专利名称：诺如病毒核酸标准样品的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒核酸标准样品的制备方法，尤其是一种省时省力、稳定性高、均匀性好的诺如病毒核酸标准样品的制备方法。
背景技术：
诺如病毒(Norovirus, NV),属杯状病毒科、沃克病毒属的小圆状结构病毒,呈20面体对称，无包膜，电镜下缺乏显著的形态特征，与动物嵌杯病毒不同的是没有明显的嵌杯凹陷或表面孔洞，在氯化铯(CsCl)中的浮密度为1.38 1.41 g / cm。对各种理化因子的抵 抗力较强，耐乙醚、酸及热，IOO0C 30分钟不能完全灭活。诺如病毒在病毒引起的肠道传染病中属常见的致病源，它已成为非细菌性肠胃炎的最主要致病源。该病毒传染性极强，容易引起暴发流行，若治疗不及时或治疗方法不正确，轻者影响人体的生长发育，严重者可导致脱水死亡。近年来，该病毒引起的病例有上升的趋势，对该病的诊断控制尤为重要，但由于诺如病毒不能体外繁殖、无动物模型、不能用组织培养法或动物实验进行分离检测等，阻碍了对该病的病原学、致病机理、诊断方法的研究和防治措施的制订。由于该病毒不但具有上述的特殊性，而且该病毒属于RNA病毒，其RNA极其容易被降解，各自实验室提取RNA病毒，不但费时费力，而且很难保持其稳定性和均匀性，难以保证实验室的质量控制。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种省时省力、稳定性高、均匀性好的诺如病毒核酸标准样品的制备方法。本发明的技术解决方案是一种诺如病毒核酸标准样品的制备方法，其特征在于按如下步骤进行
a.提取诺如病毒RNA
在离心管中加入Trizol裂解液1000 μ I、感染诺如病毒粪便200 μ I、加入氯仿200 μ I震荡混匀，10 000 g离心15min ;吸取上清液500 μ I加入到500 μ I异丙醇中，反复颠倒混匀，10 000 g离心15min ;弃去上清后，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入75%的酒精1000 μ 1，颠倒洗涤，10 000 g离心IOmin ;再弃去上清后，倒置于吸水纸上，沾干液体；4OOOg离心lOsec，用吸干管底的液体，室温干燥3 min ;加入11.5μ I的DEPC水，溶解管内的RNA，2 OOOg离心5sec，4°C保存，做为模板备用；
b.RT-PCR 反应 b-Ι.反转录体系
5XM-MLV Buffer 4μ1, dNTPs (各 2. 5mmol/L) 2μ1, M-MLV (5υ/μ1) μ , RNA 酶抑制剂O. 5μ1,反转录游引物(20pmol/>L) μ , a步骤所得RNA模板11. 5μ1 ;所述反转录游引物是5’ -TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’ ；b-2.反转录条件 42°C水浴lh 2h ； b-3. PCR扩增反应体系
IOXPCR Buffer (含 Mg2+) 2· 5μ1，dNTPs (各 2· 5mmol/L) O. 5μ1，Taq DNA 聚合酶(5U/μυ μ ，上游引物、下游引物(20ρπιο1/μ1)各 μ ，b-2的反转录产物O. 5μ1，用无菌水补充至 25μ1 ；
所述上游引物是 5’ -TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’ ；
所述下游引物是 5’ -TCACTATGATGCTGATTACTC-3’ ；
b-4. PCR扩增条件94°C预变性3min ;94°C变性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸I. 5min，30 个循环；72°C 5min ;4°C保存；
c.目标基因的纯化
米用 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. O试剂盒,回收目标分子DNA片段；
d.目的片段的连接转化 d-Ι连接体系
c步骤所得到的纯化的目的片段4μ1, 2XRapid ligation buffer 5μ1, PGEM-T载体
O.5μ1，Τ4 DNA Ligase O. 5μ1，室温连接 Ih ；d-2转化
将上一步骤的连接产物加入到感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴2 Om i η，4 2 °C热应激lmin,冰浴2min,加入800μ1 SOC培养基，150g摇菌I. 5h, I OOOg离心IOmin,弃去培养液，加入新鲜的SOC培养基200μ1，混匀后涂在含有Amp+的LB平板上，风干后，37°C倒置培养12tTll0h ；
d-3阳性克隆的筛选
挑取单克隆菌进行培养，用PCR方法进行阳性克隆的筛选，PCR体系及反应条件如b-3、
b-4 ；
e.回收质粒；
f.体外转录
将e步骤所得质粒用SalI进行单酶切，反应体系为10XH Buffer 5μ1，Sail μ ，质粒ΙΟμΙ,双蒸水34μ1 ；37°C 2h,用Omega回收试剂盒回收线性化质粒；转录反应体系为10XT7 RNA polymerase buffer δμΙ, ΤΤ 5μ1, NTP ΙΟμΙ, Rnasin μ ，线性化质粒 5μ1，Τ7RNApolymerase μ ，DEPC处理水 28μ1 ;37°C 2h，然后再加入 IOU DnaseI 2μ1，37°C，30min。本发明不仅制备过程省时省力，而且所制备的诺如病毒核酸标准样品稳定性高、均匀性好，可以为诺如病毒检测研究、医药研究、应用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果的比对，从而保证实验室的质量控制。
图I是本发明实施例诺如病毒聚合酶基因的RT-PCR扩增电泳图。 图2是本发明实施例诺如病毒聚合酶基因系统发育树。
具体实施例方式a.提取诺如病毒RNA在离心管中加入Trizol裂解液1000 μ I、人感染诺如病毒粪便200 μ I (购于中国疾病预防控制中心)、同时设阳性对照、阴性对照。加入氯仿200μ I震荡混勻，10 000 g离心15min ;吸取上清液500 μ I加入到500 μ I异丙醇中，反复颠倒混勻，
10000 g离心15min ;弃去上清后，倒置于吸水 纸上，沾干液体，加入75%的酒精1000 μ 1，颠倒洗涤，10 000 g离心IOmin;再轻轻弃去上清后，倒置于吸水纸上，沾干液体；4 OOOg离心lOsec，用微量加样器吸干管底的液体，室温干燥3 min ;加入11. 5μ I的DEPC水，轻轻混匀，溶解管内的RNA，2 OOOg离心5sec，4°C保存，做为模板备用；
b.RT-PCR 反应 b-Ι.反转录体系
5XM-MLV Buffer 4μ1, dNTPs (各 2. 5mmol/L) 2μ1, M-MLV (5υ/μ1) μ , RNA 酶抑制剂
0.5μ1,反转录游引物(20pmol/>L) μ , a步骤所得RNA模板11. 5μ1 ;所述反转录游引物是5’ -TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’ ；
b-2.反转录条件 42°C水浴lh 2h ； b-3. PCR扩增反应体系
IOXPCR Buffer (含 Mg2+) 2· 5μ1，dNTPs (各 2. 5mmol/L) O. 5μ1，Taq DNA 聚合酶(5U/μυ μ ，上游引物、下游引物(20ρπιο1/μ1)各 μ ，b-2的反转录产物O. 5μ1，用无菌水补充至 25μ1 ；
所述上游引物是 5’ -TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’ ；
所述下游引物是 5’ -TCACTATGATGCTGATTACTC-3’ ；
上述引物均为人工合成；
b-4. PCR扩增条件94°C预变性3min ;94°C变性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸
1.5min，30 个循环；72°C 5min ;4°C保存；
PCR电泳结果如图I所示图中出现明显目的条带，M为DL2 000 Marker ；1为诺如病毒聚合酶基因；2为阴性对照；
c.目标基因的纯化
米用 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. O 试剂盒(货号 DV805A),并按其操作说明回收目标分子DNA片段；
d.目的片段的连接转化 d-Ι连接体系
c步骤所得到的纯化的目的片段4μ1, 2XRapid ligation buffer 5μ1, PGEM-T载体O. 5μ1，Τ4 DNA Ligase O. 5μ1，室温连接 Ih ；d-2转化
将上一步骤的连接产物加入到感受态细胞(购于大连宝生物公司)中，轻轻用移液器混匀，冰浴20min，42°C热应激Imin，冰浴2min，加入800μ1 SOC培养基，150g摇菌I. 5h，IOOOg离心lOmin，弃去培养液，加入新鲜的SOC培养基200μ1，混匀后涂在含有Amp+的LB平板上，风干后，37°C倒置培养12tTll0h ；d-3阳性克隆的筛选挑取单克隆菌进行培养，用PCR方法进行阳性克隆的筛选，PCR体系及反应条件如b-3、
b-4 ；
e.回收质粒；
应用Omega公司质粒回收试剂盒回收质粒；
f.体外转录
将e步骤所得质粒用SalI进行单酶切，反应体系为10XH Buffer 5μ1，Sail μ ，质粒ΙΟμΙ,双蒸水34μ1 ；37°C 2h,用Omega回收试剂盒回收线性化质粒；转录按照宝生物公司体外转录试剂盒说明书进行。反应体系为10X T7 RNA polymerase buffer 5μ1, DTT5μ1, NTP ΙΟμΙ, Rnasin μ ，线性化质粒 5μ1，Τ7 RNApolymerase μ ，DEPC 处理水 28μ1 ;370C 2h，然后再加入 IOU DnaseI 2μ1，37°C，30min。将e步骤所回收的质粒通过宝生物公司ABI 3730进行测序。结果如下 TCACTATGATGCTGATTACTCCCGGTGGGACTCAACACAACAAAGAGCCGTGTTAGCAGCGGCTTTAGAAAT
CATGGTCAAGTTCTCCCCAGAGCCGCATCTGGCCCAAAAGGTTGCAGAAGACCTTCTTTCTCCCAGTGTGATGGACG
TGGGTGATTTTAAAATATCAATCAATGAGGGTCTCCCCTCCGGGGTGCCCTGCACCTCCCAATGGAATTCCATCGCC
CACTGGCTCCTCACTCTATGTGCACTCTCTGAGGTTACAAACCTGTCCCCTGACATTATCCAGGCCAACTCTCTCTT
TTCTTTCTACGGTGATGATGAAATTGTGAGCACAGACATAAAATTGGACCCAGAAAAGCTGACAGCAAAACTCAAGG
AATACGGGTTGAAACCGACCCGCCCTGACAAGACTGAGGGACCCCTTGTTATCTCTGAAGACCTGGATGGCCTAACC
TTCCTGCGGAGGACCGTGACCCGCGACCCAGCAGGCTGGTTTGGAAAGTTGGAACAGAGTTCAATACTCAGACAAAT
GTATTGGACTAGGGGCCCCAACCATGAAGACCCATCTGAAACAATGATACCACACTCCCAGAGGCCCATACAATTGA
TGTCTTTGCTGGGTGAGGCCGCACTCCACGGCCCAGCATTCTACAGCAAAATCAGCAAACTGGTCATTGCAGAGTTG
AAGGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCAAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCGGATCTGAGCAC
GTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGTTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGA
本发明扩增了诺如病毒聚合酶基因的部分片段，全长823bp，将本发明毒株聚合酶基因序列提交NCBI数据库进行核苷酸序列相似性检索，结果表明该毒株序列与GII-4基因群序列核苷酸相似性最高。见表I。表I诺如病毒聚合酶基因核苷酸序列blast结果
权利要求
1. 一种诺如病毒核酸标准样品的制备方法，其特征在于按如下步骤进行a.提取诺如病毒RNA在离心管中加入Trizol裂解液1000 μ I、感染诺如病毒粪便200 μ I、加入氯仿200 μ I震荡混匀，10 000 g离心15min ;吸取上清液500 μ I加入到500 μ I异丙醇中，反复颠倒混匀，10 000 g离心15min;弃去上清后，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入75%的酒精1000 μ 1，颠倒洗涤，10 000 g离心IOmin ;再弃去上清后，倒置于吸水纸上，沾干液体；4OOOg离心lOsec，用吸干管底的液体，室温干燥3 min ;加入11.5μ I的DEPC水，溶解管内的RNA，2 OOOg离心5sec，4°C保存，做为模板备用；b.RT-PCR 反应b-Ι.反转录体系5 X M-MLV Buffer 4μ1, dNTPs (各 2. 5mmol/L) 2μ1，M-MLV (5υ/μ1) μ ，RNA 酶抑制剂0.5μ1,反转录游引物(20pmol/>L) μ , a步骤所得RNA模板11. 5μ1 ;所述反转录游引物是5’ -TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’ ；b-2.反转录条件42°C水浴lh 2h ；b-3. PCR扩增反应体系10XPCR Buffer (含 Mg2+) 2· 5μ1，dNTPs (各 2. 5mmol/L) O. 5μ1，Taq DNA 聚合酶(5U/μυ μ ，上游引物、下游引物(20ρπιο1/μ1)各 μ ，b-2的反转录产物O. 5μ1，用无菌水补充至 25μ1 ；所述上游引物是 5’ -TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’ ；所述下游引物是 5’ -TCACTATGATGCTGATTACTC-3’ ；b-4. PCR扩增条件94°C预变性3min ;94°C变性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸1.5min, 30 个循环；72°C 5min ；c.目标基因的纯化米用 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. O试剂盒,回收目标分子DNA片段；d.目的片段的连接转化d-Ι连接体系c步骤所得到的纯化的目的片段4μ1, 2XRapid ligation buffer 5μ1, PGEM-T载体O.5μ1，Τ4 DNA Ligase O. 5μ1，室温连接 Ih ；d-2转化将上一步骤的连接产物加入到感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴20min，42°C热应激lmin,冰浴2min,加入800μ1 SOC培养基，150g摇菌I. 5h, I OOOg离心IOmin,弃去培养液，加入新鲜的SOC培养基200μ1，混匀后涂在含有Amp+的LB平板上，风干后，37°C倒置培养12tTll0h;d-3阳性克隆的筛选挑取单克隆菌进行培养，用PCR方法进行阳性克隆的筛选，PCR体系及反应条件如b-3、b-4 ；e.回收质粒；f.体外转录将e步骤所得质粒用SalI进行单酶切，反应体系为10XH Buffer 5μ1，Sail μ ，质粒 ομ ,双蒸水34μ1 ；37°C 2h,用Omega回收试剂盒回收线性化质粒；转录反应体系为IOX T7 RNA polymerase buffer δμΙ, ΤΤ δμΙ,ΝΤΡ 10μ1, Rnasin μ ，线性化质粒5μ1，Τ7RNApolymerase W1，DEPC 处理水 28μ1 ;37°C 2h，然后再加入 IOU DnaseI 2μ1，37°C，30min。全文摘要
本发明公开一种诺如病毒核酸标准样品的制备方法，其特征在于按如下步骤进行提取诺如病毒RNA；RT-PCR反应；目标基因的纯化；目的片段的连接转化；回收质粒；体外转录。本发明不仅制备过程省时省力，而且所制备的诺如病毒核酸标准样品稳定性高、均匀性好，可以为诺如病毒检测研究、医药研究、应用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果的比对，从而保证实验室的质量控制。
文档编号C12N15/63GK102634533SQ201210082760
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者李叶, 杜雄伟 申请人:大连民族学院