一种用于药物毒性研究的模式生物法的制作方法

专利名称：：一种用于药物毒性研究的模式生物法的制作方法
技术领域：
：本发明涉及药物的毒性研究领域，涉及应用模式生物斑马鱼进行药物毒性研究的方法。具体指用模式生物斑马鱼进行雷公藤甲素、苦参碱及大黄素等化合物的毒性研究。本方法可作为快速进行药物毒性研究的新方法。
背景技术：
：药物具有安全、有效及质量可控性，三者不可或缺。如果药物安全性存在问题，则其毒性会给病人造成损害，甚至引起严重毒性反应。据报道，最近40年来，由于严重的不良反应，美国2.9。/。上市新药被FDA撤出市场，1993年以来有7个新药上市后造成IOOO多例患者死亡而被迫撤市。我们知道，是药三分毒，用之得法，毒药亦救人，反之，良药也害人，所谓"大黄救人，人参杀人"S卩指此而言。安全性很高的药如黄芪、山药、银耳等虽使用广泛，但一般只能作为辅助用药。而中药中凡有毒者，多有奇效。在这个前提下，对有毒中药的毒性评价研究就显得愈加的重要。例如，龙胆泄肝丸引起肾衰，马兜铃致癌作用，雷公藤疗效确切却会引起肝肾等毒性。故研究药物的毒性对保证临床用药安全具有十分重要的意义。药物毒性研究常包括体内(动物)和体外(细胞、分子等)试验。体内毒性试验常采用小鼠、大鼠、犬等动物进行，主要评价方式有短期的急性毒性(12周)和长期毒性(19月)研究。其中体内毒性试验一般能较准确地反映药物的安全性，但试验一般周期长，药物用量大，不利于少量药物的快速毒性筛选。体外毒性研究多采用细胞、分子等，方法简单、条件可控，适用于药物毒性的快速初筛，但离体细胞、分子等难以精确地模拟在体过程，试验结果常出现假象。因此，建立一种既能较好的模拟在体过程，又能快速简单地预测药物毒性的毒性研究方法具有重要意义。斑马鱼是一种极好的模式生物，是取代青蛙、果蝇、小白鼠等作为研究对象的优良试验模式鱼。斑马鱼喂养和维持的费用更便宜，所需空间场地不大，易于室内大规模繁殖。成体鱼长34cm，一次交配能获得100200个胚胎，每周产卵一次，这样中等规模的鱼缸每年就能养殖成鱼数百万只，成本仅为养小鼠的0.1%-1%。斑马鱼同人类基因的相似度与小鼠相当，且在蛋白质水平上，其关键部位的同源性几乎是100%,所以可用斑马鱼模拟人类疾病[P.Goldsmith,CurrOpinPharmacol,4，504-12(2004)]。目前，人们已成功的用斑马鱼建立许多人类疾病模型，如神经系统、循环系统、听觉、视觉、癌症等方面的疾病[S.SumanasandS.Lin,DDT:TARGETS,3,89-96(2004).]。斑马鱼己在国外成为一种热门的药学研究工具，如用斑马鱼建立疾病模型，进行药物活性成分的高通量筛选及药物代谢的研究。国内对斑马鱼的研究主要限于发育遗传学方面，尚未见在药学、特别是毒理学研究方面的应用。我们拟用斑马鱼研究雷公藤甲素等化合物的毒性，从而建立一种研究药物毒性的快速、简单的模式生物新方法。
发明内容本发明的目的在于建立一种能够用模式生物斑马鱼研究药物毒性的新方法。本发明的另一目的在于将本发明的模式生物法用于研究雷公藤甲素、苦参碱、大黄素等化合物的毒性研究、。本发明是这样实现的给药方法与小鼠、大鼠、犬等哺乳动物不同，斑马鱼的体积较小，口服或注射给药方式很困难，国内尚未有相应的给药器。如能将药物溶解于斑马鱼所生活的水中，则斑马鱼会自主连续的从溶液中吸收药物，通过调节水中药，勿浓度来改变给药剂量，药物对斑马鱼的作用将随着药物浓度的变化而变化，此法简单可行。药物的毒性评价斑马鱼体积小，成体鱼长约34cm，其体内脏器更小，用肉眼难以区分，故取脏器观察病变的可行性存在问题。但实验中发现，随着药物浓度的增加，斑马鱼在一定时间内的死亡率增加，说明产生毒性的药物浓度与斑马鱼的死亡率相关，可用致死量表示药物的毒性，且观察斑马鱼的生与死的生理指标较其它指标更明显、客观、容易掌握，并可在相同条件下重复进行实验。可借鉴哺乳动物急性毒性研究中，用半数致死量(LD5Q)来衡量药物的毒性强度。LD5o是评价一个药物毒性大小的重要标志，值大表明药物毒性小，反之，LD^值小则表明其毒性大。实验方案取斑马鱼成体鱼100200条，分别置于含有3050mL溶液的瓶中，保持瓶中溶液温度基本恒定在2225'C，随机分成数组，每组含1020条。其中1组为纯净水(空白)，其它数组为不同浓度的药液。如果药物的水溶性不好，可加入0.5。/。2。/。二甲基亚砜(DMSO)助溶，此时需要增加一组溶剂对照组，即在纯净水加入0.5%2%DMSO。记录不同浓度药液中斑马鱼在24h内的死亡数量(只)，计算死亡率(％)。根据实验结果，采用Bliss法计算LD5o值。具体实施例方式实施例一用模式生物斑马鱼研究雷公藤甲素的毒性--LDso值的测定。受试药物雷公藤甲素；来源中国医学科学院协和医科大学皮肤病研究所(江苏，南京)；理化性状白色粉末；含量94%;配制方法根据所需浓度称取雷公藤甲素溶于100%DMSO中，再按0.5%比例将雷公藤甲素DMSO溶液稀释于超纯水中。动物斑马鱼，由南京大学模式生物研究所提供。试剂二甲基亚砜(DMSO)购自上海凌峰化学试剂有限公司，超纯水取自Millipore超纯水机。实验方法取斑马鱼120条，分别置于盛有50mL溶液的广口瓶中，随机分成8组，每组含15条，分别为纯净水对照组，纯净水+DMSO对照组和含雷公藤甲素浓度依次为18.00xl0'3，10.80x10-3,6.48x10-3，3.89xl(T3，2.33xl0'3，1.40xlO-3^ig/mL的给药组，记录24h内各不同药液浓度组斑马鱼的死亡数(只)，计算死亡率(％)。采用Bliss法计算LDso值。实验结果样品齐糧(|ig/mL)死亡鱼只数(条)死亡率(°/o)LD50(吗/mL)纯净水组-00-纯净水+0.5%DMSO组-00-雷公藤甲素组18.00xl0—315100.010.80xlO-31493.36.48xlCr33.89xl0-31066.733.35.39xlOg/mL2.33xl(T316.71.40xl0.300实验结果表明，空白对照组(纯净水及纯净水+0.5。/。DMSO)无斑马鱼死亡；但雷公藤甲素组斑马鱼的死亡率与药物浓度相关，采用Bliss法计算其LD5o值为5.39xl(T、g/mL，可客观的反应该药物的毒性。实施例二用模式生物斑马鱼研究苦参碱的毒性--LDso值的测定。受试药物苦参碱；来源江苏天晟药业有限公司；理化性状淡黄色粉末；含量98%;配制方法根据所需浓度称取苦参碱溶于100%DMSO中，再按0.5°/。比例将苦参碱DMSO溶液稀释于超纯水中。动物斑马鱼，由南京大学模式生物研究所提供。试剂二甲基亚砜(DMSO)购自上海凌峰化学试剂有限公司，超纯水取自Millipore超纯水机。实验方法-取斑马鱼105条，分别置于盛有50mL溶液的广口瓶中，随机分成7组，每组含15条，分别为纯净水对照组，纯净水+DMSO对照组和含苦参碱浓度依次为150.0，127.5，108.4，92.1，78.3吗/mL的给药组，记录24h内各不同药液浓度组斑马鱼的死亡数(只)，计算死亡率(％)。采用Bliss法计算LD5o值。实验结果样品剂量(吗/mL)死亡鱼只数(条)死亡率(％)LD50(|ng/mL)纯净水组-00-纯净水+0.5%DMSO组-00-苦参碱组150.015100.0127.51280.0跳4640.0112.392.116.778.300实验结果表明，空白对照组(纯净水及纯净水+0.5MDMSO)无斑马鱼死亡；但苦参碱组斑马鱼的死亡率与药物浓度相关，采用Bliss法计算其LDso值为112.3pg/mL，可客观的反应该药物的毒性。实施例三用模式生物斑马鱼研究大黄素的毒性—LD5。值的测定。受试药物大黄素；来源瑞雷植化制剂厂(中检所标准品提供单位)；理化性状黄色粉末；含量98%;配制方法根据所需浓度称取大黄素溶于100%DMSO中，再按0.5%比例将大黄素DMSO溶液稀释于超纯水中。动物斑马鱼，由南京大学模式生物研究所提供。试剂二甲基亚砜(DMSO)购自上海凌峰化学试剂有限公司，超纯水取自Milliporc超纯水机。实验方法取斑马鱼105条，分别置于盛有50mL溶液的广口瓶中，随机分成7组，每组含15条，分别为纯净水对照组，纯净水+DMSO对照组和大黄素浓度依次为2.0x103，L4xl03，0.98x103，0.67x103，0.48xl。WmL的给药组，i己录24h内各不同药液浓度组斑马鱼的死亡数(只)，计算死亡率(％)。采用Bliss法计算LDso值。实验结果:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实验结果表明，空白对照组(纯净水及纯净水+0.5。/。DMSO)无斑马鱼死亡；但大黄素组斑马鱼的死亡率与药物浓度相关，采用Bliss法计算其LD5o值为1.08x10、g/mL,可客观的反应该药物的毒性。实施例结果表明，用斑马鱼测定药物的LD5o值的方法简单、快速、客观，是一种快速研究药物毒性的新方法。权利要求1、一种应用模式生物斑马鱼进行药物毒性研究的方法取斑马鱼成体鱼100～200条，分别置于含有30～50mL溶液的瓶中，随机分成数组，每组含10～20条，其中1组为纯净水空白组，其它数组为不同浓度的药液，如果药物的水溶性不好，可加入0.5％～2％二甲基亚砜助溶，此时需要增加一组溶剂对照组，即在纯净水中加入0.5％～2％二甲基亚砜，记录不同浓度药液中斑马鱼在24h内的死亡个数，计算死亡率，以百分比表示，根据实验结果，采用Bliss法计算半数致死量LD50值，用LD50值反映药物的急性毒性。2、权利要求l的方法，其中药物可以是雷公藤甲素，苦参碱或大黄素等化合物。全文摘要一种应用模式生物斑马鱼进行药物毒性研究的方法取斑马鱼成体鱼100～200条，分别置于含有30～50mL溶液的瓶中，保持瓶中溶夜温度基本恒定在22～25℃，随机分成数组，每组含10～20条鱼。其中1组为纯净水(空白)，其它数组为不同浓度的药液。如果药物的水溶性不好，可加入0.5％～2％二甲亚砜(DMSO)助溶，此时需要增加一组溶剂对照组，即在纯净水加入0.5％～2％DMSO。记录不同浓度药液中斑马鱼在24h内的死亡数量(只)，计算死亡率(％)。根据实验结果，采用Bliss法计算半数致死量-LD₅₀值，用LD₅₀值反应药物的急性毒性。用此方法测定雷公藤甲素、苦参碱和大黄素斑马鱼的LD₅₀依次为5.39×10^-3、112.3和1.08×10³μg/mL。本方法可客观的反应药物的毒性。文档编号G01N33/15GK101216471SQ200810019040公开日2008年7月9日申请日期2008年1月10日优先权日2008年1月10日发明者张陆勇,斌舒,韦英杰申请人:中国药科大学