专利名称：一种基于微间隙阵列电极的酶催化电导免疫传感器及其检测传染性病毒的方法
技术领域：
本发明属于生物分析领域，具体涉及一种基于微间隙阵列电极的免疫传 感器，以及利用该免疫传感器检测传染性病毒的方法。
技术背景传染病是由病原微生物和寄生物感染人体后产生的有传染性的疾病。它 可在人群中快速传播并造成流行，对人类的生命和健康造成极大危害。如何 有效应对各种急慢性传染病的暴发、流行和传播，已成为当今世界各国政府 所关注的重大问题之一。目前对传染性病毒的免疫检测方法主要有酶联免疫吸附分析(ELISA)及胶体金免疫层析技术。这些方法虽然比较快速、简便，但是只能实现定性或半定量的检测，无法准确测定浓度，更重要的是这些方法不够灵敏，不能对传染性疾病进行最早期的诊断，以便采取更及时的措施防止传染病的扩散。因此，很有必要开发一种更快速、更灵敏的传染病免疫诊断技术。 发明内容本发明的目的在于，为克服传统传染性疾病免疫检测方法灵敏度低、不 能准确定量的不足，提出一种基于微间隙阵列电极的酶催化电导免疫传感器 及其用于检测传染性疾病的方法，用于检测传染性疾病具有高灵敏、快速、 低成本的特点。本发明的技术方案之一是，所述基于微间隙阵列电极的酶催化电导免疫传感器采用微间隙阵列金电极做基片，并采用以下步骤制得(1) 取常规光刻印刷法制作的微间隙阵列金电极做基片，它为叉指式 双电极，正负电极均为两个梳形金电极，彼此交叉组成微间隙阵列金电极； 梳形齿Di宽为1(im—100fim，间隙02为l|um—100|Lim (参见图1);(2) 微间隙阵列金电极的硅垸化处理，过程是a. 将微间隙阵列金电极用无水乙醇清洗三次，每次lmin;b. 将所述电极浸入l M的NaOH溶液中28min—32min，再用超纯水清 洗该电极三次，每次lmin;吹干；c. 将所述电极浸入含氨丙基三甲氧基硅垸5% (体积百分数)的乙醇溶 液中，室温下静置23小时一25小时；这样可在微间隙阵列金电极间的基片 上形成一氨基硅垸自组装单层；d. 用超纯水清洗所述电极三次，吹干，即获得硅垸化的微间隙阵列金电极；(3) 免疫传感器的制备，步骤是a. 将所述硅垸化的微间隙阵列金电极浸入质量分数为5%的戊二醛水 溶液，室温下静置0. 8小时一1. 2小时；b. 用超纯水清洗所述电极三次后，在该电极上滴加3(^L传染性病毒 的重组抗原溶液(双抗原夹心法)或传染性病毒的特异抗体溶液(双抗体夹 心法)，所述溶液中的重组抗原或特异抗体浓度为10(Vg/mL，所述溶液系将 所述重组抗原或特异抗体溶于0. OIM、 pH 7. 4磷酸缓冲溶液中，室温下静置 反应1小时而得；这样使得重组抗原或特异抗体通过戊二醛交联剂固定在微 间隙阵列金电极的基片上；c. 用超纯水清洗所述电极三次，吹干，即得免疫传感器，保存于4°C备用。本发明的技术方案之二是，采用所述基于微间隙阵列电极的酶催化电导 免疫传感器检测传染性病毒的方法，其步骤是(1)将20pL感染传染性病毒的血清或正常血清样品溶液与2(VL碱性磷酸酶标记的重组抗原(双抗原夹心法)或碱性磷酸酶标记的特异抗体(双 抗体夹心法)溶液混合，滴加在电极上，于室温下静置反应0.5小时；重组 抗原或特异抗体浓度为1(Vg/mL，它是将所述重组抗原或特异抗体溶于 O.OIM、 pH 7.4磷酸缓冲溶液而得；碱性磷酸酶标记的重组抗原或特异抗体通过感染血清中的抗体或病毒产生的抗原与固定化的重组抗原或特异抗体发生夹心反应而被捕获到传感器表面上；(2)将所述传感器置于银沉积溶液中，该银沉积溶液系将lmM抗坏血 酸磷酸酯、2mM AgN03溶于0. 1M甘氨酸-NaOH缓冲溶液而得，溶液pH9.0; 室温下静置反应8min—12min;再从该电极获取与传染性病毒抗原或抗体浓 度相关的电导或电阻信号。该步骤(2)中，传感器表面上碱性磷酸酶催化其底物抗坏血酸磷酸酯 水解产生还原剂抗坏血酸，后者将溶液中银离子还原成银金属并沉积在微间 隙阵列金电极上，使微间隙阵列金电极正负电极部分导通，从而增大微间隙 阵列金电极的电导(或降低电阻)，获得与血吸虫抗体浓度相关的电导(或 电阻)信号。本发明为一种基于微间隙阵列电极的酶催化电导免疫传感器及其用于检测传染性病毒的方法，它的优点有1. 微间隙阵列电极制备简单，可大批量、低成本生产；2. 检测步骤简单，检测时间在lh内，检测所需的仪器可用万用电表 或自行研制的电阻量测装置，便携且价格低廉；3. 本免疫传感器灵敏度高，可实现10fg/mL传染性病毒抗体或抗原的 检测，且背景干扰很小，可实现传染病的最早期诊断。
图l是微间隙阵列电极图样(黑色区域为金膜，白色区域为裸露的基片)。 掩膜图样与此相反(黑色区域为透明区，白色区域为不透明区)。它为叉指 式双电极，正负电极均为两个梳形金电极，彼此通过微米级绝缘间隙交叉组成阵列式金电极。正负电极的梳形齿数5至20个，宽为lpm—10(^。电极间隙为lnm—100拜。
具体实施方式
实施例1:基于微间隙阵列电极的免疫传感器检测人免疫缺乏病毒(HIV)抗体1. 免疫传感器的制备将微间隙阵列金电极用无水乙醇(100%)清洗三次(每次lmin)后， 将电极浸入1 M的NaOH溶液中30min;再用超纯水清洗电极三次(每次lmin)， 吹干；然后，将电极浸入含氨丙基三甲氧基硅垸5% (体积百分数)的乙醇溶 液中，室温下静置24小时；用超纯水清洗三次后吹干，获得硅烷化的微间 隙阵列金电极。将硅垸化的微间隙阵列金电极浸入戊二醛水溶液(质量分数5%)，室温 下静置1小时;用超纯水清洗三次后，在电极上滴加3(VL基因重组的HIV-1+2 抗原溶液(溶液的抗原浓度为10(^g/mL，系将所述抗原溶于0. OIM、 pH7.4 磷酸缓冲溶液而得)，室温下静置反应l小时；用超纯水清洗三次后吹干备 用。2. 人血清样品的检测将人血清样品(20pL)与碱性磷酸酶标记的基因重组的HIV-l+2抗原溶 液(2(VL，酶标抗原浓度为1(Vg/mL，该酶标抗原溶液系将所述抗原溶于 O.OIM、 pH 7.4磷酸缓冲溶液而得)混合，滴加在电极上，于室温下静置反 应0. 5小时；将传感器置于银沉积溶液(该银沉积溶液系将lmM抗坏血酸磷 酸酯、2mM AgN03溶于0. 1M甘氨酸-NaOH缓冲溶液而得，溶液pH9. 0)中， 室温下静置反应10min;然后，将免疫传感器正负极分别与电化学工作站(CHI 760C)的工作电极与对电极(参比电极与对电极复合)连接，采用线性扫描 伏安法在0 50mV电位范围检测，记录传感器电流随电位变化的响应曲线， 并计算其斜率(即电导值)。使用所研制的人免疫缺乏病毒免疫传感器如上法对7个HIV感染人血清样品和3个正常血清样品进行测定。与胶体金免疫层析方法对照，两种方法 的符合率达到100%，没有出现假阳性和假阴性结果。实施例2:基于微间隙阵列电极的免疫传感器检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)1. 免疫传感器的制备将微间隙阵列金电极用无水乙醇(100%)清洗三次(每次lmin)后， 将电极浸入1 M的NaOH溶液中30min;再用超纯水清洗电极三次(每次lmin)， 吹干；然后，将电极浸入含氨丙基三甲氧基硅垸5% (体积百分数)的乙醇溶 液中，室温下静置24小时；用超纯水清洗三次后吹干，获得硅烷化的微间 隙阵列金电极。将硅垸化的微间隙阵列金电极浸入戊二醛水溶液(质量分数5%)，室温 下静置1小时；用超纯水清洗三次后，在电极上滴加3(VL乙肝病毒表面抗 体(HBsAb)溶液(抗体浓度为10(Vg/mL，该溶液系将所述抗体溶于0. OIM、 pH 7. 4磷酸缓冲溶液而得)，室温下静置反应1小时；用超纯水清洗三次后， 吹干，备用。2. 人血清样品的检测将人血清样品(2(VL)与碱性磷酸酶标记的乙肝病毒表面抗体溶液 (2(^L，酶标抗体浓度为10jag/mL，该溶液系将所述抗体溶于0. OIM、 pH 7. 4 磷酸缓冲溶液而得)混合，滴加在电极上，于室温下静置反应0.5小时；将 传感器置于银沉积溶液(该银沉积溶液系将lmM抗坏血酸磷酸酯、2mMAgN03 溶于0. 1M甘氨酸-NaOH缓冲溶液而得，溶液pH9.0)中，室温下静置反应 10min;按照实施案例1的方法测定传感器的电导。使用所研制的乙肝病毒表面抗原免疫传感器如上法对5个正常人与10 个乙肝病人的血清样品进行测定。与ELISA方法对照，所研制的免疫传感器 的结果与ELISA的测定值的相对误差都在7. 0%以内。
权利要求
1.一种基于微间隙阵列电极的酶催化电导免疫传感器，其特征是，采用微间隙阵列金电极做基片，并采用以下步骤制得(1)取常规光刻印刷法制作的微间隙阵列金电极做基片，它为叉指式双电极，正负电极均为两个梳形金电极，彼此交叉组成微间隙阵列金电极。梳形齿宽为1μm-100μm，间隙为1μm-100μm；(2)微间隙阵列金电极的硅烷化处理，过程是a.将微间隙阵列金电极用无水乙醇清洗三次，每次1min；b.将所述电极浸入1M的NaOH溶液中28min-32min，再用超纯水清洗该电极三次，每次1min；吹干；c.将所述电极浸入含氨丙基三甲氧基硅烷5％(体积百分数)的乙醇溶液中，室温下静置23小时-25小时；这样可在微间隙阵列金电极间的基片上形成一氨基硅烷自组装单层；d.用超纯水清洗所述电极三次，吹干，即获得硅烷化的微间隙阵列金电极；(3)免疫传感器的制备，步骤是a.将所述硅烷化的微间隙阵列金电极浸入质量分数为5％的戊二醛水溶液，室温下静置0.8小时-1.2小时；b.用超纯水清洗所述电极三次后，在该电极上滴加30μL传染性病毒的重组抗原(双抗原夹心法)或传染性病毒的特异抗体(双抗体夹心法)，室温下静置反应1小时；该传染性病毒的重组抗原或特异抗体溶液是将所述抗原或抗体溶于0.01M、pH 7.4磷酸缓冲溶液而得，溶液中所述浓度为100μg/mL；c.用超纯水清洗所述电极三次，吹干，即得免疫传感器。
2、 一种采用所述基于微间隙阵列电极的酶催化电导免疫传感器检测传染性病毒的方法，其特征是，该方法的步骤为(1) 将20(iL感染传染性病毒的血清或正常血清样品溶液与2(VL碱性 磷酸酶标记的重组抗原(双抗原夹心法)或碱性磷酸酶标记的特异抗体(双 抗体夹心法)溶液混合，滴加在电极上，于室温下静置反应0.5小时；重组抗原或特异抗体浓度为1(Vg/mL，它是将所述重组抗原或特异抗体溶于 O.OIM、 pH 7.4磷酸缓冲溶液而得；碱性磷酸酶标记的重组抗原或特异抗体 通过感染血清中的抗体或病毒产生的抗原与固定化的重组抗原或特异抗体 发生夹心反应而被捕获到传感器表面上；(2) 将所述传感器置于银沉积溶液中，该银沉积溶液系将lmM抗坏血酸磷酸酯、2raM AgN03溶于0. 1M甘氨酸-NaOH缓冲溶液而得，溶液pH9.0; 室温下静置反应8min—12min;再从该电极获取与传染性病毒抗原或抗体浓 度相关的电导或电阻信号。
全文摘要
本发明提供了一种基于微间隙阵列电极的酶催化电导免疫传感器及其用于检测传染性病毒的方法，传感器包括微间隙阵列电极、硅烷化处理的电极基片、具有良好导电性的酶沉积物。本发明利用微间隙电极阵列免疫传感器，对人免疫缺乏病毒(HIV)抗体和乙肝病毒表面抗原(HBsAg)进行检测，提供了一种快速，高灵敏，高通量的传染病诊断方法，可望为传染病的早期诊断与现场筛查提供有效的技术手段。
文档编号G01N33/535GK101271111SQ20081003132
公开日2008年9月24日 申请日期2008年5月16日 优先权日2008年5月16日
发明者俞汝勤, 霞 楚, 沈国励, 蒋健晖, 勇 黄 申请人:湖南大学