在一些实施方式中，电磁辐射源是连续波电磁辐射源，如发光二极管或连续波激光器。在一些实施方式中，动力是压力。在一些实施方式中，检测器是雪崩光电二极管检测器。在一些实施方式中，分析仪采用用于折射激光束到所述探询空间上和使所述激发的染料分子成像的共焦光学装置(如图12所示)，其中所述共焦光学装置包括具有至少约0.8的数值孔径的物镜。在一些实施方式中，分析仪进一步包括能够对多个样品进行自动采样并在样品容器和所述探询空间之间提供流体连通的采样系统。在一些实施方式中，分析系统进一步包括与所述探询空间流体连通的样品回收系统，其中所述回收系统能够回收基本上所有所述样品。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括系统使用说明。A.设备/系统在一个方面中，这里描述的方法采用能够检测样品中的单个分子的分析系统。在一种实施方式中，分析系统能够进行荧光标记的单分子检测，其中当单个颗粒存在于与分析系统的采样系统流体连接的毛细管内形成的探询空间中时，分析系统检测激发的荧光标记物响应于电磁辐射的照射而发射的能量。在分析系统的进一步的实施方式中，单颗粒借助于动力移动通过毛细管流动池的探询空间。在分析系统的另一种实施方式中，自动采样系统可以包括在分析系统中以将样品引入分析系统。在分析系统的另一种实施方式中，样品制备系统可以包括在分析系统中以制备样品。在进一步的实施方式中，分析系统可以包括用于在分析完成后回收至少部分样品的样品回收系统。在一个方面中，分析系统包括用于激发用荧光标记物标记的单分子的电磁辐射源。在一种实施方式中，分析系统的电磁辐射源为激光器。在进一步的实施方式中，电磁辐射源为连续波激光器。在典型的实施方式中，电^t辐射源在标记物通过毛细管流动池的一笨询空间时激发连接到标记物上的荧光结构。在一些实施方式中，焚光标记结构包括一个或多个荧光染料分子。在一些实施方式中，荧光标记是量子点。这里描述的任何荧光结构都可以在标记物中使用。当标记物通过位于毛细管流动池内的探询空间时，标记物暴露于电磁辐射中。探询空间通常与采样系统流体连通。在一些实施方式中，标记物由于4,动标记物通过分析系统的动力的作用而通过毛细管流动池的探询空间。探询空间的定位使得它能够接收由辐射源发射的电磁辐射。在一些实施方式中，采样系统是能够对多个样品进行采样而不需要操作员介入的自动采样系统。标记物通过探询空间，并在受到电磁辐射源的激发时发射可检测量的能量。在一种实施方式中，电磁辐射检测器与探询空间可操作地连接。电磁辐射检测器能够检测由标记物发射的能量，例如由标记物的焚光结构发射的能量。在分析系统的进一步的实施方式中，该系统进一步包括样品制备装置，其中样品被部分地或完全地制备以用于分析系统的分析。在分析系统的一些实施方式中，样品在被系统分析后丢弃。在其它的实施方式中，分析系统进一步包括样品回收装置，从而至少部分的，或者全部或基本上全部样品可以在分析后回收。在这样的实施方式中，样品可以送回到样品源中。在一些实施方式中，样品可以送回到样品樣b'离定板上的微滴定孔中。分析系统通常进一步包括用于收集和报告检测的信号的数据获取系统。B.单颗粒分析仪如图1A中所示，这里描述的是分析系统300的一种实施方式。分析系统300包括电磁辐射源301、镜子302、透镜303、毛细管流动池313、显微镜物镜305、孔306、检测器透镜307、检测器滤波器308、单光子检测器309和可操作地与检测器连接的处理器310。运行中，电磁辐射源301定位成使其输出311被镜子302的前表面312反射出去。透镜303将光束311聚焦在毛细管流动池313中的单探询空间(探询空间314的说明性的例子显示在图2A中)上。显微镜物镜305聚集来自样品颗粒的光并形成光束的像到孔306上。孔306影响毛细管流动池的探询空间中的样本发射的光可以收集的部分。检测器透镜307收集通过孔306的光并在光通过检测器滤波器308后将光聚焦在检测器309的活性区域上。检测器滤波器308使由于光散射或环境光导致的异常噪音信号最小化，同时使由结合到颗粒上的激发的荧光结构发射的信号最大化。处理器310按照这里描述的方法处理来自颗粒的光信号。在一种实施方式中，显微镜物镜305是高数值孔径的显微镜物镜。这里所说的"高数值孔径透镜"包括具有等于或大于0.6的数值孔径的透镜。数值孔径是物镜捕获的高折射图象形成光线的数目的量度。较高数值孔径使得更加倾斜的光线进入物镜并因此产生具有更高分辨率的图象。高数值孔径透镜可以从多个供应商处购得，且任何一种具有等于或大于0.6的数值孔径的透镜可以用在分析系统中。在一些实施方式中，透镜具有大约0.6-大约1.3的数值孔径。在一些实施方式中，透镜具有大约0.6-大约1.0的数值孔径。在一些实施方式中，透镜具有大约0.7-大约1.2的数值孔径。在一些实施方式中，透镜具有大约0.7-大约1.0的数值孔径。在一些实施方式中，透镜具有大约0.7-大约0.9的数值孔径。在一些实施方式中，透镜具有大约0.8-大约1.3的数值孔径。在一些实施方式中，透镜具有大约0.8-大约1.2的数值孔径。在一些实施方式中，透镜具有大约0.8-大约1.0的数值孔径。在一些实施方式中，透镜具有至少大约0.6的数值孔径。在一些实施方式中，透镜具有至少大约0.7的数值孔径。在一些实施方式中，透镜具有至少大约0.8的数值孔径。在一些实施方式中，透镜具有至少大约0.9的数值孔径。在一些实施方式中，透镜具有至少大约1.0的数值孔径。在一些实施方式中，显微镜物镜305的孔径为大约1.25。在使用0.8的显微镜物镜305的实施方式中，可以使用Nikon60X/0.8NAAchromat透镜(Nikon,Inc.,USA)。在一些实施方式中，电磁辐射源301为发射可见光i普中的光的激光器。在所有实施方式中，电磁辐射源设定为具有足够激发与颗粒连接的荧光标记的波长的激光器。在一些实施方式中，激光器是具有639nm波长的连续波激光器。在其它的实施方式中，激光器是具有532nm波长的连续波激光器。在其它的实施方式中，激光器是具有422nm波长的连续波激光器。在其它的实施方式中，激光器是具有405nm波长的连续波激光器。具有适于激发在本发明的方法和组合物中使用的荧光结构的波长的任何连续波激光器都可以使用而不脱离本发明的范围。在单颗粒分析系统300中，随着各个颗粒通过电》兹辐射源的光束311,颗粒进入激发状态。当颗粒由其激发状态弛豫时，发射可检测的光脉沖。在各个颗粒通过光束的时间长度内颗粒重复激发-发射循环许多次，使得分析系统300在各个颗粒通过探询空间314时对各个颗粒检测到数十到数千个光子。由焚光颗粒发射的光子通过表示颗粒标记物复合体通过探询空间的时间的时间延迟由检测器309(图1A)记录。光子强度由检测器309记录且采样时间被分成箱元，其为均匀的、任意的、具有可自由选择的时间道宽的时间段。测定各箱元中包含的信号的数目。釆用一种或几种统计分析方法的组合以确定颗粒存在的时间。这种方法包括确定分析系统的基线噪音和设定高于基线噪音的统计水平下的荧光标记的信号强度以消除检测器的假阳性信号。电^t辐射源301聚焦在分析系统300的毛细管流动池313上，其中毛细管流动池313与样品系统流体连接。探询空间314如图2A中所示。来自图1A的连续波电磁辐射源的光束光聚焦到毛细管流动池313内的特定深度。光束313以与毛细管流动池313垂直的角度射向填充样品的毛细管流动池313。光束以纟皮选4奪激发特定的用于标记目标颗粒的荧光标记物的预定波长运作。探询空间314的大小和体积由光束313的直径与光束313聚焦的深度一起确定。可选择地，探询空间可以通过用分析系统运行已知浓度的才交准试样来确定。当在样品浓度中检测单分子时，单分子检测需要的光束大小和聚焦深度被设定，因而限定了探询空间314的大小。探询空间314设定为在适当的样品浓度下在进行观察的各个时程中仅一个颗粒存在于探询空间314中。可以理解，由光束限定的检测探询体积不是完美的球状，而通常是"领结"形。但是，为了定义的目的，探询空间的"体积"在这里定义为由直径等于光束的聚焦点直径的球包含的体积。光束311的聚焦点可以具有各种不同的直径而不脱离本发明的范围。在一些实施方式中，光束的聚焦点的直径为大约1至大约5、10、15或20微米，或者大约5至大约10、15或20微米，或者大约10至大约20微米，或者大约10至大约15微米。在一些实施方式中，光束的聚焦点的直径为大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或2(H鼓米。在一些实施方式中，光束的聚焦点的直径为大约5微米。在一些实施方式中，光束的聚焦点的直径为大约IO微米。在一些实施方式中，光束的95聚焦点的直径为大约12微米。在一些实施方式中，光束的聚焦点的直径为大约13微米。在一些实施方式中，光束的聚焦点的直径为大约14微米。在一些实施方式中，光束的聚焦点的直径为大约15微米。在一些实施方式中，光束的聚焦点的直径为大约16微米。在一些实施方式中，光束的聚焦点的直径为大约17微米。在一些实施方式中，光束的聚焦点的直径为大约18微米。在一些实施方式中，光束的聚焦点的直径为大约19微米。在一些实施方式中，光束的聚焦点的直径为大约20微米。在单颗粒分析系统的一种替代实施方式中，可以使用一种以上电磁辐射源来激发用具有不同波长的荧光标记物标记的颗粒。在另一种替代实施方式中，可以使用毛细管中的超过一个探询空间。在另一种替代实施方式中，可以采用多个^f企测器^f全测来自荧光标记物的不同发射波长。采用了分析系统的这些替代实施方式的例子在图1B中显示。这些实施方式通过引用先前的美国专利申请11/048660号引入本申请。在分析系统300的一些实施方式中，需要动力来移动颗粒通过分析系统300的毛细管流动池313。在一种实施方式中，动力可以是压力的形式。用于移动颗粒通过毛细管流动池的压力可以由泵产生。在一些实施方式中，可以使用Scivex,Inc.HPLC泵。在泵用作动力的一些实施方式中，样品可以以ljil/min至大约20|ul/min、或大约5)il/min至大约20)al/min的速率通过毛细管流动池。在一些实施方式中，样品可以以大约5|ul/min的速率通过毛细管流动池。在一些实施方式中，样品可以以大约10^1/min的速率通过毛细管流动池。在一些实施方式中，样品可以以大约15^1/min的速率通过毛细管流动池。在一些实施方式中，样品可以以大约20)il/min的速率通过毛细管流动池。在一些实施方式中，电动力可以用于移动颗粒通过分析系统。这样一种方法已经由美国专利申请11/048660号公开并通过引用引入本申请。在分析系统300的一个方面中，分析系统的4全测器309检测由荧光标记发射的光子。在一种实施方式中，光子检测器为光电二极管。在进一步的实施方式中，检测器是雪崩光电二极管检测器。在一些实施方式中，光电二极管可以是具有190nm和1100nm波长检测的硅光电二极管。当使用锗光电二极管时，检测的光的波长在400nm至n00nm之间。在其它的实施方式中，当使用砷化镓铟光电二极管时，光电二极管检测的光的波长在800nm至2600nm之间。当硫化铅光电二极管用作检测器时，检测的光的波长在lOOOnm至3500nm之间。在一些实施方式中，电^f兹辐射源301的光学部件和;险测器309的光学部件以常规的光学配置排列。在这样一种排列中，电磁辐射源和检测器定位在不同的焦平面上。如图IA和IB中所示的分析系统的激光器和检测器光学部件的排列是常规光学配置的排列。在一些实施方式中，电磁辐射源的光学部件和检测器的光学部件以共焦光学配置排列。在这样一种排列中，电磁辐射源301和检测器309定位在相同的焦平面上。共焦排列赋予分析仪更高的稳定性，因为如果分析系统发生移动，电磁辐射源301和检测器309不需要重新定位。这一排列也使该分析仪的使用更简化，因为其消除了重新定位分析系统的部件的需要。图1A的分析仪300和图IB的分析仪355的共焦排列分别如图3A和3B所示。图3A显示，来自电^f兹辐射源301的光束311由显微镜物镜315聚焦以在毛细管流动池313中形成一个探询空间314(图2A)。反射激光但允许荧光通过的分色镜316用于将荧光与激光分离。定位在检测器前方的滤波器317消除任何检测器处的非焚光。在一些实施方式中，配置成共焦排列的分析系统可以包括两个或多个探询空间。这种方法已经预先在美国专利申请11/048660号中公开，其通过引用引入本申请。激光器可以是可调的染料激光器，如氦-氖激光器。激光器可以设定为发射632.8nm的波长。可选择地，激光器的波长可以设定为发射543.5nm或1523nm的波长。可选#^地，电》兹激光器可以是氩离子激光器。在这种实施方式中，氩离子激光器可以操作为具有大约25个可见光镨中的不同波长的连续气体激光器，波长设定在408.9和686.1nm之间，但其最佳性能设定在488和514.5nm之间。1.电》兹辐射源在分析系统的一些实施方式中，可以使用化学发光标记物。在这种实施方式中，可能不需要利用EM源来检测颗粒。在另一种实施方式中，颗粒的外加标记物或内在特性是光作用标记或特性，如荧光标记物或光散射标记物。在这种实施方式中，EM辐射源用于照射标记物和/或颗粒。优选的是激发荧光标记的EM辐射源。在一些实施方式中，分析系统包括电》兹辐射源301。在任何一种分析系统300中可以使用任何数目的辐射源而不脱离本发明的范围。多电磁辐射源已经预先在先前的美国专利申请11/048660号中公开，其通过引用引入本申请。在一些实施方式中，所有连续波电磁(EM)辐射源发射相同波长的电磁辐射。在其它的实施方式中，不同的源发射不同波长的EM辐射。在一种实施方式中，EM源301、351、352为产生200nm和1000nm之间的波长的连续波激光器。这种EM源具有小型、耐用和相对便宜的优点。另外，它们一般具有产生比其它光源更大的荧光信号的能力。合适的连续波EM源的特定例子包括，但不限于氩、氪、氦-氖、氦-镉类型的激光器，以及可调的二极管激光器(红至红外区域)，各具有倍频的可能性。激光器提供连续照射而不需要附加的电子或机械装置(如闸板)遮断其照射。在使用连续波激光器的实施方式中，3mW的电磁辐射源可能具有足够的能量激发焚光标记。来自具有这种能量输出的连续波激光器的光束直径可以在2-5pm之间。颗粒暴露于激光束以达到3mW的照射的时间可以是大约1ms的时间。在替代实施方式中，暴露于激光束的时间可以等于或短于大约500ps。替代实施方式中，暴露时间可以等于或短于大约100)as。替代实施方式中，暴露时间可以等于或短于大约50fas。替代实施方式中，暴露时间可以等于或短于大约10网。LED是另一种低成本、高可靠性的照射源。最近在超亮LED和具有高吸收截面和量子产额的染料方面的进展支持了LED在单颗粒;险测中的应用。这种激光器可以单独使用或与其它光源(如水^^弧光灯、元素弧光灯、面素灯、弧光放电、等离子放电、发光二极管或其组合)组合使用。在其它的实施方式，EM源可以是脉冲波激光器的形式。在这种实施方式中，激光的脉冲大小是重要的因素。在这种实施方式中，大小、聚98焦点和激光器发射的总能量是重要的，必须具有足够的能量以能够激发荧光标记。当使用脉冲激光器时，可能需要具有较长持续时间的脉冲。在一些实施方式中，可以使用2纳秒的激光脉沖。在一些实施方式中，可以使用5纳秒的激光脉沖。在一些实施方式中，可以使用2至5纳秒之间的激光脉沖。最佳激光强度取决于单染料的光漂白特性和穿越探询空间需要的时间长度(包括颗粒的速度，采用超过一个探询空间时探询空间之间的距离和探询空间的大小)。为获得最大的信号，理想的是以不会导致高比例的染料发生光漂白的最高强度照射样品。优选的强度是使得不超过5%的染料在颗粒穿过探询空间的时间内漂白的强度。激光器的功率根据需要激发的染料分子的类型和染料分子激发的时间长度，和/或染料通过毛细管流动池的速度设定。激光器功率定义为光束传输能量的速率并以焦耳/秒或瓦的单位计量。可以理解，为在颗粒通过探询空间时向探询空间提供恒定量的能量，激光器的功率输出越大，激光照射颗粒的时间可以越短。因此，在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量超过大约0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100微焦耳。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量低于大约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或110樣吏焦耳。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约0.1和IOO微焦耳之间。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约1和IOO微焦耳之间。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约1和50微焦耳之间。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约2和50微焦耳之间。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约3和60微焦耳之间。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约3和50微焦耳之间。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约3和40微焦耳之间。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约3和30微焦耳之间。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量为大约1微焦耳。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量为大约3微焦耳。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约5微焦耳。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约IO微焦耳。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约15微焦耳。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约20微焦耳。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约30微焦耳。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约40微焦耳。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约50微焦耳。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约60微焦耳。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约70微焦耳。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约80微焦耳。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约90微焦耳。在一些实施方式中，激光器功率和照射时间的组合使得探询空间在照射期间接受的总能量在大约IO(H鼓焦耳。在一些实施方式中，激光器功率输出设定为至少约1mW、2mW、3mW、4mW、5mW、6mw、7mW、8mW、9mW、10mW、13mW、15mW、20mW、25mW、30mW、40mW、50mW、60mW、70mW、80mW、90mW、100mW或高于100mW。在一些实施方式中，激光器功率输出设定为至少约1mW。在一些实施方式中，激光器功率输出设定为至少约3mW。在一些实施方式中，激光器功率输出设定为至少约5mW。在一些实施方式中，激光器功率输出设定为至少约10mW。在一些实施方式中，激光器功率输出设定为至少约15mW。在一些实施方式中，激光器功率输出设定为至少约20mW。在一些实施方式中，激光器功率输出设定为至少约30mW。在一些实施方式中，激光器功率输出设定为至少约40mW。在一些实施方式中，激光器功率输出设定为至少约50mW。在一些实施方式中，激光器功率输出i殳定为至少约60mW。在一些实施方式中，激光器功率输出i殳定为至少约90mW。激光照射探询空间的时间可以设定为不少于大约1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000微秒。激光照射探询空间的时间可以设定为不超过大约2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500或2000微秒。激光照射纟笨询空间的时间可以设定为在大约1和iooo微秒之间。激光照射探询空间的时间可以设定为在大约5和500微秒之间。激光照射探询空间的时间可以设定为在大约5和IOO微秒之间。激光照射探询空间的时间可以设定为在大约10和IOO微秒之间。激光照射探询空间的时间可以设定为在大约10和50微秒之间。激光照射探询空间的时间可以设定为在大约10和20微秒之间。激光照射探询空间的时间可以设定为在大约5和50微秒之间。激光照射探询空间的时间可以设定为在大约1和IOO微秒之间。在一些实施方式中，激光照射探询空间的时间可以设定为大约1微秒。在一些实施方式中，激光照射探询空间的时间可以设定为大约5微秒。在一些实施方式中，激光照射探询空间的时间可以设定为大约IO微秒。在一些实施方式中，激光照射探询空间的时间可以设定为大约25微秒。在一些实施方式中，激光照射探询空间的时间可以设定为大约50微秒。在一些实施方式中，激光照射探询空间的时间可以设定为大约100微秒。在一些实施方式中，激光照射探询空间的时间可以设定为大约250微秒。在一些实施方式中，激光照射探询空间的时间可以设定为大约500微秒。在一些实施方式中，激光照射探询空间的时间可以设定为大约1000微秒。例如，利用提供3mW、4mw、5mW或高于5mW的功率输出的激光器，激光照射探询空间的时间可以设定为1毫秒、250微秒、100微秒、5(U汰秒、25樣￡秒或IO微秒。在一些实施方式中，标记物用提供3mW功率输出的激光器照射并且照射标记物大约1000微秒。在其它的实施方式中，标记物用提供不超过20mW功率输出的激光器照射不到1000毫秒。在其它的实施方式中，标记物用20mW的功率输出照射少于或等于大约250微秒。在一些实施方式中，标记物用大约5mW的激光器功率输出照射少于或等于大约1000微秒。2.毛细管流动池毛细管流动池与样品系统流体连4妻。在一种实施方式中，分析系统的探询空间314由相应的光束311的截面面积和光束在检测器309的视场内的部分确定。在分析系统的一种实施方式中，探询空间314具有在大约0.01至500pL之间、或大约O.OlpL至100pL之间、或大约O.OlpL至10pL之间、或大约O.OlpL至1pL之间、或大约0.01pL至0.5pL之间、或大约0.02pL至大约300pL之间、或大约0.02pL至大约50pL之间、或大约0.02pL至大约5pL之间、或大约0.02pL至大约0.5pL之间、或大约0.02pL至大约2pL之间、或大约0.05pL至大约50pL之间、或大约0.05pL至大约5pL之间、或大约0.05pL至大约0.5pL之间、或大约0.05pL至大约0.2pL之间、或大约0.1pL至大约25pL之间的如这里所定义的体积。在一些实施方式中，探询空间具有大约O.OlpL至10pL之间的体积。在一些实施方式中，探询空间314具有大约O.OlpL至1pL之间的体积。在一些实施方式中，探询空间314具有大约0.02pL至大约5pL之间的体积。在一些实施方式中，探询空间314具有大约0.02pL至大约0.5pL之间的体积。在一些实施方式中，探询空间314具有大约0.05pL至大约0.2pL之间的体积。在一些实施方式中，探询空间314具有大约0.1pL的体积。这里描述了其它可用的探询空间体积。本领域技术人员可以理解，探询空间314可以经过选择以使分析仪具有最佳性能。虽然非常小的探询空间显示出使背景噪音最小化，但大的探询空间具有可以在合理的时间内分析低浓度样品的优点。在使用两个探询空间370和371的实施方式中，也可以采用如这里所述的用于单:l罙询空间314的体积。在本发明的一种实施方式中，探询空间足够大以使得能够检测浓度范围从大约1000毫微微摩尔(fM)到大约1仄摩尔(zM)的颗粒。在本发明的一种实施方式中，探询空间足够大以使得能够检测浓度范围从大约1000舰到大约1微微微摩尔(aM)的颗粒。在本发明的一种实施方式中，探询空间足够大以使得能够检测浓度范围从大约10fM到大约1微微微摩尔(aM)的颗粒。在许多情况下，大的探询空间使得能够检测浓度小于大约lfM的颗粒而不需要额外的预浓缩装置和技术。本领域技术人员可以认识到，最适宜的探询空间尺寸取决于待检测的颗粒的亮度、背景信号的水平和要分析的样品的浓度。探询空间314的尺寸可以通过调整分析仪的光学设置进行限定。在一种实施方式中，光束311的直径可以进行调整以改变探询空间314的体积。在另一种实施方式中，检测器309的视场可以进行调整。因此，源301和检测器309可以进行调整以使得单颗粒在探询空间314被照射和检测。在另一种实施方式中，决定检测器309视场的孔306(图1A)的宽度是可变的。这一设置使得能够接近实时地改变探询空间，以对浓度或高或低的样品进行补偿，确保两个或多个颗粒同时处于探询空间内的可能性较低。两个或多个探询空间370和371可以类似地进行变化。在另一种实施方式中，探询空间可以通过使用已知浓度的校准试样确定，4交准试样在测试的实际样品之前通过毛细管流动池。当在才交准试样中仅一个单颗粒在样品通过毛细管流动池被检测到时，焦点的深度与电^t辐射源的光束直径一起确定毛细管流动池中探询空间的大小。固体壁也可能形成对探询空间的物理限制。在一种实施方式中，当样品流体包含在毛细管中时，壁是流动池313(图2A)壁中的一个或多个。在一种实施方式中，池由玻璃制成，但其它对大约200至大约1000nm或更高范围内的光透明的物质，例如石英、熔融硅石和如Teflon、尼龙、塑料(如聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯)的有机材料或其任意组合也可以使用而不脱离本发明的范围。虽然可以使用其它截面形状(如矩形、圆形)而不脱离本发明的范围，但在一种实施方式中毛细管流动池313具有方形截面。在另一种实施方式中，探询空间可以至少部分地由蚀刻在芯片(未显出)中的通道(未显出)限定。类似的因素应用于使用两个探询空间(图2B中的307和371)的实施方式。探询空间浸浴在流体中。在一种实施方式中，流体为水性流体。在其它的实施方式中，流体为非水性的流体或水性流体与非水性流体的组合。另外流体可以包含调节pH、离子组成的物质或筛分剂(sievingagent)，如可溶性巨颗粒或聚合物或凝胶。可以预想，阀或其它装置可以存在于探询空间之间以暂时中断流体连接。暂时中断的探询空间被看作是通过流体连接的。在本发明的另一种实施方式中，探询空间是存在于流动池313内的单探询空间，其受到样品材料在稀释体积内的层流(也称作鞘流)的大小的限制。在这些及其它的实施方式中，探询空间可以通过鞘流单独或与照射源的外形尺寸或检测器视场组合限定。鞘流可以以许多的方式配置，包括样品材料为同心层流中的内部材料，使稀释体积在外部；稀释体积在样品体积的一侧；稀释体积在样品材料的两侧；稀释体积在样品材料的多侧，但不完全包围样品材料；稀释体积完全环绕样品材料；稀释体积完全同心地环绕样品材料；样品材料为不连续的成串滴状内部材料，而稀释体积完全环绕样品材料的各滴。在一些实施方式中，本发明的单分子检测器包括不超过一个探询空间。在一些实施方式中，使用多个探询空间。多探询空间已经预先被美国专利申请11/048,660号公开，并通过引用将其并入本申请。本领域技术人员可以认识到，在某些情况下分析仪包含2、3、4、5、6个或更多的独立^t笨询空间。3.动力在分析系统的一种实施方式中，颗粒在动力作用下移动通过探询空间。在一些实施方式中，用于移动颗粒的动力是压力。在一些实施方式中，压力是通过泵和气压源、真空源、离心机或其组合提供的。在一些实施方式中，用于移动颗粒的动力是电动力。电动力作为动力的用途已经预先在在先申请中公开且通过引用美国专利申请11/048,660号而并入本申请。在一种实施方式中，压力可以用作移动颗粒通过毛细管流动池的探询空间的动力。在进一步的实施方式中，压力通过泵提供以移动样品。合适的泵是现有技术中已知的。在一种实施方式中，为HPLC应用而制造的泵，如由Scivax，Inc.制造的那些泵，可以用作动力。在其它的实施方式中，当泵送较小量的样品时，可以使用为微流体应用而制造的泵。这些泵在美国专利5,094，594、5，730,187、6,033,628和6,533，553号中进行了描述，这些文献公开了可以泵送纳升或皮升范围的流体量。优选在泵内与样品接触的所有材料由高惰性材料制成，如聚醚醚酮(PEEK)、熔融石圭石或蓝宝石。有必要用动力移动样品通过毛细管流动池以推动样品通过分析的探询空间。在样品已经通过之后也需要动力推动冲洗样品(flushingsample)通过毛细管流动池。当采用样品回收系统时，也需要动力推动样品回到样品回收容器中。标准泵具有多种尺寸，而可以选择适当的尺寸以配合预计的样品大小和液流要求。在一些实施方式中，独立的泵用于样品分析和冲洗系统。分析泵可以具有大约0.000001mL至大约10mL、或大约0.001mL至大约1mL、或大约0.01mL至大约0.2mL、或大约0.005、0.01、0.05、0.1或0.5mL的容量。冲洗泵可以具有大于分析泵的容量。冲洗泵可以具有大约O.OlmL至大约20mL、或大约0.1mL至大约10mL、或大约0.1mL至大约2mL、或大约0.05、0.1、0.5、1、5或10mL的容量。这些泵尺寸仅是示例性的，且本领域技术人员可以理解，泵尺寸可以按照应用、样品大小、待泵送的流体的粘度、管外形、流速、温度和其它现有技术中公知的因素来选择。在一些实施方式中，系统的泵由易于用微处理器进行非常精确的控制的步进电机驱动。在优选的实施方式中，沖洗和分析泵串联使用，使用专门的止回阀105为当分析泵抽取最大样品时，样品不达到泵本积大于分析泵的行程排量而实现。4.检测器在一种实施方式中，对焚光标记物在暴露于电磁辐射后发射的光(如紫外光、可见光或红外范围内的光)进行检测。检测器309(图1A)或多个检测器(364、365，图1B)能够获取来自荧光结构的光子脉冲的振幅和持续时间，并进一步将光子脉沖的振幅和持续时间转换为电信号。检测装置(如CCD相机、视频输入模块相机和超高速扫描照相机)可以用于产生具有连续信号的图象。在另一种实施方式中，可以使用如辐射热计、光电二极管、光电二极管阵列、雪崩光电二极管和光电倍增器的产生序列信号的装置。也可以使用前述检测器的任意组合。在一种实施方式中，雪崩光电二极管用于检测光子。在探询空间314(图2A)和其相应的检测器309(图1A)之间使用特定的光学装置，可以检测到发射的电磁辐射的几种独特的特性，包括发射波长、发射强度、脉冲大小、脉冲持续时间和荧光极化。在一些实施方式中，检测器309为以反向偏压使用的光电二极管。设置为反向偏压的光电二极管通常具有极高的阻抗。该阻抗在具有适宜频率的光照射在P/N结上时降低。因此，反向偏置的二极管可以通过监测其中流过的电流而用作检测器。基于这一效应的电路比基于零偏压的电路对光更灵敏。在分析系统的一种实施方式中，光电二极管可以是雪崩光电二极管，其可以以比常规光电二极管更高的反向偏压工作，因此使得各光生载体通过雪崩击穿倍增，导致光电二极管内的内部增益，这增加了装置的有效反应(灵敏度)。光电二极管的选择由荧光标记颗粒发射的能量或发射波长确定。在一些实施方式中，光电二极管是^f企测190-1100nm范围内的能量的硅光电二极管；在另一种实施方式中光电二极管是检测800-1700nm范围内的能量的锗光电二极管；在另一种实施方式中光电二极管是检测800-2600nm范围内的能量的砷化镓铟光电二极管；及在再另外的实施方式中光电二极管是检测低于1000nm至3500nm范围内的能量的硫化铅光电二极管。在一些实施方式中，雪崩光电二极管是设计为检测400nm至1100nm波长范围的能量的单光子检测器。单光子检测器可以商购得到(例如，PerkinElmer,Wellesley，MA)。在一些实施方式中，检测器是检测300nm和1700nm之间的能量的雪崩光电二极管。在一种实施方式中，硅雪崩光电二极管可用于检测300nm和1100nm之间的波长。砷化镓铟光电二极管可用于检测900nm和1700nm之间的波长。在一些实施方式中，分析系统可以包括至少一个检测器；在其它的实施方式中，分析系统可以包括至少两个检测器，且各检测器可以选择和配置为检测在特定波长范围的光能量。例如，两个独立的检测器可以用于检测用不同标记物示踪的颗粒，这些标记物在用EM源激发时发射具有不同能i普的光子。在一种实施方式中，分析系统可以包括能够检测450-700nm范围内的荧光能量(例如由绿色染料，如Alexa546发射的焚光能量)的第一检测器，和能够检测620-780nm范围内的荧光能量(例如由远红外染料，如Alexa647发射的荧光能量)的第二检测器。也可以使用用于才企测400-600nm范围内的荧光能量(例如由如Hoechst33342的蓝色染料发射的荧光能量)和用于^f全测560-700nm范围内的荧光能量(例如由如Alexa546和Cy3的红色染料发射的焚光能量)的检测器。包括两个或多个检测器的系统可以用于检测各以发射不同光谱的光的两种或多种标记物示踪的单独颗粒。例如，两个不同的^f全测器可以4全测用两种不同的染料标记物示踪的抗体。可选择地，包括两个检测器的分析系统可以用于检测不同类型的颗粒，各类型用不同的染料分子或两种或更多染料分子的混合物示踪。例如，两个不同的检测器可以检测识别两种不同的蛋白质的两种不同类型的抗体，各类型用不同的染料分子或两种或更多染料分子的混合物示踪。通过改变两种或更多染料标记分子的比例，两种或更多的不同颗粒类型可以使用两个检测器单独地检测。可以理解，也可以使用三个或更多的检测器而不脱离本发明的范围。本领域技术人员可以理解，无论在流动池内限定一个或多个^笨询空间，对各探询空间可以配置一个或多个检测器，且各检测器可以配置为检测任何上面所列的发射的电磁辐射的特性。对于例如多探询空间使用多个检测器的方法已经在在先申请中公开并通过引用美国专利申请11/048,660号并入本申请。一旦颗粒经标记而具有可斗企测性(或如果颗粒具有赋予其可检测性的内在特性)，可以使用任何现有技术中已知的检测机构而不脱离本发明的范围，例如CCD相机、视频输入模块相机和超高速扫描照相机、辐射热计、光电二极管、光电二极管阵列、雪崩光电二极管和产生序列信号的光电倍增器及其组合。可以检测不同的电磁辐射特性，包括发射波长、发射强度、脉沖大小、脉冲持续时间、荧光极化及其任意组合。C.采样系统在进一步的实施方式中，分析系统可以包括制备^1入分析系统的样品的采样系统。包括的采样系统能够对多个样品进行自动采样并在样品容器与第一探询空间之间提供流体连通。在一些实施方式中，本发明的分析系统包括用于将等分的样品引入进行分析的单颗粒分析仪的采样系统。可以使用任何能够引入样品的机构。样品可以利用由泵产生的负压吸引作用或通过施加到样品上将液体推入管中的压力抽取，或者通过任何其它的用于将样品引入采样管的机构抽取。一般，但不是必须，采样系统将已知样品量的样品引入单颗粒分析仪中；在检测一个或多个颗粒是否存在的一些实施方式中，对样品大小的精确认识并不是关键的。在优选的实施方式中采样系统提供对单个样品或多个样品的自动采样。在已知量的样品引入系统中的实施方式中采样系统提供超过约0.0001、0.001、0.01、0.1、1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500、1000、1500或2000^1的分析样品。在一些实施方式中采样系统提供小于约2000、1000、500、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.1、0.01或0.001nl的分析样品。在一些实施方式中采样系统提供大约0.01和1500^U、或大约0.1和1000|Lil、或大约1和500(il、或大约1和100|ul、或大约1和50|il、或大约1和20iul之间的分析样品。在一些实施方式中，采样系统提供大约5|al和大约200pl、或大约5pl和大约100|^1、或大约5pl和大约50pl之间的分析样品。在一些实施方式中，采样系统提供大约10lal和200^、或大约10pl和100|il、或大约10lil和50fxl之间的分析样品。在一些实施方式中，采样系统提供大约0.5和大约50nl之间的分析样品。在一些实施方式中，采样系统提供可以在各样品之间变化的样品大小。在这些实施方式中，样品大小可以是这里描述的样品大小的任何一种，且可以根据需要对每个样品或批量样品进行改变。对于即将进行的分析来说，需要采样系统达到一定的样品量准确度和样品间量的精度。在一些实施方式中，采样量的精度由所用的泵确定，通常用小于样品体积的约50、40、30、20、10、5、4、3、2、1、0.5、0.1、0.05或0.01%的CV表示。在一些实施方式中，采样系统的样品间精度用小于约50、40、30、20、10、5、4、3、2、1、0.5、0.1、0.05或0.01%的cv表示。在一些实施方式中，采样系统的批内分析精度用小于约10、5、1、0.5或0.1%的CV表示。在一些实施方式中，采样系统的批内分析精度显示为小于约5%的CV。在一些实施方式中，采样系统的批间精度用小于约io、5或iy。的cv表示。在一些实施方式中，采样系统的批间精度显示为小于约5%的CV。在一些实施方式中，采样系统提供低的样品残留(carryover),优点在于在样品之间不需要额外的清洗步骤。因此，在一些实施方式中，样品残留小于大约1、0.5、0.1、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.005或0.001%。在一些实施方式中，样品残留小于大约0.02%。在一些实施方式中，样品残留小于大约0.01%。在一些实施方式中采样器提供样品循环(sampleloop)。在这些实施方式中，多个样品顺序吸入管^^中，且各样品通过緩冲液"塞"与其它样品分开。样品通常一个接一个地4全读而在这之间不进行冲洗。沖洗在循环结束时进行一次。在使用緩冲液"塞"的实施方式中，可以通过将緩冲液塞喷射到《汰滴定板的单独的孔中而对塞进行回收。采样系统可以适宜于与标准的分析设备一起使用，例如96孔微滴定板或者优选的384孔板。在一些实施方式中该系统包括96孔板定位器和将样品管浸入或取出所述孔的机构，如提供沿X、Y和X轴的运动的机109构。在一些实施方式中，采样系统提供多个采样管，样品可以在测试开始时储存在采样管中或从中取出。在一些实施方式中，来自多个管的所有样品在一个检测器上进行分析。在其它的实施方式中，多个单分子检测器可以连接到样品管上。样品可以在采样系统取样之前通过包括对板孔中的样品进行操作的步骤进行制备，或者样品可以在分析系统内制备，或者采用两者的一些组合方式。D.样品制备系统样品制备包括制备粗分析样品必要的步骤。这些可能涉及，举例来说，下面的一个或多个步骤如离心、过滤、蒸馏、层析的分离步骤，浓缩，细胞溶解，pH改变，加緩冲液，加稀释剂，力口试剂，加热或冷却，加标记物，结合标记物，通过照射交耳关，分离未结合标记物，灭活和/或去除干扰性化合物，及任何其它制备单颗粒分析仪分析的样品必要的步骤。在一些实施方式中，血液经处理以分离出血浆或血清。还可以对血清或血浆样品进行额外的标记、去除未结合标记物和/或稀释的步骤。在一些实施方式中，分析系统包括执行为了提供准备用于单颗粒分析仪进行分析的样品而需要的一些或全部处理程序的样品制备系统。这一系统可以执行上面所列的样品制备的任何步骤或所有步骤。在一些实施方式中样品部分地被分析系统的样品制备系统处理。因此，在一些实施方式中，样品可以首先在分析系统外进行部分处理。例如，样品可以先进行离心。然后样品可以在分析仪内部通过样品制备系统进行部分处理。分析仪内部的处理包括标记样品、将样品与緩沖液混合和其它的本领域技术人员已知的步骤。在一些实施方式中，血液样品在分析系统外进行处理以提供血清或血浆样品，该血清或血浆样品可1入到分析系统中并进一步由样品制备系统进行处理以标记一种或多种目标颗粒并任选地去除未结合的标记物。在其它的实施方式中样品制备可能包括样品的免疫耗竭以去除非目标颗粒或去除可能干扰样品分析的颗粒。在再另外的实施方式中，可以耗竭掉样品中可能对样品的分析产生干扰的颗粒。例如，样品制备可能包括耗竭已知对使用非人类抗体直接或间接检测目标颗粒的免疫分析产生干扰的异嗜性抗体。类似地，其它干扰目标颗粒的测量的蛋白质也可以使用识别该干扰蛋白质的抗体从样品中除去。在一些实施方式中，样品在进行测试和分析前进行固相萃取。例如，对cAMP进行分析的血清样品可以先用cAMP结合的c18柱进行固相萃取。如蛋白酶、脂酶和磷酸酶的其它蛋白质^^皮从柱中清洗掉，而cAMP在基本没有破坏或干扰cAMP测量的蛋白质的情况下洗脱。固相萃取可以用于去除样品中可能降低分析的灵敏度的基本基质(basicmatrix)。在再另外的实施方式中，样品中存在的目标颗粒可以通过对样品进行干燥或冻干并将颗粒溶解于比原始样品小的体积中而得到浓缩。在一些实施方式中分析系统提供对系统上分析的样品进行完全制备的样品制备系统，比如对血液样品、唾液样品、尿样品、脑脊液样品、淋巴样品、BAL样品、活检样品、法医学样品、生物恐怖样品等等的完全制备。在一些实施方式中分析系统提供执行部分或全部样品制备的样品制备系统。在一些实施方式中，初始样品是由分析系统进行进一步处理的血液样品。在一些实施方式中，样品是由分析系统进行进一步处理的血清或血浆样品。血清或血浆样品可以进一步通过例如使其与一种或多种目标颗粒结合的标记物接触进行处理；然后该样品可以在去除或不去除未结合的标记物的情况下使用。在一些实施方式中，样品制备在一个或多个微滴定板(如96孔板)上在分析系统外或在分析系统的样品制备部件内进行。如现有技术中公知的，试剂、緩冲液等的储存库可以利用管路或其它适宜的结构与板孔形成间歇式的流体连通。样品可以在96孔^反或管中独立地制备。样本隔离、标记物结合和标记物分离(如果必要)的步骤可以在一个板上进行。在一些实施方式中，制备的颗粒随后从板上释放，且样品移动到用于取样到样品分析系统中的管中。在一些实施方式中，所有样品制备的步骤在一个板上进行且分析系统直接从板上获取样品。虽然这一实施方式是按照96孔板进行说明的，j旦可以理解任何包含一个或多个样品并适于样品制备的容器都可以使用。例如，可以使用384或1536孔的标准微滴定板。更一般地说，在一些实施方式中样品制备系统能够容纳和制备超过大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、500、1000、5000或10000个样品。在一些实施方式中，多个样品可以在多个分析系统中采样分析。因此，在一些实施方式中，2个样品或超过大约2、3、4、5、7、10、15、20、50或100个样品从样品制备系统采样并在多个样品分析系统中并行地分析。微流体系统也可以用于样品制备或用作作为分析系统的部分的样品制备系统，特别是对于怀疑包含足够高的颗粒浓度而检测需要较少样品的样品。微流体操作的原理和技术是现有技术中已知的。参见，例如美国专利4,979,824、5,770,029、5,755,942、5,746,901、5，681，751、5,658,413、5，653，939、5，653，859、5,645，702、5,605,662、5，571，410、5,543,838、5,480,614、5,716,825、5,603,351、5，858,195、5,863,801、5，955，028、5，989,402、6,041,515、6,071,478、6，355，420、6,495,104、6，386，219、6,606,609、6,802,342、6,749,734、6,623，613、6，554，744、6,361,671、6,143,152、6,132,580、5,274,240、6,689,323、6,783,992、6,537,437、6,599,436、6,811,668号和PCT专利申请公开W09955461(A1)号。样品可优选样品包含緩沖液。緩沖液可以在分析系统外与样品混合，或者它可以由样品制备机构提供。尽管可以使用任何合适的緩冲液，但优选的緩沖液具有低荧光背景，对可检测地标记的颗粒是惰性的，可以保持液浓度可以是任何合适的浓度，如在从大约1至大约200mM的范围内。可以使用任何緩冲液系统，只要它为目标分子提供溶解性、功能和可检测性(ddectability)。优选地，对于使用泵送的应用，緩冲液选自磷酸盐、甘氨酸、乙酸盐、柠檬酸盐、酸化、碳酸盐/重碳酸盐、咪唑、三乙醇胺、甘氨酰胺、硼酸盐、MES、Bis-Tris、ADA、aces、PIPES、MOPSO、Bis-Tris丙烷、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、MOBS、TAPSO、氨基丁三醇(Trizma)、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、Gly-Gly、二(羟乙基)甘氨酸(Bicine)、HEPBS、TAPS、AMPD、TABS、AMPSO、GHES、CAPSO、AMP、CAPS和CABS。缓冲液也可以选自Gly-Gly、二(羟乙基)甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、2-吗啉乙磺酸(MES)、4-吗啉丙磺酸(MOPS)和2-氨基-2-曱基-l-丙醇盐酸(AMP)。一种有用的緩沖液为pH8.1的2mMTris/硼酸盐，但Tris/甘氨酸和Tris/HCl也是可接受的。其它的緩冲液如这里所述。可用于电泳的緩沖液在在先申请中公开并通过对美国专利申请11/048,660号的引用并入本申请。E.才羊品回收本发明分析仪和分析系统的实施方式的一个高度有利的特征是样品可以被分析而不发生样品的消耗。当样品材料有限时，这一点可能是特别重要的。回收样品也使得能够用一个样品进行其它的分析或进行重新分析。这一特征对于样品量有限和/或需要对样品重新分析的能力的应用(如法医、药物筛选和临床诊断的应用)的优势对于本领域技术人员是显而易见的。因此，在一些实施方式中，本发明的分析系统进一步提供在分析后进行样品回收的样品回收系统。在这些实施方式中，该系统包括使样品吸入分析仪、进行分析、然后送回(例如通过相同的路径)到样品容器(如样品管)中的机构和方法。因为没有样品被破坏且因为样品不进入任何阀或其它的管路，它保持不受到污染。另外，因为样品路径中的所有材料都是高度惰性的，例如PEEK、熔融硅石或蓝宝石，所以很少有来自样品路径的污染。使用步进电机控制的泵(特别是分析泵)使得能够对抽吸和推回的量进行精确的控制。这使得能够在发生很少的(如果有的话)沖洗緩沖液的稀释的情况下完全或接近完全地回收样品。因此，在一些实施方式中，超过大约50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%的样品在分析后回收。在一些实施方式中，回收的样品是非稀释的。在一些实施方式中，回收的样品稀释度小于大纟々1.54咅、1.441"、1.34咅、1.24咅、1.14咅、1.054咅、1.014咅、1.0054咅或1.001倍。对于采样和/或样本回收，可以使用任何将液体样品从样品容器输送到分析仪的机构。在一些实施方式中分析毛细管的入口端连接可以浸入样品容器(如测试管或样品孔)或可以保持在废物容器上方的一小段管路(如PEEK管路)。当沖洗时，为了从仪器清洁掉先前的样品，该管定位在废物容器上方以捕集沖洗废液。当吸入样品时，该管置于样品孔或测试管中。通常样品快速吸入，然后在观察样品中的颗粒的时候緩慢地排出。可选择地，在一些实施方式中，样本在至少部分吸入周期中緩慢地吸入；样品可以在緩慢吸入的同时进行分析。这之后可以快速地返回样品和快速地冲洗。在一些实施方式中，样品可以同时在向内(吸入)和向夕卜(推出)周期中进行分析，这改善了例如小样品和稀释样品的计数统计，以及确认结果等等。如果想要节省样品，可以将样品推回到它来源的样品孔中或另一个样品孔中。如果不需要节省样品，则管路定位在废物容器上方。VI使用高灵敏分子分析的方法
技术领域：
：本发明的系统、系统试剂盒和方法使得能够以远低于先前测量的浓度对样品中的分子进行测量。本发明的仪器、试剂盒和方法的高灵敏度使得能够建立先前因为缺乏检测灵敏度而不可能建立的标志物(如生物标志物)。本发明也包括这里描述的组合物和方法用于发现新的标志物的用途。有许多当前可得到的标志物，尽管潜在地可用于确定生物状态，但因为它们的较低范围未知而没有在当前得到实际利用。在某些情况下，标志物的非正常高水平可以通过当前的方法检测，但正常范围还未确立。在某些情况下，标志物的较高正常范围是可检测的，但较低的正常范围或低于正常的水平不能检测。在某些情况下，例如，肿瘤特异性标志物或感染标志物，任何水平的标志物都表明生物状态的存在，因而增加检测灵敏度对于早期诊断是有利的。在某些情况下，在多个时间点标志物浓度发生改变的速率或没有改变提供了最有用的信息，但目前的分析方法不允许在状态的早期阶段采样的时间点确定标志物的水平，而这时通常是其最好治疗的时期。在许多情况下，标志物可以通过利用繁瑣的方法在临床可用的水平上对标志物进行检测，但这些方法在临床环境中是不实用的或不可用的，比如需要复杂的样品处理和费时的分析过程的方法。114另外，有一些潜在的生物状态标志物，它们以足够低的浓度出现因而通过目前的方法非常难以或不可能检测到它们的存在。本发明的分析方法和组合物提供了允许在先前不能检测到标志物的浓度下检测生物状态标志物的灵敏度和精度水平，因此使得这些标志物能够从确认标志物或仅可在受限的研究环境中使用的标志物"转化"为诊断、预后、治疗指导标志物或其它类型的可用于临床环境和/或大规模临床环境(如临床试验)中的标志物。这些方法允许例如确定这些标志物的正常和异常范围。如此转化的标志物可被用于，例如，正常状态(正常范围)的检测、反应者/非反应者(例如，对如施用药物的治疗的反应)的一企测，早期疾病或病变发生的检测(如最早期阶段的癌症的4企测、心肌缺血的早期#全测)，疾病(如癌症)分期，疾病监测(如糖尿病监测、治疗后癌症复发的监测)，疾病机理的研究和中毒(如药物治疗的中毒，例如心脏毒性)治疗的研究。本发明提供了用于标志物的灵敏检测的方法和组合物，和进一步的确定标志物的正常和异常水平值的方法。在进一步的实施方式中，本发明提供了基于标志物的确定值进行诊断、预后判断和/或治疗的选物的超灵敏检测的检测试剂。在一些实施方式中，本发明提供通过建立测定从第一群体获得的生物样品中标志物的浓度范围建立生物状态的标志物的方法，其中通过检测标志物的单个分子(例如通过检测连接到标志物的单个分子上的标记物)测量生物样品中标志物的浓度。在一些实施方式中，标志物是多肽或小分子。样品可以是这里描述的任何样品类型，如血液、血浆或血清或尿液。该方法可以利用来自第一群体的样品，其中第一群体是不表现出生物状态的群体。在生物状态是疾病状态的情况中，第一群体可以是不表现出疾病的群体，如"正常"群体。在一些实施方式中，该方法可A.方法择的方法。^物，例如用于标志以进一步包括通过检测标志物的单分子测量生物样品中标志物的浓度而建立从第二群体获得的生物样品中标志物的水平范围，其中第二群体的成员表现出生物状态。在一些实施方式中，例如断层研究中，第一和第二群体是不同的。在一些实施方式中，第二群体的至少一个成员是第一群体的成员，或者所述群体的至少一个成员是第二群体的成员。在一些实施方式中，例如纵向研究中，基本上所有第二群体的成员是已形成生物状态(如疾病或病变)的第一群体的成员。标志物单分子的检测采用这里描述的方法进行，例如通过检测标志物的单分子对所述标志物的检测极限低于样品中约1000、100、50、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005或0.001毫樣W效摩尔标志物的方法。生物状态可以是表型状态，影响生物体的状况，发育状态，年龄、健康状态，病变，疾病，疾病进程，疾病分期，感染，中毒，或对化学、环境或药物因子的反应(如药物响应表型、药物毒性表型或药物在一些实施方式中，生物状态是病变，包括，但不限于炎症、异常细胞生长和异常代谢状态。在一些实施方式中，生物状态是疾病状态。疾病状态包括，但不限于癌症、心血管疾病、炎性疾病、自体免疫疾病、神经疾病、传染病和妊娠相关病症。在一些实施方式中状态是疾病分期状态，如癌症分期状态。该方法也可以用于确定治疗反应状态。在一些实施方式中，治疗是药物治疗。反应可以是治疗作用和副作用，如不良反应。治疗作用的标志物是用药物治疗的疾病或状态。不良反应的标志物通常基于药物类别及特定的结构和作用机理和代谢机理。常见的不良反应是药物毒性。其中一个例子是可以通过标志物心肌肌4丐蛋白监测的心脏毒性。在一些实施方式中对一种或多种疾病状态的标志物或者一种或多种药物不良反应的标志物进行监测，通常是在接受药物的群体中。样品可以按照一定时间间隔获耳又，且可以按照时间观定样品中标志物的相应值。标志物单分子的检测可以包括用包含荧光结构的标记物标记标志物，该焚光结构能够在受到其激发波长的激光器发射的光激发时发射至少约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方式中，荧光结构包括包含至少一个取代的吲哚総环系统的分子，其中吲哚鑰环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。在一些实施方式中，荧光结构可以包括选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor647、AlexaFluor680或AlexaFluor700的染料。在一些实施方式中，焚光结构包括AlexaFluor647。在一些实施方式中，标记物进一步包括标志物的结合伴体，例如对所述标志物特异性的抗体(如多克隆抗体或单克隆抗体)。这里描述了多种标志物的结合伴体。该方法可以进一步包括基于第一范围或第一和第二范围确定标志物的阈水平，其中来自个体的生物样品中标志物的存在水平高于或低于阈水平表明所述个体出现生物状态的可能性增加。对正常群体确定的阈水平的一个例子是给出的在正常群体中超过第99百分位数的心肌肌4丐蛋白的阈水平，参见实施例3。其它的阈水平可以凭经验确定，即基于第一和第二群体关于标志物水平及监测的生物状态的存在与否、严重程度、进展速度、复原速度等等的数据确定。可以理解，阈水平可以建立在范围的任一端，例如样品中标志物浓度最小值低于该阈水平表明生物状态存在的可能性增加，和/或样品中标志物浓度最大值高于该阈水平表明生物状态存在的可能性增加。在一些实施方式中，可以建立风险层级，其中标志物浓度的两个或更多范围对应于风险的两个或更多等级。其它的对来自两个群体的标志物数据进行分析并为如医生或其它保健专业人员的使用提供临床相关值的方法是现有技术中公知的。对于某些生物标志物，标志物的任何存在就是疾病或病变的指征，因而阈水平基本为零。一个例子是使用前列腺特异性抗原(PSA)监测前列腺摘除后癌症的复发。PSA仅由前列腺产生，因而在假定前117列腺和所有肺瘤被除去的情况下，PSA在摘除手术后为零。任何水平的PSA出现是癌症复发的信号，例如在转移部位。因此，检测方法越灵敏，可以在这种复发发生时越早进行介入治疗。可以在例如系列的样品中进行标志物浓度的测定，其中值的变化、变化速度、峰值、降低等等都可以提供有用的确定生物状态的信息。另外，如果发现超过一种的标志物提供涉及生物状态的信息，则可以使用标志物组。如果使用标志物组，标志物可以在独立的样品(如共同样品的等分部分)中分别测量或通过多路技术同时测量。标志物组和多路技术的例子在如美国专利申请11/048,660号中给出。这些标志物和(例如)正常和/或异常状态的参考范围的建立使得能够灵敏和精确地确定生物体的生物状态。因此，在一些实施方式中，本发明提供用于检测生物体是否存在生物状态的方法，包括i)测量来自生物体的生物样品中标志物的浓度，其中所述标志物是通过检领'j标志物的单个分子测量生物样品中标志物的浓度而确定从第一群体获得的生物样品中所述标志物的浓度范围所建立的标志物；和ii)基于所存在的方法，包括i)测量来自所述生物体的多个生物样品中标志物的浓度，其中所述标志物是通过检测标志物的单个分子测量生物样品中标志物的浓度而确定从第一群体获得的生物样品中所述标志物的浓度范围所建立的标志物；和ii)基于所述多个样品中所述标志物的所述浓度确定所述生物状态是否存在。在一些实施方式中，样品为不同类型的样品，如来自不同组织类型的样品。在这种情况下，确定生物状态是否存在是基于所述不同类型的样品中所述标志物的浓度的比较。更一般的情况是，样品是相同类型的，且样品是按照时间间隔采取的。样品可以是这里描述的任何样品类型，如血液、血浆或血清、或尿液。样品之间的时间间隔是几分钟、几小时、几天、几周、几个月或几年。在紧急的临床环境中，时间间隔可以是几分钟或几小时。在涉及个体监测的情况中，时间间隔可以是几天、几周、几个月或几年。在许多情况下，被检测是否存在的生物状态是疾病表型。因此，在一种实施方式中，关注的疾病表型是临床诊断的疾病状态。这种疾病状态包括，例如，癌症、心血管疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、神经疾病、呼吸道疾病、传染病和妊娠相关病症。在本发明的某些方面中包括癌症表型。这里癌症的例子包括，但不限于乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、及喉、胆嚢、胰腺、直肠、曱状旁腺、曱状腺、肾上腺、神经组织、头和颈、结肠、胃、支气管、肾的癌症、基底细胞癌、溃疡型和乳头型两种类型的鳞状细胞癌、皮肤转移癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、网状细胞肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺肿瘤、非小细胞肺癌胆石、胰岛细胞瘤、原发性脑瘤、急性和慢性淋巴细胞和粒细胞瘤、毛细胞瘤、腺瘤、过度增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤、肠神经节细胞瘤、增生性角膜神经瘤、高磺酸体质瘤、肾母细胞瘤、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌瘤、子宫颈非典型增生和原位癌、成神经细胞瘤、成^L网膜细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌瘤、局部皮肤损伤、蕈类肉牙肺、横紋肌肉瘤、卡波济氏肉瘤、骨原性和其它肉瘤、肿瘤性高钩血症、肾细胞肺瘤、真性红细胞增多症、腺癌、多形性胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、恶性黑色素瘤、表皮样癌及其它癌和肉瘤。本发明的其它应用可以包括心血管疾病。心血管疾病的例子包括，但不限于充血性心力衰竭、高血压、心律失常、动脉粥样硬化、胆固醇、预激综合征、长QT综合征、心绞痛、心动过速、心动过緩、心房纤颤、心室纤颤、充血性心力衰竭、心fL缺血、心月几才更塞、心压塞、心月几炎、心包炎、心律失常性右心室发育不良、肥厚型心肌病、威廉斯综合征、心脏瓣膜疾病、心内膜炎、细菌性的、肺动脉闭锁、主动脉瓣狭窄、雷诺氏病、雷诺氏病、胆固醇栓塞、瓦伦贝格综合征、希-林二氏病和毛细管扩张。本发明的其它实施方式可以包括炎性疾病和自身免疫疾病。炎性疾病和自身免疫疾病的例子包括，但不限于风湿性关节炎、非特异性关节炎、喉部炎性疾病、炎症性肠病、牛皮癣、甲状腺机能减退(如桥本曱状腺炎)、结肠炎、l型糖尿病、骨盆炎症性疾病、中枢神经系统炎性疾病、颞动脉炎、风湿性多肌痛、关节强硬性脊推炎、结节性多动脉炎、莱特尔综合征、硬皮病、和系统性红斑狼瘠。本发明的方法和组合物还可以提供有关传染病标志物的实验室信息，传染病标志物包括腺病毒、百日咳杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、霍乱毒素、霍乱毒素p、空肠弯曲菌、巨细胞病毒、白喉毒素、EBNA、EBEA、EBVCA、幽门螺杆菌、乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原、乙型肝炎病毒(HBV)包膜、乙型肝炎病毒(HBV)表面(Ay)抗原、丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原、丙型肝炎病毒(HCV)NS3、丙型肝炎病毒(HCV)NS4、丙型肝炎病毒(HCV)NS5、曱型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎病毒(HEV)orf23KD、戊型肝炎病毒(HEV)orf26KD、戊型肝炎病毒(HEV)orf33KD、人体免疫缺陷病毒(HIV)-1p24、人体免疫缺陷病毒(HIV)-1gp41、人体免疫缺陷病毒(HIV)-1gpl20、人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱渗病毒HSV-1/2、单纯疱渗病毒HSV-1gD、单纯疱渗病毒HSV-2gG、人T细胞白血病病毒(HTLV)-1/2、流感病毒A、流感病毒AH3N2、流感病毒B、杜氏利什曼原虫、莱姆病、流行性腮腺炎、肺炎支原体、结核分枝杆菌、副流感病毒l、副流感病毒2、副流感病毒3、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、巨细胞性包含体病毒、麻疹、链球菌溶血素O、破伤风毒素、梅毒螺旋体15kd、梅毒螺旋体p47、克氏锥虫、弓形体和水痘带状疱渗的才示志物。B.示例性的标志物本发明的仪器、标记物和方法已用于以比原先的水平低10到100倍或更低的水平确定如血清和尿液中标志物的范围。标志物是大范围的生物状态如心脏疾病和心脏毒性(肌钓蛋白)、感染(TREM-1)、炎症和其它状态(LTE4、IL-8和IL-8)、癌症(Aktl、TGF-(3、Fas配体)及同种异体移植排斥和变性疾病的指征。标志物包括蛋白质和非蛋白质标志物。标志物在这里进行简短的描述，而过程和结果在实施例中给出。1.心脏损伤心肌肌钙蛋白是当前仅在异常高含量下才可检测到的标志物的一个例子。心肌肌4丐蛋白是心脏损伤的标志物，可在许多的疾病和状态(如急性心肌梗死)中用于诊断、预后判断和治疗方法的确定。另夕卜，心肌肌钙蛋白是有用的由治疗(如药物治疗)导致的心脏毒性的标志肌肉中的肌4丐蛋白复合物由肌4丐蛋白I、C和T组成。肌4丐蛋白C以两个异型体存在，一个来自心脏和慢缩肌，一个来自快缩肌；因为它在实际上所有横紋肌中发现，其作为特异性标志物的应用受到限制。相反地，肌4丐蛋白I和T在慢缩肌、快缩肌和心肌中表达为不同的异型体。肌钙蛋白I和T的独特的心脏异型体使得它们能够与其它骨骼肌的肌4丐蛋白进行免疫学区分。因此，肌4丐蛋白I和T释放到血液中表示心肌的损伤，因而提供了其用作诊断和预后标志物，或帮助确定治疗方法的基础。当前使用的心脏损伤标志物存在限制其临床应用的缺陷。心肌酶分析已形成确定是否存在心肌的损伤的基础。不幸的是，标准肌酸激酶(CK-MB)分析直到胸痛开始后10-12小时才能可靠地排除梗死。更早的诊断对于进行纤维蛋白溶解治疗和治疗类选具有非常特另'j的优因为健康个体循环系统中发现的肌钙蛋白的水平是非常低的，而心脏特异性肌4丐蛋白不会由心脏外来源产生，所以肌4丐蛋白是非常灵敏和特异的心脏损伤标志物。除心肌梗死外，许多其它的状态可能引起心肌的伤害，而对这种伤害的早期检测证明对医生是有用的。但是，目前的检测和定量心肌肌钓蛋白的方法不具有足够的灵敏度，它们直到肌钙蛋白水平达到异常高的浓度(如0.1ng/ml或更高)时才能检测心肌肌4丐蛋白在血液中的释放。本发明的方法和组合物因此包括用于心肌肌钙蛋白的高度灵敏检测和定量的方法和组合物，及基于这种高度灵敏的检测和定量进行诊断、预后判断和确定治疗的组合物和方法。建立的心肌肌钙蛋白I的标准曲线具有低于约1pg/1的检测极限(实施例1)。确定了正常个体中心肌肌钙蛋白I的水平，且确定了正常的第99百分位数的阈值(实施例3)。对来自患有急性心肌梗死的个体的系列样品进行了分析，且确定了心肌肌钙蛋白I浓度的时程(包括与基线的偏离)(实施例4)。因此，心肌肌钙蛋白I用作可被本发明的系统和方法在提供可在临床和研究环境中用于进行诊断和预后的信息的水平下检测的标志物的例子。还可以参见与本申请同日提交的美国专利申请_号，名称为"肌钙蛋白分析的高灵敏系统和方法(HighlySensitiveSystemandMethodsforAnalysisofTroponin)",其通过引用全文引入。2.感染TREM-1是细菌或真菌感染的标志物。本发明的分析表明，TREM-1可以在100fM的浓度下常规地测量。3.细月包因子许多细胞因子、趋化因子和生长因子的正常水平起初是未知的，因为现有技术不能够在低于疾病患者的样品中发现的水平时进行检测。例如，如IL-10、TNF-a、IL-4、IL-1(3、IL-2、IL-12和IFN-y的其它细胞因子的基础水平不能通过在临床环境中进行的常规分析方法进行检测，而本发明的分析系统能够轻易地确定这些细胞因子和其它细胞因子的水平。知道细胞因子和生长因子的水平有助于医生对包括癌症和呼吸、感染和心血管疾病的许多疾病的诊断、预后判断和治疗。可以使用本发明的分析系统分析如血浆、血清和尿的样品以及其它流体样品以达到在临床样本中早期检测细胞因子以监测正常和疾病状态，从而提供更好的转化医学(translationalmedicine)应用。例如，确定正常浓度范围未知的细胞因子的水平将有助于医生诊断和治疗随后的疾病和状态。骨形态发生蛋白可用于监测骨折、脊柱融合、矫形手术和口腔手术的治疗；白介素-10(IL-IO)可用于检测和监测包括非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤和卵巢癌在内的癌症的存在，以及用于检测和监测抗炎症治疗、器官移植、免疫缺陷和寄生虫感染的效应；白介素-11(IL-11)可用于检测和监测如乳腺癌的癌症的存在；白介素-12(IL-12)用于癌症和HIV感染；TNFa(—种炎症细胞因子)单独或与IL-6组合可用作败血症、急性胰腺炎、结核病及如风湿性关节炎和狼疮的自身免疫疾病的良好预报因子。可选择地，可能已存在正常和异常值的数据库，但当前方法可能不能实际用于日常的个体筛选以足够灵敏地确定标志物的个体值是在正常范围内。例如，大多数目前测定样品中IL-6浓度的方法能够检测IL-6最低约5pg/ml的浓度；IL-6值的正常范围为大约1-大约10pg/ml，目前的方法仅能在正常范围的较高部分检测IL-6。与此相反，本发明的分析仪和分析系统允许检测最低低于约0.1pg/ml浓度的IL-6，或低于正常范围值的十分之一。定量的下限(LLOQ)为大约0.01pg/ml。因此本发明的分析仪和分析系统允许为标志物(如IL-6)建立更宽范围和更精细(nuanced)的数据库，也允许对在正常范围内和正常范围外的标志物进行筛查以使得能够进行更早的检测。因此，本发明的分析仪和分析系统允许为标志物(如IL-6)建立更宽范围和更精细的数据库，也允许对在正常范围内和正常范围外的标志物进行筛查以使得能够更早地进行涉及IL-6的状态的检测。IL-6相关病症包括，^旦不限于败血症、外周动3永疾病和'lt性阻塞性肺病。白介素-6介导的炎症也是动脉粥样硬化的血管疾病和年龄相关病症(包括骨质疏松症和2型糖尿病)的共同病因和治疗目标。另外，IL-6可以与其它细胞因子(例如TNFa)结合测量以诊断其它的疾病，如脓毒性休克。4.炎症才示志物炎症标志物和标志物组。可以用于4全测炎性病症的细胞因子的例子为白三烯4(LTE4)(其可能是译喘的早期标志物)和TGFP(其可用于检测和监测炎性病症的状态，包括纤维化、硬化)。一些标志物可以用于检测一种以上的病症，例如TGF(3也可以用于4全测癌症的存在。白三烯E4半胱氨酰白三烯(LTC4、LTD4、LTE4)在哮喘的病理发生中发挥了重要的作用。白三烯是由肥大细胞、嗜酸性粒细胞和其它气道炎性细胞产生的，并增加血管通透性、收缩支气管平滑肌和介导苗述的123支气管高反应性。尿LTE4(LTC4和LTD4的稳定代谢产物)水平在患有哮喘的儿童和成人中与健康对照者相比提高，且在哮喘病人用抗原进行支气管诱发后、在阿斯匹林敏感受试者用阿斯匹林进行口腔诱发后及在运动诱发性支气管痉挛期间提高。白三烯在哮喘病理中的重要性在使用阻断白三烯作用的药剂进行的大型临床试验中得到了进一步证明。例如，孟鲁司特(montelukast)(—种潜在的白三烯受体拮抗剂，每日口服一次)在儿童(2-14岁)和成人中都显著改善哮喘的控制，并緩解运动诱发性支气管痉挛。白三烯途径的激活伴随着尿LTE4水平的升高，且。孝喘的急性恶化伴随着尿中LTE4水平的提高，随之在症状消退后显著降低。在恶化期间及后续时间(followupperiod)中气流受限的程度与尿LTE4水平相互关联，因此表明白三烯途径在急性哮喘期间被激活。另外，吸入支气管收缩剂量的LTC4或LTE4以剂量依赖的方式改变尿LTE4排泄，因此表明尿LTE4可以用作患有哮喘的病人的肺中硫醚酞(sulphidopeptide)白三烯合成的标志物。本发明的方法可以用于检测生物样品(如尿样品)中LTE4的变化(实施例)。低于纳克水平的LTE4的测量可以用作;险测和监测患有慢'性或急'性哮喘的病人的肺中硫醚酞白三烯合成的基准。6.TGF(5本发明的方法还可以用来检测以TGF(3作为标志物的疾病的早期发作。TGF(3相关疾病的例子包括纤维变性疾病。纤维变性指的是瘢痕组织的过度和持久形成，这是在许多影响肺、肾、眼睛、心脏、肝和皮肤的慢性疾病中造成与器官衰竭关联的发病和死亡的原因。TGF卩作为'|~曼性纤维变性效应的介体的作用是7>知的。例如，TGFp在纤维化肺疾病中参与促进成纤维细胞增殖和基质积聚。TGFP的抑制已被提议为肺纤维变性处理的潜在治疗途径。TGF卩不仅刺激许多细胞外分子(包括纤连蛋白和I型胶原及它们的受体)的合成，而且通过对于蛋白酶及其抑制剂的表达的不同效应减少基质降解，强烈地促进细胞外基质的产生。因此本发明的分析系统可以检测与纤维变性疾病关联的TGF(3的异常水平，这些疾病包括但不限于特发性肺纤维化、糖尿病肾病、包括肾血管球硬化症和IgA肾病的进行性肾病(肾衰竭的原因，且需要透析和再移植)，糖尿病视网膜病和老年黄斑变性(眼睛的纤维变性疾病，且产生失明的原因，肝硬化和胆道闭锁(产生肝纤维症和衰竭的原因)，和充血性心力衰竭、恰加斯氏病中与进行性纤维变性关联的心肌病，肺纤维化和硬皮病。TGFp也是癌症(包括前列腺癌、子宫颈癌、肺癌和霍奇金病)的标志物。患有肺癌的病人中TGF(3的血浆水平通常升高。已证明，在具有升高的血浆TGFpi水平的病人进行诊断时，监测这一水平可能有利于检测疾病持续性质和放疗后的复发。转化生长因子-(3(TGF-P)是影响发育、内环境稳定和组织修复的多能生长因子。另外，已有报告TGF-(3表达在不同恶性肿瘤中增加，显示这一生长因子在肿瘤发生中的作用。特别是，已经表明，TGF-卩在骨肉瘤的肿瘤基质中小血管的内皮和血管周围层中的存在显示了这一生长因子的血管生成活性，TGF-(3异型体表达增加显示其在骨肉瘤的进展中具有作用(Kloen等，Cancer，80:2230-9(1997))。TGF-卩是少数已知能够抑制细胞生长的蛋白质之一，但是，虽然对这一观念仍存在争议，一些研究者相信某些人体恶性胂瘤(如乳腺癌)出于其自身的目的破坏TGF-p。在未被理解的反论中，这些癌症制造TGF-(3并稳定地增加其表达直到它变成转移发生和存活率降低的标志物。例如，血浆TGF-p水平在具有转移到局部淋巴结和骨的前列腺癌的人中显著升高。在没有转移的临床和病理证据的人中，手术前血浆TGF-(3水平是手术后生物化学进展的强预报因子，估计是因为与在根治性前列腺切除术时存在的潜伏代谢疾病相关联。其它可以通过本发明的方法检测的异常细胞生长标志物包括Aktl、Fas配体和IL-6。癌症的诊断通常依赖于肿瘤生长的粗测量，如肿瘤本身的显象，这或者是不精确的，或者在通过当前的方法在例如实际的临床环境中成为可检测的之前必须达到高水平。在检测的时候，肿瘤经常已经长到足够大小而不太可能在转移之前进行介入治疗。例如X射线的肺癌检测需要肺瘤直径lcm，CD扫描需要大于2-3mm。可选择地，可以使用肺瘤生长的标志物，但同样经常是在生物标志物在当前临床技术可达到的水平成为可检测的时候，肿瘤已经充分发展了。此外，在介入治疗(如手术、化疗或放疗以收缩或消除肿瘤)后，通常直到残留的疾病发展到进一步的介入治疗不太可能成功的时候，才可能对胂瘤标志物进行足够灵敏的测量以确定是否肺瘤复发。使用本发明的分析仪、系统和方法，有可能在介入治疗更可能成功的时候(例如，由于转移的可能性低)同时检测肿瘤生长的开始和肿瘤生长的恢复。可以在先前未显示的水平^f全测的癌症标志物包括上面〃厶开的标志物。可以转化为诊断标志物的标志物检测分析的例子包括上面讨论的TGF-(3、Aktl、Fas配体和IL-6，其在实施例中给出。7.AktlAktl是v-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同源物1，并且是AKT1基因编码的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。Akt激酶参与完全不同的细胞反应，包括抑制细胞凋亡和促进细胞增殖、血管生成和肿瘤细胞侵入。Akt最为人所知的是其抑制凋亡和非凋亡细胞死亡的能力，因此Akt可以进行监测以预才艮胂瘤对抗癌治疗的反应。通过测定凋亡和非凋亡细胞死亡的影响预报肺瘤反应，这使得能够发展出更有效的方案来增强抗癌治疗的治疗效果。抗癌治疗诱导的细胞凋亡通过经由线粒体达到的凋亡前体蛋白和抗凋亡蛋白的平衡进行调节，且对细胞凋亡的抵抗通过Akt依赖的和Bcl-2依赖的途径介导。Bcl-2部分地抑制非凋亡细胞死亡及细胞凋亡，而Akt通过几种目标蛋白同时抑制凋亡和非凋亡细胞死亡。由于药物敏感性很可能与凋亡和非凋亡细胞死亡的累积有关，而凋亡和非凋亡细胞死亡的累积可以影响抗癌治疗中的整体肺瘤反应，因此由几种重要的细胞死亡相关蛋白质的调节预报整体肺瘤反应的能力可以产生更有效的提高治疗效果的方案。Aktl也参与到作为在发育和肿瘤发生过程中的重要过程的上皮间质转化(EMT)中，通过这一过程上皮细胞获得成纤维细胞样特性并显示出减小的细胞间粘附和增大的运动性。AKT在许多人体癌中激活，且AKT驱动的EMT可以给予组织侵入和转移需要的运动性。因此基于AKT抑制的进一步的治疗方法可以通过控制肺瘤细胞侵入和转移补充常规治疗。Akt在大多数黑色素瘤细胞系和不同发展阶段的肿瘤样品中是组成性激活的，且AKT的激活与侵入/转移相关黑色素瘤细胞粘附分子(MelCAM)的表达相关联，而这又与黑色素瘤恶性的获得紧密相关。Aktl在前列腺癌中也被上调，且其表达与肺瘤发展相关。因此，Aktl可能应用于癌症的治疗介入(尽管在其最早期的阶段)。在一些实施方式中，本发明的分析系统提供一种在Aktl的水平低于大约100、50或25pg/ml时，通过确定来自病人的样品中Aktl的存在或浓度进行癌症的早期诊断的方法。参见实施例6。8.Fas酉己^Fas配体(FasL),也称作CD95L，是TNF家族的成员并通过与Fas(CD95)结合诱导细胞凋亡。该蛋白质以两种形式存在，或者是膜FasL或可溶性FasL，其分别以45kDa和26kDa的分子量迁移。FasL在包括活化的淋巴细胞、自然杀伤细胞和单核细胞的多种细胞上表达。FasL与Fas的相互作用在生理凋亡过程中发挥重要作用。Fas-FasL系统的功能异常引起外周淋巴器官的增生并加速自身免疫疾病的发展和肿瘤发生。一般关于可溶性凋亡因子的数据有限，更具体地说关于它们对治疗方案的调整的数据有限。本发明的系统和方法可以;险测^氐至2.4pg/ml的Fas配体浓度。因此，在一些实施方式中，本发明的分析系统和方法提供检测Fas配体以确认如细胞凋亡的异常水平的病理状态。病人样品中Fas的测量可以用于诊断如多嚢卵巢综合征的状态、如睾丸生殖细胞肿瘤、膀胱癌、肺癌的肿瘤、和如滤泡树枝状细胞肿瘤的罕见肺瘤。另外，Fas配体的Fas测量可以用于诊断同种异体移植排斥和如骨关节炎的退行性疾病。因此，在一些实施方式中，本发明的分析系统和方法可以用于确定来自被怀疑患有Fas配体相关病症的病人的样品中Fas配体的浓度以诊断该病症，或者Fas配体的浓度可用于监测接受Fas配体相关病127症治疗的病人中该病症的进程或状态。在一些实施方式中，分析能够以低于大约100、50、25、10或5pg/ml的浓度确定样品中Fas配体的水平。参见实施例8。C.商业方法
技术领域：
：本发明涉及用于建立可在诊断生物体的生物状态或状况中使用的标志物、基于该标志物进行诊断和利用该诊断使诊断和服务商业化z市场化的系统和方法(包括商业方法)。在一种实施方式中，这里的商业方法包括使用以下方法建立一种或多种标志物通过检测一种或多种标志物的单个分子测量生物样品中一种或多种标志物的浓度而建立从第一群体获得的生物样品中所述一种标志物或多种标志物的浓度范围；使上述步骤中确认的一种或多种标志物在例如诊断产品中商业化。确认的生物标志物优选为多肽或小分子。这种多肽可以是预先已知或未知的。这里的诊断产品可以包括一种或多个与标志物(如多肽)特异性结合的抗体。在一种实施方式中，这里的商业方法包括使用系统建立一种或多种标志物，该系统包括通过检测标志物的单个分子测量生物样品中标志物的浓度而建立从第一群体获得的生物样品中所述标志物标志物的浓度范围；和提供用以确定生物体是否具有关注的生物状态或状况的诊断服务。确认的生物标志物优选为多肽或小分子。这种多肽可以是预先已知或未知的。这里的诊断产品可以包括一种或多个与标志物(如多肽)特异性结合的抗体。这里的诊断服务可以由得到该商业机构许可的CLIA认证的实验室或由该商业机构自己提供。这里的诊断服务可以直接提供给保健服务提供商、保健服务保险商或病人。因此这里的商业方法可以从出售例如诊断服务或诊断产品获得收入。这里的商业方法也设想向例如保健服务提供商、保险商、病人等提供诊断服务。这里的商业机构可以通过与服务实验室签约或建立服务实验室(得到临床实验室改善条例(CLIA)或其它规章认证)提供诊断服务。这种服务实验室然后可以完成这里7>开的方法以确认样品中是否存在特定的标志物或标志物模式。该一种或多种标志物是多肽或小分子，或新的化学体。VII试剂盒本发明进一步提供试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包括如前所述的分析系统和标记物。本发明的试剂盒包括适当地包装的一种或多种可用于对这里描述的分子(如标志物)进行灵敏检测的组合物。在一些实施方式中，本发明的试剂盒提供这里描述的标记物及其它成分(如使用说明、试剂或其它成分)。在一些实施方式中，试剂盒提供在独立容器中作为单独成分(如抗体和荧光结构)的标记物，在使用前由消费者连接。在一些实施方式中本发明的试剂盒提供对分子(如标志物)特异性的结合伴体对(如抗体对)，其中结合伴体中的至少一种为这里描述的标志物的标记物。在一些实施方式中，结合伴体(如抗体)在独立的容器中提供。在一些实施方式中，结合伴体(如抗体)在相同的容器中提供。在一些实施方式中，结合伴体(如抗体)中的一种固定在固体载体(如微滴定板或顺磁性微球)上。在一些实施方式中，其它的结合伴体(如抗体)用这里描述的荧光结构进行标记。作为试剂盒成分的结合伴体(如抗体)、固体载体和荧光标记可以是这里描述的任何合适的该种成分。试剂盒可以另外包括可用于本发明的试剂，如用于结合反应中的緩冲液和其它试剂、用于预处理进行分析的仪器的洗液、緩冲液或其它试剂、用于过滤试剂的滤器和用于使样品通过仪器运行的洗脱緩冲液或其它试剂。试剂盒可以包括一种或多种标准品，例如用于本发明的分析中的标准品(如高度纯化的标准品，如重组体、蛋白质标志物或其各种片段、复合体等等)。试剂盒可以进一步包括使用说明。实施例下面的实施例以举例说明的方式给出，而不是用于限制公开的范围。除非另外说明，实施例中的处理样品在如这里所述的单分子检测器(SMD)中进行分析，采用如下的参数激光器波长639nm的连续波亚砷酸镓二极管激光器(BlueSkyResearch,Milpitas,CA),聚焦在大约2微米大小的点上(0.004pL如这里定义的探询空间)；流速=5微升/分钟，通过具有IOO微米正ID和300微米正OD的熔融珪石毛细管；透镜非共焦排列(参见，例如图1A);0.8数值孔径的聚焦透镜(Olympus);珪雪崩光电二极管检测器(PerkinElmer，Waltham，MA)。实施例1.生物标志物的夹心分析心肌肌钙蛋白I(cTnI)分析这一分析的目的是检测人血清中心肌肌钙蛋白I(cTnI)的存在。分析模式是基于小鼠单克隆捕获抗体和羊多克隆检测抗体的两步夹心免疫分析。需要十微升样品。分析的工作范围是0-900pg/ml，具有1-3pg/ml的典型分析检测极限。该分析需要大约4小时的工作时间来完成。材料以下的材料用于下面描述的分析过程中分析板NuncMaxisorp，产品464718,384孔，透明(clear),用单克隆抗体BiosPacificA34440228P(批号A0316)被动包被(5)ig/ml，0.05M碳酸钠pH9.6中，室温下过夜)；用PBS中的5%蔗糖、1%BSA进行封闭，并在4°C下储存。对于标准曲线，使用人心肌肌4丐蛋白I(BiosPacific,目录号J34000352)。标准浓度的稀释剂是免疫耗竭内源性cTnl的人血清，等分分配并在-20。C下储存。标准品的稀释在96孔板(锥形、聚丙烯，Nunc产品号249944)中进行。使用下面的緩沖液和溶液(a)分析緩冲液具有1%BSA和0.1%TritonX-lOO的BBS;(b)包含2mg/ml小鼠IgG(EquitechBio)、2mg/ml羊IgG(EquitechBio)和2mg/mlMAK33poly，Roche11939661号的分析缓冲液中的一皮动封闭液；(c)检测抗体(Ab):亲和性纯化的肽3的山羊多克隆抗体(BiosPacificG129C),其用荧光染料AlexaFluor647标记，并在4°C下储存；检测抗体稀释液50%分析緩沖液，50%被动封闭液；清洗緩冲液硼酸盐緩沖盐水Triton緩沖液(BBST)(1.0M硼酸盐、15.0M氯化钠、10%TritonX-100，pH8.3);洗脱緩沖液具有4M脲、0.02%TritonX-100和0.001%BSA的BBS。AlexaFluor647标记抗体的制备检测抗体G-129-C通过以下步骤与AlexaFluor647偶联首先将lOOpgG-129-C溶解于400|il偶联緩沖液(0.1MNaHCO3)中。然后通过将溶液转移到YM-30过滤器中并使溶液和过滤器离心使抗体溶液浓缩到50)ul。然后通过加入400pl偶联緩冲液清洗YM-30过滤器和抗体三次。通过向过滤器加入50^1、反转过滤器并以5,000xg离心1分钟回收抗体。所获得的抗体溶液为1-2pg/^a。通过向一个AlexaFluor647的小瓶中加入20piDMSO重建AlexaFluor647NHS酯，这一溶液在-20。C下储存最多一个月。将3|ul的AlexaFluor647原液加入抗体溶液中，抗体溶液然后混合并在黑暗中孵育1小时。1小时后，将7.5pl的lMtris加入到抗体AlexaFluor647溶液中并混合。溶液用YM-30进行超滤以除去低分子量成分。包含与AlexaFluor647偶耳关的抗体的渗余物的体积通过添加PBS调整到200-400)al。将3)il的10%NaN3加入到溶液中，将所获得的溶液转移到Ultrafree0.22离心装置并以12,000xg离心2分钟。收集包含偶联抗体的滤液并用于分析。过程cTnl标准品和样品的制备和分析标准曲线如下制备工作标准品通过将cTnl原液进行系列稀释成标准稀释液或获得1.2pg/ml-4.3pg/ml之间的cTnl浓度范围而制备(0-900pg/ml)。将10|11被动封闭液和10|111标准品或样品加入各孔中。标准品运行四次。板用Axyseal密封膜密封，以3000RPM离心1分钟，并在25。C振摇条件下孵育2小时。洗板5次，在纸巾上以倒置位置进行离心直到转子达到3000RPM。制备1nM检测抗体的工作稀释液，并向每孔中加入20(il检测抗体。对板进行密封并离心，且在25。C振摇条件下孵育l小时。每孔加入30pl洗脱緩沖液，板被密封并在25。C振摇条件下孵育1/2小时。板可以在进行分析前在4。C下储存最多48小时，或者立即进行样品分析。对于分析过程，40|11/分钟需要每孔20pi样品，在5iil/分钟时5pl样品被分析。数据基于4cj的阈进行分析。绘制标准品的原始信号对浓度的曲线。对低浓度范围采用线性拟合，而对全标准曲线采用非线性拟合。检测极限计算为(LoD)计算为LOD气3X零的标准差)/线性拟合的斜率。样品浓度由适于样品信号的方程(线性的或非线性的)进行计算。将部分试样泵入分析仪中。通过设定探询空间以使得在激光激发后仅一个焚光分子的发射在限定的空间中被检测到而在毛细管流动过程中测量个别标记的抗体。通过使各个信号代表一个数字事件，这一配置使得极高的分析灵敏度成为可能。总的荧光信号确定为个体数字事件的总和。计数的各分子是具有数百至数千DMC事件/样品的阳性数据点。本发明的cTnl分析的检测极限由平均值+3SD确定。结果采用该分析方案进行四次测量得到的典型cTnl标准曲线的数据在表3中显示。表3cTnl标准曲线cTnl(pg/ml)信号标准差%CV02332510.81.5625346318.93.125463357.56.25695395.612.51137615.32519881397.05036541744.810054933506.420082642673.240097021491.58009976500.5分析系统的灵敏度在15次操作中测试，并发现常规地检测亚毫132微微摩尔/升(fM)水平的标准品，如表4中数据所示。精度在4和12pg/mlcTnl为10%。表4仪器灵敏度<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table>cTnl浓度范围的线性化标准曲线如图5中所示。分析检测极限(LoD)通过15个连续的分析试-睑确定。LoD为0标准的平均值+3SD(n二4)批内分析确定。平均LoD为1.7pg/ml(范围0.4-2.8pgZml)。样品的回收通过分析已免疫耗竭cTnl并具有已知量的cTnl峰值的血清样品确定。表5显示了在3天时间内分析的系统的样品回收数据。表5一羊品回收<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table>分析的线性在具有cTnl峰值并用标准稀释剂稀释的混合人血清中确定。表6中的结果显示了稀释度和相应稀释度预想的信号的％。表6分析线性<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table>这些数据表明，本发明的分析系统允许对亚毫微微摩尔浓度的cTnl进行高度灵敏的激光诱导免疫分析。实施例2.基于樣O求的Tnl夹心分析上述的分析采用相同的微滴定板模式，其中塑料表面用于固定目与未结合体的分离而进行的分析相容。材料MyOne抗生蛋白链菌素Cl微粒(MPs)从Dynal得到(650.01-03,10mg/ml原液)。分析中使用的緩沖液包括IOX硼酸盐緩冲盐水Triton緩冲液(BBST)(1.0M硼酸盐、15.0M氯化钠、10%TritonX-100，pH8.3)、分析緩沖液(O.lMTris(pH8.1)、0.025MEDTA、0.15MNaCl、0.1%BSA、0.1%TritonX-100和0.1%NaN3中的2mgZml正常羊IgG、2mg/ml正常小鼠IgG和0.2mg/mlMAB-33-IgG-聚合体，在4°C下储存)和洗脱緩沖液(含有4M脲、0.02%TritonX-100和0.001%BSA的BBS,在2-8。C下储存)。基于微J求的夹心分析中使用的抗体包括Bio-Ab(A34650228P(BiosPacific),每IgG具有1-2个生物素)和Det-Ab(G-129-C(BiosPacific),与A647偶联，2-4个焚光染料/IgG)。标准品为重组人心肌肌4丐蛋白I(BiosPacific,目录号J34120352)。标准稀释液为TBSwEDTA中的30mg/mlBSA。孩i粒包被IOOiuIMP原液置于埃彭道夫管中。通过施加》兹体、去除上清液、移去》兹体和重悬在清洗緩沖液中的步骤用100plBBST清洗緩沖液清洗MP三次。清洗后MP重悬在100|ul分析緩冲液中并加入15)igBio-Ab。然后混合物在室温下通过恒速混合孵育1小时。如上所述，MP用1ml的清洗緩冲液清洗5次。清洗后MP重悬在15ml分析緩冲液中(或100^1,以在4°C下储存)。标准品和样品的制备标准品用标准稀释液稀释以得到合适的标准曲线(通常200pg/ml到0.1pg/ml)。冷冻的血清和血浆样品需要在室温下以13Krpm离心IO分钟。小心地移出澄清的血清/血浆以避免带出任何可能的沉淀物或飘浮物，并放入新管中。50pl的各标准品或样品用移液管移入适当的孔中。捕获目标向各孔中加入150plMP(重悬在15ml分析緩沖液+400mMNaCl中后)。混合物在室温下在JitterBug,5上醉育l小时。清洗和检测板置于f兹体上，并在确保所有MP被》兹体捕获后移除上清液。在板从磁体上移开后加入250pl清洗緩沖液。然后将板置于磁体上，并在确保所有MP被磁体捕获后移除上清液。每孔加入20plDet-Ab(Det-Ab在分析緩沖液+400mMNaCl中稀释到500ng/ml)。混合物在室温下在JitterBug,5上孵育30分钟。清洗和洗脱将板置于磁体上并用清洗緩沖液清洗三次。在确保所有MP被磁体捕获后移除上清液并加入250pl清洗緩沖液。清洗后将样品转移到新的96孔板中。然后新的板置于》兹体上，并在确保所有MP被磁体捕获后移除上清液。在板从磁体上移开后加入250)il清洗緩冲液。然后将板置于磁体上，并在确保所有MP被磁体捕获后移除上清液。然后加入20pl的洗脱緩冲液且混合物在室温下在JitterBug，5上孵育30分钟。过滤MP和转移到384孔板上将标准品和样品转移到置于384孔分析板顶部的384孔滤板中。该板然后在室温下利用板转子(platerotor)以3000rpm进行离心。除去滤板并加入合适的校准器。板被覆盖并准备在SMD上运^t。SMD:将部分试样泵入分析仪中。通过设定探询空间以使得在激光激发后仅一个荧光分子的发射在限定的空间中被检测到，在毛细管流动过程中测量个别标记的抗体。通过使各个信号代表一个数字事件，这一配置使得极高的分析灵敏度成为可能。总的荧光信号确定为个体数字事件的总和。计数的各分子是具有数百至数千DMC事件/样品的阳性数据点。本发明的cTnl检测极限由平均值+3SD确定。实施例3.正常非疾病受试群体中cTnl的浓度范围人血清中cTnl浓度的参考范围或正常范围使用来自88个明显健康受试者(非疾病)的血清样品建立。执行如实施例1中描述的夹心免疫分析且如上所述使用本发明的单颗粒分析系统对信号或事件的数目进行计数。血清肌钓蛋白I的浓度通过使分析仪检测的信号与如上所述的标准曲线关联而确定。所有分析进行四次。按照当前欧洲和美国心脏病学会(ESC/ACC)的建议，肌4丐蛋白分析应当精确地定量正常范围的第99百分位数，使分析变异系数(CV)小于10%，从而在患有ACS的病人和不患有缺血性心脏病的病人之间做出可靠的区分，及对不利心脏事件进行风险分级。该分析显示出Tnl的生物阈(临界浓度)为7pg/ml的Tnl浓度，其是建立在第99百分位数的，相应的CV值为10%(图5)。在10%的CV水平，精度特征点在4和12pg/ml的Tnl浓度处。另外，该分析与由国家标准技术研究所提供的肌钙蛋白I的标准测量具有很好的相关性(图6)。本发明的分析足够灵敏和精确以满足ESC/ACC的要求，且与如Koerbin等人描述的分析方法(AnnClinBiochem,42:19-23(2005))相比，它是最灵敏的心肌肌钙蛋白I的分析方法。本发明的分析具有比当前可用的分析方法高10-20倍的灵敏度，当前可用的分析方法确定生物阈范围为111-333pg/ml的cTnl。实施例4.急性心肌梗死(AMI)病人的循环中Tnl早期释放的检测研究1:从急诊室(ED)中表现出胸痛的18个病人逐次获得47个样品。这些病人都具有非ST抬高的ECG,并诊断为患有AMI。来自所有18个病人的初始样品中cTnl的浓度在接纳进入急诊室的时候按照商用分析方法确定为<350pg/ml(10%临界点)，且12个<100pg/ml(第99百分位数)。这些样品采用相同的商用分析方法在随后进行测试，并确定为cTnl测试阳性。相同的血清样品也按照如实施例1和3中描述的本发明的分析方法对cTnl进行分析，且其结果与采用商用分析方法获得的结果进行比较。在病人表现出胸痛的时候第一次抽取血液(样品1),并随后按照4-8小时的时间间隔抽取血液样品(样品2在12小时，样品3在16小时，样品4在24小时，样品5在30小时，样品6在36小时，样品7在42小时和样品8在48小时)。血清采用本发明的方法和当前商用的方法进行分析，且所获得的结果在图7中显示。本发明的分析仪在病人出现胸痛时(样品1)4企测到cTnI,而商用的分析方法在迟得多的时间(36小时的样品6)首次检测到cTnl。样品3中Tnl的浓度超过了使用本发明的分析仪建立的生物阈水平(7pg/ml，见图5)，因而表明样品3为Tnl阳性，提示心脏事件的发作。商用分析方法的生物阈在111和333pgZmlTnl之间。因此，样品3不会被认为预示了可能的心脏事件。另外，本发明的方法和组合物使得能够基于心肌肌钙蛋白水平，如通过从病人取得的第一个样品的结果所证明的肌4丐蛋白水平，进行早得多的诊断和采取可能的介入措施。在初始的商用分析cTnl值在100和350ng/ml之间的3个病例中，通过本发明的分析方法检测都为阳性(即cTnl超过7pgZml)。在初始的商用分析cTnl值低于100pg/ml的12个病例中，5个通过本发明的分析方法确定为心血管事件阳性(即cTnl超过7pg/ml)。预计本发明的分析方法在测试入院样品时将检测到比当前商用分析方法高53%的AMI病例。研究2:50个按照商用分析方法测试为阴性的血清样品采用本发明的分析仪和分析方法进行测试。结果在图8中显示。50个样品中，36个在第99百分位数内并确定为在本发明的分析确立的正常范围内。但是，剩余的14个经商用分析方法确定为"正常"或非疾病范围内的样品经测试在本发明确立的生物阈值之上。因此，本发明的高灵敏度cTnl分析允许在cTnl血清水平在商用技术的阈水平之下时检测病人的心肌损伤。本发明的高度灵敏和精确的cTnl分析的应用使得能够比现有的cTnl分析更早地检测AMI,因而提供了进行适当诊断和早期医疗介入以提高治疗效果的可能性。137实施例5.白三烯T4(LTE4)的检测建立用于定量緩沖液中的白三烯E4(LTE4)的分析方法作为使用例如尿样本的分析的初步分析。该分析模式是单步骤单抗体竟争免疫分析。需要50微升样品。这一分析的典型的工作范围是0-300pg/ml，具有2-3pg/m1(0.1-0.15pg/样品)的典型检测极限。分析需要大约4小时的工作时间(benchtime)来完成。制备以下的材料并用于下面描述的分析过程中在CaymanChemical白三烯E4(EIA试剂盒，目录号52041l)中提供的小鼠抗兔IgG包被的板、LTE4标准品原料(在乙醇中的100ng/ml纯化的LTE4(CaymanChemical白三烯E4EIA试剂盒，目录号520411))、用90mlNanopure水按照1:10稀释的分析緩沖液(10XEIA緩冲浓缩液(CaymanChemical白三烯E4EIA试剂盒，目录号520411))、稀释标准品的緩冲液(3%乙醇)、用30mlEIA緩冲液稀释的抗LTE4抗体(白三烯E4EIA抗血清(CaymanChemical白三烯E4EIA试剂盒，目录号520411)、31)iM的抗生物素蛋白链菌素-Alexa检测试剂原液(用AlexaFluor647标记的抗生物素蛋白链菌素)、使得与分析仪的检测相容的示踪剂(LTE4-生物素结合物)、按1:40稀释的清洗緩冲液(400X浓缩液(CaymanChemical白三烯E4EIA试剂盒，目录号520411))、洗脱緩冲液(含有4M脲、0.02%TritonX-100和0.001%BSA的硼酸盐缓沖盐水，pH8.3)。对示踪剂的基质和抗血清浓度进行测试以确定最灵敏的分析条件。标准曲线如下制备通过在分析緩冲液中对100ng/ml原液进行系列稀释制备工作标准品以获得0.005pg/ml至3000pg/ml之间的浓度范围。将50pi标准品(或样品)加入分析板的每一孔中。所有标准分析两次。通过用分析緩冲液将示踪剂原液稀释到1pg/ml制备工作示踪剂。将50|al示踪剂(或緩沖液)加入分析板的每一孔中。通过在分析緩沖液中稀释100%原液制备10%工作抗血清溶液(按照试剂盒说明进行)。将50(il抗血清(或緩冲液)加入分析板的每一孔中，该板被密封并在25。C振摇条件下孵育过夜。工作抗生物素蛋白链菌素-Alexa检测试剂通过用分析緩沖液将原液稀释到140pM进行制备。将15^1的检测试剂加入到各孔中，并且板在25。C振摇条件下孵育30分钟。洗板5次。将50iil洗脱緩冲液加入各孔中，并且板在25。C振摇条件下孵育l/2小时。该板立即使用，或者在分析前在4。C下储存最多48小时。以40jul/分钟的速率将20jul样品泵入分析^C中，且以5lul/分钟的速率分析5pl样品。数据文件采用等于4cj的阈值和0-8毫秒之间的互相关性进行分析。对于标准品绘制原始信号对浓度的曲线，且对低范围标准采用线性拟合，而对全标准曲线采用非线性拟合。检测极限计算为LOD二最大信号的80%(无目标控制)(B/B。=80%时的浓度)。样品浓度由适于样品信号的方程(线性的或非线性的)进行计算。LTE4的竟争曲线如图9中所示。LOD计算为80。/。，B/Bo=1.5pg/ml(大约5pM)。采用商购的试剂盒进行的LTE4分析仅在LTE4以至少30pg/ml的浓度存在时检测到LTE4。因此，分析系统可以用于检测LTE4的水平以确定是否存在LTE4相关病症(如初起的哮喘)和在疾病的任何早期阶段提醒医生需要医疗介入以提高临床效果。实施例6.人Aktl的检测建立用于定量血清样品中的低水平Aktl的夹心免疫分析。通过将浓的标准品稀释成緩冲的蛋白质溶液建立标准曲线。将lO微升(jil)的分析緩冲液和10(^1的样品或标准品加入已经用对Aktl特异性的抗体包被的384孔板的各孔中并孵育2小时。更具体地说，将抗体841660(R&DSystems)以2.5微克/ml包被到NuncMaxisorp板上。对板进行清洗，并向各孔中加入20^1对Aktl特异性的标记的检测抗体，用AlexaFluor647标记的AF1775(R&DSystems)(2-4焚光染料/IgG)加入各孔中。在孵育1小时后，将板进行清洗以除去未结合的检测抗体。结合的检测抗体被洗脱并在分析仪器中测量。以下的材料用于下面描述的分析过程中。包被的384孔板、分析緩沖液、重悬緩沖液、稀释緩沖液、标准稀释液、Aktl标准品、Aktl的检测抗体试剂、清洗緩冲液(IOmM硼酸盐、150mMNaCl、0.1%TritonX-100，pH8.3)、洗脱緩沖液(4M脲加上0.02%TritonX-100和0.001%BSA)、设定在"7"的微板振荡器、洗板机、板离心机、Axyseal密封膜(Axygen产品321-31-051)、Nunc可穿透密封带(Nunc产品235306)。材料提供的试剂捕获抗体841660(R&DSystems),以2.5微克/ml包被到NuncMaxisorp板上(384孔板)分析緩冲液重悬緩沖液稀释緩冲液标准稀释液Aktl标准品Aktl的4全测抗体试剂，用AlexaFluor647标记的AF1775(R&DSystems),2-4荧光染料/IgG其它需要的试剂TritonX-100清洗緩冲液(10mM硼酸盐、150mMNaCl、0.1%TritonX-100,pH8.3)洗脱緩冲液(4M脲加上0.02%TritonX-100和0.001%BSA)微板振荡器，设定在"7"洗板机板离心机Axyseal密封膜，Axygen产品321-31-051Nunc可穿透密封带，Nunc产品235306过程Aktl标准品制备在0.5ml重悬緩沖液中重悬标准品，终浓度^70ng/ml在稀释緩冲液中以1:3稀释标准品为57ng/ml在标准稀释液中以1:19稀释标准品为3ng/ml在标准稀释液中进行系列的3倍稀释达到4.1pg/ml浓度每孔加入10^1分析緩沖液每孑L力口入10|ul才示-,口口口或才羊f口用Axyseal密封膜对板进4亍密封以3000RPM离心1分钟在25。C振摇条件下孵育2小时将板清洗5次以3000RPM离心倒置在纸巾上的板1分钟向每孔中加入20iul检测抗体试剂用Axyseal密封膜对板进行密封以3000RPM离心倒置在纸巾上的板1分钟在25。C振摇条件下孵育1小时将板清洗5次以3000RPM离心倒置在纸巾上的板1分钟每孔加入30)il洗脱緩沖液以3000RPM离心1分钟用Nunc可穿透密封带密封，用滚筒确保紧密密封在25。C振摇条件下孵育1/2小时板可以在进行分析前在4。C下储存最多48小时在Zeptx仪器上进行分析Aktl的标准曲线如下产生制备Aktl标准品以获得4.1pg/ml至170ng/mlAktl之间的范围。将10|il各标准品稀释液(或样品)加入分析板孔中。该板被密封，并在25。C振摇条件下孵育2小时。将板进行清洗并离心千燥。向每孔中加入20|il检测抗体试剂，并在25。C振摇条件下孵育1小时。通过每孔加入30|al洗脱緩冲液，并在25。C振摇条件下孵育l/2小时，使抗体-Aktl复合体断裂。该板或者立即使用，或者在分析前在4。C下储存最多48小时。洗脱液被泵入分析仪中。采用该分析方案进行四次测量得到的典型Aktl标准曲线的数据在表14中给出，且曲线图数据在图10中显示。表14Aktl的标准曲线<table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table>使用1000pg/ml标准品的36个重复样品通过在单板上分析样品测试批内分析的精度。平均信号为1822±243,%CV=13。分析的检测极限(LoD)通过向三十六个零标准重复实验的平均信号加上两个标准差并由标准曲线计算相应的Aktl浓度而确定。LoD计算为25pg/ml。因此，分析系统可以用于片企测Aktl的水平以确定Aktl相关病症"口癌症)是否存在。实施例7.TGF-(3的检顶'J建立用于定量血清中的低水平TGF-P的夹心免疫分析。通过将浓的标准品稀释成緩沖的蛋白质溶液建立标准曲线。将10微升(iil)的分析緩冲液和10|al的样品或标准品加入用TGF-(3特异性抗体包被的384孔板的各孔中并孵育2小时。对板进行清洗，并向各孔中加入20)^1对TGF-卩特异性的标记的检测抗体。在孵育1小时后，将板进行清洗以除去未结合的检测抗体。结合的检测抗体被洗脱并在分析仪器中测以下的材料用于下面描述的分析过程中。包被的384孔板、分析緩沖液、标准稀释液、TGF-(3标准品的100(Lig/ml原液、TGF-(3的才企测抗体试剂、TritonX-100清洗緩沖液(10mM硼酸盐、150mMNaCl、0.1%TritonX-lOO，pH8.3)、洗脱緩沖液(4M脲加上0.02%TritonX-100和0.001%BSA)。TGF-卩的标准曲线如下产生制备TGF-卩标准品以获得100ng/ml至4.1pg/mlTGF-p之间的范围。将10^1的分析緩沖液和lOpl的标准品或样品加入各孔中，该板被密封，并在25。C振摇条件下將育2小时。该板被密封，并在25。C振摇条件下孵育2小时。将板清洗并离心干燥。向每孔中加入20nl检测抗体试剂，并在25。C振摇条件下孵育1小时。通过每孔加入30^1洗脱緩沖液，并在25。C振摇条件下孵育1/2小时，使抗体-TGF-p复合体断裂。该板或者立即使用，或者在进行分析前在4。C下储存最多48小时。洗脱液被泵入分析仪中。采用该分析方案进行四次测量得到的典型TGF-P标准曲线的数据如表15中所示，且曲线图数据在图11中显示。表15TGF-(3的标准曲线浓度(pg/ml)平均信号标准差%CV012301149411906861212611321037117015814111124210383331364135101000193910053000360449714分析的检测极限(LoD)通过向二十个零标准重复实验的平均信号加上两个标准差并由标准曲线计算相应的TGF-P浓度而确定。LoD=350pg/ml。因此，分析系统可以用于;f全测TGF-(3的水平以确定TGF-P相关143病症(如癌症)是否存在。实施例8.Fas配体的检测建立用于定量血清中的低水平Fas配体的夹心免疫分析。通过将浓的标准品稀释成緩沖的蛋白质溶液建立标准曲线。将10微升oa)的分析緩沖液和lOial的样品或标准品加入用Fas配体特异性抗体包被的384孔板的各孔中并孵育2小时。对板进行清洗，并向各孔中加入20^1对Fas配体特异性的标记的检测抗体。在孵育1小时后，将板进行清洗以除去未结合的检测抗体。结合的检测抗体被洗脱并在Zeptx仪器中测量。Fas配体的标准曲线如下产生制备Fas配体标准品以获得100ng/ml至4.1pg/mlFas配体的范围。将lO^il的分析緩冲液和lO^il的标准品或样品加入各孔中，该板被密封，并在25。C振摇条件下孵育2小时，清洗并离心干燥。向每孔中加入20|il检测抗体试剂，并在25'C振摇条件下孵育1小时。通过每孔加入30)il洗脱緩冲液，并在25"C振摇条件下孵育1/2小时，使抗体-Fas配体复合体断裂。该板或者立即使用，或者在进行分析前在4X:下储存最多48小时。采用该分析方案进行四次测量得到的典型Fas配体标准曲线的数据如表16中所示。表16Fas配体标准曲线Fas配体标准品浓度(pg/ml)平均信号标准差%CV09358291.210074443.4122256511158770433286952210059391412144<table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table>使用3个标准浓度的12个重复样品通过在单板上分析样品测试批内分析的精确度。三个点中各点的12个值的平均值、标准差和CV如表17中所示。表17Fas配体的批内分析精确度<table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table>分析的检测极限(LoD)通过向二十个零标准重复实验的平均信号加上两个标准差并由标准曲线计算相应的Fas配体浓度而确定。LoD计算为2.4pg/ml。因此，本发明的分析系统可以检测Fas配体的水平以指示Fas配体相关病症(例如，癌症、同种异体移植排斥和如骨关节炎的变性疾病)的存在。实施例9.生物标志物TREM-1的夹心分析最近的才艮告已经确认TREM-1为细菌或真菌感染的生物标志物(参见，如Bouchon等(2000)J.Immunol.164:4991-5;Colonna(2003)Nat.Rev.Immunol.3:445-53;Gibot等(2004)N.Engl.J.Med.350:451-8;Gibot等(2004)Ann.Intern.Med.141:9-15)。对TREM-1的分析已经4吏用夹心分析才莫式建立(SandwichAssayforDetectionofIndividualMolecules,美国临时专利申请60/624,785号)。TREM-1检测的分析试剂可以商购得到(R&DSystems,Minneapolis,MN)。分析在96孔板上进行。单克隆抗体用作捕获试剂，另一种单克隆或多克隆抗体用于4企测。4全测抗体用AlexaFluorA647⑧标记。分析方案如下1.用捕获抗体包4皮板，清洗5次，2.在PBS中的1%BSA、5%蔗糖中封闭，3.添加在血清中稀释的目标，孵育，清洗5次，4.添加检测抗体，孵育，清洗5次，5.添加0.1M甘氨酸(pH2.8)以从板上释放结合的分析成分，6.将样品从处理板转移到检测板，使样品的pH达到中性并在单颗粒分析系统上进行分析。图13显示了使用该分析产生的TREM-1的标准曲线。该分析在100-1500毫微微摩尔的测量范围内是线性的。最近引入了R&DSystems的ELISA分析。用它们的ELISA分析净艮告的标准曲线在60-4000pg/ml之间。这一实施例表明，我们可以在标准曲线中例行地进行100fM(4.7pg/ml)的测量，使得能够进行灵敏大约IO倍的测量。另外，趋化因子、T细胞活化分子、细胞粘附分子和信号转导分子的标准曲线也已建立(图15)。结果显示，使用单颗粒分析仪对分析物的检测始终比使用ELISA分析的检测灵敏度高10-100倍。实施例10.生物标志物的夹心分析血清中的IL-6和IL-8水平分析这一方案描述了使用本发明的单颗粒分析系统对血清中的低水平IL-6进行定量的夹心免疫分析。通过将浓的标准物稀释成緩冲的蛋白质溶液建立标准曲线。将10微升()al)的分析緩沖液和10^1的样品或标准物加入用IL-6特异性抗体包^皮的384孔板的各孔中并孵育2小时。对板进行清洗，并向各孔中加入2(Vl对IL-6特异性的标记的检测抗体。在孵育1小时后，对板进行清洗以除去未结合的检测抗体。结合的检测抗体被洗脱并在单颗粒分析仪器中测量。材料以下的材料用于下面描述的过程中包被的384孔板、分析緩冲液、标准稀释液、IL-6标准品的100ng/ml原液、用AlexaFluor647染料标记的IL-6检测抗体(R&DSystems)、TritonX-lOO清洗緩沖液(10mM硼酸盐、150mMNaCl、0.1%TritonX-lOO，pH8.3)、洗脱緩冲液(4M脲加上0.02%TritonX-100和0.001%BSA)、设定在"7"的微板振荡器、洗板机、板离心机、Axyseal密封膜(Axygen产品321-31匿051)和Nunc可穿透密封带(Nunc产品235306)。过程IL-6标准和样品的制备和分析IL-6的标准曲线如下制备解冻100ng/ml的原液，然后将原液稀释1000倍得到100pg/ml的标准稀释液，进行6次连续的3倍稀释得到最低标准浓度为0.14pg/ml的浓度范围。将lOpl的分析緩沖液和10pl的标准或样品加入包被的384孔板的各孔中，该板用Axyseal密封膜密封，并以3000RPM离心1分钟。分析板在25。C振摇条件下孵育2小时，清洗5次，并在倒置在纸巾上的同时以3000RPM离心1分钟。向各孔中加入20pl检测抗体试剂，板用Axyseal密封膜密封，并以3000RPM离心1分钟。分析板在25。C振摇条件下孵育1小时，清洗5次，并在倒置在纸巾上的同时以3000RPM离心1分钟。将30)dl洗脱缓冲液加入各孔中，板用Nunc可穿透密封带密封，并用滚筒确保紧密密封。分析板以3000RPM离心1分钟，并在25。C振摇条件下孵育l/2小时。立即进行分析步骤。可选择地，板在进行分析步骤前在4。C下储存48小时。来自EDTA处理的32名血库献血者全血的血清样品用于分析IL-6。结果采用该分析方案进行四次测量得到的典型IL-6标准曲线的数据如表18中所示。表18IL-6的标准曲线<table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table>IL-6的高和低浓度范围的线性化标准曲线分别如图15A-B所示。该分析使得能够检测低于0.5pg/ml的IL-6(图14A-B)、检测极限(LoD)计算为0.06pg/ml。分析的检测极限(LoD)通过向零标准重复实验的平均信号加上两个标准差并由标准曲线计算相应的IL-6浓度而确定。这一灵敏度水平即使对于0.5至1.0pg/ml之间的正常IL-6水平的才全测也是极佳的。进行4企测来自血库献血者全血样品的血清中的IL-6和IL-8的分析实验，分析的结果如图14C和D中所示。IL-6在100%的样品中(32/32)得到定量。IL-6的平均浓度为2.3pg/ml，且浓度范围为0.2至〉26pg/ml(图14C)。基本上采用用于IL-6的过程对相同样品进行IL-8分析实J5全。-使用IL-8标准品和IL-8特异性的抗体。建立IL-8的标准曲线(未显出)并用其确定样品中的IL-8浓度(图14D)。IL-8在100%(32/32)的样品中得到定量。IL-8的平均浓度为7.3pg/ml,且浓度范围为1.2至〉26pg/ml。IL-6或任何目标颗粒的测量可以通过将分析仪的检测方式从对分子进行计数(数字信号)转换为检测较高浓度分析物时产生的光子的总和(模拟信号)在低和高浓度下进行(图14A和B)。在图14E中显示了一般的途径。该单颗粒分析仪具有6个数量级的扩展的线性动态范围。增大检测样品中的颗粒浓度的动态范围的能力使得能够确定正常(较低浓度范围)和疾病(较高浓度范围)水平的颗粒浓度。正常和疾病水平的IL-6的检测范围如图15F中所示。权利要求1、一种用于检测样品中的单蛋白质分子的分析系统试剂盒，所述试剂盒包括分析仪和至少一种包含荧光结构和所述蛋白质分子的结合伴体的标记物，且其中所述分析仪包括a)用于激发所述荧光结构的电磁辐射源；b)供所述标记物穿过的毛细管流动池；c)用于在所述毛细管流动池中移动所述标记物的动力源；d)在所述毛细管流动池中形成的用于接收所述电磁源发射的电磁辐射的探询空间；和e)可操作地与所述探询空间连接的用于测量所述受到激发的荧光结构的电磁特征的电磁辐射检测器；其中，所述荧光结构能够在受到其激发波长的激光器发射的光的激发时发射至少约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。2、如权利要求1所述的分析系统，其中所述电磁辐射源是激光器，且其中所述激光器具有至少约3、5、10或20mW的功率输出。3、如权利要求1所述的分析系统，其中所述荧光结构包括荧光分子。4、如权利要求3所述的分析系统，其中所述荧光分子为染料分子。5、如权利要求4所述的分析系统，其中所述染料分子包括至少一个取代的吲哚総环系统，该吲哚鐵环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。6、如权利要求1所述的分析系统试剂盒，其中所述分析仪包括不超过一个探询空间。7、如权利要求1所述的分析系统，其中所述电磁辐射源是连续波电石兹辐射源。8、如权利要求7所述的分析系统，其中所述连续波电磁辐射源是发光二极管或连续波激光器。9、如权利要求1所述的分析系统，其中所述动力是压力。10、如权利要求1所述的分析系统，其中所述检测器是雪崩光电二极管检测器。11、如权利要求1所述的分析系统，进一步包括用于折射激光束到所述探询空间上和使所述激发的染料分子成像的共焦光学装置，其中所述共焦光学装置包括具有至少约0.8的数值孔径的物镜。12、如权利要求1所述的分析系统，进一步包括能够对多个样品进行自动采样并在样品容器和所述探询空间之间提供流体连通的采样系统。13、如权利要求1所述的分析系统，进一步包括与所述探询空间构成流体连通的样品回收系统，其中所述回收系统能够回收基本上所有所述样品。14、一种确定生物样品中是否存在单蛋白质分子的方法，包括用标记物标记所述分子和在单分子检测器中一全测所述标记物是否存在，其中，所述标记物包括能够在受到其激发波长的激光器发射的光激发时发射至少约200个光子的荧光结构，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。15、如权利要求14所述的方法，其中所述样品中所述单分子的检测极限小于约10、1、0.1、0.01或0.001毫微微摩尔。16、如纟又利要求14所述的方法，微微摩尔。17、如权利要求14所述的方法,述荧光结构发射的电磁辐射。18、如^l利要求14所述的方法,超过一个探询空间。其中所述检测极限小于约1毫其中所述的检测包括检测由所其中所述单分子检测器包括不19、如权利要求18所述的方法，进一步包括将所述焚光结构暴露于电磁辐射，其中所述电磁辐射由激光器提供。20、如权利要求19所述的方法，其中所述激光器以低于约20mW的功率输出激发所述结构。21、如权利要求20所述的方法，其中所述激光器激发所述结构持续时间小于约IOOO、250、100、50、25或10孩i秒。22、如权利要求14所述的方法，其中所述标记物进一步包括特异性结合所述分子的结合伴体。23、如权利要求22所述的方法，其中所述结合伴体是抗体。24、如权利要求14所述的方法，其中所述荧光结构包括荧光染料分子。25、如权利要求24所述的方法，其中所述染料分子包括至少一个取代的吲咮鐵环系统，该口引哚鐵环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。26、如权利要求24所述的方法，其中所述染料分子为选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor647、AlexaFluor680或AlexaFluor700的AlexaFluor分子。27、如权利要求24所述的方法，其中所述染料分子为AlexaFluor647染料分子。28、如权利要求24所述的方法，其中所述焚光结构包括多个AlexaFluor647染料分子。29、如权利要求28所述的方法，其中所述多个AlexaFluor647染料分子包括约2-4个AlexaFluor647分子。30、如权利要求14所述的方法，其中所述荧光结构是量子点。31、如权利要求14所述的方法，进一步包括测量样品中的所述蛋白质的浓度。32、如权利要求14所述的方法，其中所述的检测所述标记物是否存在包括(i)使一部分所述样品通过探询空间；和(ii)使所述探询空间暴露于电磁辐射，如果所述标记物存在的话，所述电磁辐射足以激发所述荧光结构发射光子；和(iii)检测在步骤(ii)的所述暴露过程中发射的光子。33、如权利要求32所述的方法，进一步包括检测所述探询空间中的背景光子水平，其中所述背景水平代表所述探询空间中没有标记物的情况下以步骤(ii)中的相同方式进行电磁辐射照射时所述探询空间的平均光子发射。34、如权利要求33所述的方法，进一步包括将步骤(iii)中检测的光子的量与阈光子水平比较，其中所述阚光子水平是所述背景光子水平的函数，其中步骤(iii)中检测的光子的量高于阈水平表明所述标记物的存在，而步骤(iii)中检测的光子的量等于或低于阈水平表明所述标i己物不存在。35、一种用于确定检测对象是否存在一种生物状态的方法，包括a)对来自所述对象的样品进行免疫分析，其中所述免疫分析包括将一种标志物的多个标记物结合到所述样品中的所述标志物的多个分子上，其中所述标记物对所述标志物是特异性的且其中一个标记物结合到一个标志物分子上，和其中所述标记物包括与焚光结构结合的抗体，该荧光结构能够在受到其激发波长的激光器发射的光激发时发射至少约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳；b)检测所述标记物，其中所述检测包括用单分子检测器检测单个标记物；和c)基于步骤b)中检测的标记物的数目测定所述样品中的所述标志物的浓度。36、如权利要求35所述的方法，进一步包括将步骤b)中获得的所述浓度与已知指示所述生物状态是否存在的所述标志物的浓度或浓度范围进行比较。37、一种用于检测生物分子的标记物，包括与焚光结构结合的所述生物分子的结合伴体，其中所述荧光结构能够在受到其激发波长的激光器发射的光激发时发射至少约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指？1到该点上的总能量不超过约3微焦耳，其中所述结构包括大约2到4个荧光体。38、如权利要求37所述的标记物，其中所述生物分子是蛋白质或小分子。39、如权利要求38所述的标记物，其中所述生物分子是蛋白质。40、如权利要求37所述的标记物，其中所述荧光体包括焚光染料分子。41、如权利要求37所述的标记物，其中所述荧光染料分子包括至少一个取代的吲哚総环系统，该吲哚鑰环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。42、如权利要求40所述的标记物，其中所述染料分子为选自AlcxaFl丽488、AlexaFl匿532、AlexaFl酉647、AlexaFluor680或AlexaFluor700的AlexaFl匿分子。43、如^f又利要求42所述的标记物，其中所述染一+分子为AlexaFluor647染料分子。44、如权利要求37所述的标记物，其中所述结合伴体是抗体。45、如权利要求37所述的标记蛋白，其中所述染料分子包括第一型和第二型染料分子。46、如权利要求45所述的标记蛋白，其中所述第一型和第二型染料分子具有不同的发射光谦。47、如权利要求46所述的标记蛋白，其中所述第一型与第二型染料分子的数目的比率为大约3:1、2:1、1:1、1:2或1:3。48、用于测定样品中的物质的浓度的分析仪，其中该分析仪能够在至少大约105的动态浓度范围上测定所述浓度。49、如权利要求48所述的分析仪，其中所述动态范围为从大约1毫微微摩尔到大约100皮摩尔。50、一种建立生物状态的标志物的方法，包括i)测定从第一群体获得的生物样品中所述标志物的浓度范围，其中所述测定包括通过4全观'j所述标志物的单个分子测定所述生物样品中所述标志物的浓度。51、如权利要求50所述的方法，其中所述第一群体是不表现出所述生物状态的群体。52、如权利要求50所述的方法，进一步包括测定从第二群体获得的生物样品中所述标志物的水平范围，其中所述第二群体的成员表现出所述生物状态，且其中所述测定包括通过检测所述标志物的单分子测量所述生物样品中所述标志物的水平。53、如权利要求52所述的方法，其中所述第一和第二群体是不同的。54、如权利要求52所述的方法，其中所述第二群体的至少一个成员是所述第一群体的成员，或者所述第一群体的至少一个成员是所述第二群体的成员。55、如权利要求54所述的方法，其中基本上所有第二群体的成员是已形成所述生物状态的第一群体的成员。56、如权利要求50所述的方法，其中所述检测所述标志物的单分子采用对所述标志物的检测极限小于样品中约1000、100、50、20、10、5、1或0.5毫微微摩尔的所述标志物的方法进行。57、如权利要求50所述的方法，其中所述生物状态是表型状态，影响生物体的状况，发育状态，年龄，健康状态，病变，疾病，疾病进程，疾病分期，感染，中毒，或对化学、环境或药物因子的反应(如药物响应表型、药物毒性表型或药物效力表型)。58、如权利要求57所述的方法，其中所述生物状态是病变。59、如权利要求50所述的方法，其中所述标志物是多肽或小分子。60、如权利要求57所述的方法，其中所述状态是疾病状态。61、如^L利要求60所述的方法，其中所述疾病状态选自癌症、心血管疾病、炎性疾病、自体免疫疾病、神经疾病、传染病和妊娠相关病症。62、如权利要求61所述的方法，其中所述状态是疾病分期状态。63、如权利要求62所述的方法，其中所述疾病分期状态是癌症分期状态。64、如权利要求57所述的方法，其中所述状态是治疗反应状态。65、如^L利要求64所述的方法，其中所述治疗是药物治疗。66、如^l利要求65所述的方法，其中所述反应选自治疗作用和副作用。67、如权利要求66所述的方法，其中所述反应是治疗作用。68、如权利要求66所述的方法，其中所述反应是副作用。69、如权利要求68所述的方法，其中所述副作用是不良反应。70、如权利要求50所述的方法，其中所述检测包括用包含荧光结构的标记物标记所述标志物，该焚光结构能够在受到其激发波长的激光器发射的光激发时发射至少约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指？1到该点上的总能量不超过约3微焦耳。71、如权利要求70所述的方法，其中所述焚光结构包括包含至少一个取代的。引哚鐵环系统的分子，该p引咮鐵环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质基团。72、如权利要求70所述的方法，其中所述焚光结构包括选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor647、AlexaFluor680或AlexaFluor700的染并牛。73、如权利要求70所述的方法，其中所述焚光结构包括AlexaFluor647。74、如^l利要求70所述的方法,述标志物的结合伴体。75、如权利要求74所述的方法，标志物特异性的抗体。76、如^^又利要求75所述的方法，77、如权利要求75所述的方法，其中所述标记物进一步包括所其中所述结合伴体包括对所述其中所述抗体包括多克隆抗体。其中所述抗体为单克隆抗体。78、如权利要求50所述的方法，进一步包括基于所述第一和第二范围确定所述标志物的阈水平，其中来自个体的生物样品中所述标志物的存在水平超过上述阈水平表明所述个体出现该生物状态的可能性大大增加。79、一种用于检测生物体的生物状态是否存在的方法，包括i)测量来自所述生物体的生物样品中标志物的浓度，其中所述标志物是通过权利要求50的方法建立的标志物；和ii)基于所述生物体中所述标志物的所述浓度确定所述生物状态是否存在。80、一种用于检测生物体的生物状态是否存在的方法，包括i)测量来自所述生物体的多个生物样品中标志物的浓度，其中所述标志物是通过权利要求50的方法建立的标志物；和ii)基于所述多个样品中所述标志物的所述浓度确定所述生物状态是否存在。81、如权利要求80所述的方法，其中所述样品为不同类型的样口口o82、如权利要求81所述的方法，其中所述确定是基于所述不同类型的样品中所述标志物的浓度的比较。83、如权利要求80所述的方法，其中所述样品是相同类型的，且其中所述样品是间隔一段时间采取的。84、如^又利要求50所述的方法，其中所述生物样品是血液、血浆或血清。85、一种商业方法，包括使用与生物体的生物状态相关的权利要求1的系统鉴别一种或多种标志物；及使所述的一种或多种标志物在诊断中商业化以检测所述生物体中所述生物状态是否存在。86、如权利要求85所述的商业方法，其中所述一种或多种标志物为多肽或小分子。87、如权利要求85所述的商业方法，其中所述一种或多种标志物为新的化学个体。88、如权利要求85所述的商业方法，其中所述商业方法进一步包括进行收费的诊断服务。89、如权利要求85所述的商业方法，其中所述商业方法进一步包括出售基于所述一种或多种标志物的诊断产品。90、一种商业方法，包括使用与生物体的生物状态相关的权利要求50的方法鉴别一种或多种标志物；及提供确定所述生物体是否具有所述生物状态的诊断服务。91、如权利要求90所述的商业方法，其中所述诊断服务是由CLIA认证的实验室提供的。92、如权利要求91所述的商业方法，其中所述诊断服务提供给保健服务提供商、保险商或病人。93、一种用于4全测标志物的标记物，其中所述标记物包4舌所述标志物的结合伴体和荧光结构，其中该荧光结构能够在受到其激发波长的激光器发射的光激发时发射至少约200个光子，其中激光聚焦于包含该结构的直径不小于约5微米的点上且其中由激光指引到该点上的总能量不超过约3微焦耳。94、如权利要求93所述的标记物，其中所述荧光结构包括菱光分子。95、如权利要求94所述的标记物，其中所述荧光分子包括多个荧光分子。96、如^L利要求95所述的标记物，其中所述标记物包括大约2-10、2-8、2-6、2-4、3-10、3-8、3-6个荧光分子。97、如权利要求96所述的标记物，其中所述标记物包括大约2-4个荧光分子。98、如权利要求97所述的标记物，其中所述荧光染料分子包括至少一个取代的吲咮総环系统，该吲哚鐵环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。99、如权利要求97所述的标记物，其中所述焚光分子选自AlcxaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor647、AlexaFluor680或AlexaFluor700。100、如权利要求97所述的标记物，其中所述荧光分子选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor680或AlexaFluor700。101、如权利要求93所述的标记物，其中所述结合伴体包括抗体。102、如^l利要求101所述的标记物，其中所述抗体为单克隆抗体。103、如权利要求102所述的标记物，其中所述抗体为多克隆抗体。104、如斥又利要求101所述的标记物，其中所述抗体为炎症标志物特异性的。105、如权利要求104所述的标记物，其中所述抗体是对选自趋化因子、生长因子、蛋白酶及抑制剂、细胞粘附分子、干细胞因子、信号转导和凋亡分子、神经营养因子和发育蛋白的标志物特异性的。106、如权利要求105所述的标记物，其中所述抗体是对生长因子特异性的。107、如权利要求101所述的标记物，其中所述抗体是对细胞因子特异性的。108、如^l利要求108所述的标记物，其中所述细;9包因子。109、如权利要求101所述的标记物，其中所述荧光结构包括荧光分子。110、如权利要求110所述的标记物，其中所述焚光结构包括多个荧光分子。111、如权利要求111所述的标记物，其中所述标记物包括大约2-10、2-8、2-6、2-4、3-10、3-8或3-6个荧光分子。112、如权利要求112所述的标记物，其中所述标记物包括大约2-4个荧光分子。113、如权利要求112所述的标记物，其中所述荧光染料分子包括至少一个取代的吲咮鑰环系统，该吲哚鐵环的3位碳上的取代基包含化学反应基团或偶联物质。114、如权利要求112所述的标记物，其中所述焚光分子选自AlexaFl匿488、AlexaFl露532、AlexaFluor647、AlexaFl匿680或AlexaFl匿700。115、如权利要求101所述的标记物，其中所述焚光分子选自AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor680或AlexaFl匿700。116、如权利要求101所述的标记物，其中所述荧光分子为AlexaFluor647分子。全文摘要本发明公开了高灵敏分子检测的方法、试剂盒和组合物。所述方法、试剂盒和组合物可用于测定样本中1毫微微摩尔、1微微微摩尔或更低水平的分子浓度。所述方法、试剂盒和组合物也允许测定大范围(如7个数量级的范围)的浓度而不需要进行样品稀释。文档编号G01N21/64GK101438146SQ200780016213公开日2009年5月20日申请日期2007年4月4日优先权日2006年4月4日发明者D·赫尔德,J·托德,P·戈伊克斯,R·利文格斯顿,R·普斯卡斯申请人:神谷来克斯公司