专利名称：具有编码多聚-γ-谷氨酸合成酶的基因pgsBCA的表面表达载体以及利用该载体在微生物 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及可在微生物表面有效制备外源性蛋白的新的表达载体，该表达载体利用细胞外膜蛋白(pgsBCA)参与合成源于Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸。此外，本发明还涉及在微生物表面表达外源性蛋白的方法，该方法是利用细胞外膜蛋白(pgsBCA)参与合成源于Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸。
背景技术：
近来，为了制备新的疫苗、筛选多种抗原和抗体、以及将有用的酶固定在细胞表面，已经在噬菌体、细菌、以及酵母中采用了表面表达用来在细胞表面制备有价值的外源性蛋白。
在细胞表面表达外源性蛋白的方法最初用于制备多肽的抗原区域，尤其用于疫苗的大规模稳定表达。目前，通过致病细菌随机突变来制备疫苗，并筛选得到具有一致、稳定滴度的细菌。然而，当人和动物口服后，酶不可避免地要失活。因此，许多研究都致力于克服这一问题。通常采用戈兰氏阴性细菌的细胞表面蛋白，其基因与抗原蛋白基因连接，然后将连接后的基因插入适当的宿主细胞，从而在细胞表面可有效制备融合蛋白。通过上述步骤制备的重组蛋白由于在细胞表面突出，因此可作为有效的抗原。特别地，有报道说，由于细胞外膜的脂多糖(LPS)增强了在细胞表面表达的蛋白的抗原性，因此戈兰氏阴性细菌最适合用于该种制备。
为了在细胞表面表达外源性蛋白，在最初的序列中需要存在分泌信号，它能介导生物合成的细胞蛋白穿过细胞膜。此外，在戈兰氏阴性细菌中，重组蛋白还必须穿过细胞内膜和细胞膜之间的空腔，插入并与细胞外膜相连，最后在细胞膜外侧稳定地突出。
实际上，有一些蛋白，例如细胞表面蛋白，特殊的酶，以及毒素蛋白，包含这样的分泌信号和目标信号，并可在细胞表面稳定突出。同样地，如果这些分泌和目标信号与适当的启动子相连，则可在细菌表面成功表达外源性蛋白。
用于外源性蛋白表面表达的细胞表面蛋白通常可被大致分成4部分，细胞外膜、脂蛋白、分泌蛋白、以及细胞表面器官蛋白。目前，戈兰氏阴性细菌中的表面蛋白，例如LamB，PhoE，以及OmpA主要被用于制备有用的外源性蛋白。然而，这些蛋白具有对所插入蛋白大小的结构性限制，这些所插入的蛋白被插入到细胞表面的突出环(protruded loop)。由于所插入的外源性蛋白的C-和N-末端需要在立体结构上闭合，如果它们距离很远，可用连接肽连接以减小两末端之间的距离。
具体地，如果LamB和PhoE用于插入含有多于50～60氨基酸的外源性多肽，则结构性限制将阻止细胞膜稳定性蛋白的生成(Charbit，et al.，J.Immunol.，1391658-1664，1987；Agterberg，et al.，Vaccine，885-91，1990)。尽管可使用OmpA将外源性蛋白插入突出环，但是由于结构限制，实际上只有含有最小目标信号的OmpA的部分片段可被插入。已经通过在C-末端与OmpA目标信号连接而在细胞表面表达β-内酰胺酶。
近来，已经发现来源于Pseudomonas sp.的冰晶蛋白(ice-nucleationprotein)可以作为戈兰氏阴性细菌的细胞外膜并用于表面表达(Jung et al.，Nat.Biotechnol.，16576-560，1998；Jung et al.，Enzyme Microb.Technol.，22(5)348-354，1998；Lee et al.，Nat.Biotechnol.，18645-648，2000)。Jung及其同事使用冰晶蛋白在细胞表面表达了果聚糖蔗糖酶(levansucrase)，其包括N-末端、中间重复区域、以及C-末端，在C-末端与果聚糖蔗糖酶基因相连，而且还用冰晶蛋白表达了羧甲基纤维素，其包括N-末端、缺失的中间重复区域、以及C-末端，在C-末端与该基因融合，从而检测各自酶的活性。此外，Lee及其同事使用冰晶蛋白在Escherichia coli或者Salmonella typhiTy21a菌株细胞表面进行表达，所用冰晶蛋白仅包含N-末端或者N-末段和C-末端、在每一末端与HBV表面抗原和HCV核心抗原连接，研究证明了这些蛋白作为复杂的活疫苗是有效的。
脂蛋白同样被用作表面表达的表面蛋白。特别地，E.Coli脂蛋白可通过N-末端的分泌蛋白穿过细胞内膜，该蛋白与细胞外膜或者内膜直接连接的末端含有L-半胱氨酸。一种主要的脂蛋白，Lpp，在N-末端与细胞外膜相连，在C-末端与肽聚糖(PG)相连。因此，如果Lpp与细胞外膜蛋白的OmpA片段相连，则外源性蛋白可被稳定地表达在细胞外膜的细胞表面上(Francisco，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，4892713-2717，1992)。该特性还可用于另一脂蛋白，TraT，在细胞表面表达外源性蛋白，诸如脊髓灰质炎病毒的C3抗原决定簇(Felici，et al.，J.Mol.Biol.，222301-310，1991)。而且，对肽聚糖连接性脂蛋白(peptidoglycan-associated lipoprotein，PAL)来说，尽管其确切功能还未得到阐明，但其已被用于表面表达来制备重组抗原(Fuchs，et al.，Bio/Technology，91369-1372，1991)。在这种情况下，PAL的C-末端与细胞壁相连，N-末端与重组抗体相连，从而在细胞表面表达融合蛋白。
同时，尽管可穿过细胞外膜的分泌蛋白可被用作表面蛋白，但这并未在戈兰氏阴性细菌中得到应用，并且只有在特定蛋白参与分泌机制时才有几种分泌蛋白可帮助穿过细胞外膜。例如，当脂蛋白Klebsiella sp.普鲁兰酶(pullulanase)的N-末端被脂类物质取代并连接至细胞外膜后，可完全分泌至细胞培养介质中。Komacker及其同事使用普鲁兰酶(pullulanase)的N-末端片段将β-内酰胺酶表达至细胞表面，但是所得的普鲁兰酶-β-内酰胺酶融合蛋白立刻连接到细胞表面，然后却在细胞培养介质中分离了。此外，还使用该步骤制备了碱性磷酸酶，这是一种胞质间间隙蛋白(periplasmic spaceprotein)，但由于其分泌过程至少需要14种蛋白，因此不能稳定表达该重组蛋白(Kornacker，et al.，Mol.Microl.，41101-1109，1990)。
此外，来源于致病菌Neisseria sp.的IgA蛋白酶具有一特殊的分泌系统，其C-末端具有一片段信号，可使N-末端的蛋白酶稳定地连接到细胞外膜上。当该蛋白酶到达细胞外膜并在细胞表面突出后，根据其水解能力分泌至细胞培养介质中。Klauser及其同事采用IgA蛋白酶片段将分子量约为12kDa的霍乱毒素B亚基不连续地表达至细胞表面(Klauser，et al.，EMBO J.，91991-1999，1990)。然而，该融合蛋白的分泌被分泌过程中细胞膜空间产生的蛋白折叠所抑制。
另外，对戈兰氏阴性细菌来说，存在于细胞表面且用于表面表达的细胞亚器官(suborgans)包括鞭毛、菌毛、菌伞毛等。更详细地，采用含有鞭毛、且与其抗体有强结合性的鞭毛蛋白作为亚单位已经连续制备了霍乱毒素B亚基和来源于乙型肝炎病毒多肽(Newton，et al.，Science，24470-72，1989)。丝束蛋白(fimbrin)，一种在细胞表面由线状伞毛构成的亚基，已经被用于表达外源性多肽，然而只有小的多肽被成功地制备出来(Hedegaard，et al.，Gene，85115-124，1989)。
除了已经将戈兰氏阴性细菌的表面蛋白用于表面表达外，最近，戈兰氏阳性细菌的表面蛋白也被用于表面表达(Samuelson，et al.，J.Bacteriol.，1771470-1476，1995)。然而，在这种情况下，仍需要用来穿过细胞内膜的分泌信号以及用于表面表达和连接到细胞表面的载体。实际上，来源于Staphylococcus hyicus的脂肪酶的分泌信号和来源于Straphylococcus aureus的蛋白A的膜连接载体(membrane attachment carrier)已经被用于制备疟疾血期(malaria blood stage)抗原，其包括80个氨基酸以及来源于Streptococcus蛋白G的白蛋白连接蛋白，并成功地将所得蛋白表达在细胞表面。
如上所述，由于很多研究已经集中在利用戈兰氏阴性细菌和戈兰氏阳性细菌进行表面表达，已经发展出很多表达系统用于制备有价值的蛋白，并且尤其在美国、欧洲、以及日本提交专利保护。更详细地，已经有5份专利申请公开了戈兰氏阴性细菌的细胞外膜蛋白(WO 9504069，WO 9324636，WO9310214，EP 603672，US 5356797)，1份专利申请报道了使用鞭毛作为细胞表面器官(WO 9410330)，1份使用细胞表面脂蛋白(WO 9504079)。
如上所述，为了使用细胞外膜蛋白将外源性蛋白表达至细胞表面，必须将适宜的细胞内膜和外源性蛋白在基因水平连接，诱导生物合成，当稳定穿过细胞内膜后持续存在于细胞外膜。为完成这一过程，应选择满足下述要求的细胞内膜，然后用于表面表达的载体中首先，穿过细胞内膜的分泌信号的存在；其次，与细胞外膜稳定连接的目标信号的存在；第三，大量表达至细胞表面；第四，不考虑蛋白大小，蛋白能稳定表达。
然而，还没有发明出满足上述所有条件的用于表面表达的载体。目前，仅有下述缺点得到了补救。
基于上述背景，本发明人对来源于Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸合成酶基因(pgsBCA)作为表面表达的新载体进行了研究。研究结果发现，采用含有pgsBCA基因的新的表达载体可有效地将外源性蛋白表达至微生物表面，同时发现了可大范围地将外源性蛋白成功表达至微生物表面的方法。
本发明公开本发明的目的在于提供一种在微生物表面制备外源性蛋白的方法。
详细地，在本发明中，从参与合成源于Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸的细胞外膜蛋白中选择出可大范围地将外源蛋白表达至戈兰氏阴性和戈兰氏阳性细菌表面的新的表面表达载体。然后，利用该基因，构建可在微生物表面表达外源性蛋白或多肽的表面表达载体，并将该载体转化至多种宿主细胞，从而选择用于表面表达的细胞转化株。
为完成本发明的目的，提供了选自pgsB、pgsC、以及pgsA的、包含一个或多个编码多聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因的表面表达载体。
详细地，本发明提供了用于在微生物表面制备蛋白的表面表达载体，其中pgsB、pgsC以及pgsA基因包含分别与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3具有80％同源性的核苷酸序列。此外，还提供了在微生物表面制备蛋白的表面表达载体，包括编码目的蛋白的基因以及C-末端的终止密码子。
此外，还提供了用上述表达载体转化得到的细胞转化株。
最后，本发明提供了在戈兰氏阴性或戈兰氏阳性宿主细胞微生物表面表达目的蛋白的方法，其包括下述步骤(a)通过将编码目的蛋白的基因插入表面表达载体中构建重组表达载体；(b)使用重组载体转化戈兰氏阴性宿主细胞；以及(c)培养转化的宿主细胞，在宿主细胞的表面表达目的蛋白。
附图详细描述本发明的上述以及其他的目的、特性、以及优点将通过附图以及下述详细描述相结合得到更好的理解，其中
图1描述了表面表达载体pGNBCA和重组表达载体pGNBCA-HB168的限制性图谱，在本发明中，它们利用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞；图2描述了在用本发明的重组表达载体pGNBCA-HB168转化的戈兰氏阴性细菌中HBV表面抗原蛋白的表面表达，其是通过Western印迹法和荧光活化细胞分类试验(fluorescence-activated cell sorting assays)检测的；图3描述了本发明的表面表达载体pGNCA和重组表达载体pGNCA-HB168的限制性图谱；图4描述了在用本发明的表面表达重组载体pGNCA-HB168A2、pGNCA-HB168A3和pGNHB-AA4转化的戈兰氏阴性细菌中HBV表面抗原蛋白的表面表达，其是通过Western印迹法和荧光活化细胞分类试验(fluorescence-activated cell sorting assays)检测的；图5描述了本发明的表面表达载体pGNA和重组表达载体pGNA-HB168的限制性图谱；图6描述了本发明的表面表达载体pGNCA2和重组表达载体pGNHB-A的限制性图谱；图7描述了本发明的表面表达载体pGNC和重组表达载体pGNC-PreS1的限制性图谱；图8描述了在用本发明的表面表达重组载体pGNC-PreS1转化的戈兰氏阴性细菌中HBV表面抗原PreS1蛋白的表面表达方式，它是通过Western印迹法检测的；图9描述了本发明的表面表达载体pHCE1LBBCA和重组表达载体pHCE1LBBCA-HB168的限制性图谱；图10描述了在用本发明的表面表达重组载体pHCE1LBBCA-HB168转化的戈兰氏阴性细菌中HBV表面抗原决定簇的表面表达方式，其是通过Western印迹法和荧光活化细胞分类试验(fluorescence-activated cell sortingassays)检测的；图11描述了用本发明的重组表达载体pHCE1LBBCA-HB168转化的戈兰氏阴性细菌的活疫苗的效力；图12描述了在用本发明的表面表达重组载体pHCE1LBBCA-HB168转化的戈兰氏阳性细菌中HBV表面抗原决定簇的表面表达，它是通过Western印迹法和荧光活化细胞分类试验(fluorescence-activated cell sortingassays)检测的；图13描述了用本发明的重组表达载体pHCE1LBBCA-HB168转化的戈兰氏阳性细菌的活疫苗的效力；图14描述了本发明的表面表达载体pHCE1LBA和重组表达载体pHCE1LBA-TGEN1以及pHCE1LBA-PEDN的限制性图谱；图15描述了用本发明的表面表达重组载体pHCE1LBA-TGEN1转化的戈兰氏阴性(Escherichia coli)和戈兰氏阳性细菌制备的TGE病毒N蛋白的表面表达方式，它是通过Western印迹法检测的；图16描述了用本发明的表达重组载体pHCE1LBA-PEDN转化的戈兰氏阴性和戈兰氏阳性细菌制备的PED病毒N蛋白的表面表达方式，它是通过Western印迹法检测的；图17描述了用本发明的重组表达载体pHCE1LBA-TGEN1和pHCE1LBA-PEDN转化的戈兰氏阳性细菌的活疫苗的效力；图18描述了本发明的表面表达载体pHCE1LBA和重组表达载体pHCE1LBA-PreS1以及pHCE1LBA-PreS2的限制性图谱；图19描述了本发明的表面表达载体pHCE1LBA和重组表达载体pHCE1LBA-PreS1PreS2以及pHCE1LBA-L的限制性图谱；图20描述了分别用本发明的表达重组载体pHCE1LBA-PreS1和pHCE1LBA-PreS1PreS2转化的戈兰氏阴性细菌制备的乙型肝炎病毒PreS1和PreS1PreS2的表面表达方式，以及用本发明的表达重组载体pHCE1LBA-L转化的戈兰氏阴性细菌制备的乙型肝炎病毒L蛋白的表面表达方式，它是通过Western印迹法检测的；图21描述了本发明的表面表达载体pHCE1LBA-TNF-a的限制性图谱；图22描述了本发明的重组表达载体pGNA-脂肪酶的限制性图谱，以及采用重组表达载体pGNA-脂肪酶转化的戈兰氏阴性细菌细胞表面表达的脂肪酶活性；
图23描述了本发明的重组表达载体pGNA-酰胺酶的限制性图谱，以及采用重组表达载体pGNA-酰胺酶转化的戈兰氏阴性细菌细胞表面表达的酰胺酶活性。
本发明的最佳实施方式在下文中，将对本发明进行详细描述。
由pgsBCA基因编码的蛋白是一种存在于Bacillus sp.菌株中的细胞外部蛋白，它是一种具有可食用性、可溶解性、带有阴离子、可生物降解的聚合体物质，其参与多聚-γ-谷氨酸的合成，并且是由Bacillus subtilis(IFO3336；Natto.Biochem.Biophys.Research Comm.，263，6-12，199，Bacilluslicheniformis(ATCC 9945；Biotech.Bioeng.，4)，430-437，1998)以及Bacillusanthracis(J.Bacteriol.，171，722-730，1989)等制备出的。
从Natto菌株(Bacillus subtilis IFO 3336)中分离出来的一种细胞膜蛋白(pgsBCA)总共包含922个氨基酸，精确地说，pgsB的393个氨基酸，pgsC的149个氨基酸，以及pgsA的380个氨基酸。Ashiuchi等公开了来源于Bacillus natto菌株的多聚-γ-谷氨酸合成酶基因的克隆、将其转化至Escherichia coli中、以及其合成(Ashiuchi，et al.，Biochem.Biophy.ResearchComm，2636-12，1999)。
然而，包含多聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的pgsBCA蛋白的功能还没有被详细阐述。至少，pgsB作为氨基化合物连接系统参与了构成酶复合物蛋白，并且在pgsB的N-末端通过特定的氨基酸与细胞膜或者细胞壁相互作用。pgsA在N-末端和C-末端具有特定的亲水氨基酸序列，起到与pgsB相关联的分泌信号、目标信号以及结合信号的作用，进而穿过细胞内膜。
本发明人发现，参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白是一种有效的表面表达载体，该载体能根据外源性蛋白一级氨基酸序列的结构和特征将其表达至细胞表面。具体地，其有很多优点。首先，参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白可被大量表达，用于合成多聚-γ-谷氨酸和细胞外分泌；其次，在细胞周期的静息期，表达至细胞表面的参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白可被稳定保持；第三，该细胞外膜蛋白在细胞表面呈结构性突出，尤其在pgsA中；第四，参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白(pgsBCA)来源于戈兰氏阳性细菌的细胞表面，其可被表达至戈兰氏阳性或者戈兰氏阴性细菌的细胞表面。
本发明提供了可用于将外源性蛋白表达至细胞表面的重组表达载体，其利用了参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白的性质。详细地说，将本发明的表面表达载体构建为含有分泌信号和目标信号的构建体，所述信号存在于参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白(pgsBCA)的一级序列中。
此外，本发明提供了使用表面表达载体将外源性蛋白表达至戈兰氏阴性和戈兰氏阳性细菌表面的方法，其利用了参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白的特性。详细地说，由于利用了参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白，外源性蛋白表达至细胞表面，因此本发明的制备外源性蛋白的方法可以省略某些步骤，诸如细胞超声降解或者蛋白纯化等。
因此，本发明提供了通过表面表达方法制备的外源性蛋白的多种用途。详细地说，本发明提供的方法可有效制备抗原和抗体、筛选抗原的多肽库、结合蛋白或者吸附蛋白、以及生理活性物质等等。
除了细胞外膜蛋白参与来源于Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸的合成外，所有含有多聚-γ-谷氨酸合成基因的表面表达载体也在本发明的保护范畴之内。
此外，本发明的使用多聚-γ-谷氨酸合酶基因的表面表达载体可应用于所有表面表达的微生物菌株。优选地这些载体可被用于戈兰氏阴性细菌，尤其是Escherichia coli，Salmonella typhi，Salmonella typhimurium，Vibrio cholera，Mycobacterium bovis，以及Shigella，也可用于戈兰氏阳性细菌，尤其是Bacillus，Lactobacillus，Lactococcus，Staphylococcus，Lyseria，Monocytogenesis，以及Streptococcus。所有使用这些菌株制备外源性蛋白的方法也在本发明的保护范畴之内。
根据需要，可将多聚-γ-谷氨酸合成酶基因在N-末端或者C-末端插入所有或某些限制性酶的多个识别位点。因此，包括这些限制性酶识别位点的表面表达载体也在本发明的保护范畴之内。
详细地，本发明涵盖了所有来源于Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸合成酶基因。其中，pgsA基因用于在C-末端插入限制性酶识别位点，它很容易克隆多种外源性蛋白基因，从而构建表面表达载体pGNBCA。
本发明还提供了重组表面表达载体pGNBCA-HB168，它能在戈兰氏阴性细菌的细胞表面表达抗原决定簇，并以融合的形式形成抗S抗原的中和抗体。详细地，参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白复合物包括pgsB、pgsC、以及pgsA蛋白，pgsA蛋白基因的C-末端与抗原决定簇的N-末端相连接从而形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体。
本发明还提供了重组表面表达载体pGNCA-HB168、pGNA-HB168和pGNHB-A，它们能在戈兰氏阴性细菌的细胞表面表达抗原决定簇，并以融合的形式形成抗S抗原的中和抗体。详细地，参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白复合物包含pgsC和pgsA蛋白，或者仅有pgsA蛋白，然后，前一种情况的pgsA蛋白基因的C-末端，或后一种情况的N-末端或C-末端与抗原决定簇的N-末端相连接从而形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体。
本发明还提供了重组表面表达载体pGNC-PreS1，它能在戈兰氏阴性细菌的细胞表面表达抗原决定簇，并以融合的形式形成抗S抗原的中和抗体。详细地，参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白复合物包括pgsC蛋白，然后，pgsC蛋白基因的C-末端与乙型肝炎病毒表面抗原中的Pres1抗原的N-末端相连接。
本发明还提供了重组表面表达载体pHCE1LBBCA和pHCE1LBA，它们是对用在戈兰氏阴性细菌的表面表达载体pGNBCA进行了修饰，并且这两种表达载体能用于戈兰氏阴性和阳性菌。详细地，参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白复合物包含pgsB、pgsC和pgsA蛋白，或者仅含有pgsA蛋白，然后，pgsA蛋白基因的C-末端与外源蛋白基因连接。
本发明还提供了重组表面表达载体pHCE1LBBCA-HB168，其能用于戈兰氏阴性和戈兰氏阳性细菌，表达抗原决定簇，在细胞表面以融合形式形成抗S抗原的中和抗体。详细地，参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白复合物包括pgsB，pgsC，以及pgsA蛋白，pgsA蛋白基因的C-末端与抗原决定簇的N-末端相联接，从而形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体。
本发明还提供了重组表面表达载体pHCE1LBA-TGEN1，它能用于戈兰氏阴性和戈兰氏阳性细菌，能以融合形式将核蛋白质N蛋白表达至细胞表面。详细地，参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白复合物包括pgsA蛋白，pgsA蛋白基因的C-末端与猪的遗传性胃病(TGE)病毒的部分核蛋白基因的N-末端相联接。
本发明还提供了重组表面表达载体pHCE1LBA-PEDN，其能用于戈兰氏阴性和戈兰氏阳性细菌，能以融合形式将核蛋白质N蛋白表达至细胞表面。详细地，参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白复合物包括pgsA蛋白，pgsA蛋白基因的C-末端与猪腹泻疾病(PED)病毒的核蛋白基因的N-末端相联接。
本发明还提供了重组表面表达载体pHCE1LBA-PreS1、pHCE1LBA-PreS2、pHCE1LBA-PreS1PreS2，以及pHCE1LBA-L，它们能用于戈兰氏阴性和戈兰氏阳性细菌，以融合形式分别将下述蛋白表达至细胞表面exPreS1、PreS2、PreS1-PreS2或者HBV表面L(PreS1-PreS2-S)蛋白中的全部L蛋白。详细地，参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白复合物由pgsA蛋白组成，pgsA蛋白基因的C-末端分别与PreS1、PreS2、PreS1-PreS2或者全部L蛋白的N-末端相联接。
本发明还提供了重组表面表达载体pHCE1LBA-TNF-α，其能用于戈兰氏阴性和戈兰氏阳性细菌，以融合形式将TNF-α蛋白表达至细胞表面。详细地，参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白复合物由pgsA蛋白组成，pgsA蛋白基因的C-末端与一种细胞因子-肿瘤坏死因子α的N-末端相联接。
本发明还提供了重组表面表达载体pGNA-脂肪酶和pGNA-酰胺酶，其能用于戈兰氏阴性和戈兰氏阳性细菌，并将工业用酶如脂肪酶和酰胺酶，以融合形式至细胞表面。详细地，参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白复合物由pgsA蛋白组成，pgsA蛋白基因的C-末端与工业应用酶中的脂肪酶或者酰胺酶的N-末端相联接。
实施例下述实施例为本发明的实用和优选的实施例。
然而，在不偏离本发明实质精神的前提下，本领域的技术人员结合本发明所公开的内容可对本发明进行修饰和改进。
实施例1表面表达载体pGNBCA的构建利用细胞外膜蛋白基因pgsBCA参与合成源自Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸，并利用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞来制备本发明的表面表达载体，对Bacillus subtilis var.chungkookjang(目录号KCTC 0697 BP)的总染色体DNA进行了纯化。
基因pgsBCA由DNA片段pgaB、pgaC、以及pgaA组成并具有上述的连续核苷酸序列，其中DNA片段pgaB含有核苷酸序列SEQ ID NO1，DNA片段pgaC含有核苷酸序列SEQ ID NO2，DNA片段pgaA含有核苷酸序列SEQ ID NO3。
为了获得参与多聚-γ-谷氨酸生物合成的细胞内膜的N-末端和C-末端的编码基因，采用总染色体作为模板，以N-末端核苷酸序列为SEQ IDNO4(5-gaa cca tgg gct ggt tac tcc tta tag cct g-3)、C-末端核苷酸序列为SEQID NO5(5-ctc gga tcc ttt aga ttt tag ttt gtc act-3)的寡核苷酸作为引物。然后，利用上述模板和引物进行聚合酶链式反应(PCR)。
对应于N-末端的寡核苷酸引物SEQ ID NO4也可构建为含有在表达性载体pHCE19T(II)中出现的限制性酶NcoI的识别位点，而C-末端的寡核苷酸引物SEQ ID NO5也可构建为含有在表达性载体pHCE19T(II)中出现的限制性酶BamHI的识别位点。在这种情况下，测定从细胞外膜蛋白基因pgsB的N-末端区域到pgsA的C-末端区域的范围内的扩增基因片段的大小为2.8kb。通过PCR扩增的基因片段用限制性酶NcoI和BamHI消化，并插入到用NcoI和BamHI消化的高表达载体pHCE19T(II)中。结果，含有参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞内膜蛋白基因的新的表达载体并不包括翻译终止密码子，但它包括一个新的附加限制性酶识别位点，表达载体的大小约为6.5kb，它具有核苷酸序列SEQ ID NO6，并且被命名为表达载体pGNBCA(参考图1)。
将表面表达载体转化至Escherichia coli，所得细胞转化株于2001年7月26日存放在国际保藏机构以及位于Korean Research Institute of Bioscienceand Biotechnology(KRIBB)的Korean Collection for Type Cultures(KCTC52Eoeun-dong，Yusong-gu，Daejon)(目录号KCTC 10025 BP)。
实施例2表面表达载体pGNBCA-HB168的构建重组表达载体pGNBCA-HB168可表达抗原决定簇，该抗原决定簇用于产生抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体，该重组表达载体可利用细胞外膜蛋白基因pgsBCA参与合成源自Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸，并利用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞来构建。
为了将乙型肝炎病毒S抗原基因插入至利用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞的表面表达载体pGNBCA中，采用包含在常规克隆载体pUC8中的1.4kb大小的HBV基因作为模板，以核苷酸序列SEQ ID NO7以及核苷酸序列SEQ ID NO8的寡核苷酸作为引物。然后，利用上述模板和引物进行聚合酶链式反应(PCR)，从而扩增S抗原基因。结果得到168bp大小的扩增基因片段。
在这种情况下，构建的核苷酸序列SEQ ID NO7以及核苷酸序列SEQID NO8的引物也可包含限制性酶BamHI和HindIII识别位点。然后，将扩增后的乙型肝炎病毒S抗原基因用限制性酶BamHI和HindIII消化，并通过调节翻译密码子与已经制备好的参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因的C-末端区域相连接。所得的重组表达载体pGNBCA-HB168如图1所示。
实施例3利用重组表达载体pGNBCA-HB168表面表达抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体的抗原决定簇使用重组表达载体pGNBCA-HB168对产生抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体的抗原决定簇进行表面表达。
将实施例2构件的表达载体转化至E.coli中，在含有50ml的LB培养液(酵母提取物5g/L，胰化蛋白胨(trypton)10g/L，氯化钠5g/L，pH7.0)以及100mg/L抗菌素氨比西林的500ml的培养瓶中培养，使之进行表面表达。
抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体的抗原决定簇进行细菌表达，所述S抗原与参与多聚-γ-谷氨酸合成的C-末端基因进行融合，利用抗S-抗原的抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western免疫印迹法进行鉴定。将在相同细胞浓度下得到的蛋白变性，制备实验样品，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对样品进行分析，将蛋白片段转移至PVDF膜上。将所得的PVDF膜在封闭缓冲液(10ml Tris HCl，5％脱脂乳，pH8.0)中搅拌1小时进行封闭，然后与用封闭液1,000倍稀释的抗S抗原的羊的多克隆一抗反应12小时。反应完成后，将膜用同样的缓冲溶液清洗，与用封闭缓冲液稀释1,000倍的与生物素偶联的二抗反应4小时。将反应后的膜再次用缓冲液清洗，浸入抗生物素蛋白-生物素反应液中1小时，然后清洗。在浸没的膜中加入底物H2O2和DAB试剂作为染料，对膜进行染色，可观察到与抗S抗原抗体和上述融合蛋白的特异性结合(参考图2，A)。在图2中，泳道1是未转化的宿主细胞JM109，泳道2是细胞转化株pGNBCA-HB168/JM109。如所述，约48kDa的融合蛋白条带由表达载体pGNBCA-HB168制备得到。
此外，为直接证实用于产生抗乙型肝炎病毒的S抗原中和抗体的抗原决定簇在E.coli表面的表达，将诱导表面表达的E.coli转化株超声降解，通过外膜分馏法分成可溶性部分、细胞内膜部分、以及细胞外膜部分，然后利用抗S抗原的抗体通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western免疫印迹试验进行鉴别。必要地，收集如上所述的用于在细胞表面诱导融合蛋白表达的E.coli转化株以及未转化的E.coli菌株，调节至相同浓度，用缓冲溶液(10mMHEPES，pH 7.4)洗涤几次。然后，将所得物质悬浮在缓冲液(10g/mL溶菌酶，1mM PMSF，1mM EDTA)中，在4℃反应10分钟，加入DNase(0.5mg/mL)和RNase(0.5mg/mL)，将混合物用超声仪破裂，在4℃，10,000×g离心20分钟，分离未反应的E.coli和细胞碎片。然后将分离到的E.coli的细胞碎片在4℃，15,000×g离心20分钟，收集含有外周胞质和细胞质蛋白的片段。将所得的细胞沉淀用含有1％月桂酰基肌氨酸钠(N-月桂醇肌氨酸酯，钠盐)的PBS缓冲液(pH7.4)溶解，在4℃，15,000×g离心2小时并分离。
在这种情况下，将上清液分为E.coli内膜和E.coli外膜蛋白沉淀，利用抗S-抗原的抗体采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western免疫印迹法进行鉴定。在上述的E.coli片段中，在细胞外膜鉴定出可形成抗S-抗原的中和抗体的抗原决定簇(参看图2，AWestern blotting后E.coli膜部分的结果)。如图2所示，泳道1是未转化的E.coli JM 109菌株，泳道2是E.coli转化株pGNBCA-HB168/JM109的全细胞，泳道3是E.coli转化株pGNBCA-HB168/JM109的可溶性部分，泳道4是E.coli转化株pGNBCA-HB168/JM109的细胞内膜部分，泳道5是E.coli转化株pGNBCA-HB168/JM109的细胞外膜部分。
采用荧光活化细胞分类(FACS)流氏细胞仪检测法，检测到S抗原中和抗体的抗原决定簇从多聚-γ-谷氨酸合成酶蛋白的C-末端被表达至E.coli细胞的表面。在免疫荧光着色实验中，用于诱导表面表达的E.coli被以同样的细胞浓度收集，用PBS缓冲液(pH 7.4)洗几次。然后将所得的细胞沉淀用1ml含有1％牛血清白蛋白的缓冲液重悬，与1,000倍稀释的抗S抗原的羊的多克隆一抗在4℃反应12小时。反应完成后，将所得细胞再洗涤几次，用1ml含有1％牛血清白蛋白的缓冲液重新悬浮，然后与1,000倍稀释的抗S抗原的与生物素偶联的二抗在4℃反应3小时。完全反应的细胞同样用缓冲溶液洗涤几次，用0.1ml含有1％牛血清白蛋白的缓冲液重悬，然后与1,000倍稀释的对生物素特异的链亲和素-R-藻红蛋白(streptoavidin-R-phycoerythrin)染料试剂结合。
然后，将E.coli细胞重新洗涤几次，采用荧光活化细胞分类(FACS)流氏计数检测法进行测定。结果证实了可形成抗S抗原中和抗体的抗原决定簇蛋白被表达至细胞表面，与未转化的E.coli区别明显(参照图2，B)。如图2所示，白色条带描述了未转化的E.coli JM109菌株，而黑色条带是由E.coli转化株pGNBCA-HB168/JM109得到的。结果，可生成抗S抗原中和抗体的抗原决定簇蛋白在未转化的E.coli中未见表达，但在用本发明的表面表达载体转化的E.coli转化株可见到清楚表达。
实施例4重组表面表达载体pGNCA-HB101的构建以及可生成抗乙型肝炎病毒S抗原中和抗体的抗原决定簇的表面表达(1)采用源自Bacillus sp.菌株的参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsBCA，并利用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞来构建一重组表达载体，该重组表达载体用来表达形成抗乙型肝炎病毒S抗原中和抗体的抗原决定簇。
基因pgsCA具有包含SEQ ID NO2的pgsC DNA和SEQ ID NO3的pgaA DNA的连续的核苷酸序列。
为了利用参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因获得编码pgsC和pgsA蛋白的N-末端和C-末端的基因，利用其总染色体作为模板，以N-末端核苷酸序列为SEQ ID NO9、C-末端为SEQ ID NO5的寡核苷酸作为引物，进行聚合酶链式反应。
还构建了对应于N-末端的引物并包含SEQ ID.NO9的序列，它包括限制性酶NdeI的识别位点。在这种情况下，扩增的基因区域约为1.6kb，范围包括从参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsC的N-末端区域到pgsA的C-末端区域。
将通过聚合酶链式反应扩增的基因用限制性酶NdeI和BamHI消化，插入到已经用BamHI和NdeI消化的高表达载体pHCE19T(II)，从而创建一种新的大小约5.3kb的表达载体，该表达载体具有新的限制性酶识别位点，且在细胞外膜蛋白基因的末端没有终止密码子，其被称作表达载体pGNCA(参考图3)。
(2)采用与上述实施例2描述的相同的步骤构建重组表达载体pGNCA-HB168，该表达载体能表达抗原决定簇，从而形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体。详细地，该重组表达载体是采用来源于参与多聚-γ-谷氨酸合成的pgsBCA基因的细胞外膜蛋白基因pgsC和pgsA，并用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞来制备的。
如上构建的重组表达载体在图3中进行了描述。
(3)利用表面表达载体pGNCA-HB168对形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体的抗原决定簇的表达采用下述方法检测将表面表达载体转化至E.coli宿主细胞，采用与上述实施例3所述的相同的步骤诱导表达。然后，使用抗S抗原的抗体通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹的方法对该抗原决定簇在E.coli转化株中的表达进行鉴别，该抗原决定簇可形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体，且与细胞外膜蛋白pgsCA融合(参照图4)。
如图4所示，泳道1是未转化的宿主细胞JM109，泳道2是细胞转化株pGNCA-HB168/JM109。结果，鉴别到约48kDa的重组表达载体pGNCA-HB168表达的融合蛋白条带。
实施例5重组表面表达载体pGNA-HB168的构建和抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体的抗原决定簇的表面表达
(1)采用细胞外膜蛋白基因pgsA并用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞来构建重组表达载体，该重组表达载体用来表达形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体的抗原决定簇，所述细胞外膜蛋白基因来自参与多聚-γ-谷氨酸合成的源于Bacillus sp菌株的pgsBCA基因。
基因pgsA包含核苷酸序列SEQ ID NO3。
为了利用参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因获得编码pgsA蛋白的N-末端和C-末端基因，采用总染色体作为模板，以寡核苷酸为引物进行聚合酶链式反应，所述寡核苷酸含有在N-末端的SEQ ID NO10和在C-末端的SEQ ID NO5核苷酸序列。
构建与N-末端相应并包括SEQ ID NO10序列的引物，其包括限制性酶NdeI识别位点。在这一方面，扩增的基因区域约为1.1kb，范围包括从参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsA的N-末端区域到pgsA的C-末端区域。
将通过聚合酶链式反应扩增得到的基因用限制性酶NdeI和BamHI消化后插入至预先用BamHI和NdeI消化过的高表达载体pHCE19T(II)，从而制备新的被称作表达载体pGNA的表达载体，其大小约为4.8kb，具有新的限制性酶识别位点，并且在细胞外膜蛋白基因的末端没有终止密码子(参考图5)。
(2)采用与上述实施例2描述的相同的步骤构建重组表达载体pGNA-HB168，该表达载体能表达抗原决定簇，从而形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体。详细地，该重组表达载体是采用细胞外膜蛋白基因pgsA，并用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞来制备的，所述的细胞外膜蛋白基因pgsA来源于参与多聚-γ-谷氨酸合成的pgsBCA基因。
上述构建的重组表达载体pGNA-HB168在图5中有描述。
(3)利用表面表达载体pGNA-HB168对形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体的抗原决定簇的表达采用下述方法检测将表面表达载体转化至E.coli宿主细胞，采用与上述实施例3所述的相同的步骤诱导表达。然后，使用抗S抗原的抗体通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹的方法对该抗原决定簇在E.coli转化株中的表达进行鉴别，该抗原决定簇可形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体，且与细胞外膜蛋白pgsCA融合(参照图5)。
如图5所示，泳道1是未转化的宿主细胞JM109，泳道2是细胞转化株pGNA-HB168/JM109。结果，鉴别到约48kDa的重组表达载体pGNA-HB168表达的融合蛋白条带。
此外，还通过荧光活化细胞分类(FACS)流式计数检测法检测了所述抗原决定簇从细胞外膜蛋白pgsA到E.coli细胞表面的表达，该抗原决定簇能形成抗S抗原的中和抗体。为了实现这一目的，采用与实施例3相同的步骤，在细胞表面检测可形成抗S抗原的中和抗体的抗原决定簇，其与位转化的E.coli有着明显的区别(参照图4)。如图4所示，白色条带是未转化的E.coli JM109，而黑色条带来源于E.coli转化株pGNA-HB168/JM109。由此可见，未转化的E.coli并未表达能形成抗S抗原的中和抗体的抗原决定簇，而采用仅包括pgsA基因的表面表达载体转化的E.coli转化株显然在细胞表面表达了能形成抗S抗原的中和抗体的抗原决定簇。
实施例6重组表面表达载体pGNHB-A的构建和可形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体的抗原决定簇的表面表达(1)采用N-末端pgsA基因并用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞来构建重组表达载体，该重组表达载体用来表达形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体的抗原决定簇，所述N-末端pgsA基因来自源于Bacillus sp.菌株的参与多聚-γ-谷氨酸合成的pgsBCA基因。
基因pgsA包含核苷酸序列SEQ ID NO3。
为了利用参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因获得编码pgsA蛋白的N-末端和C-末端基因，采用总染色体作为模板，以寡核苷酸为引物进行聚合酶链式反应，所述寡核苷酸包括在N-末端的SEQ ID NO11和在C-末端的SEQ ID NO12核苷酸序列。
构建与N-末端相应并包括SEQ ID NO11序列的引物，其包括限制性酶BamHI识别位点。在这一方面，扩增的基因区域约为1.1kb，它包括从参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsA的N-末端区域到pgsA的C-末端区域。将通过聚合酶链式反应扩增得到的基因用限制性酶BamHI和HindIII消化后插入至预先用BamHI和HindIII消化过的高表达载体pHCE19T(II)，从而制备新的被称作表达载体pGNA2的表达载体，其大小约为4.8kb，在pgsA基因的前端具有新的限制性酶识别位点，并且在参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因的末端没有终止密码子(参考图6)。
(2)还构建了重组表达载体pGNHB-A，该表达载体能表达抗原决定簇，该抗原决定簇能形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体。详细地，该重组表达载体是采用细胞外膜蛋白基因pgsA的N-末端，并用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞来制备的，所述的细胞外膜蛋白基因pgsA来源于参与多聚-γ-谷氨酸合成的pgsBCA蛋白基因。
为了将乙型肝炎病毒S抗原基因插入表面表达载体pGNA2，采用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞，将1.4kb的肝炎病毒基因克隆至普通的克隆载体pUC18中用作模板，用带有SEQ ID NO13和SEQ ID NO14核苷酸序列的寡核苷酸为引物，通过聚合酶链式反应来扩增S抗原基因。在这种情况下，扩增的基因区域的大小约为1.6bp。
带有SEQ ID NO13和SEQ ID NO14核苷酸序列的引物还可构建为在表面表达载体pGNA2中含有限制性酶NdeI和BamHI的识别位点。扩增的乙型肝炎病毒S抗原的基因采用限制性酶NdeI和BamHI消化，并与pgsA基因的N-末端区域连接，所述pgsA基因来自参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因，该基因存在于已经通过调节翻译密码子的方法制备的表面表达载体pGNA2中。上述构建的重组表达载体pGNHB-A在图6中有描述。
(3)利用表面表达载体pGNHB-A对形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体的抗原决定簇的表达采用下述方法检测将表面表达载体转化至E.coli宿主细胞，采用与上述实施例3所述的相同的步骤诱导表达。然后，使用抗S抗原的抗体通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹的方法对该抗原决定簇在E.coli转化株中的表达进行鉴别，该抗原决定簇可形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体，且与细胞外膜蛋白pgsCA融合(参照图5)。
如图5所示，泳道1是未转化的宿主细胞JM109，泳道2是细胞转化株pGNHB-A/JM109。结果，鉴别到约48kDa的由重组表达载体pGNHB-A表达的融合蛋白条带。
实施例7重组表面表达载体pGNC-PreS1的构建和形成抗乙型肝炎病毒PreS1抗原的中和抗体的抗原决定簇的表面表达(1)采用C-末端pgsC基因并用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞来构建重组表达载体，该重组表达载体用来表达可形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体的抗原决定簇，所述C-末端pgsC基因来自参与多聚-γ-谷氨酸合成的源于Bacillus sp.菌株的pgsBCA基因。
基因pgsC包含核苷酸序列SEQ ID NO2。
为了从参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因中获得编码pgsA蛋白的N-末端和C-末端基因，采用总染色体作为模板，以寡核苷酸为引物进行聚合酶链式反应，所述寡核苷酸包括在N-末端的SEQ ID NO15和在C-末端的SEQ ID NO16核苷酸序列。
构建包含SEQ ID NO15序列的N-末端引物，该引物包括存在于表面表达载体pHCE 19T(II)上的限制性酶NdeI识别位点，而所构建的包含SEQID NO16序列的引物包括存在于表面表达载体pHCE 19T(II)上的限制性酶BamHI识别位点。在这一方面，扩增的基因区域约为0.45kb，范围包括从参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsC的N-末端区域到pgsC的C-末端区域。将通过聚合酶链式反应扩增得到的基因用限制性酶BamHI和NdeI消化后插入至预先用BamHI和NdeI消化过的高表达载体pHCE19T(II)，从而制备新的被称作表达载体pGNC的表达载体，其大小约为4.1kb，具有新的限制性酶识别位点，并且在参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因的末端没有终止密码子(参考图7)。
(2)还构建了重组表达载体pGNC-PreS1，该表达载体能表达抗原决定簇，该抗原决定簇能形成抗乙型肝炎病毒PreS1表面抗原的中和抗体。详细地，该重组表达载体是采用细胞外膜蛋白基因pgsC的N-末端序列并用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞来制备的，所述的细胞外膜蛋白基因pgsC来源于参与多聚-γ-谷氨酸合成的pgsBCA蛋白基因。
为了将乙型肝炎病毒PreS1抗原基因插入表面表达载体pGNC，采用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞，以克隆至普通的克隆载体pUC18的约1.5kb的肝炎病毒基因作为模板，以带有SEQ ID NO17和SEQ ID NO18核苷酸序列的寡核苷酸为引物，通过聚合酶链式反应来扩增S抗原基因。在这种情况下，扩增的基因区域的大小约为356bp。
带有SEQ ID NO17和SEQ ID NO18核苷酸序列的引物还可构建为含有存在于表面表达载体pGNC中的限制性酶HindIII和BamHI的识别位点。扩增的乙型肝炎病毒PreS1抗原的基因采用限制性酶HindIII和BamHI消化，并与pgsC基因的N-末端区域连接，所述pgsC基因来自参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因，该基因存在于已经通过调节翻译密码子的方法制备的表面表达载体pGNC中。上述构建的重组表达载体pGNC-PreS1在图7中有描述。
(3)利用表面表达载体pGNC-PreS1对形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体的抗原决定簇的表达采用下述方法检测将表面表达载体转化至E.coli宿主细胞，采用与上述实施例3所述的相同的步骤诱导表达。然后，使用抗PreS1抗原的抗体通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹的方法对抗原决定簇在E.coli转化株中的表达进行鉴别，该抗原决定簇可形成抗乙型肝炎病毒PreS1抗原的中和抗体，且与细胞外膜蛋白pgsC融合(参照图8)。
如图8所示，泳道1是未转化的宿主细胞JM109，泳道2和3是细胞转化株pGNC-PreS1/JM109。结果，鉴别到约27kDa的由重组表达载体pGNC-PreS1表达的融合蛋白条带。
实施例8重组表面表达载体pHCE1LBBCA和pHCE1LBBCA-HB168的构建和产生抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体的抗原决定簇的表面表达(1)采用C-末端pgsC基因并用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞来构建重组表达载体pHCE1LBBCA，该重组表达载体用来使形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体的抗原决定簇表达至细胞表面，所述C-末端pgsC基因来自参与多聚-γ-谷氨酸合成的源于Bacillus sp.菌株的pgsBCA基因。
由于质粒pHCE1LB在戈兰氏阴性和戈兰氏阳性细菌内都能被接收并且能复制，因此采用该质粒作为克隆载体。表达载体pHCE1LB由构成性高表达HCE启动子、包括多个限制性酶识别位点的克隆位点、在戈兰氏阴性细菌中的可复制起点、以及对氨比西林的抗生素抗性标记所组成。此外，表面表达载体pHCE1LB由来源于Lactobacillus sp.的戈兰氏阳性细菌的可复制起点和对氯霉素(chloroamphenicol)的抗生素抗性标记所组成。
为了获得编码pgsBCA蛋白的N-末端和C-末端基因，采用总染色体作为模板，以寡聚核苷酸为引物进行聚合酶链式反应，所述pgsBCA蛋白为参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白中之一，所述寡聚核苷酸包括在N-末端的SEQ ID NO4和在C-末端的SEQ ID NO5核苷酸序列。由此得到的扩增的基因区域的大小约为2.8kb，范围包括从参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsB的N-末端区域到pgsA的C-末端区域。将通过聚合酶链式反应扩增得到的基因用限制性酶NcoI和BamHI消化后插入至预先用BamHI和NcoI消化过的表达载体pHCE1LB，从而制备新的被称作pHCE1LBBCA的表达载体，其大小约为8kb，具有新的限制性酶识别位点，在参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因的末端没有终止密码子，并且可利用戈兰氏阴性或者戈兰氏阳性细菌作为宿主细胞(参考图9)。
(2)还构建了重组表达载体pHCE1LBBCA-HB168，该表达载体能表达抗原决定簇，该抗原决定簇能形成抗乙型肝炎病毒S表面抗原的中和抗体。详细地，采用与上述相同的步骤，即利用参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsBCA，并且用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞来制备重组表达载体。
上述构建的重组表达载体pHCE1LBBCA-HB168在图9中有描述。
(3)利用表面表达载体pHCE1LBBCA-HB168和Salmonella typhiTy21a作为戈兰氏阴性宿主细胞对形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体的抗原决定簇的表达采用下述方法检测将表面表达载体转化至Salmonella typhi Ty21a宿主细胞，采用与上述实施例3所述的相同的步骤诱导表达。然后，利用外膜分类法(outermembrane fractionation)分开可溶性部分、内膜部分和外膜部分，并对分离的部分采用抗S抗原的抗体通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹的方法对抗原决定簇在Salmonella typhi Ty21a转化株的细胞表面的表达进行鉴别。结果显示，产生了大小为48kDa、可与pgsA融合的、可形成抗S抗原的中和抗体的抗原决定簇条带，且该抗原决定簇位于Salmonella typhiTy21a的外膜部分(参照图10)。如图10所示，泳道1是未转化的宿主细胞JM109，泳道2是细胞转化株的全细胞，泳道3、4和5分别是细胞转化株的可溶性部分、外膜部分和内膜部分。
此外，还通过荧光活化细胞分类(FACS)流式计数检测法检测了能形成抗S抗原的中和抗体的抗原决定簇的表面表达。为了实现这一目的，采用与实施例3相同的步骤，在细胞表面检测抗原决定簇蛋白，其与未转化的Salmonella typhi Ty21a有着明显的区别(参照图10)。如图10所示，黑色没有箭头的是未转化的Salmonella typhi Ty21a，而黑色有箭头的是转化的Salmonella typhi Ty21a。由此可见，用表面表达载体转化的E.coli转化株很显然能将形成抗S抗原的中和抗体的抗原决定簇表达至细胞表面。
实施例9用于将可形成抗S抗原的中和抗体的抗原决定簇表达至细胞表面的微生物中疫苗效力的分析构建用于实施例8中表面表达的重组载体pHCE1LBBCA-HB168，将该载体转化至戈兰氏阴性细菌Salmonella typhi Ty21a中，利用与实施例3相同的步骤诱导在细胞表面的表达。然后，检测能形成抗S抗原的中和抗体且与参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白融合的抗原决定簇的抗原性。
首先，将用于表面表达的重组载体pHCE1LBBCA-HB168转化至Salmonella typhi Ty21a中，检测上述抗原的表达。然后，将一部分Samonella菌株通过鼻腔给药方式给予BALB/C小鼠，几天以后(1)收集小鼠血清，检测血清中存在的抗S抗原的IgG抗体，以及(2)收集小鼠各器官，利用酶联免疫吸附检测方法(ELISA)检测用于洗涤器官的悬浮溶液中抗S抗原的IgA抗体的存在。
在该测定中，用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤收集的细胞，并调节至相同的细胞浓度，然后取表面有抗原表面表达的Salmonella typhi Ty21a细胞2×109个，用鼻腔给药的方式给予4～6周龄的BALB/C小鼠，共给予两次，两次之间的间隔为3天。4周以后，再注射给药2次，两次之间的间隔为3天。2周以后收集血清和用于洗涤器官的溶液，利用ELISA的方法检测抗该抗原的抗体的滴度(参照图11)。
如图11所示，框图A所示为血清中抗S抗原决定簇的IgG抗体的滴度也就是未转化的Salmonella的滴度、用表达载体pHCE1LBBCA-HB168转化的Samonella的滴度、以及用表达载体pHCE1LBHB168转化的Samonella的滴度。在图11中，框图B所示为组织中抗S抗原决定簇的IgA抗体的滴度也就是未转化的Salmonella的滴度、用表达载体pHCE1LBHB168转化的Samonella的滴度、以及用表达载体pHCE1LBBCA-HB168转化的Samonella的滴度。
如图11所示，用表面表达载体pHCE1LBBCA-HB168转化的Salmonella typhi Ty21a转化株的BALB/c小鼠的血清和用于洗涤器官的溶液中有更高滴度的IgG和IgA，且与其他各组的结果有明显的差别。
因此，证实了本发明的微生物可用作有效的活疫苗，所述微生物可将形成抗乙型肝炎病毒S抗原中和抗体的抗原决定簇表达至细胞表面。
实施例10形成抗乙型肝炎S抗原的中和抗体的抗原决定簇在以表达载体pHCE1LBBCA-HB168转化的戈兰氏阳性细菌表面的表达研究了如实施例8所示的可形成抗乙型肝炎S抗原的中和抗体的抗原决定簇在戈兰氏阳性细菌Lactobacillus casei表面的表达，所述细菌采用为表面表达所构建的重组载体pHCE1LBBCA-HB168转化。
将如上制备的用于表面表达的重组载体转化至Lactobacillus casei并在含有200ml MRS介质和50mg/L抗生素氯霉素的500ml培养瓶(flask)的稳定状态下培养，从而诱导表面表达。
为了对位于Lactobacillus casei细胞表面的抗原决定簇进行定位，利用细胞壁分馏法(cell wall fractionation method)将细胞转化株分离成片段，诸如细胞质和细胞壁等，然后利用抗S抗原的抗体通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹的方法对上述分离的部分进行分析。利用相同的细胞浓度收集将融合蛋白诱导表达至细胞表面的Lactobacillus转化株和未转化的Lactobacillus，用TES缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，25％蔗糖)洗涤几次，用含有5mg/ml溶解酶、1mM PMSF、以及1mM EDTA的蒸馏水重悬，然后分别在-60℃和室温冷冻及溶解几次。所得的细胞加入0.5mg/ml的DNase和0.5mg/ml的RNase，用超声仪裂解。然后，将超声裂解后的细胞溶液在4℃，10,000Xg离心20分钟分离出Lactobacillus全细胞沉淀(全细胞部分)，即未被超声的部分以及细胞碎片(上清部分)，然后再在4℃，21,000Xg离心1小时，收集包含Lactobacillus细胞质蛋白的上清液以及细胞沉淀。将所得的细胞沉淀用含有1％SDS的TE缓冲液(10mMTris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，pH 7.4)重悬，收集Lactobacillus的细胞壁蛋白(细胞壁片段)。
利用抗S抗原的抗体通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western免疫印迹方法对每一部分进行分析，确定细胞壁上可形成抗S抗原中和抗体的抗原决定簇的位点(参照图12A)。如图12所示，泳道1、3和5是未转化Lactobacillus casei，泳道2是用表达载体pHCE1LBBCA-HB168转化的Lactobacillus casei全细胞，泳道4和6分别是转化细胞的可溶性部分和细胞壁部分。
此外，采用荧光活化细胞分类(FACS)流氏计数检测法检测到形成S抗原中和抗体的抗原决定簇从多聚-γ-谷氨酸合成酶蛋白的C-末端的表达。为了这一目的，采用与实施例3所述的相同的步骤，结果显示在细胞表面显示有抗原决定簇蛋白，这一点与未转化的Lactobacillus有明显区别(参照图12B)。如图12B所示，白色带为未转化的Lactobacillus，黑色条带来自于采用表达载体pHCE1LBBCA-HB168转化的Lactobacillus细胞。结果显示，用表面表达载体转化的Lactobacillus转化株能明显将形成抗S抗原的中和抗体的抗原决定簇表达至细胞表面。
实施例11将形成抗乙型肝炎S抗原的中和抗体的抗原决定簇表达至细胞表面的微生物进行疫苗效力2的分析构建用于实施例8中表面表达的重组载体pHCE1LBBCA-HB168，将该载体转化至戈兰氏阳性细菌Lactobacillus casei中，利用与实施例3相同的步骤诱导在细胞表面的表达。然后，检测能形成抗乙型肝炎S抗原的中和抗体且与参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白融合的抗原决定簇的抗原性。
首先，将构建的用于表面表达的重组载体pHCE1LBBCA-HB168转化至Lactobacillus casei中，收集并使之达到相同的细胞浓度，用PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤几次，然后，取表面表达了抗原的Lactobacillus细胞5×1010个，通过口腔给药的方式给予4-6周龄的BALB/c小鼠，共给予3次，每次之间的时间间隔为1天，4周以后再给予3次，间隔为1天。此外，取表面表达了抗原的Lactobacillus细胞1×1010个，通过鼻腔给药的方式给予BALB/c小鼠，共给予2次，每次之间的时间间隔为3天，4周以后再给予2次，间隔为3天。口腔和鼻腔给药2周后(1)收集小鼠血清，检测血清中存在的抗S抗原的IgG抗体滴度，以及(2)收集小鼠各器官，利用酶联免疫吸附检测方法(ELISA)检测用于洗涤器官的悬浮溶液中抗S抗原的IgA抗体的存在(参照图13)。
如图13所示，框图A所示为血清中抗S抗原决定簇的IgG抗体的滴度也就是在鼻腔给药组中以表达载体pHCE1LBBCA-HB168转化的Lactobacillus中的滴度、在口腔给药组中以表达载体pHCE1LBBCA-HB168转化的Lactobacillus中的滴度、在口腔给药组中以表达载体pHCE1LBHB168(其中pgsBCA基因缺失，使用该载体细胞能表达HB168)转化的Lactobacillus中的滴度、以及口腔给药组中未转化的Lactobacillus中的滴度。在图13中，框图B所示为器官中抗S抗原决定簇的IgA抗体的滴度也就是未转化的Lactobacillus中的滴度、以表达载体pHCE1LBHB168转化的Lactobacillus中的滴度、以及以表达载体pHCE1LBBCA-HB168转化的Lactobacillus中的滴度。利用不同的分组进行试验鼻腔给药组和口腔给药组。
如图11所示，给予以表面表达载体pHCE1LBBCA-HB168转化的Lactobacillus转化株的BALB/c小鼠的血清和用于洗涤器官的溶液中有更高滴度的IgG和IgA，且与其他各组的结果有明显的差别。
因此，证实了本发明的微生物可用作有效的活疫苗，所述微生物可将形成抗乙型肝炎病毒S抗原中和抗体的抗原决定簇表达至细胞表面。
实施例12表面表达载体pHCE1LBA的构建仅利用细胞外膜蛋白基因pgsA来构建重组表达载体，所述重组表达载体可表达形成抗乙型肝炎S抗原中和抗体的抗原决定簇，所述pgsA基因为来源于Bacillus sp.菌株的参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsBCA即表面表达载体pHCE1LBA，其能利用戈兰氏阴性细菌或戈兰氏阳性细菌作为宿主细胞。
为了获得参与多聚-γ-谷氨酸生物合成的细胞外膜蛋白中编码pgsA蛋白的N-末端和C-末端的编码基因，采用总染色体作为模板，以N-末端核苷酸序列为SEQ ID NO10、C-末端核苷酸序列为SEQ ID NO5的寡核苷酸作为引物，进行聚合酶链式反应。
在这种情况下，测定扩增基因区域的大小约为1.1kb，范围包括从参与多聚-γ-谷氨酸生物合成的外膜蛋白基因pgsA的N-末端区域到C-末端区域。通过聚合酶链式反应扩增的基因用限制性酶NdeI和BamHI消化，并插入至预先以BamHI和NdeI消化的表达载体pHCE1LB中，从而构建新的表达载体pGNCA，该表达载体大小约为6.3kb，具有新的限制性酶识别位点，在细胞外膜蛋白基因的末端不包括翻译终止密码子，其能利用戈兰氏阴性细菌或戈兰氏阳性细菌作为宿主细胞(参考图14)。
实施例13重组表面表达载体pHCE1LBA-TGEN1的构建以及TGE N抗原的表面表达利用pgsA基因以及戈兰氏阴性细菌或戈兰氏阳性细菌作为宿主细胞构建重组表达载体pHCE1LBA-TGEN1，所述重组表达载体可将诱导猪遗传性胃病的遗传性胃肠炎病毒(TGE)的核蛋白(N)抗原表达至细胞表面，所述pgsA基因来源于Bacillus sp.菌株的参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsBCA。
为了将TGE病毒的N抗原基因的主要抗原决定簇区域引入表面表达载体pHCE1LBA中，如实施例12所述，利用戈兰氏阴性细菌或戈兰氏阳性细菌作为宿主细胞，约1.1kb的TGE病毒基因克隆至通用的克隆载体pUC8中用作模板，以核苷酸序列为SEQ ID NO19和SEQ ID NO20的寡核苷酸作为引物，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增S抗原基因。结果得到大小为415bp的扩增基因片段。在这种情况下，还可构建核苷酸序列为SEQ IDNO19和SEQ ID NO20的寡核苷酸引物使其含有存在于表面表达载体pHCE1LBA的限制性酶BamHI和HindIII的识别位点。
接下来，用限制性酶BamHI和HindIII消化扩增的TGE病毒的N抗原基因，并通过调整翻译密码子的方式将其连接至表面表达载体pHCE1LBA中的细胞外膜蛋白基因pgsA的C-末端区域。所得的重组表达载体pHCE1LBA-TGEN1如图1所示。
采用重组表达载体pHCE1LBA-TGEN1在E.coli和Lactobacillus中研究TGE病毒N抗原的表面表达。为实现这一目的，将重组表达载体转化至E.coli和Lactobacillus中，采用与上述相同的步骤诱导表达。分别利用抗TGEN抗原和pgsA蛋白的抗体，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western免疫印迹的方法证实了与细胞外膜蛋白融合的TGE N抗原在细胞表面的表达(参考图15)。
如图15所示，在A中，泳道1是未转化的宿主细胞JM109，泳道2和3是细胞转化株pHCE1LBA-TGEN1/JM109，在B中，泳道1是未转化的宿主细胞Lactobacillus casei，泳道3和4是Lactobacillus casei的转化株pHCE1LB-TGEN1。结果显示，鉴别到大小约57kDa的条带，该条带对应于从表达载体pHCE1LBA-TGEN1制备的融合蛋白。
实施例14重组表面表达载体pHEC1LBA-PEDN的构建以及PED N抗原的表面表达(1)利用pgsA基因以及戈兰氏阴性细菌或戈兰氏阳性细菌作为宿主细胞构建重组表达载体pHCE1LBA-PEDN，所述重组表达载体可将诱导猪遗传性胃病的猪流行性痢疾病毒(PED)的核蛋白(N)抗原表达至细胞表面，所述pgsA基因来源于Bacillus sp.菌株的参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsBCA。
为了将PED病毒的N抗原基因的抗原决定簇区域引入表面表达载体pHCE1LBA中，如实施例12所述，利用戈兰氏阴性细菌或戈兰氏阳性细菌作为宿主细胞，约1.3kb的PED病毒基因克隆至通用的克隆载体pUC8中用作模板，以核苷酸序列为SEQ ID NO21和SEQ ID NO22的寡核苷酸作为引物，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增S抗原基因。结果得到大小为1326bp的扩增基因片段。在这种情况下，还可构建核苷酸序列为SEQ ID NO21和SEQ ID NO22的核苷酸引物使其含有存在于表面表达载体pHCE1LBA的限制性酶BamHI和HindIII的识别位点。
接下来，用限制性酶BamHI和HindIII消化扩增的PED病毒的N抗原基因，并通过调整翻译密码子的方式将其连接至表面表达载体pHCE1LBA中细胞外膜蛋白基因pgsA的C-末端区域。所得的重组表达载体pHCE1LBA-PEDN如图14所示。
(2)采用重组表达载体pHCE1LBA-PEDN在E.coli和Lactobacillus中研究PED病毒N抗原的表面表达。为实现这一目的，将重组表达载体转化至E.coli和Lactobacillus中，采用与上述相同的步骤诱导表达。分别利用抗PED N抗原和pgsA蛋白的抗体，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western免疫印迹的方法证实了与细胞外膜蛋白融合的PED N抗原在细胞表面的表达(参考图16)。
如图16所示，在A中，泳道1是未转化的宿主细胞JM109，泳道2和3是细胞转化株pHCE1LBA-TGEN1/JM109，在B中，泳道1是未转化的宿主细胞Lactobacillus casei，泳道2是Lactobacillus casei的转化株pHCE1LBA，泳道3是Lactobacillus casei的转化株pHCE1LBA-PEDN。
如上图所述，鉴别到大小约90kDa的条带，该条带对应于从表达载体pHCE1LBA-PEDN制备的融合蛋白。
实施例15用于将TGE病毒和PED病毒的N抗原表达至细胞表面的Lactobacillus的疫苗效力2的分析分别构建用于实施例13和14中表面表达的重组载体pHCE1LBA-TGEN1和pHCE1LBA-PEDN，将该载体转化至戈兰氏阳性细菌Lactobacillus casei中，利用与实施例3相同的步骤诱导在细胞表面的表达。然后，检测与参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白融合的TGE病毒N抗原和PED病毒N抗原的抗原性。
首先，将构建的用于表面表达的重组载体pHCE1LBA-TGEN1和pHCE1LBA-PEDN转化至Lactobacillus casei中，收集并使之达到相同的细胞浓度，用PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤几次，然后，取表面表达了N抗原的Lactobacillus细胞5×10个，各自通过口腔给药的方式给予4-6周龄的BALB/c小鼠，共给予3次，每次之间的时间间隔为1天，1周以后再给予3次，间隔为1天。第一次给药4周以后(1)收集小鼠血清，利用N抗原通过Western印迹的方法检测抗N抗原的IgG抗体的存在(参照图17)。
结果如图17所示，给予了用表面表达载体pHCE1LBA-TGEN1(A)或者pHCE1LBA-PEDN(B)转化的Lactobacillus转化株的BALB/c小鼠的血清中含有抗N抗原的抗体。
实施例16重组表达载体pHCE1LBA-PreS1的构建以及PreS1抗原的表面表达(1)仅利用来源于Bacillus sp.菌株的参与多聚-γ-谷氨酸合成的pgsBCA基因的细胞外膜蛋白基因pgsA基因构建重组表达载体，该重组表达载体可将来源于乙型肝炎S抗原的PreS1抗原表达至细胞表面，即表面表达载体pHCE1LBA-PreS1，所述pgsA基因可利用戈兰氏阴性细菌或戈兰氏阳性细菌作为宿主细胞。
为了将来源于乙型肝炎病毒表面抗原的PreS1抗原决定簇引入表面表达载体pHCE1LBA中，如实施例12所述，利用戈兰氏阳性细菌或戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞，约1.5kb的乙型肝炎病毒基因克隆至通用的克隆载体pUC8中作为模板，以包含核苷酸序列SEQ ID NO17和SEQ ID NO18的寡核苷酸作为引物，进行聚合酶链式反应。
接下来，用限制性酶BamHI和HindIII消化扩增的HBV S抗原基因，并通过调整翻译密码子的方式将其连接至表达载体pHCE1LBA中细胞外膜蛋白基因pgsA的C-末端区域，从而得到如图18所示的新的被称作pHCE1LBA-PreS1的重组表达载体。
(2)采用重组表达载体pHCE1LBA-PreS1在E.coli中研究乙型肝炎病毒PreS1抗原的表面表达。为实现这一目的，将重组表达载体转化至E.coli中，采用与实施例3相同的步骤诱导表达。利用抗PreS1抗原的抗体通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western免疫印迹的方法证实了与细胞外膜蛋白pgsA融合的PreS1抗原在细胞表面的表达(参考图20中A)。
如图20所示，在A中，泳道1是未转化的宿主细胞JM109，泳道2是细胞转化株pHCE1LBA-PreS1/JM109。
如上图所述，鉴别到大小约55kDa的条带，该条带对应于从表达载体pHCE1LBA-TGEN1制备的融合蛋白。
实施例17重组表面表达载体pHCE1LBA-PreS2的构建利用来源于Bacillus sp.菌株的参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白pgsBCA基因的pgsA基因，并利用及戈兰氏阴性细菌或戈兰氏阳性细菌作为宿主细胞构建重组表达载体pHCE1LBA-PreS2，所述重组表达载体pHCE1LBA-PreS2可将来源于乙型肝炎病毒表面抗原的PreS2抗原表达至细胞表面。
为了将乙型肝炎病毒的PreS2抗原基因的抗原决定簇区域引入表面表达载体pHCE1LBA中，如实施例12所述，利用戈兰氏阴性细菌或戈兰氏阳性细菌作为宿主细胞，约1.3kb的乙型肝炎病毒基因克隆至通用克隆载体pUC8中用作模板，以包含核苷酸序列SEQ ID NO23和SEQ ID NO24的寡核苷酸作为引物，进行聚合酶链式反应从而扩增PreS2抗原基因。该扩增得到大小约165bp的扩增基因区域。构建的包含SEQ ID NO23和SEQ IDNO24的引物还进一步含有存在于表面表达载体pHCE1LBA中的包括限制性酶BamHI和HindIII的识别位点。
用限制性酶BamHI和HindIII消化通过聚合酶链式反应扩增的HBVPreS2抗原基因，并通过调整翻译密码子的方式将其连接至表达载体pHCE1LBA中细胞外膜蛋白基因pgsA的C-末端区域，从而得到如图18所示的新的被称作pHCE1LBA-PreS2的重组表达载体。
实施例18重组表达载体pHEC1LBA-PreS1PreS2的构建以及PreS1抗原的表面表达(1)仅利用来源于Bacillus sp.菌株的参与多聚-γ-谷氨酸合成的pgsBCA基因的细胞外膜蛋白基因pgsA构建重组表达载体，所述重组表达载体可将PreS1抗原和PreS2抗原的融合形式表达至细胞表面，所述PreS1抗原和PreS2抗原来源于乙型肝炎病毒表面抗原所述重组表达载体即为pHEC1LBA-PreS1PreS2，其可利用及戈兰氏阴性细菌或戈兰氏阳性细菌作为宿主细胞。
为了将来源于乙型肝炎病毒表面抗原的PreS1和PreS2的抗原决定簇引入表面表达载体pHCE1LBA中，如实施例12所述，利用戈兰氏阳性细菌或戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞，约1.5kb的乙型肝炎病毒基因克隆至通用的克隆载体pUC8中用作模板，以包含核苷酸序列SEQ ID NO17和SEQ IDNO24的寡核苷酸作为引物，进行聚合酶链式反应。该反应得到大小约522bp的基因扩增区域。
接下来，用限制性酶BamHI和HindIII消化扩增的HBV PreS1PreS2抗原基因，并通过调整翻译密码子的方式将其连接至表达载体pHCE1LBA中细胞外膜蛋白基因pgsA的C-末端区域，从而得到如图19所示的新的被称作pHCE1LBA-PreS1PreS2的重组表达载体。
(2)采用重组表达载体pHCE1LBA-PreS1PreS2在E.coli中研究HBVPreS1和PreS2抗原的表面表达。为实现这一目的，将重组表达载体转化至E.coli中，采用与实施例3相同的步骤诱导表达。利用抗PreS1抗原的抗体通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western免疫印迹的方法证实了与细胞外膜蛋白pgsA融合的PreS1PreS2抗原在细胞表面的表达(参考图20中A)。如图20所示，在A中，泳道1是未转化的宿主细胞JM109，泳道3是细胞转化株pHCE1LBA-PreS1PreS2/JM109。
如上图所述，鉴别到大小约60kDa的条带，该条带对应于从表达载体pHCE1LBA-TGEN1制备的融合蛋白。
实施例19重组表面表达载体pHEC1LBA-L的构建以及L抗原的表面表达(1)利用来源于Bacillus sp.菌株的参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsBCA的pgsA基因，并利用戈兰氏阳性或戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞构建重组表达载体pHCE1LBA-L，所述重组表达载体pHCE1LBA-L可将来源于乙型肝炎病毒表面抗原的PreS1和PreS2及S抗原的融合形式表达至细胞表面。构建的包含SEQ ID NO25的引物还包括存在于表面表达载体pHCE1LBA中的限制性酶BamHI和HindIII识别位点。
用限制性酶BamHI和HindIII消化扩增的乙型肝炎病毒的L基因，并通过调整翻译密码子的方式将其连接至来源于细胞外膜基因的pgsA基因的C-末端区域。重组表达载体pHCE1LBA-L如图19所示。
(3)采用重组表达载体pHCE1LBA-L在E.coli中研究L抗原，即包括PreS1、PreS2以及S抗原的融合抗原的表面表达。为实现这一目的，将表面表达载体转化至E.coli宿主细胞中，采用与实施例3相同的步骤诱导表达。利用抗PreS1抗原的抗体通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western免疫印迹的方法证实了与细胞外膜蛋白pgsA融合的L抗原的表达(参考图20中B)。如图20所示，在A中，泳道1是未转化的宿主细胞JM109，泳道2和3是细胞转化株pHCE1LBA/JM109。
如上图所述，鉴别到大小约86kDa的条带，该条带对应于由重组表达载体pHCE1LBA-L表达的融合蛋白。
实施例20重组表面表达载体pHCE1LBA-TNF-α的构建利用来源于Bacillus sp.菌株的参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsBCA的pgsA基因，并利用及戈兰氏阳性或戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞构建重组表达载体pHCE1LBA-TNF-α，所述重组表达载体pHCE1LBA-TNF-α可将肿瘤坏死因子α(TNF-α)——一种制药或者临床应用的蛋白，的融合形式表达至细胞表面。
为了将TNF-α基因引入表面表达载体pHCE1LBA中，如实施例12所述，利用戈兰氏阳性或戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞，约0.5kb的TNF-α基因克隆至通用的克隆载体pUC8中用作模板，以包含核苷酸序列SEQ IDNO26和SEQ ID NO27的寡核苷酸作为引物，进行聚合酶链式反应。该扩增得到大小为482bp的基因扩增区域。构建的包含SEQ ID NO26和SEQID NO27的引物还包含存在于表面表达载体pHCE1LBA中的限制性酶BamHI和HindIII的识别位点。
用限制性酶HindIII和BamHI消化扩增的乙型肝炎病毒L基因，并通过调整翻译密码子的方式将其连接至参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜基因的C-末端区域，从而得到如图21所示的重组表达载体pHCE1LBA-TNF-α。
实施例21重组表面表达载体pGNA-脂肪酶的构建以及脂肪酶的表面表达利用pgsA基因以及戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞构建重组表达载体pGNA-脂肪酶，所述重组表达载体可将脂肪酶表达至细胞表面，所述pgsA基因来源于Bacillus sp.菌株的参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsBCA。
为了将脂肪酶基因引入表面表达载体pGNA中，利用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞，约0.5kb的脂肪酶基因克隆至通用的克隆载体pUC8中用作模板，以包含核苷酸序列为SEQ ID NO28和SEQ ID NO29的寡核苷酸作为引物，进行聚合酶链式反应。结果得到大小为546bp的扩增基因片段。包含SEQ ID NO28和SEQ ID NO29的引物还进一步构建为含有表面表达载体pGNA中的限制性酶BamHI和HindIII的识别位点。
用限制性酶BamHI和HindIII消化扩增的乙型肝炎病毒的L基因，并通过调整翻译密码子的方式将其连接至参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜基因的C-末端区域。按上述方法构建得到的重组表达载体pGNA-脂肪酶如图22所示。
(2)采用重组表达载体pGNA-脂肪酶在E.coli中研究脂肪酶基因的表面表达。为实现这一目的，将重组表达载体pGNA-脂肪酶转化至E.coli中，采用与上述实施例3相同的步骤诱导表达。然后，在包含1％的具有油降解活性的三辛酸甘油酯的琼脂介质(1％胰化蛋白胨(trypton)、0.5％酵母提取物、0.619％NaCl、0.5％阿拉伯胶、1mM CaCl、1％三辛酸甘油酯)中检测表达至细胞表面的脂肪酶的活性。将E.coli转化株涂至含有1％油性底物的琼脂介质表面，然后在37℃稳定状态下培养9小时。
结果，油性底物降解变为清楚的区域(参考图22)，从而证实了脂肪酶在细胞表面的表达。
实施例22重组表面表达载体pGNA-酰胺酶的构建以及酰胺酶的表面表达
(1)利用pgsA基因以及戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞构建重组表达载体pGNA-酰胺酶，所述重组表达载体可将酰胺酶表达至细胞表面，所述pgsA基因来源于Bacillus sp.菌株的参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsBCA。
为了将酰胺酶基因引入表面表达载体pGNA中，利用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞，约0.8kb的酰胺酶基因克隆至E.coli表达载体pGNA中用作模板，以包含核苷酸序列为SEQ ID NO30和SEQ ID NO31的寡核苷酸作为引物，进行聚合酶链式反应。结果得到大小为792bp的扩增基因片段。包含SEQ ID NO30和SEQ ID NO31的引物还进一步被构建为含有表面表达载体pGNA中限制性酶BamHI和HindIII的识别位点。
用限制性酶HindIII和BamHI消化扩增的乙型肝炎病毒的L基因，并通过调整翻译密码子的方式将其与参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜基因C-末端区域的表面表达载体pGNA相连接。按上述方法构建得到的重组表达载pGNA-酰胺酶如图23所示。
(2)采用重组表达载体pGNA-酰胺酶在E.coli中研究酰胺酶基因的表面表达。为实现这一目的，将重组表达载体pGNA-脂肪酶转化至E.coli中，采用与上述实施例3相同的步骤诱导表达。然后，在E.coli中加入100mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0，其中含有10mM的D-alaNH作为底物，并含有0.5mM的CoCl作为辅助因子)，检测表达至细胞表面的酰胺酶的活性。详细地，反应几小时后，利用HPLC(Hypersil ODS；250×4.6mm柱)对表面表达了酰胺酶的E.coli进行检测，在600nm的OD值为1的细胞生长作为一个单位体积。利用上述方法比较野生型E.coli和包含表面表达载体pGNA的细胞转化株中表达至细胞表面的酰胺酶的酶活性。
如图23所示，与对照组相比，可发现本发明的E.coli转化株的酰胺酶活性升高了100倍。因此，证实了本发明的表面表达方法可有效地将酰胺酶表达至细胞表面。
工业实用性如上所示及所证，本发明的新的表达载体可在微生物表面有效制备外源性蛋白，它是利用来源于Bacillus sp.菌株的参与多聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsBCA作为表面表达的载体从而在微生物表面产生外源蛋白，并且该载体在戈兰氏阴性细菌及戈兰氏阳性细菌都能稳定应用。采用表面表达载体转化的细胞转化株包括外源性目的蛋白的插入位点，从而制备所连接的编码外源性蛋白的外源性基因，通过培养使之进行细胞表面表达。
本发明的表面表达载体可有效用作多种外源性蛋白在细胞表面的稳定和易测的表达，该方法不用考虑细胞周期的情况。因此，这种微生物表面表达系统可用于制备多种抗原、重组抗体、重组酶、以及连接或吸附蛋白，可筛选多种抗原和抗体，并能制备用于生物转化的酶类。实际上，这些酶可被表达至细胞表面且其催化活性没有任何降低，从而可使本发明工业应用于生物转化的目的。
本领域的技术人员利用本发明公开的思想以及前述说明书中特定的实施例可以很容易地修改或者设计出其它的实施例，从而实现与本发明相同的目的。
本领域的技术人员同样在不偏离本发明所附权利要求书的实质精神的情况下可尝试等效的实施例。
SEQUENCE LISTING<110>生物领先公司M.D.实验室有限公司<120>具有编码多聚-γ-谷氨酸合成酶的基因pgsBCA的表面表达载体以及利用该载体在微生物表面表达目的蛋白的方法<130>PC031033C<150>KR2001-48373<151>2001-08-10<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1182<212>DNA<213>Bacillus subtilis<400>1atgggctggt tactcattat agcctgtgct gtcatactgg tcatcggaat attagaaaaa60cgacgacatc agaaaaacat tgatgccctc cctgttcggg tgaatattaa cggcatccgc120ggaaaatcga ctgtgacaag gctgacaacc ggaatattaa tagaagccgg ttacaagact180gttggaaaaa caacaggaac agatgcaaga atgatttact gggacacacc ggaggaaaag240ccgattaaac ggaaacctca ggggccgaat atcggagagc aaaaagaagt catgagagaa300acagtagaaa gaggggctaa cgcgattgtc agtgaatgca tggctgttaa cccagattat360caaatcatct ttcaggaaga acttctgcag gccaatatcg gcgtcattgt gaatgtttta420gaagaccata tggatgtcat ggggccgacg cttgatgaaa ttgcagaagc gtttaccgct480acaattcctt ataatggcca tcttgtcatt acagatagtg aatataccga gttctttaaa540caaaaagcaa aagaacgaaa cacaaaagtc atcattgctg ataactcaaa aattacagat600gagtatttac gtaattttga atacatggta ttccctgata acgcttctct ggcgctgggt660gtggctcaag cactcggcat tgacgaagaa acagcattta agggaatgct gaatgcgccg720
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<223>PCR primer 3<400>7ctgggatccc aaggtatgtt gcccgtttg 29<210>8<211>30<212>DNA
<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR primer 4<400>8tgaagcttat taggacgatg ggatgggaat 30
权利要求
1.一种在微生物表面制备蛋白的表达载体，其包含一种或两种以上编码多聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的、选自pgsB、pgsC或pgsA的基因。
2.权利要求1所述的在微生物表面制备蛋白的表达载体，其中所述的基因来源于制备聚-γ-谷氨酸合成酶的Bacillus sp.菌株。
3.权利要求1所述的在微生物表面制备蛋白的表达载体，其中pgsB、pgsC、pgsA基因的核苷酸序列分别与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQID NO3的基因同源，具有80％的同源性。
4.权利要求1所述的在微生物表面制备蛋白的表达载体，其中所述的基因包含编码目的蛋白的基因并且在3’-末端具有转录终止密码子。
5.权利要求4所述的在微生物表面制备蛋白的表达载体，其中所述的编码目的蛋白的基因选自编码酶、抗原、抗体、连接蛋白或者吸附蛋白的基因。
6.权利要求1-5任意一个所述的在微生物表面制备蛋白的表达载体，其中所述的表达载体用于戈兰氏阴性细菌。
7.一种根据权利要求6所述的被表达载体转化的戈兰氏阴性细菌，该表达载体能在微生物表面表达蛋白。
8.权利要求1-5任意一个所述的在微生物表面制备蛋白的表达载体，其中所述的表达载体用于戈兰氏阳性细菌。
9.一种根据权利要求6所述的被表达载体转化的戈兰氏阳性细菌，该表达载体能在微生物表面表达蛋白。
10.权利要求1-5任意一个所述的在微生物表面制备蛋白的表达载体，其中所述的表达载体能用于戈兰氏阴性及戈兰氏阳性细菌。
11.一种在戈兰氏阴性宿主细胞的表面表达目的蛋白的方法，其包括下述步骤(a)根据权利要求6所述通过将编码目的蛋白的基因插入到表面表达载体来构建重组表达载体；(b)用所述的重组载体转化戈兰氏阴性宿主细胞；以及(c)培养所述的转化的宿主细胞，在宿主细胞的表面表达所述的目的蛋白。
12.一种在戈兰氏阳性宿主细胞的表面表达目的蛋白的方法，其包括下述步骤(a)根据权利要求6所述通过将编码目的蛋白的基因插入到表面表达载体来构建重组表达载体；(b)用所述的重组载体转化戈兰氏阴性宿主细胞；以及(c)培养所述的转化的宿主细胞，在宿主细胞的表面表达所述的目的蛋白。
全文摘要
本发明涉及具有编码多聚－γ－谷氨酸合成酶基因pgsBCA的表面表达载体，以及利用该载体在微生物表面表达目的蛋白的方法。将外源性基因插入该载体，转化微生物，使外源性蛋白在微生物表面稳定表达。
文档编号C12R1/01GK1539018SQ02815371
公开日2004年10月20日 申请日期2002年8月9日 优先权日2001年8月10日
发明者成文喜, 洪承杓, 李宗洙, 郑昌敏, 金哲仲, 左右田健次, 芦内诚, 健次 申请人:生物领先公司, M.D.实验室有限公司