专利名称：猪n-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法及其应用。
技术背景长期以来人们认为猪乳能够提供足够量的氨基酸以满足哺乳仔猪的生长需 要，但近年来的研究却表明当猪乳作为仔猪唯一的日粮蛋白来源时，哺乳仔猪 并不能够获得最佳的生长性能，研究结果表明仔猪7-21日龄时母乳中的精氨酸 供应及仔猪内源合成的精氨酸是限制仔猪最佳生长需要主要因素之一，因此增 加哺乳仔猪的精氨酸供应有助于发挥新生仔猪的最大生长潜力。N-乙酰谷氨酸(NAG)是精氨酸的内源合成途径第一个合成酶一氨基甲酰 磷酸合成酶(CPSI)的变构激活剂(Adadjieva et al., 2001)。 N-乙酰谷氨酸 合成酶(NAGS)存在在肝脏和肠线粒体中，它能催化谷氨酸和乙酰辅酶A合成 N-乙酰谷氨酸。在哺乳仔猪的小肠粘膜和肝脏的线粒体中由于N-乙酰谷氨酸合 成酶的不足致使N-乙酰谷氨酸的合成量不足，从而降低肠道瓜氨酸和精氨酸的 合成，导致哺乳仔猪精氨酸缺乏。虽然在哺乳仔猪的奶替代日粮中添加精氨酸 可以极大的提高其生产性能，但由于全自动人工饲喂系统成本昂贵，不适于实 际的养猪生产。因此如何检测不同日粮水平和不同发育阶段猪NAGS在体内的分 布和表达活性的变化，以阐明NAG缺乏的潜在分子机制和寻找内源性精氨酸的 营养调节的实用方法是目前亟待解决的问题。 发明内容本发明的目的在于提供一种猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法 及其应用。这种抗体能检测不同日粮水平和不同发育阶段猪NAGS在体内的分布 和表达活性的变化。本发明猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤 l)克隆猪的NAGS基因，根据该基因序列设计并合成引物TGAAGCCTCTGGTGGTTCTGGGGCTG-3';NAGSR: 5， -CTGCAGGTCGACTCATTCAGCTGCCTGGGTCAGAAGCCG-3，， 其中5"aJl酶切位点5' G' TCGAC 3' ， 酶切位点5' G' AATTC 3'，CATCACCATCACCATCAC为六个组氨酸标签，通过RT-PCR扩增猪NAGS基因的编码 区序列，其全长为1107 bp;2) 将步骤1)获得的表达全长猪N-乙酰谷氨酸合成酶的重组原核表达质 粒pLMl-NAGS转化到大肠杆菌BL21中；3) 培养转化重组质粒的BL21到OD值为0. 4;4) 在培养的大肠杆菌BL21中加入IPTG 0. 2mM，诱导；5) 将诱导后的菌体离心收集，用PBS重悬，加入溶菌酶裂解，再超声波 破碎，把破碎后的菌液离心，收集上清；6) 使用Hitrap chealting HP镍亲和层析柱纯化蛋白；7) 用纯化后的N-乙酰谷氨酸合成酶作为抗原免疫日本大耳白黑眼兔，得 到N-乙酰谷氨酸合成酶的多克隆抗体，用不完全福氏佐剂加强；8) 测抗N-乙酰谷氨酸合成酶的血清效价，取血，得到相应的抗血清。 本发明的应用在于检测不同发育阶段NAGS在哺乳仔猪体内的分布和表达活性的变化，以阐明NAG缺乏的潜在分子机制，从而为寻找内源性精氨酸的营 养调节提供了一个新的有效途径的应用。本发明得到的猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体，这种抗体能检测不同日 粮水平和不同发育阶段猪NAGS在体内的分布和表达活性的变化，以便人们寻找 内源性精氨酸的营养调节的实用方法。本发明为深入阐明猪NAGS基因的功能及 其表达调控规律奠定了基础。
图1是重组质粒pLM卜NAGS图谱(包括NAGS基因插入区域)。 图2是插入的NAGS基因序列(包括特异性酶切位点、组氨酸标签、NAGS全 长c腿)。图3是重组质粒pLMl-NAGS在大肠杆菌BL21 (DE3)中高效表达的SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定图。
具体实施方式
1基因克隆取新鲜健康猪肝组织，用RNA抽提试剂盒，按常规的异硫氰 酸胍法提取总RNA。根据我们首次克隆的猪NAGS的基因序列(GenBank登录号 EF429095)设计并合成引物。正向引物5'ATGGACATGAAGCCTCTGGT GG3';反向 引物5' TCAGCTGCCTGGGTCAGAAGCC 3'.以猪肝脏总RNA为模板，用上述引物通 过RT-PCR扩增猪NAGS基因的编码区序列，其全长为1107 bp,核苷酸序列见 图2。2重组质粒pLMl-NAGS构建根据猪NAGS的基因序列设计并合成引物TGAAGCCTCTGGTGGTTCTGGGGCTG-3，；NAGSR: 5' -CTGCAGGTCGACTCATTCAGCTGCCTGGGTCAGAAGCCG-3，。其中6^71酶切位点5， G， TCGAC 3， ， AcoM酶切位点5' G' AATTC 3，，CATCACCATCACCATCAC为六个组氨酸标签。PCR反应体系(50uL): 10XPCR缓冲液5 u L， MgCl2 (20腿ol/L) 4uL， dNTPs (1O誦ol/L) In L，引物NAGSF(10pmol/uL)和引物NAGSR(10pmol/uL) 各2.5"L ，模板DNA(约100ng/uU 1 u L， Taq DNA聚合酶(5U/uL)各 0. 5uL。 PCR程序94。C 4min ;94。C 45sec ，63°C 45sec ， 72°C 90sec ,共30个 循环；72°C 8min。使用fco7 l和双酶切纯化的PCR产物和pLMl载体，室温连接。然后 将连接产物转化A co7i'DH5oc感受态细胞。使用双酶切法筛选阳性克隆子，并 将筛选到的阳性克隆进行测序验证即得到pLMl-NAGS重组质粒。 3重组NAGS蛋白的表达、纯化将pLM1-NAGS重组质粒转化入大肠杆菌中，首先37'C震荡培养，当菌液0D 值达到0. 4时，加入0. 2mM IPTG，诱导NAGS重组蛋白的大量表达。室温震荡 培养6hr后，4000rpm离心收集菌体，超声破碎菌体，10次X3组，每次6s， 每组间隔10s，然后4'C， 8000rpm离心，含有NAGS重组蛋白的粗蛋白在上清和Western blot鉴定。 4兔抗猪NAGS血清的制备将纯化蛋白以0.25mg/kg与等量弗氏完全佐剂进行多点皮下注射；首免后 每隔14-20天加强免疫一次，共加强4次(每次间隔两周)。从耳缘静脉采取少 量血液，经琼脂糖双向扩散试验证明阳性后，颈动脉插管收集血清，加0.1%叠 氮钠-2(TC保存。5兔抗猪NAGS多克隆抗体的鉴定 5. 1 ELISA测定抗体效价(1) 包被用pH9.6的PBS将纯化蛋白稀释至约10吗/ml,微量反应板上每孔O.lml,置湿盒中，37。C温育2h，转入418h。C以上。(2) 洗涤倾去孔内液体，用洗涤缓冲液洗涤三次(每孔200pl)，每次5min。(3) 封闭；每孔加入100nl的l。/QBSA-PBS于37O(:封闭2h;(4) 洗涤同(2)(5) 加样；待检血清、阴性血清均用稀释缓冲液作梯度稀释，每孔10(V1。(6) 洗涤同(2)(7) 加HRP-SPA:按工作效价稀释后每孔100pl，置湿盒中，37。C温育lh。(8) 洗涤同(2)(9) 加入100^il新配制的底物缓冲夜(OPD) ， 37。C温育10-20min;(10) 加入50pl的终止液；(11) 经ELISA测定，所制备的多克隆抗体效价为l: 25600。 5.2 Western blot分析将制备的多克隆抗体以l: 2000稀释进行Westem blot分析，结果在NC膜上 看到40kDa处的特异性条带。6 ELISA法检测pNAGS在Vero细胞中的表达动力学 6.1ELISA检测样品的制备采用脂质体介导方法将pCI-NAGS转染Vero细胞，转染后，每隔12h，用胰酶 消化，0.01M/LPBS (pH7.2)洗涤一次，4°C， 2000 g离心10min，收集细胞， 沉淀重悬于100W PBS，反复冻融3次后，用0.06% Triton-lOO室温裂解细胞15min， 4°C， 2000g离心10min，收集上清液，-40。C保存备用。 6.2ELISA检测chlL-2的表达动力学用纯化的pNAGS抗体包被96孔酶标板(2.5 (^g/ml)， 37。C温育l h后转入4'C 过夜，5。/。的脱脂奶封闭lh， PBST洗3次后加入100 pl待检样品，37。C孵育lh。 PBST洗3次后加入纯化的兔抗猪NAGS (10pg/ml)， 37'C孵育1 h。 PBST洗3 次后加入5000倍稀释的HRP-羊抗兔IgG后37"C孵育lh，PBST洗8次后加底物 37。C温育10分钟，最后用2MH2S04终止反应，用酶标仪读取各孔在OD 490nm 值。检测结果显示，重组载体转染Vero细胞36h之前均检测不到蛋白的表达，48h 后即为阳性，P/N值为2.25士0.38， 72 h达到峰值，P/N值为2.78士0.25，随后又 有所下降；而pCI对照组和正常对照组的P/N值均在1.5以下，结果均为阴性。 本发明达到的技术指标为1. 根据GeneBank上提供的猪EST序列信息，设计合成引物，采用RT-PCR的 方法，以猪肝组织总RNA反转录所得的cDNA为模板，扩增pNAGS全长 编码区；然后利用基因重组技术将该PCR扩增产物构建到原核表达载体 pLMl中，获得原核表达质粒pLMl-NAGS (见图1)，其大小为4764bp，该 质粒中启动子元件、多克隆位点均来源于pLMl，在其&oi l和位点之 间插入了包括起始和终止密码子的NAGS全长编码区，并且His标签的开放 阅读框与NAGS的开放阅读框完全一致，两编码区之间有的间隔为3bp (如 图2所示)。2. 该原核表达质粒pLMl-NAGS在IPTG诱导下可在BL21(DE3)中表达。对该 蛋白在大肠杆菌中的分布定位分析表明，该蛋白主要以可溶形式存在于上清 中。亲和层析后得到了纯化的融合蛋白(如图3所示)。3. 用该质粒表达并经亲和层析纯化后的产物免疫家兔制备的抗蛋白抗体具有 较高的滴度及特异性(图3)。Untitledl. ST25. txt 序列表<110> 印遇龙<120>猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法及其应用 <160> 3<170〉 Patentln version 3.3<210> 1〈211〉 85〈212〉 PRT<213> 猪〈400> 1Cys Gly Cys Gly Cys Gly Ala Ala Thr Thr Cys Ala Gly Gly Ala Gly 15 10 15Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly Ala Gly 20 25 30Gly Ala Thr Cys Gly Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala 35 40 45Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Gly Ala Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly 50 55 60Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly 65 70 75 80Gly Gly Cys Thr Gly 85<210> 2<211> 39〈212> PRT〈213〉 猪〈400〉 2Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Cys Thr Cys Ala Thr 15 10 15Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Ala 20 25 30Untitledl. ST25. txtGly Ala Ala Gly Cys Cys Gly 35〈210〉 3 <211> 4764 <212> DNA 〈213〉 猪〈400〉 3cttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcg3tgta^ccc360ctcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtg3gC犯120gcaaaatgccgc犯aaaaggg组卿ggcgac3cggaaatgttg犯tac180tcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcg240gatacatatttg犯tgtattggttccgcgcacatttcccc300gaB犯gtgccacctgacgtct￡L￡lga^￡LCC￡Lttattatcatgacattaacct at aaaaat a360ggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtg犯aacctctgac420ac3tgcagctcccggagacggtC￡LC￡LgCttgtctgtaagcgg3tgCCgggagcagacaag480cccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcat540cagagcagattgt￡LCtg￡LgagtgcaccatatgCggtgtg6Laataccgcacagatgcgtaa600ggagaa犯taccgcatcagga犯ttgt犯gcgttaatattttgtt犯肌ttcgcgttaaa660tttttgttaaatcagctceitttttt犯ccaataggccg肌atcggcaaaatcccttataa720tagaccgagatagggttg8gtgttgttccagtttggaeicaagagtccact780attaaag^cgtggactccaacgtcaaagggcg犯a^ccgtctatcagggcgatggccc840actacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaa900tcggaaccct犯鄉gagcccccgatttag￡lgCttg￡lCgggga犯gccggcg肌cgtggc960cga犯ggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggt1020cacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtccat1080tcgccattcaggctgcgc犯ctgttggg犯gggcgatcggtgcgggcctcttcgctatta1140cgccagctgcgaaattaatacgactcactataggg卿ccacaacggtttccctctagaa1200ataattttgttgaattcagggLggaatttaa犯tg卿ggatcgcatcaccatcaccatcei1260cgacatgaagcctctggtggttctggggctgccggctcccactgcgccctcaggctgtct1320Untitledl. ST25. txtttccttctgggaggcca鄉cacagcttgccca^gstgc犯ggcgctggtgaacacgct1380gcggcsc犯tgccgccaccgctgtgcctttttttggtggtgggtcggtactgggcgctgc1440tgagccagcccctcatgccagctacagcggcatcgtctcggtggaga^cggacctactaca1500gtggtgcctgg3gtXgggt3gcattcccatcctgtgcccc3"tCgggg卿cggctgcgcg1560ccgctccgtgctcctcgactcgctggaggcgaccgcggccctggccaaggcgctgcagcc1620caccaaaat tatcttcctcaatactacaggcggcatatacgacagcagtcacaaggtcct1680gagtaacgtgaacttgcccgccgacctggaCCtggtgELCC组gcgg叫tgggtga>gc￡LC1740caaagaacggC3gC3g3tgCggctcatcgtggeicgtgctcagtcgcctgccccaccactc1800ctcggcggtcatcaccgccgccagcacgctgCtC3Cgg6Lgctcttcagcaacaaggggtc1860cgggaccctgttcaaga^cgccgaacggatgctgcgagtgcgcagcctggacagcctgga1920ccaggaccgcttagcgaacctggtcaacgccagctttggc犯g犯gctgcgggacgacta1980tctggcctcgttacgcccgcgactgcactatgtctacgtctctgeLggggtac犯cgcggc2040cgccattctgaccaLcggagcccgtactggggggcaccccgt3tctag3caBgCttgtggt2100gagttccagccgccagggcc,gctccggccagatgctgtggg￡LgCgCCtgcggcggga2160cctgcagacgcttttctggcgctcccgggtcaxx肌ccccatcaacccctggtacttcaa22203ca^gtg3tggcagcttctgtggatcttcttctggtttggcctggccga2280catccgggactcttatgagctggtcaaccatgcc犯ggggctgccggactccttctgc犯2340gccggcttctgacccaggcagctg肌tgagtcgacctgcaggCgLtgC犯gcttggctgtt2400ttggcggatgagagaagattttcagcctgatac3gatt肌atcag犯cgc卿agcggtc2460tgataa^acagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccga2520actcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcga^gtag2580ggaactgccaggcatcaaata^訊cgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgtttt2640atctgttgtttgtcggtg犯cgctctcctga/tccgccgggsgcggatttg2700aacgttgcgaagcaacggcccggeigggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccagg2760catcaaattaa^gC3g卿gccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactctt2820ttgtttatttttcta^atacattcaaatatgtatccgctcatgagac犯taaccctgata2880aatgcttcaataatctgcatt肌tgaatcggcc犯cgcgcgggg，ggcggtttgcgta2940ttgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggc3000Untitledl.ST25. txtgagcggtatcagctcactcatacggttatcgggg3t犯Cg3060cagga犯gaacatgtgagcaeLa3ggcc3gc肌犯ggCC8ggaaccgtaaa肌ggccgcgt3120tgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaa犯tcgacgctcaa3180gtcagaggtggcgaaacccg3C3ggEictat肌EigatEicceLggcgtttccccctggaagct3240ccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcc3300cttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtagg3360tcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgcct3420tatccggt犯ctatcgtcttgagtcca^ccCggt犯g3C3cgacttatcgccactggcag3480cagccactggtaacaggattagc，gcgaggt3tgt叫gcggtgctetcagagttcttga3540agtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctga3600agccagttaccttcgg3犯a^gctcttgatccggca^c犯￡lCC￡LCCgCtg3660gtagcggtggtttttttgtttgcaa>gca>gcagattacgcgggatctcaag3720aagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtgg肌cg肌肌ctcacgttaag3780ggattttggtcatgagatteitcttcacctagatcctttta3840gaagttttaaa^c犯tct犯3gt3ta^tg3gta犯cttggtctgacagttaccaatgct3900taatcagtg已ggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgac3960tccccgtcgtgtag3t犯ctacgatacgggagggcttaccatctggcccc3gtgCtgC肌4020tgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaa/taaaccagccagccg4080gaagggccg￡Lgcgc卿agtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaatt4140gttgccgggaagctagagtaagtagttcgcC3gtt犯ta^gtttgcgc肌cgttgttgcca4200ttgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggtt4260cccaacgatc犯ggcg叫ttacatgatxccccatgttgtgc犯犯犯gcggttagctcct4320tcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactc3tggtt3tgg4380cagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtg4440agtactcaaccaagtcattcgt"gcggcgaccgagttgctcttgcccgg4500cgtcaatacgggataataccgcgccac6itagcagaactttaaaagtgctc3tcattgga^4560aacgttcttcggggcg犯a^ctctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgt4620aacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggt4680Untitledl. ST25. txtgagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 4740 gaatactcat actcttcctt tttc 476权利要求
1. 一种猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法，其特征是包括如下步骤1)克隆猪的NAGS基因，根据该基因序列设计并合成引物NAGSF5′-CGCGCGAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGACATGAAGCCTCTGGTGGTTCTGGGGCTG-3′；NAGSR5′-CTGCAGGTCGACTCATTCAGCTGCCTGGGTCAGAAGCCG-3′，其中Sal1酶切位点5’G’TCGAC 3’，EcoR1酶切位点5’G’AATTC 3’，CATCACCATCACCATCAC为六个组氨酸标签，通过RT-PCR扩增猪NAGS基因的编码区序列，其全长为1107bp；2)将步骤1)获得的表达全长猪N-乙酰谷氨酸合成酶的重组原核表达质粒pLM1-NAGS转化到大肠杆菌BL21中；3)培养转化重组质粒的BL21到OD值为0.4；4)在培养的大肠杆菌BL21中加入IPTG 0.2mM，诱导；5)将诱导后的菌体离心收集，用PBS重悬，加入溶菌酶裂解，再超声波破碎，把破碎后的菌液离心，收集上清；6)使用Hitrap chealting HP镍亲和层析柱纯化蛋白；7)用纯化后的N-乙酰谷氨酸合成酶作为抗原免疫日本大耳白黑眼兔，得到N-乙酰谷氨酸合成酶的多克隆抗体，用不完全福氏佐剂加强；8)测抗N-乙酰谷氨酸合成酶的血清效价，取血，得到相应的抗血清。
2、 根据权利要求1所述猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤4)中，所述的诱导温度为室温，诱导时间为4-6hr。
3、 根据权利要求1所述猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法， 其特征在于步骤5)中，所述PBS的pH值为8.0，加溶菌酶裂解的时间为60min, 超声破碎10次x3组，每次6s,每组间隔10s;破碎后的菌液在4"C， 8000rpm离 心15min，收集上清。
4、 根据权利要求1所述的猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法， 其特征在于步骤6)中用经过亲合层析获得的NAGS免疫日本大耳白黑眼兔 得到的NAGS多克隆抗体具有较高的抗体滴度及特异性。
5、 一种对应权利要求1所述的猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的应用 为检测不同发育阶段NAGS在哺乳仔猪体内的分布和表达活性的变化，以阐 明NAG缺乏的潜在分子机制，从而为寻找内源性精氨酸的营养调节提供了一个 新的有效途径的应用。
全文摘要
本发明公开了一种猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法及其应用，其步骤是克隆猪的NAGS基因，根据该基因序列设计并合成引物，将获得的表达全长猪N-乙酰谷氨酸合成酶的重组原核表达质粒pLM1-NAGS转化到大肠杆菌BL21中；培养转化重组质粒的BL21到OD值为0.4；在培养的大肠杆菌BL21中加入IPTG 0.2mM，诱导；将诱导后的菌体离心收集，用PBS重悬，加入溶菌酶裂解，再超声波破碎，把破碎后的菌液离心，收集上清；使用Hitrap chealtingHP镍亲和层析柱纯化蛋白；用纯化后的N-乙酰谷氨酸合成酶作为抗原免疫日本大耳白黑眼兔，得到N-乙酰谷氨酸合成酶的多克隆抗体，用不完全福氏佐剂加强；得到相应的抗血清。本发明能检测不同发育阶段NAGS在哺乳仔猪体内的分布和表达活性的变化。
文档编号G01N33/573GK101265475SQ200810031259
公开日2008年9月17日 申请日期2008年5月9日 优先权日2008年5月9日
发明者储武英, 印遇龙, 黄瑞林 申请人:印遇龙