专利名称：：检测样品中的目标分子的制作方法
技术领域：
：本发明涉及检测样品中目标分子的存在的方法，且具体而言涉及包括使样品接触基板且随后在清洗步骤中清洗基板的方法，此外，本发明涉及准务測定的设备、在测定中检测目标分子的光学检测系统、根据该方法制作的基板以及进行测定的工具包.
背景技术：
：特定生物学分子(生物分子)的检测方法多种多样且本领域技术人员目前可以采用许多不同方法.特定生物分子的检测具有一系列重要的实际应用，包括用于诊断目的的基因识别。一般而言，诸如多核苷酸、DNA、RNA、细胞和抗体的生物样本("目标")的检测可以专门在例如所谓生物阵列(或微阵列)的阵列上进行，其中相应探针分子附着在该阵列上各种位置。目标-探针的例子包括DNA/RNA-寡核苷酸、抗体-抗原、细胞-抗体/蛋白质、激素受体-激素等。当目标结合或杂交到相应探针分子时，目标生物分子的检测可以通过各种光学、电子、甚至微机械方法来进行。检测结合在生物阵列上的分子的常用技术为荧光标记目标的光学检测，其中该荧光标记目标也已知为"标签"或"标记"。一般而言，标签可以是就其物理分布和/或其发出的信号强度而言是可检测的任何试剂。荧光剂被广泛使用，但是备选包括磷光剂、电致发光剂、化学发光剂、生物发光剂等，一般而言，发光检测的问题涉及将低强度的发光与通常高强度的照明非发光分离。发光检测的可靠性因此非常依赖于在分离过程中使用的光谱滤波器的光学特性。光谦滤波器功能可包括两级第一滤波器(称为"激发滤波器")，优选地透射波长与标签的激发光镨交叠的射线并阻挡波长位于检测窗口光详内的所有射线。第二滤波器(称为"发射滤波器"或"检测滤波器")优选地阻挡所有照明光且仅透射发光射线。典型滤波器组的衰减(阻挡能力)优于1(T6。为此，也可以考虑基板的光学属性.US2005/0048571公开了一种用于从生物阵列减小与光学检测相关的自动荧光的基板.在公开内容中，基板的多孔层使用着色剂来着色.然而着色基板的缺点为，这使得基板更为昂贵，并限制了可以使用的不同类型基板的数目.本发明的发明人已经意识到用于发光检测的改进手段是有益的，并因此提出了本发明.
发明内容本发明旨在提供一种诸如与进行生物测定相关的处理发光检测的改进方式，且优选地本发明个别或者任意組合地緩和、减轻或消除了一个或多个上述及其它缺点.本发明由独立权利要求限定。从属权利要求限定优选实施例.根据本发明的第一方面，提供了一种检测样品中目标分子的存在的方法.该目标分子可以是与荧光基团共轭的生物分子。辐射通常是在可见或近可见范围、在红外(IR)或在紫外(UV)范围的电磁辐射。在本发明的上下文中，措辞"荧光，，和"磷光"应广义地理解为由于下述过程形成的发射光，即光被分子或原子在特定波长吸收，随后在该受激发分子/原子的寿命之后在相同或不同波长发射。发射光经常是但无需限于可见光谱(VIS)、UV光谱和IR光谱，在一实施例中，通过使用辐射束照射基板且随后检测来自基板的所得发光束即目标分子的发光来检测该目标分子。被检测的辐射的发光部分可以是光致发光，特别是荧光或磷光。用于固定探针分子的基板可以是布置成用于分析生物目标的生物阵列。通常，该生物阵列可包括多个点位(spots),其中目标分子固定在这些点位中。在此上下文中，点位理解为具有特定延展的区域。点位可具有2D或3D配置。生物阵列可包括硅晶片、玻璃板、诸如尼龙、硝化纤维的多孔膜等。用于固定探针分子的基板的光学属性可以使得基板具有非常高的反射率。散射量特别取决于空气和基板之间的折射率差异。由于高反射率，入射辐射难以穿透基板，这减小了能够激发已经结合到基板、特别是位于基板内的荧光基团的入射辐射量.此外，由于高反射率，大部分反射光在一些配置中会被反射向检测器.本发明具体地但非专有地优选地用于减小基板的反射率.通过在清洗步骤期间使用折射率基本匹配的流体，基板的反射率可以大幅减小.此外，穿透基板的光量将增加，导致入射辐射与发光辐射的比例的改善.在优选实施例中，冲洗液的折射率在基板折射率的+/-10%范闺内.原则上，获得尽可能好的折射率匹配是优选的，不过至少在给定探针和/或目标分子和/或基板需要特定类型寸洗液的情形中，是有利的.冲洗液折射率相对于基板折射率的匹配可以优于+/-8%，+/-6%，+/-4%，+/-2%,在优选实施例中，冲洗液为糖(蔗糖)在水中的水溶液，其中糖的重量百分比为50%至80%。蔗糖的水溶液可能是优选的，因为许多荧光基团共轭物容易溶解在这种流体中。本发明的实施例优选地可以使用多孔基板来应用，因为来自基板的高反射对于多孔基板而言由于孔的散射而更成问题。在本发明的方法的实施例中，目标分子为与荧光基团共轭的生物分子。在本发明的方法的实施例中，基板为使用探针分子准备的生物阵列，目标分子化学结合到存在于基板中的探针分子。在各种优选实施例中，可以在从辐射源到检测器的光束路径中引入辐射滤波器、镜以及可能的其它光学部件.例如，通过使用輻射束照射基板且随后检测来自基板的所得光束来检测目标分子。所得光束可以透射穿过基板，或者从基板反射。在一实施例中，第一辐射滤波器(2)引入在辐射源(36)和基板(3，30-32)之间的光束路径中.在一实施例中，第二辐射滤波器(4)引入在基板(3,30-32)和检测器(35)之间的光束路径中。在一实施例中，该光束路径还包括二向色镜(5)。本发明的方法优选地例如可以通过在依据本发明其它方面的设备或检测系统中实施该方法而至少部分地自动化.在第二方面，本发明涉及用于准备测定的设备.在第三方面，本发明涉及在测定中用于检测目标分子的光学检测系^*o本发明的第二和第三方面可以提供用于检测样品中一种或多种生物目标即目标分子的存在以及可选的数量的设备和检测系统.该系统可检测包括但不限于多核苷酸、DNA、RNA、细胞和抗体的目标。生物检测系统经常十分复杂，且本发明在提供收集数据的可靠性高的系统方面是有益的.在第四方面，本发明涉及依据第一方面的方法制作的基板.在第五方面，本发明涉及用于进行测定的工具包.一般而言，本发明的各个方面可以在本发明范围内按照任何可能方式来组合和结合.本发明的这些和其它方面、特征和/或优点将从下述实施例变得显而易见并得以阐述。本发明的实施例将参考附图仅示例性地予以描述，其中图1示意性示出光学设置的两个总体实施例；图2示出图1B的设置的光谱特性以及Cy5染料的光详；图3示出检测样品中目标分子的存在的方法的实施例；图4示出蔗糖水溶液的折射率n和重量百分比p的函数的曲线图，具体实施例方式在生物研究和医疗诊断中，许多生物标记借助于所附着的荧光标签而被检测。通常使用的设备为焚光扫描器或显微镜，但是对于特定应用，基于相同检测原理制作专用设备，在本发明总体实施例中，使用一光学设置，其中应用了至少两个光谱滤波器。图1示意性示出两个总体实施例.图1A示出透射模式下的荧光检测装置的示意图，其中所得光束透射穿过基板，而图1B示出反射模式下的荧光检测装置的示意图，其中所得光束从基板反射.在图1A和1B中，光束1A、1B发射向基板3。应用光谦滤波器，从而将所得荧光光束与照明非荧光分离。光谦滤波器功能由两级组成第一辐射滤波器2(称为"激发滤波器，，)被引入在轎射(光)源和基板之间的光束路径中.激发滤波器优选地透射波长与标签的激发光谦交叠的射线并阻挡波长位于检测窗口光谦内的所有射线.第二辐射滤波器4(称为"发射滤波器"或"检测滤波器")被引入在光束路径中，该发射滤波器优选地阻挡或者至少基本抑制照明光且仅透射荧光射线.典型滤波器组的衰减(阻挡能力)优于10-6.在图IB中还应用了分束器5,该分束器例如可以^板不透明的情形下被应用.在备选实施例中，可以应用二向色镜来代替分束器，二向色镜反射低于特定波长的激发光并透射大于该波长的光.二向色镜因此也可以用作发射滤波器4，分离的发射滤波器仍可以使用以提高性能，但不是必须的.在一实施例中，基板可以被许多高功率LED(诸如2至10个红色LED)照射，暗场设置可以应用。得到的光由CCD相机(未示出)检测，其中发射滤波器安装在相机前面。作为荧光基团的示例，可以使用染料Cy5。基板3可以通过任意合适的基板(诸如在生物测定中使用的生物阵列基板)准备方式来准备。一种典型的阵列测定方法涉及将探针分子固定在基板上的离散位置。包括与所附着探针结合的目标分子的溶液在下述条件下置为接触结合探针，即这些条件足以促进溶液中的目标结合到基板上的互补探针以形成结合到基板表面的结合复合物.该生物阵列可具有微米量级或甚至毫米量级的尺寸。生物阵列上具有相异杂交特性的不同点位的数目在当前阵列上可以从约1每平方毫米变化到1000每平方毫米甚至更高，例如高达106点位每平方毫米.通常相同的探针分子固定在阵列上的点位内。图2示出图1B设置的可能涉及的光语特性的实施例以及Cy5染料的光谦，图2是利用可从OmegaOptical网站(www.omegafilters.com)获得的Curv-o-matic在线应用而产生的。图2示出对于Omega滤波器组XF110-2，所涉及光谱的单位为百分比的透射率T与单位为纳米的波长X的函数。图2示出激发峰值在649nm的Cy5激发光谦20以及发射峰值在670nm的相应发射光谱21。每个光子的照射波长和荧光波长之间的差异称为"斯托克斯频移".Cy5的斯托克斯频移为21nm.激发滤波器为Omega630AF50激发滤波器，其呈现用22表示的光谱(带宽50nm，中心在630nm).发射滤波器为Omega695AF55发射滤波器，其呈现用23表示的光谦(带宽55nm，中心在695nm),二向色镜选择为使得用24表示的二向色镜光谦是反射激发輻射波长的入射光，而透射所得到的经斯托克斯频移的光的光谦.特定滤波器组和二向色镜作为示例提供，但不一定应用于所有实施例中.例如，如结合固1B所述，可以在使用二向色镜时配备发射滤波器.表1示出实验结果，其中多孔尼龙基板(NytranN和NytranSPC)3的光学属性被测量.使用650nm入射波长照射基板且随后检测来自基板的所得光束来进行该实验。进行了两种类型的实验，一种使用干基板，一种使用在清洗步骤中暴露于水的基板.表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从表1可以看出，基板具有非常高的反射率，特别是干基板。这种高反射率的原因是由于基板高多孔性引起的散射.散射量取决于空气和基板之间折射率差异。与空气相比，水的折射率更为接近基板的折射率。这是湿基板反射低于干基板的原因.依据本发明，在测定的清洗步骤期间应用折射率基本匹配的流体，且基板的反射率因此可以大幅减小直至5%的典型值.与水作为冲洗液相比，激发强度的改善至少为3倍，不过与干基板相比可以高达20倍。与水相比，激发辐射与荧光辐射的比例的改善至少为14倍，与干基板相比可高达19倍.图3示出依据本发明检测样品中目标分子的存在的方法的实施例，其中生物阵列使用清洗步骤来准备.困3A至3C说明至少部分涉及的步骤，在图3A步騍之前的步骤中，使用与荧光基团共轭的目标生物分子准备样品流体.在图3A的步稞37中，通过使样品流体流过基板30而使样品6接触基板30，致使具有荧光基团的目标生物分子附着到基板上的特定结合位置*应理解，目标分子例如可以通过应用来省脉动喷射的液滴淀积或者通过其它合适手段以备选的方式接触到基板.在准备步骤期间，不是所有荧光基团均预期结合到探针分子，这意味着除了已经结合到基板30的荧光基团之外，还存在未附着到基板而仍存在的非结合的荧光基团.应用清洗步骤38以除去或者至少稀释任何非结合的荧光基团共轭物，仅在基板上留下结合的荧光基团共轭物，如图3B所示。在该步骤期间，清洗液7被挤压通过基板31。在本发明中，清洗液7选择为使得该冲洗液的折射率基本匹配基板31的折射率。图3C示出目的是检测基板上所得的结合复合物存在的检测步骤39，该检测步骤已经结合图1予以描述.由于在清洗步骤中^f吏用折射率基本匹配的流体(图3B),基板32的反射率已经显著减小，改善了检测步骤的灵敏度。该检测通常紧接着清洗步骤，使得基板仍是湿的.在本发明不同实施例中，可以使用不同的折射率匹配流体。在一个实施例中，可使用油，作为合适的油的示例，可以使用在23'C时n-1.518的Zeiss1mmersol518F。在其它实施例中，可以应用致密材料的水溶液，在特定实施例中，使用糖的水溶液。优选使用60%至70%糖(蔗糖等)的溶液，由此获得1.45的折射率(见图4,其示出蔗糖水溶液的折射率n与重量百分比p的函数)。蔗糖水溶液可以是优选折射率匹配流体，因为荧光基团共轭物容易溶解在这种流体中，使得该流体对于清洗步骤和检测步骤均是合适的.应理解，在备选实施例中，可以应用附加的清洗步骤，这些附加清洗步骤可以应用以不同或相同的冲洗液，对于不同清洗步骤使用不同冲洗液的情形，至少最后清洗步骤使用与基板折射率基本匹配的冲洗液来执行。图3的步骤以及可能的附加步骤可以在用于准备测定的设备和/或光学检测系统中以自动或半自动的方式来进行.这些设备和系统可包括用于容纳基板的处理单元33以及用于对基板执行清洗步骤的清洗单元4。处理单元和清洗单元可以实施于同一单元内，或者样品可以在单元之间移动，光学检测系统的实施例还包括诸如一个或多个激光二极管的辐射源36以及诸如CCD的辐射检测器35.还提供了用于目标检测测定的工具包，该工具包至少包括与基板折射率基本匹配的冲洗液以及用于使用该冲洗液的指令.该；具包还可包括在实施目标检测测定时使用的一个或多个附加部件，诸如一个或多个基板、样品准备试刑、緩冲液、标签等.供使用的指令可以以纸格式来提供，可以记录在合适记录介质上，可以以如何经由远程源例如英特网访问该指令的指示形式来提供，等等.尽管已经结合具体实施例描述了本发明，本发明并不旨在限于此处所述具体形式，相反，本发明的范围仅由所附权利要求限定。在权利要求书中，措辞"包括"不排除其它要素或步骤的存在.此外，尽管在不同权利要求中包括单独的特征，这些特征可以有利地组合，且包括在不同权利要求中并不意味着特征的组合不可行和/或不优选。此夕卜，单数引用并不排除存在多个。因此，对"一"、"一个"、"笫一"、"第二"等的引用并不排除多个。此外，权利要求书中的参考符号不应理解为限制范围。权利要求1.检测样品中目标分子的存在的方法，所述方法包括(a)使所述样品(37)接触基板，所述基板上固定有特定地结合到所述目标分子的探针分子；(b)在清洗步骤中通过冲洗液清洗所述基板(38)，从而除去或稀释非结合的目标分子；(c)检测所述基板上所得结合复合物(39)的存在以确定所述目标分子是否存在于所述样品中；其中所述冲洗液的折射率基本匹配于所述基板。2.权利要求l所述的方法，其中所述冲洗液的折射率在所述基板折射率+10%到所述基板折射率-10%的范围内.3.权利要求1所述的方法，其中所述沖洗液为糖在水中的水溶液，其中糖的重量百分比为50%至80%。4.权利要求1所述的方法，还包括在所述清洗步骤(b)之前的至少一个附加清洗步骤。5.权利要求l所述的方法，其中所述基板为多孔基板。6.权利要求l所述的方法，其中所述目标分子化学结合到存在于所述基板中的所述探针分子。7.权利要求l所述的方法，其中所述目标分子的存在是通过检测所述目标分子的发光来检测。8.用于准备测定的设备，所述设备包括处理单元(33)，用于容纳基板以及用于使样品与所述基板(3，30-32)接触，所述基板上固定有特定地结合到目标分子的探针分子；清洗单元(35),用于使用冲洗液对所述基板进行清洗步骤，从而除去或稀释非结合的目标分子，所述沖洗液的折射率基本匹配于所述基板。9.在测定中用于检测目标分子的光学检测系统，所述检测系统包括处理单元(33),用于容纳基板以及用于使样品与所述基板接触，所述基板上固定有特定地结合到目标分子的探针分子；清洗单元(34)，用于使用冲洗液对所述基板进行清洗步骤，从而除去或稀释非结合的目标分子，所述冲洗液的折射率基本匹配于所述基板;检测器(35,36),用于检测所述基板上所得结合复合物的存在以确定所述目标分子是否存在于所述样品中.10.用于进行测定的工具包，所述工具包包括冲洗液，所述冲洗液的折射率基本匹配于基板；用于在权利要求1所述方法中使用所述冲洗液的指令.全文摘要本发明涉及检测样品中目标分子的存在，其中该样品与基板接触，该基板随后在清洗步骤中清洗。具体而言，本发明涉及检测样品中目标分子的存在的方法，该方法包括(a)使该样品(37)接触基板，该基板上固定有特定地结合到该目标分子的探针分子；(b)在清洗步骤中通过冲洗液清洗该基板(38)，从而除去或稀释非结合的目标分子；(c)检测该基板上所得结合复合物(39)的存在以确定该目标分子是否存在于该样品中。该冲洗液的折射率基本匹配于该基板。文档编号G01N33/543GK101548186SQ200780039684公开日2009年9月30日申请日期2007年10月19日优先权日2006年10月24日发明者D·J·W·克伦德,H·R·斯塔珀特,M·M·J·W·范赫尔彭申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司