专利名称：抗原呈递细胞、其制备方法及其用于癌症疫苗的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学领域，特别涉及在人或动物体的治疗方法中使用的产品、物质和组合物，更特别地涉及用于癌症诊断、治疗和预防的产品、物质和组合物。本发明涉及癌症疫苗及其制备方法。
背景技术：
由不同组织型的转化细胞组成型表达的几种肿瘤相关抗原(TAA)最近得到了鉴定(Renkvist N.等.Cancer Immunol.Immunother.503-15，2001).
许多这些TAA能够提供在特定HLA I型同种特异性(allospecificity)情况下由CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所识别的多种优势免疫抗原肽(Renkvist N.等.Cancer Immunol.Immunother.503-15，2001)；而且经选择的TAA，例如MAGE(Jager E.等，J.Exp.Med.，187265-270，1998)，NY-ESO-1(Jager E.等，J.Exp.Med.，187265-270，1998)，SSX(Tureci O等，Cancer Res；56(20)4766-72 1996)，酪氨酸酶(Topalian S.L.等，J.Exp.Med.，1831965-1971，1996.)，Melan-A/MART-1(Zarour H.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97400-405，2000)同时包括在特定HLA II型同种特异性情况下由CD4+T淋巴细胞所识别的表位，因而能够诱导定向于TAA的体液免疫应答(Wang R.F.，Trends Immunol.，22269-276，2001)。
已鉴定出了可起着治疗靶向物重要作用的不同类别的TAAi)在多种组织肿瘤中进行表达而不在除睾丸和胎盘以外的正常组织中进行表达的癌-睾丸抗原(CTA)，如MAGE，GAGE，SSX SART-1，BAGE，NY-ESO-1，XAGE-1，TRAG-3和SAGE，其中一些代表多个家族(Traversari C.，Minerva Biotech.，11243-253，1999)；ii)在正常和肿瘤性黑素细胞中进行表达的分化-特异性抗原，如酪氨酸酶，Melan-A/MART-1，gp100/Pme117，TRP-1/gp75，TRP-2(Traversari C.，Minerva Biotech.，11243-253，1999)；iii)在不同组织的恶性组织中进行超表达但也在其良性对应组织中存在的抗原，如PRAME(Ikeda H.等，Immunity，6199-208，1997)，HER-2/neu(Traversari C.，Minerva Biotech.，11243-253，1999)，CEA，MUC-1(Monges G.M.等，Am.J.Clin.Pathol.，112635-640，1999)，α-胎蛋白(Meng W.S.等，Mol.Immunol.，37943-950，2001)；iv)得自编码遍在表达蛋白的基因的点突变的抗原，如MUM-1，β-连环蛋白，HLA-A2，CDK4和caspase 8(Traversari C.，MinervaBiotech.，11243-253，1999)；v)病毒抗原(Traversari C.，Minerva Biotech.，11243-253，1999)。
除了TAA以外，对有效免疫原性和被宿主的T淋巴细胞有效识别起关键作用的细胞元件包括HLA I型和HLA II型抗原以及共同刺激性/辅助性分子(例如，CD40，CD54，CD58，CD80，CD81)(Fleuren G.J.等，Immunol.Rev.，14591-122，1995)。
在已知类别的TAA中，由于CTA在正常组织中的表达有限并且其在活体特别是哺乳动物包括人中具有已知的体内免疫原性，所以在对癌症患者进行的主动特异性免疫疗法当中CTA是特别合适的治疗靶向物(Jager E.等，J.Exp.Med.，187265-270，1998；Rejnolds S.R.等，Int.J.Cancer，72972-976，1997)。然而，特定的CTA在不同患者的肿瘤性病损中的不均一表达限制了其对定向于CTA的治疗性疫苗接种的生物合适性。事实上，不同癌症患者的恶性损伤可经常只能表达选择性的CTA(Sahin U.等，Clin．Cancer Res.，63916-3922，2000)，另外，还报道了特定CTA在个别肿瘤性损伤中的下调性(Leth B.等，Melanoma Res.，7S83-S88，1997)和/或不均一(dos Santos N.R.等，Cancer Res.，601654-1662，2000)表达(Jungbluth A.A.等，Br.J.cancer，83493-497，2000)。这些可以在体内分别或同时发生的事件还可使恶性细胞的免疫原性组成型低下，促使疾病进展(Speiser D.E.等，J.Exp.Med.，186645-653，1997)，并且在针对特定CTA的免疫学治疗过程中还可以引起肿瘤性细胞在体内的免疫选择，出现CTA-阴性克隆。因此，由于在肿瘤性损伤中靶CTA缺失或可能表达下调，所以将重点放在免疫靶向单一CTA的不同免疫原性表位的免疫疗法不能施用于大量的癌症患者；而且，在体内免疫靶向单一CTA可能产生丧失CTA的肿瘤变异体，该变异体有效地逃避了治疗-诱导的/扩增的CTA-特异性免疫应答。对靶向单一CTA的治疗方法的其它限制来自于其在损伤内部的不均一表达(Schultz-Thater E.等，Br.J.Cancer，83204-208，2000)，而且由特定HLA I型或HLA II型同种特异性对单一CTA的不同免疫原性表位的递呈只能允许对具有某些限定的HLA表型的患者进行治疗。
为了部分消除这些限制，最近的治疗方案采用单一或多种CTA的一种以上的免疫原性表位，或完整CTA蛋白作为疫苗接种剂(Conference on Cancer Vaccines，编者Ferrantini M.和Belardelli F.，罗马-意大利，1999年11月15-16日；http//www.cancerresearch.org)。
因此，亟需一种能够克服现有技术中的缺陷的癌症疫苗，尤其是能够克服较差的免疫原性和体内免疫选择，从而能够将癌症疫苗应用于广大的癌症患者，而不限于特定的单一靶向的CTA或TAA，由此癌症疫苗不会被“限制”到经选择的HLA I型和/或HLA II型抗原。
最近的体外实验证据表明在目前已知的CTA基因中已研究的全部CTA基因与DNA降低甲基化试剂(hypomethylating agent)接触后在不同组织的肿瘤性细胞中的表达被诱导或上调(dos Santos N.R.等，Cancer Res.，601654-1662，2000；Weber J.等，Cancer Res.，541766-1771，1994)。发现CTA诱导现象一直持续到在处理结束后的几个星期仍然能够检测到。这些发现支持了CTA属于受DNA甲基化综合调节的一类TAA的观点。而且，利用DNA降低甲基化试剂处理肿瘤性细胞能够诱导对其表达HLA I型抗原和所研究的HLA I型同种特异性的同时并且持续的上调，而且还上调了共同刺激性/辅助性分子CD54和CD58的表达(Coral S.等，J.Immunother.，2216-24，1999)。
尽管CTA具有治疗前景，但是CTA仍然表现出许多不足，诸如迄今为止研究的特定CTA在CTA-阳性和CTA-阴性恶性细胞共存的不同肿瘤性损伤中进行不均一表达；迄今为止所鉴定的CTA中只有经选择的CTA可以在不受组织来源限制的不同肿瘤性病损上进行表达；特定CTA在肿瘤性细胞上的表达阈值水平对其被CTA-特异性CTL识别是必需的以及针对特定CTA的疫苗需要合适的HLA I型表型，并且对于选择性的CTA来说，还需要患者的HLA II型表型。
由于其独特的生物学特性，经选择的CTA被用于不同的临床试验，其目的是诱导或加强患不同组织恶性疾病的患者体内的CTA-特异性免疫应答。正如该领域的专家所知，不同的方案目前被用于在临床上进行治疗性CTA的体内施用或被用于在临床前水平上创建更有效的疫苗接种工具(dos Santos N.R.等，Cancer Res.，601654-1662，2000；Weber J.等，Cancer Res.，541766-1771，1994)。值得注意的是，主要是由于多种技术和实践条件的限制，只有有限数目的特定CTA的免疫原性表位或单一完整CTA蛋白目前在临床被用于治疗目的。以下列表包括目前已被采用的或迄今为止假设的将CTA施用于癌症患者的主要策略；还应当强调的是相同的方案被用来对患者施用属于其它类型的目前已知的TAA的TAA，并且不同的佐剂和/或载体有时被用来加强治疗剂的免疫原性。
·代表由CD8+T细胞识别的单一CTA或多种CTA的免疫原性表位的合成肽(Conference on Cancer Vaccines，由Ferrantini M.和Belardelli F.编著，罗马-意大利，1999年11月15-16日；http//www.cancerresearch.org)。
·代表单一CTA或多种CTA的免疫原性表位的脂质体包封的合成肽(Steller M.A.等，Clin.Cancer Res.，42103-2109，1998)。
·单一CTA的完整合成蛋白(Conference on Cancer Vaccines，由Ferrantini M.和Belardelli F.编著，罗马-意大利，1999年11月15-16日；http//www.cancerresearch.org)。
·表达由CD8+T细胞识别的单一CTA或多种CTA的表位的重组病毒载体(Jenne L.等.，Trends Immunol.，22102-107，2001)。
·裸露的DNA shooting(Park J.H.等人，Mol.Cells，9384-391，1999)·离体加载了代表由CD8+T细胞识别的单一CTA或多种CTA的表位的合成肽的自体PBMC/巨噬细胞(Conference on CancerVaccines，由Ferrantini M.和Belardelli F.编著，罗马-意大利，1999年11月15-16日；http//www.cancerresearch.org)。
·离体加载了代表由CD8+T细胞识别的单一CTA或多种CTA的表位的合成肽或加载了单一CTA的完整合成蛋白或加载了完整肿瘤细胞制剂的自体树突细胞(Conference on Cancer Vaccines，由Ferrantini M.和Belardelli F.编著，罗马-意大利，1999年11月15-16日；http//www.cancerresearch.org；Jenne L.等，Trends Immunol.，22102-107，2001)。
·离体转染或转导了DNA/RNA以表达全长CTA或与完整肿瘤细胞融合的自体树突细胞(Jenne L.等，Trends Immunol.，22102-107，2001)。
·离体转染或转导了DNA/RNA以表达全长CTA的自体T淋巴细胞。
针对被本发明当作主要目的的自体癌症疫苗，可以引用许多专利参考文献。WO99/42128公开了用于测定实体瘤进行HLA转录或表达情况的方法、用于选择适当的治疗方法和/或用于监控肿瘤进展的方法。该参考文献的目的在于抑制某些同种型的HLA-G从而增强天然抗肿瘤的应答反应。所述方法包括从肿瘤样品中提取细胞，进行溶胞并使溶胞产物与针对HLA I型抗原的抗体进行反应。
DE29913522提供了一种通过使提取自患者体内的肿瘤细胞承受200-9000巴的压力以便杀伤或破坏肿瘤细胞却能保持其表面的完整，然后再将所述细胞重新注入到患者体内来制备癌症疫苗的设备。
WO00/02581公开了一种能诱导针对癌基因或突变的肿瘤抑制蛋白或肽的T细胞应答的端粒酶蛋白或肽。所述肽被用于癌症疫苗。
WO00/18933公开了能引起功能上无活性的修饰抗原进行表达的DNA构建体，该抗原在DNA、RNA转录和翻译的效率方面或抗原性肽的产生方面没有发生改变。通过施用编码修饰的人癌症相关抗原特别是PSMA抗原的RNA或质粒DNA来治疗患癌症的患者。在一个不同的实施方案中，将与RNA或质粒DNA进行了体外接触的自体树突细胞用作疫苗。
WO00/20581公开了一种含有新的分离的MAGE-A3人白细胞抗原(HLA)II型-结合肽的癌症疫苗。所述肽还可被用来选择性富集一群T淋巴细胞，其中CD4+T淋巴细胞对所述肽特异。所述被富集的淋巴细胞还被用作癌症疫苗。
WO00/25813公开了与主要组织相容性复合体分子结合的通用肿瘤-相关抗原(TAA)。治疗方法包括施用编码TAA的核酸分子，该抗原由能够激活细胞毒性淋巴细胞和杀伤表达TAA的细胞的抗原呈递细胞进行加工。除了特定的hTERT肽，不同TAA的鉴定通过复杂的计算机-辅助方法合成计算机设计的肽和对该肽的有用性进行证实的生物学分析来实现。
WO00/26249公开了人WT-1蛋白或人gata-1蛋白的片段。这些肽片段通过激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)而被用于癌症疫苗。
US6077519提供了含有T细胞表位的组合物的癌症疫苗，所述表位是通过对源自肿瘤组织的表位进行酸洗脱而回收的。
WO00/46352提供了一种含有表达功能性CD86分子的人T淋巴细胞的癌症疫苗。所述T淋巴细胞通过使T细胞经受至少连续两次刺激而获得，其中每次刺激涉及至少一种激活剂(一种抗CD2，3或28的抗体)和一种刺激T细胞增殖的细胞因子(白介素)。
Coral S等.Journal of Immunotherapy 22(1)16-24，1999教导了黑色素瘤细胞的潜在免疫原性及其被宿主细胞毒性细胞的识别取决于人白细胞抗原(HLA)I型抗原、共同刺激分子和黑色素瘤-相关抗原(MAA)在肿瘤性细胞上的存在及其表达水平。可能有一种暗示，就是通过全身施用对人黑色素瘤进行主动和/或被动特异性免疫治疗的5-AZA-CdR可提高细胞毒性细胞对黑色素瘤的识别。
Momparler，Anticancer Drugs Apr；8(4)358-68，1997中提到了5-AZA-CdR被用作化学治疗剂。
Shichijo S等，Jpn.J.Cancer Res.87，751-756，1996年7月研究了脱甲基化试剂5-AZA-CdR是否能够在正常和恶性淋巴样细胞中诱导产生MAGE1、2、3和6以便更好地理解其在细胞中的表达机制。所述作者显示了在选择性测试样品中诱导所研究的CTA并且讨论了脱甲基化不足以在所有情况下刺激诱导MAGE基因，并且其结果使人能够更好地理解MAGE基因在细胞中的表达机制。没有提示可涉及治疗。
发明的概述目前已经发现了一种生成抗原呈递细胞的方法，该方法包括a)从受试者的体内收集所述细胞；b)激活所述收集的细胞c)离体培养和任选地扩增所述被激活的细胞；d)用DNA降低甲基化试剂处理所述培养和任选扩增的细胞以使所述细胞同时表达多种肿瘤相关抗原。
可按照本发明方法获得的细胞及其细胞组分单独或与所述细胞联合，被用于预防和治疗尤其是包括人类在内的哺乳动物的不同组织型恶性肿瘤，其中所述肿瘤组成型表达在所述细胞中表达的多种肿瘤相关抗原中的一种或多种。
在本发明下文中，所述细胞被简称为ADHAPI-细胞。
最便利的是，可由上述方法得到的细胞以癌症疫苗的形式被使用。
在下文中，本发明还将通过实施例和附图的方式得到详细的说明，其中
图1显示受ADHAPI-细胞/B-EBV或对照B-EBV细胞(S)刺激的自体(aMLR)PBMC(R)的增殖情况；图2显示受ADHAPI-细胞/PWM-B或对照PWM-B细胞(S)刺激的自体(aMLR)PBMC(R)的增殖情况；
图3显示受ADHAPI-细胞/CD40L-B或对照CD40L-B细胞(S)刺激的自体(aMLR)PBMC(R)的增殖情况；图4显示受ADHAPI-细胞/PWM-PBMC或对照PWM-PBMC细胞(S)刺激的自体(aMLR)PBMC(R)的增殖情况；图5显示受ADHAPI-细胞/PHA-PBMC和对照PHA-PBMC刺激的自体(aMLR)PBMC(R)的增殖情况；图 6显示受ADHAPI-细胞/PHA-+PWM-PBMC或对照PHA-+PWM-PBMC(S)刺激的自体(aMLR)PBMC(R)的增殖情况。
本发明的详细描述根据本发明，事实上不存在对能够被处理以便产生抗原-呈递细胞的细胞类型的限制，只要所述类型的细胞能被适当地激活和用降低甲基化试剂处理就行。
根据本本明，从受试者，特别是哺乳动物，更特别地是人体内收集细胞。在本发明的一个可能性实施方案中，所述人是癌症患者。
在本发明的第一个优选实施方案中，可通过上述方法获得的抗原-呈递细胞是免疫细胞。
在本发明的第二个优选实施方案中，可通过上述方法获得的抗原-呈递细胞是非免疫细胞。
可根据本发明获得的细胞能够表达共有的优势免疫癌症抗原或者能够表达共有的非优势免疫癌症抗原。
在本发明的某些特定实施方案中，适用于本文所述方法的细胞是·EB病毒-无限增殖化、DNA降低甲基化试剂处理的B-类淋巴母细胞系(ADHAPI-细胞/B-EBV)，该细胞系产生自处于疾病晚期的癌症患者或健康受试者的外周血单核的细胞(PBMC)。
·商陆促分裂原(PWM)激活的、DNA降低甲基化试剂处理的B-淋巴细胞(ADHAPI-细胞/PWM-B)，该细胞产生自从处于疾病晚期的癌症患者或健康受试者的PBMC中纯化的B淋巴细胞。
·CD40激活的、DNA降低甲基化试剂处理的B-淋巴细胞(ADHAPI-细胞/CD40-B)，该细胞产生自从处于疾病晚期的癌症患者或健康受试者的PBMC中纯化的B淋巴细胞。
·商陆促分裂原(PWM)激活的、DNA降低甲基化试剂处理的PBMC(ADHAPI-细胞/PWM-PBMC)，该细胞产生自处于疾病晚期的癌症患者或健康受试者的纯化PBMC。
·植物凝集素(PHA)+重组人白介素-2(rhIL-2)激活的、DNA降低甲基化试剂处理的PBMC(ADHAPI-细胞/PHA-rhIL2-PBMC)，该细胞产生自处于疾病晚期的癌症患者或健康受试者的纯化PBMC。
·植物凝集素(PHA)+重组人白介素-2(rhIL-2)+商陆促分裂原(PWM)激活的、DNA降低甲基化试剂处理的PBMC(ADHAPI-细胞/PHA-rhIL2-PWM-PBMC)，该细胞产生自处于疾病晚期的癌症患者或健康受试者的纯化PBMC。
·树突细胞、单核细胞、巨噬细胞。
·CD34+细胞、成纤维细胞、干细胞、成纤维细胞和角质形成细胞(cheratinocyte)。
可由本发明方法获得的细胞适于被用作预防和治疗不同组织型恶性肿瘤的药剂，其中所述肿瘤组成型表达一种或多种优势免疫或非优势免疫的癌症抗原。
本发明的另一个可能性实施方案可应用于那些其中不希望或不必利用疫苗接种细胞的直接抗原呈递能力的情况。在这种实施方案中，可通过本发明方法获得的疫苗接种细胞或其细胞组分可被用作混合(pooled)癌症抗原的“储存库(reservoir)”以接种患者。
在本发明的一个优选实施方案中，所选TAA是CTA。
本发明的该实施方案为技术人员提供了下列优点由于CTA含有由HLA I型-限制性CTA-特异性CD8+CTL识别的表位，所以CTA是免疫原性的。
由于CTA含有由HLA II型-限制性CTA-特异性CD4+T淋巴细胞识别的表位，所以CTA是免疫原性的。
被选CTA同时含有由HLA I型和HLA II型抗原呈递的表位；因此，被选CTA可同时诱导CD8+CTL和CD4+T淋巴细胞反应。
CTA不在除睾丸和胎盘之外的良性组织中表达。
不同CTA可同时在实体和造血恶性肿瘤的肿瘤性细胞中进行表达，从而提供了在被转化细胞上共表达的多个治疗性靶向物。
不同CTA在指定患者的同时和顺序性转移病损之中进行均一性表达。
不同CTA可在不同组织来源的恶性组织中进行表达从而提供了由人肿瘤共有的而不考虑其特定组织型的共同治疗性靶向物。
不同CTA可以编码在不同HLA I型和HLA II型同种特异性情况下呈递的多种免疫原性肽。
在本发明的另一个实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂能够协同DNA降低甲基化试剂来诱导/上调CTA、HLA抗原和共同刺激性/辅助性分子在不同组织的肿瘤性细胞上的表达。事实上，DNA甲基化和组蛋白脱乙酰基化作为在癌症中的外遗传基因沉默的协同层来发挥作用(Fuks F.等，Nat.Genet.，2488-91，2000)，对DNA进行了初步的最低程度的脱甲基后，接着用组蛋白脱乙酰基酶抑制剂进行处理，结果在结肠直肠癌细胞中观察到经选的超甲基化的基因被强烈再激活，其具有肿瘤抑制功能(Cameron E.E.等，Nat.Genet.，21103-107，1999)。
按照公知常识实施本发明方法中的激活步骤，在任何情况下都可以参考Current.Protocols in Immunology，Coligan J.E.等编辑，Wiley。
本发明方法中的脱甲基化处理是熟知的并且文献对该方法加以报道，为了获得进一步的信息还可参照Santini V.等，Ann.Intern.Med.，134573-586，2001.
用于本发明目的的降低甲基化试剂，已知在本技术领域中还被称为脱甲基化试剂，在本技术领域中是熟知的。DNA脱甲基化试剂被广泛公开于文献中，例如参见WO 01/29235，US5851773。一种优选的DNA脱甲基化试剂是5-氮杂-胞苷，或更优选地是5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-AZA-CdR)。
本发明的抗原呈递细胞适于制备癌症疫苗。在本发明的一个优选实施方案中，所述疫苗是自体疫苗。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述疫苗是同种异体疫苗。在该实施方案中，可按照上述方法获得的细胞既可以被用作抗原呈递细胞又可以被用作混合癌症抗原的“储存库”形式，其可以是细胞也可以是细胞组分。
在本发明的另一个实施方案中，所述细胞和/或细胞组分可被用于生成效应免疫细胞的方法当中，所述效应免疫细胞被用于制备在众所周知的过继免疫治疗中使用的产物。在本发明的另一个实施方案中，本文公开的疫苗可与采用降低甲基化试剂如decitabine对癌症患者进行全身预处理联合使用。该实施方案可采用一种商品，例如一种含有本发明疫苗和适于全身施用降低甲基化试剂如decitabine的药物组合物的试剂盒来进行。
可按照本技术领域的技术人员熟知的技术，只遵循公知常识，来制备疫苗。例如，在本说明书中提到的专利参考文献对癌症疫苗的制备方法作了充分的公开，例如参见WO00/25813或WO00/46352。
技术人员毫无困难地就能建立使用本发明疫苗的合适方式，特别是用药方案。
下列实施例对本发明作出了进一步的说明。
实施例1ADHAPI-细胞/B-EBVPBMC纯化通过标准的Ficoll-Hypaque密度梯度离心从处于疾病晚期的癌症患者或健康受试者的肝素化的外周血中提纯PBMC。
利用EB病毒(EBV)使PBMC无限增殖来产生自体B-类淋巴母细胞系B-EBV+类淋巴母细胞系通过以下方法来制备在37℃和5％CO2的潮湿环境下，于添加了10％热灭活的胎牛血清(或人AB血清)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中将PBMC与得自B95.8绒猴细胞系的上清液一起培养。
ADHAPI-细胞/B-EBV和对照B-EBV细胞的制备在37℃和5％CO2的潮湿环境下，于添加了10％热灭活的胎牛血清(或10％热灭活的人AB血清)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养B-EBV+类淋巴母细胞系(7.5×105细胞/ml)，并且每12小时用1μM 5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-AZA-CdR)脉冲四次；然后，将一半的培养基换成新鲜培养基并再培养48小时。而后将细胞用于实验过程和/或在存活条件下冷冻起来。在类似的但不进行5-AZA-CdR脉冲的实验条件下培养对照细胞(B-EBV细胞)。
ADHAPI-细胞/B-EBV和对照B-EBV细胞的最终回收结果见表I。
自体混合的淋巴细胞反应(aMLR)和MLR收集ADHAPI-细胞/B-EBV和对照B-EBV细胞(刺激物＝S)，用Hanks’平衡盐溶液(HBSS)冲洗两次并进行X-射线处理(75Gy)。针对aMLR和MLR，将标量浓度(从1×106细胞/ml至6×104细胞/ml)的ADHAPI-细胞/B-EBV或对照B-EBV细胞加到在Basal Iscove’s培养基中的自体或同种异体PBMC(1×106细胞/ml)(反应物＝R)中，并且接种到96孔U-底平板上，使终体积达到200μl/孔，其中Basal Iscove’s培养基中添加了10％的热灭活的人AB血清、2 mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素。在37℃和5％CO2的潮湿环境下培养24小时后，收集100μl的培养上清液并立即保存在-80℃下直至被用于进行细胞因子分析。然后，向每孔中加入100μl的新鲜培养基并且再培养5天，此时用3H-TdR(1μLCi/孔)对培养物进行脉冲O/N；然后对平板进行收获并利用β-计数器测定掺入到R细胞当中的3H-TdR。
在aMLR中受ADHAPI-细胞/B-EBV或对照B-EBV细胞(S)刺激的自体PBMC(R)的增殖见图1。
ADHAPI-细胞/B-EBV和对照B-EBV细胞的表型谱结果见表II.
RT-PCR分析由ADHAPI-细胞/B-EBV和对照B-EBV细胞表达的CTA被用来评估CTA在被研究细胞上的表达的实验条件和引物如下所示对于MAGE-1、-2、-3、-4，Brasseur，F.等，Int.J.Cancer 63375-380，1995；对于GAGE 1-6，Van den Eynde，B.等，J.Exp.Med.182689-698，1995；对于NY-ESO-1，Stockert，E.等，J.Exp.Med.187265-270，1998；对于SSX-2；Sahin，U.等，Clin.Cancer Res.63916-3922，2000。
a阳性的/被测试的；NT，未测试；ELISA评价由在aMLR中被ADHAPI-细胞/B-EBV或对照B-EBV细胞(S)刺激的PBMC(R)释放的IFN-γ结果见表III。
实施例2ADHAPI-细胞/PWM-BB-淋巴细胞的纯化通过标准的Ficoll-Hypaque密度梯度离心从处于疾病晚期的癌症患者或健康受试者的肝素化的外周血中提纯PBMC，并且利用神经氨酸酶-处理的羊血红细胞通过常规的E玫瑰花结技术获得纯化的B淋巴细胞。
PWM-激活的B细胞的制备向纯化的B-淋巴细胞(1.5×106细胞/ml)中加入PWM(3μg/ml)并在37℃和5％CO2的潮湿环境下于添加了10％的热灭活的人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素的BasalIscove’s培养基中培养48小时。
ADHAPI-细胞/PWM-B和对照PWM-B细胞的制备每12小时用1μM 5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-AZA-CdR)对PWM-激活的B-淋巴细胞脉冲四次；然后，将一半的培养基换成新鲜培养基并再培养48小时。而后将细胞用于实验过程和/或在存活条件下冷冻起来。在类似但不进行5-AZA-CdR脉冲的实验条件下培养对照细胞(PWM-B细胞)。
ADHAPI-细胞/PWM-B和对照PWM-B细胞的最终回收结果见表I。
自体混合的淋巴细胞反应(aMLR)和MLR收集ADHAPI-细胞/PWM-B和对照PWM-B细胞(刺激物＝S)，用添加了0.5％的α-甲基甘露吡喃糖苷的Hanks’平衡盐溶液(HBSS)冲洗三次并进行X-射线处理(30Gy)。针对aMLR和MLR，将标量浓度(从1×106细胞/ml至6×104细胞/ml)的ADHAPI-细胞/PWM-B或对照PWM-B细胞加到在Basal Iscove’s培养基中的自体或同种异体PBMC(从1×106细胞/ml)(反应物＝R)中，并且接种到96孔U-底平板上，使终体积达到200μl/孔，其中Basal Iscove’s培养基中添加了10％的热灭活的人AB血清、2 mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素。在37℃和5％CO2的潮湿环境下培养6天后，从每孔收集100μl的培养上清液并立即存在-80℃下直至被用于进行细胞因子分析。然后，向每孔中加入100μl的新鲜培养基并且用3H-TdR(1μCi/孔)对培养物进行脉冲O/N；然后对平板进行收获并利用β-计数器测定掺入到R细胞当中的3H-TdR。
ADHAPI-细胞/PWM-B和对照PWM-B细胞的表型谱结果见表II.
RT-PCR分析由ADHAPI-细胞/PWM-B和对照PWM-B细胞表达的CTA
a阳性的/被测试的；NT，未测试；在aMLR中受ADHAPI-细胞/PWM-B或对照PWM-B细胞(S)刺激的自体PBMC(R)的增殖结果见图2。
ELISA评价由被ADHAPI-细胞/PWM-B或对照PWM-B细胞(S)刺激的同种异体(MLR)和自体(aMLR)PBMC(R)释放的IFNγ结果见表III。
实施例3ADHAPI-细胞/CD40L-BPBMC纯化通过标准的Ficoll-Hypaque密度梯度离心从处于疾病晚期的癌症患者或健康受试者的肝素化或酸式柠檬酸葡萄糖(ACD)-抗凝的外周血中提纯PBMC。
NIH3T3-CD40L-激活的PBMC的制备在37℃和5％CO2的潮湿环境下，于添加了10％的热灭活的人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、2ng/ml重组人(rh)白介素4(rhIL-4)、50μg/ml人转铁蛋白、5μg/ml rh胰岛素、5.5×10-7M环孢菌素A(CsA)、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素的Basal Iscove’s培养基(完全培养基)中将PBMC(2×106细胞/ml)与半汇合度的、X-射线处理的(75Gy)NIH3T3-CD40L进行共同培养。培养6天后，收集PBMC，用HBSS冲洗两次，以1×106细胞/ml的浓度重新悬浮在完全培养基中并且与如上所述新鲜制备的NIH3T3-CD40L在37℃和5％CO2的潮湿环境下再共同培养3天。每2-3天就重复该过程直至16-18天的最长培养时间。
生成ADHAPI-细胞/CD40L-B和对照CD40L-B细胞培养16-18天后，收集被激活的PBMC并按照上述方法用NIH3T3-CD40L进行再刺激；在37℃和5％CO2的潮湿环境下进行O/N培养后，每12小时用1μM 5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-AZA-CdR)将培养物脉冲四次；然后，收获细胞并按照上述方法用NIH3T3-CD40L进行再刺激并再培养48小时。而后将细胞用于实验过程和/或在存活条件下冷冻起来。在类似但不进行5-AZA-CdR脉冲的实验条件下培养对照细胞(CD40L-B细胞)。
ADHAPI-细胞/CD40L-B和对照CD40L-B细胞的最终回收结果见表I。
自体混合的淋巴细胞反应(aMLR)和MLR收集ADHAPI-细胞/CD40L-B和对照CD40L-B细胞(刺激物＝S)，用Hanks’平衡盐溶液(HBSS)冲洗三次并进行X-射线处理(50Gy)。针对aMLR和MLR，将标量浓度(从1×106细胞/ml至6×104细胞/ml)的ADHAPI-细胞/CD40L-B或对照CD40L-B细胞加到在BasalIscove’s培养基中的自体或同种异体PBMC(1×106细胞/ml)(反应物＝R)中，并且接种到96孔U-底平板上，使终体积达到200μl/孔，其中Basal Iscove’s培养基中添加了10％的热灭活的人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素。在37℃和5％CO2的潮湿环境下培养24小时后，收集100μl的培养上清液并立即保存在-80℃下直至被用于进行细胞因子分析。然后，向每孔中加入100μl的新鲜培养基并且再培养5天，此时用3H-TdR(1μCi/孔)对培养物进行脉冲O/N；然后对平板进行收获并利用β-计数器测定掺入到R细胞当中的3H-TdR。
ADHAPI-细胞/CD40L-B和对照CD40L-B细胞的表型谱结果见表II.
RT-PCR分析由ADHAPI-细胞/CD40L-B和对照CD40L-B细胞表达的CTA
a阳性的/被测试的。
在aMLR中受ADHAPI-细胞/CD40L-B或对照CD40L-B细胞(S)刺激的自体PBMC(R)的增殖结果见图3。
ELISA评价由在aMLR中被ADHAPI-细胞/CD40L-B或对照CD40L-B细胞(S)刺激的PBMC(R)释放的IFN-γ结果见表III。
实施例4ADHAPI-细胞/PWM-PBMCPRMC纯化通过标准的Ficoll-Hypaque密度梯度离心从处于疾病晚期的癌症患者或健康受试者的肝素化的外周血中提纯PBMC。
PWM-激活的PBMC的制备向PBMC(1.5×106细胞/ml)中加入PWM(3μg/ml)并在37℃和5％CO2的潮湿环境下于添加了10％的热灭活的人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素的Basal Iscove’s培养基中培养48小时。
ADHAPI-细胞/PWM-PBMC和对照PWM-PBMC细胞的制备每12小时用1μM 5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-AZA-CdR)将PWM-激活的PBMC脉冲四次；然后，将一半的培养基换成新鲜培养基并再培养48小时。而后将细胞用于实验过程和/或在存活条件下冷冻起来。在类似但不进行5-AZA-CdR脉冲的实验条件下培养对照细胞(PWM-PBMC细胞)。
ADHAPI-细胞/PWM-PBMC和对照PWM-PBMC细胞的最终回收结果见表I。
自体混合的淋巴细胞反应(aMLR)和MLR收集ADHAPI-细胞/PWM-PBMC和对照PWM-PBMC细胞(刺激物＝S)，用添加了0.5％的α-甲基甘露吡喃糖苷的Hanks’平衡盐溶液冲洗三次并进行X-射线处理(30Gy)。针对aMLR和MLR，将标量浓度(从1×106细胞/ml至6×104细胞/ml)的ADHAPI-细胞/PWM-PBMC或对照PWM-PBMC细胞加到在Basal Iscove’s培养基中的自体或同种异体PBMC(1×106细胞/ml)(反应物＝R)中，并且接种到96孔U-底平板上，使终体积达到200μl/孔，其中Basal Iscove’s培养基中添加了10％的热灭活的人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素。在37℃和5％CO2的潮湿环境下培养6天后，从每孔收集100μl的培养上清液并立即保存在-80℃下直至被用于进行细胞因子分析。然后，向每孔中加入100μl的新鲜培养基并且用3H-TdR(1μCi/孔)对培养物进行脉冲O/N；然后进行收获并利用β-计数器测定掺入到R细胞当中的3H-TdR。
ADHAPI-细胞/PWM-PBMC和对照PWM-PBMC细胞的表型谱结果见表II.
RT-PCR分析由ADHAPI-细胞/PWM-PBMC和对照PWM-PBMC细胞表达的CTA
a阳性的/被测试的；NT，未测试；在aMLR中受ADHAPI-细胞/PWM-PBMC或对照PWM-PBMC细胞(S)刺激的自体(aMLR)PBMC(R)的增殖结果见图4。
ELISA评价由在aMLR中被ADHAPI-细胞/PWM-PBMC或对照PWM-PBMC细胞(S)刺激的自体PBMC(R)释放的IFN-γ结果见表III。
实施例5ADHAPI-细胞/PHA-PBMCPBMC纯化通过标准的Ficoll-Hypaque密度梯度离心从处于疾病晚期的癌症患者或健康受试者的肝素化的外周血中提纯PBMC。
PHA-激活的PBMC的制备向PBMC(1.5×106细胞/ml)中加入PHA(10μg/ml)和100 UI/mlrhIL-2并在37℃和5％CO2的潮湿环境下于添加了10％的热灭活的胎牛血清(或在添加了10％的热灭活的人AB血清的Basal Iscove’s培养基中)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素的RPMI 1640培养基(完全培养基)中培养48小时。
ADHAPI-细胞/PHA-PBMC和对照PHA-PBMC的制备每12小时用1μM 5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-AZA-CdR)将PHA-激活的PBMC脉冲四次；然后，将一半的培养基换成无PHA-M的新鲜完全培养基并再培养48小时。而后将细胞用于实验过程和/或在存活条件下冷冻起来。在类似但不进行5-AZA-CdR脉冲的实验条件下培养对照细胞(PHA-PBMC)。
ADHAPI-细胞/PHA-PBMC和对照PHA-PBMC的最终回收结果见表I。
自体混合的淋巴细胞反应(aMLR)和MLR收集ADHAPI-细胞/PHA-PBMC和对照PHA-PBMC(刺激物＝S)，用添加了0.5％的α-甲基甘露吡喃糖苷的Hanks’平衡盐溶液冲洗三次并进行X-射线处理(50Gy)。针对aMLR和MLR，将标量浓度(从1×106细胞/ml至6×104细胞/ml)的ADHAPI-细胞/PHA-PBMC或对照PHA-PBMC加到在Basal Iscove’s培养基中的自体或同种异体PBMC(1×106细胞/ml)(反应物＝R)中，并且接种到96孔U-底平板上，使终体积达到200μl/孔，其中Basal Iscove’s培养基中添加了10％的热灭活的人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素。在37℃和5％CO2的潮湿环境下培养24小时后，从每孔收集100μl的培养上清液并立即保存在-80℃下直至被用于进行细胞因子分析。然后，向每孔中加入100μl的新鲜培养基并且再培养5天，此时用3H-TdR(1μCi/孔)对培养物进行脉冲O/N；然后对平板进行收获并利用β-计数器测定掺入到R细胞当中的3H-TdR。
ADHAPI-细胞/PHA-PBMC和对照PHA-PBMC的表型谱结果见表II.
RT-PCR分析由ADHAPI-细胞/PHA-PBMC和对照PHA-PBMC表达的CTA
a阳性的/被测试的；NT，未测试；在aMLR中受ADHAPI-细胞/PHA-PBMC和对照PHA-PBMC刺激的自体PBMC(R)的增殖结果见图5。
ELISA评价由被ADHAPI-细胞/PHA-PBMC或对照PHA-PBMC(S)刺激的同种异体(MLR)和自体(aMLR)PBMC(R)释放的IFN-γ结果见表III。
实施例6ADHAPI-细胞/PHA+PWM-PBMCPBMC纯化通过标准的Ficoll-Hypaque密度梯度离心从处于疾病晚期的癌症患者或健康受试者的肝素化或ACD-抗凝的外周血中提纯PBMC。
PHA+PWM-激活的PBMC的制备向PBMC(1.5×106细胞/ml)中加入PHA-M(10μg/ml)、PWM(3μg/ml)和100 UI/ml rhIL-2并在37℃和5％CO2的潮湿环境下于添加了10％的热灭活的人AB血清(或添加10％的热灭活的自体血清)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素的BasalIscove’s培养基(完全培养基)中培养48小时。
ADHAPI-细胞/PHA+PWM-PBMC和对照PHA+PWM-PBMC的制备每12小时用1μM 5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-AZA-CdR)将PHA+PWM-激活的PBMC脉冲四次；然后，将一半的培养基换成不含PHA或PWM的新鲜完全培养基并再培养48小时。而后将细胞用于实验过程和/或在存活条件下冷冻起来。在类似但不进行5-AZA-CdR脉冲的实验条件下培养对照细胞(PHA+PWM-PBMC)。
ADHAPI-细胞/PHA+PWM-PBMC和对照PHA+PWM-PBMC的最终回收结果见表I。
自体混合的淋巴细胞反应(aMLR)和MLR收集ADHAPI-细胞/PHA+PWM-PBMC和对照PHA+PWM-PBMC(刺激物＝S)，用添加了0.5％的α-甲基甘露吡喃糖苷的Hanks’平衡盐溶液冲洗三次并进行X-射线处理(50Gy)。针对aMLR和MLR，将标量浓度(从1×106细胞/ml至6×104细胞/ml)的ADHAPI-细胞/PHA-rhIL2-+PWM-PBMC或对照PHA+PWM-PBMC细胞加到在Basal Iscove’s培养基中的自体或同种异体PBMC(1×106细胞/ml)(反应物＝R)中，并且接种到96孔U-底平板上，使终体积达到200μl/孔，其中Basal Iscove’s培养基中添加了10％的热灭活的人AB血清、2 mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素。在37℃和5％CO2的潮湿环境下培养6天后，从每孔收集100μl的培养上清液并立即保存在-80℃下直至被用于进行细胞因子分析。然后，向每孔中加入100μl的新鲜培养基并且用3H-TdR(1μCi/孔)对培养物进行脉冲O/N；然后对平板进行收获并利用β-计数器测定掺入到R细胞当中的3H-TdR。
ADHAPI-细胞/PHA+PWM-PBMC和对照PHA+PWM-PBMC的表型谱结果见表II。
RT-PCR分析由ADHAPI-细胞/PHA+PWM-PBMC和对照PHA+PWM-PBMC表达的CTA
a阳性的/被测试的。
在aMLR中受ADHAPI-细胞/PHA+PWM-PBMC或对照PHA+PWM-PBMC刺激的自体(aMLR)PBMC(R)的增殖结果见图6。
ELISA评价由被ADHAPI-细胞/PHA+PWM-PBMC或对照PHA+PWM-PBMC(S)刺激的同种异体(MLR)和自体(aMLR)PBMC(R)释放的IFN-γ结果见表III。
ADHAPI-细胞的体内致瘤作用施用ADHAPI-细胞后180天，单次皮下异种移植活的ADHAPI细胞/PHA-rhIL2-PWM-PBMC(12×106)及其对照细胞(14×106)，ADHAPI-细胞/CD40L-B(8×106)及其对照细胞(8×106)或x-射线-处理的(30Gy)ADHAPI-细胞/PHA-rhIL2 PWM-PBMC(12×106)及其对照细胞(14×106)，x-射线处理的(50Gy)ADHAPI-细胞/CD40L-B(15×106)及其对照细胞(18×106)既不在注射或远距(临床可探测的)位点诱导肿瘤形成，也不影响BALB/c nu/nu小鼠的整体健康状况和体重。第一次施用后180天，重复进行的皮下异种移植活的ADHAPI-细胞/B-EBV(5×106/1st注射；1×107/2nd和后继注射)和对照B-EBV细胞(5×106/1st注射；1×107/2nd和后继注射)或x-射线处理的ADHAPI-细胞/B-EBV(75Gy)(5×106/1st注射；1×107/2nd和后继注射)和x-射线处理的(75Gy)对照B-EBV细胞(5×106/1st注射；1×107/2nd和后继注射)在第0，33，63和96天既不在注射或远距(临床可探测)位点诱导肿瘤形成，也不影响BALB/c nu/nu小鼠的整体健康状况和体重。ADHAPI-细胞-处理的动物的总体健康状况和体重与对照动物(未处理或移植B-EBV细胞)相当。
ADHAPI-细胞作为多价细胞CTA疫苗的优点与已经利用的，或迄今为止假设的最有效地对癌症患者施用已知CTA的主要方案相比，ADHAPI-细胞代表全新的和改进的方法并且具有许多突出/显著的优点。在这些当中ADHAPI-细胞相对于未遗传修饰的细胞CTA疫苗由于能同时表达多种/所有甲基化-调节的CTA，所以ADHAPI-细胞是新型的和独一无二的APC疫苗；由于是内源性合成的，所以CTA能够直接和同时进入ADHAPI-细胞中的HLA I型和HLA II型抗原加工途径(Jenne L等，Trends Immunol.，22102-107，2001)。
因此，由于其组成型细胞膜表达HLA I型和HLA II型抗原，ADHAPI-细胞能够同时将内源性合成的CTA的免疫原性表位呈递给CD8+和CD4+自体T淋巴细胞；因此，ADHAPI-细胞能同时诱导/扩增定向于CTA的CTL和体液免疫应答。另外，ADHAPI-细胞可以表达和向宿主T细胞呈递还没有得到鉴定和表征的甲基化调节的CTA(以及已知和仍然未知的CTA的非优势免疫表位)。
与ADHAPI-细胞相反，合成CTA肽-脉冲的、合成CTA全蛋白-脉冲的或完整肿瘤细胞制品-脉冲的自体APC疫苗(例如树突细胞，PBMC)，以及电融合-产生的肿瘤细胞-树突细胞杂交细胞(Kugler A.等，Nat.Med.，6332-336，2000.TureciO.等，Cancer Res.，564766-4772，1996.编辑)共有的主要限制包括i)离体加载的合成CTA肽、完整合成CTA蛋白或源自肿瘤的CTA在体内的命运未知，这可显著地影响抗原向宿主免疫系统的呈递的持续时间；ii)可离体加载到细胞疫苗的HLA I型和/或HLA II型抗原上的有限量的合成CTA肽、完整合成CTA蛋白或源自肿瘤的CTA，可以显著地阻碍被施用的CTA的免疫原性；iii)受患者HLA表型的限制和迄今为止所鉴定的CTA的数目仍比较有限的已知HLA I型抗原-以及甚至更为有限的HLA II型抗原限制性免疫原性表位；iv)可利用足量的新鲜肿瘤组织，这也充分表明了在肿瘤性损伤中表达的不同CTA(Jenne L.等，Trends Immunol.，22102-107，2001)。
ADHAPI-细胞表达内源性合成的CTA持续很长时间；因此，与离外合成CTA肽脉冲的或合成CTA完整蛋白脉冲的或完整的肿瘤细胞制剂脉冲的自体APC疫苗不同，ADHAPI-细胞能够在体内持续刺激宿主的免疫应答而对患者的施用次数较少。由于ADHAPI-细胞没有长期的体内致瘤作用，所以该假说通过预见到以活的、未经x-射线处理的细胞疫苗形式来施用ADHAPI-细胞的可能性而得到进一步的支持。而且一旦ADHAPI-细胞在体内经历生理性死亡，它们仍将起着内源性合成的CTA肽和蛋白的″储存库″的作用，这将进一步并有效地强化患者的树突细胞通过交叉致敏的免疫机制将HLA I型-限制性CTA表位呈递给CD8+T细胞，以及通过充分明确的抗原加工的外源途径将HLA II型-限制性CTA表位呈递给CD4+T细胞。
ADHAPI-细胞保留了它们的APC功能；事实上，它们有效地刺激了自体和同种异体PBMC的增殖和对IFN-γ的释放；而且，与其各自的对照细胞相比，ADHAPI-细胞在大多数情况下是更强的刺激物。在这方面，相关的是除了CTA以外，与其各自的对照细胞相比，ADHAPI细胞可同时表达更高水平的HLA I型抗原和/或不同的共同刺激性/辅助性分子。这些证据清楚地说明了与免疫原性差而且不能组成型表达几种共同刺激性/辅助性分子的自体肿瘤细胞相比，ADHAPI-细胞作为自体细胞疫苗具有很大的优势。而且，与离体产生和扩增的自体树突细胞相比，ADHAPI-细胞疫苗由完全成熟的和免疫活性的APC产生；这一点克服了用于制备细胞疫苗的树突细胞成熟阶段所带来的潜在限制，而这可能影响其耐受原性而不影响其免疫原性。
与其它的细胞疫苗相比，离体产生同时表达多种/所有甲基化-调节的CTA的ADHAPI-细胞疫苗是简单的，在大多数情况下是快速的，不需要繁琐的体外细胞操作，不涉及遗传操作，不需要自体肿瘤组织，而且由健康个体和癌症患者的PBMC高度可重复。
而且，近100％的ADHAPI-细胞制剂表达所有被研究的CTA，该CTA在APC中可诱导脱甲基化。由于具有这些特性，ADHAPI-细胞疫苗的制备更易于标准化和控制质量(例如对被选择的细胞表面分子进行流式细胞仪分析并对经选择的CTA进行RT-PCR)以及效力(例如对经选择的CTA进行定量RT-PCR)。此外，与迄今为止必须在每次对患者施用时新鲜制备，因而产生显著的制剂间差异(例如，细胞存活性、疫苗接种细胞的表型谱、所加载的合成CTA肽或合成CTA完整蛋白或完整的肿瘤细胞制剂的量、通过电融合生成肿瘤细胞-树突细胞杂合体的效力)的其它细胞疫苗相比，ADHAPI-细胞疫苗一旦制成并检测了存活率、质量和效力，就能进行等分，适当地冷冻起来并保存在存活条件下一直到被用于治疗目的。而且，由于它们不需要获得自体肿瘤组织来脉冲自体细胞疫苗或离体制备肿瘤细胞-树突细胞的杂合体，而且它们能从重复的leukaphereses进行快速的大量制备，所以ADHAPI-细胞疫苗为每位患者提供了实际上不受限制的治疗剂来源。
鉴于ADHAPI-细胞能同时表达多种/所有甲基化-调节的CTA，其中所述CTA是内源性合成的并且能直接和同时进入HLA I型和HLAII型抗原加工途径，由于ADHAPI-细胞有可能对还没有被鉴定和表征的甲基化-调节的CTA(以及已知的和仍然未知的CTA的非优势免疫表位)进行表达并呈递给宿主的T细胞，和由于迄今为止所鉴定的CTA的已知HLA I型抗原-和HLA II型抗原-限制性免疫原性表位数目仍然有限(所述CTA表位由此可根据患者的HLA表型而被用于治疗目的)，ADHAPI-细胞的其它优势是它们很可能能够在任何以及多种HLA I型和HLA II型同种特异性情况下同时呈递不同CTA的已知和仍然未知的免疫原性表位。因此，与合成CTA肽脉冲的或合成CTA完整蛋白脉冲的细胞疫苗相比，采用ADHAPI-细胞疫苗的治疗不限于具有明确HLA表型的患者；因此肿瘤性损伤表达一种或多种CTA的所有癌症患者都可以作为进行ADHAPI-细胞疫苗治疗的候选对象，而不用考虑他们的HLA表型。在这方面，在迄今为止已知的CTA中，其一种或多种通常在大多数被研究的不同组织型恶性肿瘤中表达；因此接种ADHAPI-细胞对于绝大多数的癌症患者来说是合适的。一条有意义的信息是MAGE，GAGE或NY-ESO-1在96％的人类肿瘤中表达(Cancer Immunol.Immunother.503-15，2001)。
与合成CTA肽脉冲的或合成CTA完整蛋白脉冲的细胞疫苗(其中可以将有限量的蛋白离体加载到细胞疫苗的HLA I型和/或HLA II型抗原上，显著地阻碍了所施用的CTA的免疫原性)相比，并且由于ADHAPI-细胞同时表达多种/所有甲基化-调节的CTA，ADHAPI-细胞疫苗能够克服在针对单一或数种CTA的治疗过程中出现的CTA-阴性肿瘤变异体的免疫选择，并且克服在特定肿瘤性损伤中不同CTA的组成型不均一表达和时而下调的表达。
ADHAPI-细胞疫苗由自体功能性APC构成，其同时表达多种/所有已知的甲基化-调节的CTA以及很可能表达仍未得到鉴定的CTA，该CTA的表达通过DNA甲基化来进行调节；而且，ADHAPI-细胞疫苗能被用于患不同组织型CTA-阳性肿瘤的患者。这些功能性和表型特征比目前采用的同种异体肿瘤细胞疫苗(例如，完整的混合肿瘤性细胞系的溶胞产物或其未纯化的提取物、从混合肿瘤性细胞系脱落下的抗原)具有明显的优势，事实上，这些肿瘤细胞疫苗可能不含或可能含有不足量的已知和仍然未知的免疫学相关CTA，含有可与CTA竞争免疫应答的非相关细胞组分，由于是同种异体而可能毒性增加，需要由患者免疫系统进行有效加工，并且可仅仅用于患相同组织型恶性肿瘤的患者。
ADHAPI-细胞相对于遗传修饰的细胞CTA疫苗ADHAPI-细胞的制备不包括对自体树突细胞或其它自体APC的离体遗传操作，该操作是生产遗传修饰的细胞疫苗所需要的，在转染或转导后，该疫苗表达经选的CTA。而且，与ADHAPI/细胞相比，许多限制因素影响了遗传修饰的细胞疫苗；这些限制因素有i)可利用的转染方法的效率较低；ii)诱导针对被用于细胞转导的病毒载体的抗原的细胞免疫应答，导致对遗传修饰的疫苗接种细胞造成了破坏；iii)存在预先就存在的或接种疫苗-诱导产生的干扰疫苗施用的中和抗体；iv)病毒载体对被转导细胞的存活、成熟和抗原-呈递能力的直接影响(Jenne L.等，Trends Immunol.，22102-107，2001)。
表IADHAPI-细胞和对照细胞的回收
a数据表示在3(a)，4(b)，4(c)，4(d)，7(e)和5(f)次独立实验中，与被用于其产生的细胞数目(100％)相比，被回收细胞的平均值％±SD。
表IIADHAPI-细胞与自体对照细胞*进行比较的表型谱 *通过Student’s配对t检验比较在6(a)，6(b)，4(c)，4(d)，6(e)和2(f)次独立实验中利用流式细胞仪获得的平均荧光强度的平均值来获取数据。统计学显著差异不变地代表与自体对照细胞相比被研究抗原在ADHAPI-细胞上表达上调。
f不显著；gp值；h未检测的；
ADHAPI-细胞/CD40L-B＝82-100％CD20+；对照CD40L-B细胞＝87-99％CD20+。
表III酶联免疫吸附测定(ELISA)评估由受ADHAPI-细胞(S)或对照细胞(S)刺激的自体(R)(aMLR)和同种异体(MLR)PBMC(R)释放的IFN-γ。*
*数据代表在2(a)，4(b)，4(c)，4(d)，3(e)和4(f)次独立实验中释放的IFN-γ的平均值±SD(pg/ml)。S/R比值是3∶1(a)，1∶1(b)，1∶2(e)，1∶1(d)，1∶1(e)，1∶2(f)。在培养开始后的24小时(a)，6天(b)，24小时(c)，6天(d)，24小时(e)和6天(f)检测IFN-γ的释放；g通过Student’s配对t-检验获得的相对于对照细胞的p值；h未检测的。
权利要求
1.一种生成抗原呈递细胞的方法，包括a)从受试者收集所述细胞；b)激活所述收集的细胞；c)离体培养和任选地扩增所述被激活的细胞；d)用DNA降低甲基化试剂处理所述培养和任选扩增的细胞以使所述细胞同时表达多种肿瘤相关抗原。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述受试者是人。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述受试者是癌症患者。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞是非免疫细胞。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞表达共有的优势免疫癌症抗原。
8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞表达共有的非优势免疫癌症抗原。
9.如权利要求1-5中任一项和权利要求7-8中任一项所述的方法，其中所述细胞是EB病毒-无限增殖化的B-类淋巴母细胞系。
10.如权利要求1-5中任一项和权利要求7-8中任一项所述的方法，其中所述细胞是商陆促分裂原(PWM)激活的B-淋巴细胞。
11.如权利要求1-5中任一项和权利要求7-8中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD40激活的B-淋巴细胞。
12.如权利要求1-5中任一项和权利要求7-8中任一项所述的方法，其中所述细胞是植物凝集素(PHA)+重组人白介素-2(rhIL-2)激活的PBMC。
13.如权利要求1-5中任一项和权利要求7-8中任一项所述的方法，其中所述细胞是植物凝集素(PHA)+重组人白介素-2(rhIL-2)+商陆促分裂原(PWM)激活的PBMC。
14.如权利要求1-4中任一项和权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述细胞是树突细胞、单核细胞、巨噬细胞。
15.如权利要求1-4中任一项和权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD34+细胞、成纤维细胞、干细胞、成纤维细胞和cheratinocyte。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中组蛋白脱乙酰酶抑制剂被用于步骤d)。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述DNA降低甲基化试剂选自5-氮杂胞苷或5-氮杂-2’-脱氧胞苷。
18.可由权利要求1-17中任一项所述的方法获得的细胞。
19.权利要求18所述细胞和/或其细胞组分在预防和治疗不同组织型恶性肿瘤中的用途，所述恶性肿瘤组成型表达一种或多种癌症抗原。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述共有癌症抗原是优势免疫癌症抗原。
21.如权利要求18所述的用途，其中所述共有的癌症抗原是非优势免疫的。
22.如权利要求18所述的用途，其中所述癌症抗原是癌症睾丸抗原。
23.如权利要求19-22中任一项所述的用途，其中所述细胞被贮存为混合抗原的储存库。
24.如权利要求23中所指的混合抗原用作癌症疫苗。
25.含有权利要求18所述细胞的癌症疫苗。
26.如权利要求25所述的疫苗，所述疫苗是自体的。
27.如权利要求25所述的疫苗，所述疫苗是同种异体的。
28.如权利要求27所述的疫苗，其中所述细胞按照权利要求23所述被使用。
29.如权利要求27或28所述的疫苗，其中使用了权利要求19所述的细胞组分。
30.权利要求18所述的细胞和/或其细胞组分在用于生成效应免疫细胞的方法中的用途，所述效应免疫细胞被用于制备在过继免疫疗法中有用的产品。
31.一种商品，其含有如权利要求25-29中任一项所述的疫苗和适于全身施用降低甲基化试剂的药物组合物。
全文摘要
本发明公开了一种生成抗原呈递细胞的方法，包括a.从受试者的体内收集所述细胞；b.激活所述收集的细胞；c.离体培养和任选地扩增所述被激活的细胞；d.用DNA降低甲基化试剂处理所述培养和任选扩增的细胞以使所述细胞同时表达多种肿瘤相关抗原。可按照本发明方法获得的细胞，以及其细胞组分单独或与所述细胞相联合，用于预防和治疗不同组织型恶性肿瘤，所述恶性肿瘤组成型表达在所述细胞中表达的多种肿瘤相关抗原中的一种或多种。便利地是，所述细胞和/或细胞组分为疫苗的形式。由于所述疫苗能同时表达多种/所有甲基化－调节的肿瘤相关抗原，所以该疫苗优于现有技术。
文档编号C12N15/85GK1537161SQ02815007
公开日2004年10月13日 申请日期2002年7月25日 优先权日2001年7月30日
发明者R·德桑提斯, R 德桑提斯 申请人:希格马托制药工业公司