专利名称：用于确定作为抗菌药物的D-Ala-D-Ala连接酶抑制剂的基于结构的药物设计方法
技术领域：
本发明涉及药物开发方法，特别是开发能抑制D-Ala-D-Ala连接酶—细菌细胞壁形成中必需的酶的新药物的方法。
抑制细菌细胞壁生物合成的化合物一般被证明是有效的抗生素。例如，能阻止D-丙氨酸形成的消旋酶抑制剂氟-D-丙氨酸和能抑制转肽的β-内酰胺类抗生素可抑制细胞壁合成和细菌生长(Parsons等人，J.Med.Chem.，311772-1778，1988)。然而，最近出现的抗药菌株表明不断地需要新的广谱抗生素。
在与细胞壁生物合成有关的酶当中，D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶(“D-Ala-D-Ala连接酶”；E.C.6.3.2.4)是很重要的，因为其合成独特的二肽D-丙氨酰-D-丙氨酸(“D-Ala-D-Ala”)。该二肽最终掺入到个体肽聚糖链内，在那儿提供在肽聚糖交联期间用于酰基转移的位点(Ellsworth等人，Chemistry & Biology，337-44，1996)。
人们假定阻止D-Ala-D-Ala装配和掺入到细胞壁内的抑制剂是有效的抗生素，因为它们可引起细菌溶解。D-Ala-D-Ala连接酶抑制剂可以是高选择性的广谱抗生素，具有较少的不利副作用，因为D-Ala-D-Ala连接酶在原核生物中高度保守，并且不存在于人类中。
D-Ala-D-Ala连接酶是多结构域蛋白，含有两个结合口袋，一个用于结合ATP，另一个用于结合D-Ala-D-Ala。迄今为止，没有鉴定出能结合D-Ala-D-Ala连接酶的ATP结合位点的有用的抑制剂。
发明概述本发明部分基于下述发现一些小分子可结合D-Ala-D-Ala连接酶的ATP结合位点，甚至在没有酶底物存在的情况下也是如此，并且可引起类似于在ATP和底物与酶结合时所发生的酶结构的构象改变。虽然不希望受敷于理论，但据信，这样的构象改变是激活或抑制酶所必需的。从该发现所获得的信息已使得能够鉴定酶活性位点中的关键相互作用，以及设计和优化抑制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及评价化学实体与下列物质发生缔合的可能性的方法包含结合口袋的分子或分子复合物，所述结合口袋是由依据附图8的D-Ala-D-Ala连接酶大肠杆菌氨基酸Lys144，Glu180，Lys181，Leu183，Glu187，Asp257和Glu270的结构坐标所限定的；或所述分子或分子复合物的同源物，所述同源物包含结合口袋，所述结合口袋具有不超过10_的从所述氨基酸主链原子的均方根偏差。该方法包括一个或多个，优选所有下列步骤(1)采用预测方法(例如计算机程序或其它计算手段)以在化学实体与结合口袋中间进行拟合操作，其中所述结合口袋由D-Ala-D-Ala连接酶大肠杆菌氨酸Lys144，Glu180，Lysl81，Leu183，Glul87，Asp257和Glu270的结构坐标+/-不超过10_的从所述氨基酸主链原子的均方根偏差所限定；(2)和分析所述拟合操作的结果以定量确定化学实体与结合口袋之间的缔合。
在另一个实施方案中，本发明涉及确定D-Ala-D-Ala连接酶的可能的抑制剂的方法。所述方法包括下列步骤(1)使用依据附图8的大肠杆菌D-Ala-D-Ala连接酶的Lys144，Glu180，Lys181，Leu183，Glu187，Asp257和Glu270的位置和结构(例如使用这些氨基酸的原子坐标)+/-不超过10_的从所述氨基酸主链原子的均方根偏差来产生D-Ala-D-Ala连接酶结合口袋的三维结构；(2)使用所述三维结构设计或选择所述可能的抑制剂(例如设计或选择满足由上述氨基酸或酶的共底物结合位点中的其它氨基酸限定的物理相互作用模式所施以的要求的抑制剂，所述相互作用可类似于预先选择的或参考模式的相互作用，例如在D-丙氨酸或另一底物或共底物与酶结合时所发生的相互作用)。在优选的实施方案中，该方法还包括一个或两个下列步骤(3)合成或获得所述抑制剂；和(4)将所述抑制剂与D-Ala-D-Ala连接酶接触以确定所述可能的抑制剂抑制D-Ala-D-Ala的能力。任选地，所用的步骤可包括设计这样的分子，当停靠在所述三维结构内时，其具有距离Glu 80侧链的一个或两个羧酸氧原子2.4至3.5_处的氢键供体，距离Lys 181的主链酰胺氧2.4至3.5_处的氢键供体，距离Leu 183的主链酰胺氮2.4至3.5_处的氢键受体，距离Leu 183的主链酰胺氧2.74至3.5_处的氢键供体，和距离Lys 144的侧链氮2.4至3.5_处的氢键受体。该分子还可以包括分别距离Leu269和Met154侧链上的CD1碳和SD硫原子3.5-4.5_的疏水相互作用。可能的抑制剂还可以是双底物类似物(例如可结合酶的ATP-结合位点和D-Ala-结合位点的类似物)。
在另一个实施方案中，本发明涉及确定D-Ala-D-Ala连接酶或D-Ala-D-Ala连接酶同系物的可能抑制剂的方法。所述方法包括下列步骤(1)设计或选择这样的分子，其使得D-Ala-D-Ala连接酶的Ile142或其在同源物中的相应部分处于D-Ala-D-Ala连接酶的Met259或其在同源物中相应部分的12_以内，D-Ala-D-Ala连接酶的Met154或其在同源物中的相应部分处于Leu269的12_以内；(2)合成或获得所述抑制剂；和(3)将所述抑制剂与D-Ala-D-Ala连接酶接触以确定所述可能的抑制剂抑制D-Ala-D-Ala的能力。
除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常所理解的含义。虽然类似于或等同于本文所述方法和物质的方法和物质可用于实施或测试本发明，但是下文描述合适的方法和物质。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文件都全文引入本文以供参考。在矛盾时，包括定义的本说明书起控制作用。此外，这些物质、方法和实施例仅是举例说明，而不是限制性的。
通过阅读下面的详细描述和权利要求书，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。
附图简述附
图1是在没有底物和/或辅因子存在的情况下，D-Ala-D-Ala连接酶的假定的结构图，其根据晶体学数据作出，并显示了该蛋白的ATP-和D-Ala-D-Ala-结合位点和4个域的相对位置。
附图2是仅与ATP复合，或者与ADP、磷酸盐和D-Ala-D-Ala复合(分别如红色和黄色所示)的D-Ala-D-Ala连接酶的晶体结构的叠加。箭头表明了从前一结构向后一结构转化的域B的刚体旋转方向。
附图3是在ATP或抑制剂与D-Ala-D-Ala连接酶的ATP-结合位点结合时的一系列构象改变图，其是假定沿着酶的反应途径发生的。这些图与未结合的酶(E)、初始抑制剂复合物模型(EI)以及在抑制剂引起的构象改变后的酶晶体结构(EI*)相应。
附图4表示的是引起连接酶构象改变的在酶的活性位点残基与抑制剂之间的至少某些关键静电(a)和疏水性(b)相互作用。虚线相当于在保守的蛋白残基与抑制剂之间形成的氢键。在(b)中显示的残基参与和抑制剂的范德华相互作用。
附图5是截流-连接酶结合速度对ATP浓度的图。
附图6是D-Ala-D-Ala连接酶的荧光淬灭对ATP浓度的图。
附图7是得自与D-Ala-D-Ala连接酶结合的新抑制剂的晶体结构的相互作用图。
附图8是大肠杆菌D-Ala-D-Ala连接酶与ADP、磷酸根离子和D-Ala-D-Ala的复合物的原子坐标列表，其通过该复合物晶体的X-射线衍射得到。
附图9是与AMPPNP复合的大肠杆菌D-Ala-D-Ala连接酶的原子坐标列表，其通过该复合物晶体的X-射线衍射得到。
附图10是得自不同菌株的51个D-Ala-D-Ala连接酶序列的比对数据表。
发明详述构象改变的特征确定D-Ala-D-Ala连接酶是由4个结构域构成的多结构域蛋白，这些结构域的界面产生D-Ala-D-Ala和ATP的结合口袋(附图1)。构象改变通过下述手段观测确定与作为ATP竞争性抑制剂的配体复合的酶的晶体结构；使用两个动力学分析的生化测定证实的构象改变存在。
确定构象改变的结构方法首先通过比较两个晶体结构来确定酶的构象柔性即(1)与ATP复合的酶的晶体结构(EI*)和(2)与ADP、磷酸盐和D-Ala-D-Ala复合的酶的晶体结构(EP)。这两个结构的叠加表明，当酶与ADP、磷酸盐和D-Ala-D-Ala复合时，结构域B进入活性位点内的微小刚体旋转(附图2)。该结果表明，连接结构域B的铰链点是相当灵活的，并且当配体在结构域B和C的界面之间结合时，结构域B可能经历显著的刚性体移动。附图3图示表明了当配体首先与酶结合时所发生的事件顺序，以及引起的构象改变的可能大小，其中EI是假定的初始复合物。
连接酶的截流研究我们已经发现，在与ATP和ADP结合时会发生显著的荧光淬灭，我们已用其来测定连接酶的机制特征。我们已经进行了截流实验来探究ATP和ADP与连接酶的结合。这些实验是在4℃进行。我们观察了单指数荧光淬灭，其在＜20ms内完成。用所观测的速度常数与核苷酸浓度绘图，产生双曲线，其表明初始结合之后发生构象改变(附图5)。这证实了我们以前关于连接酶的假设，即酶经历构象改变，构象改变是其酶机制的重要固有部分。该酶似乎属于“诱导契合”种类。
如附图5所示，初始的碰撞复合较弱，形成的是EA复合物(开放复合)。酶经历构象改变以形成部分封闭的复合物EA*。对于ATP，该构象改变将亲和力提高了3.2倍，最终达到Kd＝157μM(总亲和力是两个离解常数Kd1和Kd2的乘积)，净离解速度常数是126s-1。ADP表现出类似的双曲线依赖性，这也表明了诱导契合机制(即在结合后发生构象改变)。对于ADP，该构象改变使部分封闭复合物的核苷酸亲和力相对于初始碰撞复合物提高了7倍，导致50μM的总Kd。我们假定，形成更多的相互作用可提高亲和力，并因此稳定该部分封闭的形式。为了离解配体，酶必须松弛到开放形式。因此，这些抑制剂的亲和力可能与净离解速度常数(即k2)的下降有关。例如，对于D-Ala-D-Ala连接酶，ADP的亲和力高于ATP3倍，并且具有较低的k2＝72s-1。在某些情况下，抑制剂启动进一步的构象改变可能是有利的，也许是结构域D的ω环封闭，导致完全封闭形式的酶。
截流研究使得我们更了解连接酶结合配体的机制，并且证实了以前被怀疑的“锈导契合”机制。通过平衡结合方法或稳态酶动力学法确定高亲和力抑制剂(低nM)的亲和力很困难。截流实验可能是以任何可信度测定高亲和力抑制剂亲和力的唯一方法。该实验可例如使用Eccleston，J.F.“停止流动的分光光度技术”，Spectrophotometry andSpectrofluorimety a Practical ApproachEd.D.A.Harris & C.L.Bashford，IRL Press，1987，p.137-164中描述的方法来进行。
荧光滴定实验除了截流实验以外，还可以稳态荧光滴定研究来测定新化合物对D-Ala-D-Ala连接酶的亲和力。这些实验也利用了在核苷酸结合时发生的内在色氨酸淬灭。我们已经在25℃测定了ATP对连接酶的亲和力(附图6)。有趣的是，ATP结合的KD弱于Km，这意料不到地表明了形成产物后连接酶机制中发生限速步骤。该方法可用于确定连接酶的可能抑制剂的特征。这些滴定方法可使用例如Lohman，T.M.& Mascotti，D.P.(1992)“通过荧光方法测定非特异性配体-DNA平衡结合参数”，Methods inEnzymology，vol.212，p.425-458中描述的方法来进行。
蛋白酶解实验我们已经开发了体外测试来探究ω环(即D域)的封闭。ω环的封闭是通过蛋白酶解来探查的。在没有配体存在下，胰蛋白酶将该酶裂解成两个较小片段。存在ATP和次膦酸盐使得该酶被保护而不发生蛋白酶解。如通过晶体学研究所证实的那样，已知该混合物能稳定ω环的封闭。单独的ATP或ATP结合分子不能封闭ω环。然而，在D-Ala点结合分子例如次膦酸盐存在下，二肽D-Ala-D-Ala或环丝氨酸与ATP、ADP或ATPgS一起稳定ω环封闭。令人惊奇的是，非水解ATP类似物AMPPNP不能支持ω环封闭，这可能表明在ω环封闭方面磷酸盐结合区域中有精细的相互作用。
我们已经合成了腺苷类似物，其中磷酸盐基团被在末端有胺基的小链替代了。该分子之所以值得关注是由于下述两个原因在次膦酸盐或环丝氨酸存在下，其支持了ω环封闭，并且其将提高分子亲和力的基团放置在磷酸盐结合区域内。该分子的亲和力比ATP大20倍(Kd＝300μM)。
获得可支持ω环封闭的分子可带来具有显著更高亲和力的抑制剂。这些实验对于确定在pH7的结晶条件也很重要。在pH7，似乎只有ω环封闭形式的酶会结晶。
确定构象改变的特征与我们的抑制剂复合的酶的晶体结构清楚地显示了限定良好的结合口袋。附图4显示了在蛋白与引起构象改变的抑制剂之间的一些关键相互作用。其中所示的残基是抑制剂必须与其相互作用以启动如附图3所示的结构域B朝着活性位点的大刚体旋转的关键活性位点残基。这种改变还可以依据如表1所列出的个体残基移动来描述。
表1在构象改变期间的分子间距离改变在假定模型EI和晶体结构EI*与EP(封闭的)中的残基ILE142与MET259以及MET 154与LEU 269之间的距离ILE142与MET259之间 MET154与LEU 269之间EI 17.4 13.5El* 7.9 8.9EP 7.0 8.5下面列出在抑制剂优化过程中我们所针对的活性位点中的其它残基。这些残基可能经由范德华相互作用和/或氢键直接与抑制剂相互作用。与下列侧链的可能的疏水性相互作用ILE142TRP182LEU183MET259MET154
LEU269PHE209与下列侧链(或如果指出的话，主链原子)的可能的静电相互作用GLU180LYS181LEU183(主链CO)LEU183(主链NH)GLU185(主链NH)LYS144GLU187LYS215TYR212SER150GLU270ASP257LYS97GLU148ARG255ASN272SER94GLU68残基 侧链相互作用伙伴Asp hb供体Glu hb供体Arg hb受体，芳环Lys hb受体，芳环His hb供体，hb受体，芳环，带正电荷基团Pro 疏水基团(脂族，芳族)Val 疏水基团(脂族，芳族)
Ala 疏水基团(脂族，芳族)Leu 疏水基团(脂族，芳族)Ile 疏水基团(脂族，芳族)Trp 疏水基团(脂族，芳族)，带正电荷基团Gln hb供体，hb受体Asn hb供体，hb受体Ser hb供体，hb受体Thr hb供体，hb受体Tyr hb供体，hb受体，疏水基团(脂族，芳族)，带正电荷基团Phe 疏水基团(脂族，芳族)，带正电荷基团Gly (没有侧链)Cys hb供体，hb受体Met hb供体，疏水基团(脂族，芳族)优化抑制剂效力的方法我们已经开发了提高引起上述构象改变的化合物的效力的反复方法。该方法顺序利用得自蛋白晶体学、分子模拟、化学和生物化学的信息。
蛋白晶体学该方法的第一个步骤是结晶出与引起所需构象改变的配体复合的蛋白并解析其结构。分析在抑制剂附近的结合口袋，并且该结构信息可用于设计专门实现与催化袋中的目标残基特定相互作用的衍生物。如附图7所示，借助于结合在D-ala-D-ala连接酶活性位点中的我们发现的抑制剂的晶体结构定向的2D代表可最好地说明该方法。
该结构确定了嘌呤环的6位是有效衍生化的最佳锚合位点，而2、3和9位涉及与蛋白残基的关键相互作用。如在下一部分所述，因此，在6位的衍生物可以与残基Glu 270和187、Asp 157、Lys 144和97以及其它残基相互作用。
分子模似通过产生和停靠含有所需母核的化合物的虚拟库(virtuallibraries)，结合口袋的结构信息还可以用于设计优化的类似物。例如，基于附图1的晶体学信息，将嘌呤母核与市售构建单元合并起来以产生6-取代的2-氨基嘌呤的虚拟库。然后将所得结构停靠在D-Ala-D-Ala连接酶的活性位点内，并根据停靠得分来选择一组有希望的化合物。
如上所述，晶体结构还鉴定了能够是可能的特定相互作用目标的结合口袋中的一系列残基Glu 270和187、Asp 157、Lys 144和97等。通过用具有适当大小和化学特征的片段将嘌呤先导化合物衍生化来设计新的配体，以与这些残基当中的某些残基特异性地相互作用。然后通过将所得衍生物停靠在DDL的催化口袋中来验证该设计。实施例7中描述了涉及生成和停靠6-取代的嘌呤虚拟库的步骤。通过选择最有希望的候选化合物来进行合成，这些模拟方法优先合成某些化合物，由此提高了先导化合物优化方法的效率。
化学该方法的第三个步骤合成优先的化合物。然后使用专门方法或已在文献中描述的已知化学反应制备停靠在活性位点内并且已决定优先合成的上述类似物。在分子模拟部分中描述的虚拟库可使用市售原料或文献中描述的原料来产生。当原料可商购获得时，则购买原料，然后用于合成由停靠法预测是有效的酶抑制剂的化合物。当原料不能商购获得，但是可如文献所述合成时，则首先用文献方法或专门方法合成原料，然后用于合成由虚拟库停靠所优先的化学结构。
生物化学最后一个步骤是确定新合成的化合物是否抑制酶，然后确定它们是否引起所需构象改变。例如，可在体外测定中并行测试活性化合物，并通过蛋白晶体学进行分析以开始下一个轮优化。
已经使用酶学实验来解卷曲(deconvolute)或鉴定ATP结合位点的重要组分。我们已经发现，大部分亲和力来自ATP分子的腺嘌呤部分，并且磷酸盐，尤其是α磷酸盐实际损害亲和力。分析可例如使用Duncan等人的ATPase测定(Biochemistry，273709-3714，1988)来进行。
抑制D-Ala-D-Ala连接酶的测定
D-Ala-D-Ala连接酶抑制的测定可使用在实施例2中描述的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶(PK/LDH)测定。在细菌细胞壁合成过程中，连接酶催化ATP转化成ADP，同时发生两个D-丙氨酸残基的连接。之后PK将由此生成的ADP再生成ATP，同时磷酸丙酮酸转化成丙酮酸。LDH通过将NADH转化成NAD+而催化丙酮酸还原成乳酸。通过监测NAD+的生成速度，可确定D-Ala-D-Ala连接酶活性。
双底物类似物还考虑了不仅与D-Ala-D-Ala连接酶的ATP-结合位点结合，而且还与D-Ala结合位点结合的双底物类似物。这样的类似物将包括经由柔性或钢性连接基团(例如烷基、链烯基、炔基或多芳族连接基团或一个或多个这些基团的衍生物或杂合基团)连接的ATP-及D-Ala-样部分。双底物类似物可表现出提高的效力和/或对于D-Ala-D-Ala连接酶的特异性。
抗菌活性测定可使用标准方法来筛选化合物的抗菌活性。
在如实施例5所示的一个实例中，使用肉汤微稀释技术来测定化合物抗给定细菌培养物的体外活性，以获得最小抑制浓度(MIC)数据。
在一个典型方法中，可筛选化合物抗多种不同菌株的抗菌活性。测定化合物的效力和活性谱宽度以鉴定出可能的先导化合物。可筛选具有制菌活性(即阻止细菌生长)和/或杀菌活性(即杀死细菌)的化合物。
可通过例如改变取代基以产生衍生化合物来进一步优化先导化合物。衍生物可每次制备一种，或者可用平行或组合合成方法来制备衍生物。在任一种情况下，可测定衍生物以产生结构-活性关系(SAR)数据，其可用于进一步优化先导化合物。
优化酶抑制活性的方法一旦已经鉴定出可能的抑制剂(例如通过在酶测定中比较化合物与标准物例如AMP-PNP的活性)，就可以使用基于结构的设计方法来优化抑制剂。使用in silico中以活性位点的计算机模型预筛选的药物样分子，可提高先导化合物的高输出量筛选。例如，可将抑制剂和酶作为复合物结晶出来，并且可确定该复合物的晶体结构。然后可使用得自晶体结构的结构信息来制定药效基团假设。例如，如果晶体结构表明例如酶的活性位点中在距离抑制剂分子的氢键供体(例如质子化的胺部分)一定距离(例如3_)处有未利用的氢键受体(例如谷氨酸残基的羰基)，则可以设计其中氢键供给基团在适当距离的新的可能的抑制剂。可重复该方法以提供效力增加的特异性酶抑制剂。
可使用X-射线晶体结构信息来进行计算药效研究以产生计算模型。可停靠和选择市售化合物来用停靠得分进行筛选以作为一个、但无需是唯一一个考虑要素。
可购买或合成另外的类似物，然后筛选。用这些类似物进行的实验可用于证实从以前的筛选实验所作的假设，或提出可通过重复该过程来类似地检验的新假设。在某些情况下，可鉴定另外的模板，并且可购买或合成基于这些模板的化合物以检验新的假设。可能希望鉴定药理相关模板，和/或最佳地检验互补结合假设的模板。在每一情况下，一般是筛选化合物抗酶目标的活性，并且还测试化合物的体外抗菌活性。
此外，分子模拟技术为本领域已知，包括适用于产生和利用受体和酶构象模型的硬件和软件。
在本发明方法中，有多种计算机程序可以使用，并且适于理论的药物设计和计算机模拟、模型构建和计算鉴定、选择和评价可能的抗菌化合物的过程。这些程序包括例如GRID(得自Oxford University，UK)、MCSS(得自Accelrys，Inc.，San Diego，CA)、AUTODOCK(得自OxfordMolecular Group)，FLEX X(得自Tripos，St.Louis.MO)、DOCK(得自University of California，San Francisco)、CAVEAT(得自University of California，Berkeley)、HOOK(得自Accelrys，Inc.，San Diego，CA)和3D数据库系统例如MACCS-3D(得自MDL InformationSystems，San Leandro，CA)、UNITY(得自Tripos，St.Louis.MO)和CATALYST(得自Accelrys，Inc.，SanDiego，CA)。还可以使用软件包例如LUDI(得自Biosym Technologies，San Diego，CA)、LEGEND(得自Accelrys，Inc.，San Diego，CA)和LEAPFROG(Tripos Associates，St.Louis，MO)来“重头”计算设计可能的抗菌化合物。化合物变形能量和静电排斥可用程序例如GAUSSIAN 92、AMBER、QUANTA/CHARMM和INSIGHT II/DISCOVER来评估。这些这些计算机评估和模拟技术可用任何合适的硬件，包括例如得自Silicon Graphics，Sun Microsystems等的工作站等来进行。这些技术、方法、硬件和软件包是代表性的，并且没有全部列出来。依据本发明，还可以使用本领域已知的其它模拟技术。残基例如N.C.Cohen，Molecular Modeling in Drug Design，Academic Press(1996)(以及其中的参考文献)和在不同因特网站点确定的软件。
D-Ala-D-Ala连接酶抑制活性的优化可独立于抗菌活性的优化。不同的活性可通过提供经过基因工程改造而能过量表达D-Ala-D-Ala连接酶的菌株(即产生对D-Ala-D-Ala连接酶抑制剂有抗药性的菌株)来区别，然后表明特定先导化合物的抗菌活性不受该过量表达的影响。
在下述实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制由权利要求书确定的本发明范围。
实施例实施例1蛋白结晶、数据收集和结构确定的方法通过在配体存在下将D-Ala-D-Ala连接酶共结晶，或者通过将配体浸入到预先形成的该蛋白晶体内来获得结构信息。第一个方法是，在含有5mg/ml蛋白、35mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)、2.75％(w/v)聚乙二醇6000、4％DMSO和超过其Ki值15-100倍(摩尔)的过量抑制剂的4μl液滴中，通过在18℃蒸气扩散，5天后获得了与抑制剂复合的连接酶的衍射质量晶体(六角形柱；0.1mm×0.1mm×0.2mm)。在第二个操作中，在含有70mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)、5％(w/v)聚乙二醇6000和超过其Ki值15-100倍(摩尔)的过量抑制剂的稳定溶液中培养与ATP复合的连接酶晶体。
在RAXIS IV++成象板上于-180℃收集数据，该成象板固定在RigakuRuH3R旋转阳极发生器上，该阳极发生器装配着铜阳极、0.5mm阴极和锇镜。晶胞参数是由单个1°振动图像，使用DENZO加工软件(Z.Otwinowski和W.Minor，“以振动方式收集的X-射线衍射数据的加工”，Methods in Enzymology，Vol.276Macromolecular Crystallography，part A，p.307-326，1997，C.W.Carter，Jr.& R.M.Sweet，Eds.，Academic Press)确定的。通过以100mm的检测器距离和以1°的间隔15分钟内收集100-180个振动图像来获得全数据集。连接酶-抑制剂复合物的共晶体和浸泡的晶体都属于空间群P212121，在不对称晶胞上有两个分子和下列晶胞尺寸a＝69.6_，b＝82.6_，c＝96.7_。典型的数据集是有98％完全达到2.0_，Rsym为4-9％。
使用出版的关于连接酶和次膦酸盐抑制剂的复合物的原子坐标(Fan等人，Science，266(5184)439-443，Oct.21，1994)来作为检索模型，以使用XPLOR程序(Brunger等人，Science，235458-460，1987)通过分子置换来解析连接酶AMPPNP的结构，然后使用该精确的AMPPNP结构来精确随后的复合物。通过以下方式精确与使用本发明方法确定的分子复合的连接酶的结构进行几个模拟退火循环，然后用XPLOR进行位置和限制的B-因子精确。
实施例2--D-Ala-D-Ala-连接酶IC50测定在筛选当天，将实施例1的嘌呤衍生物以100mM的浓度溶解在二甲亚砜(DMSO)中，如果需要的话使用涡旋混合器进行来促进溶解。将该溶液保持在室温直至筛选完成。
在筛选当天，通过将32μmol NADH溶解在3.2ml双重蒸馏水中来制备10mM NADH(Sigma)贮备液。将该NADH溶液保持在冰上。也制备含有50mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP；Sigma)，500μm HERMES，30mM三磷酸腺苷(ATP；Sigma)，200mM D-丙氨酸(Sigma)和4×核心缓冲液(即100mM Hepes，40mM氯化镁和40mM氯化钾)的贮备液，并在冰上贮存。丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶(PK/LDH)的贮备液也得自Sigma。
对于每组7种嘌呤测试化合物，使用2个96孔板抑制剂板和酶板。测试化合物在平板的第A-G排。D-环丝氨酸(Sigma)在每个板的第H排。
让酶溶液在25℃平衡。
如下所述制备稀释液将50μl二甲亚砜(DMSO)加入到抑制剂板的第1-11列、第A-G排的每个孔中。将50μl1×的核心缓冲液或DMSO(根据溶解环丝氨酸对照物的溶剂)加到第1-11列、第H排的每个孔中。将100μl的100mM嘌呤溶液加到第12列、第A-G排中(即第一种化合物在第A排中，第二种化合物在第B排中，如此类推)。将100μl的100mM环丝氨酸加到第12列、第H行中。
将50μl溶液从每一排的第12列转移到相同排的第11列中，将该溶液与DMSO混合。然后将50μl溶液从每排的第11列转移到相同排的第10列中，将50μl从第10列转移到第9列中，如此类推直至第2列。没有溶液转移到第1列中。记录开始和结束的时间。
将120μl酶溶液加到酶板的每个孔中。
将底物溶液置于25℃温度下。
然后将嘌呤与酶温育。因为反应是在列中开始的，所以嘌呤也逐列加入以将孔之间的反应时间差异减至最小。在t＝0分钟，将5μl嘌呤从抑制剂板第1-4列的每个孔中转移到酶板的相应孔中。在t＝4分钟，将5μl嘌呤从抑制剂板第5-8列的每个孔中转移到酶板的相应孔中。在t＝8分钟，将5μl嘌呤从抑制剂板第9-12列的每个孔中转移到酶板的相应孔中。然后将抑制剂板冷冻。
在t＝18-19分钟，将底物溶液从25℃转移到Spectromax_UV-vis分光光度计。在t＝20分钟时，在30秒的时间框架中，将125μl底物溶液加到第1-4列的每个孔中，读取在340nm的吸收度。在t＝24分钟和t＝28分钟时，分别用第5-8和9-12列重复该操作。
因此，在每一排的第1-12列中，化合物的浓度分别是0、1.9μM、3.9μM、7.8μM、15.6μM、31.2μM、62.5μM、125μM、250μM、500μM、1mM和2mM。
将减小值乘于-4.06以将mOD/分钟单位转化成nM/秒(OD＝λLM；λ＝6220l/Mcm；L＝0.66cm；mOD/秒＝6220×0.66×(mM/秒)×60；(mOD/秒)×4.06＝nM/秒)；乘于-1是因为NADH吸收度随着更多产物的生成而降低)。
使用Kaleidograph_产生反应速度对抑制剂浓度的曲线，将数据拟合到适当方程上之后，确定IC50和Ki值。对于％抑制，在DMSO存在下的酶活性用作100％活性对照。
1×核心缓冲液中的环丝氨酸具有约150μM的值。
该测定方法取决于嘌呤化合物是非竞争性抑制剂的假设。
实施例3-测定对D-Ala-D-Ala连接酶的％抑制重复实施例2中描述的测定操作，但是在平板中用5mM抑制剂溶液(而不是系列稀释液)制备抑制剂板，以产生100μM抑制剂的终浓度。
实施例4-确定Ki和抑制方式使用分别在不同酶板中的3种不同底物溶液重复实施例2中描述的测定操作。反应混合物中的终浓度为(A)2mM ATP和1mM D-丙氨酸；(B)2mM ATP和32mM D-丙氨酸；和(C)50μM ATP和32mM D-丙氨酸。所有这3个酶板都使用相同的抑制剂板。使用腺苷(Sigma)和环丝氨酸(Sigma)作为对照。
实施例5-微稀释抗微生物敏感性测试在DMF中制备浓度为5mg/ml的测试化合物的贮备液。然后由贮备液在Mueller-Hinton肉汤(MHB)中以64μg/ml的起始浓度制备测试化合物的工作溶液(即在974.4μl MHB中的25.6μl贮备液＝128μg/ml，按照下述操作用等体积的细菌接种物将其稀释)。
细菌接种物是由过夜培养物制备的(即在5ml MHB中加入得自琼脂板的一个新鲜菌落；流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)在加入酵母提取物、正铁血红素和NAD的MHB中生长)，离心2×5分钟/3000rpm(对于肺炎链球菌和流感嗜血菌，2×10分钟/3000rpm)，每次分配在5ml新鲜的MHB中，这样将细菌悬浮液稀释以在一个微量滴定板孔(总体积100μl)中获得100个菌落形成单位(cfu)。
给微量滴定板孔填充由64μg/ml开始的2倍稀释的测试化合物(50μl)。然后给第2-12列填充50μl细菌接种物(最终体积100μl/孔)。将微量滴定板在37℃培养18-24小时(将肺炎链球菌在富含CO2的气氛下生长)。
然后用TECAN SpectroFluor Plus_测定在590nm的每个孔的光密度(OD590)。最小抑制浓度(MIC)定义为表现出90％生长抑制的浓度。
实施例6-使用过量表达的大肠杆菌测定MIC重复实施例5的操作，但是进行下列改动用于细菌生长的培养基是加入了抗生素(对于pBAD载体，是20mg/l氯霉素，对于质粒筛选的pTAC载体，是100mg/l氨苄西林)的luria肉汤(LB)或具有D-甘露醇作为碳源的M9最小培养基。
用于在LB中接种的细菌是如下所述制备的将过夜培养物在新鲜的LB培养基中进行1∶50稀释，在250rpm的摇床上于37℃培养。达到中-对数期后(OD600＝0.5-1.0，约3小时)，加入操纵子调节剂(葡萄糖、阿拉伯糖或IPTG)，将细菌再培养3小时。约3小时后，再测定OD600以估计细菌数目，将培养物在LB培养基(抗生素-氯霉素或氨苄西林和调节剂以两倍浓度加入)中稀释。最终的细菌接种物约为10,000cfu/孔。
在M9最小培养基中用于接种的细菌是如下所述制备的将LB中的过夜培养物离心2×5分钟/3000rpm，用M9培养基洗涤，在M9最小培养基中进行1∶50稀释，在37℃放置14小时(OD600～0.5)，加入操纵子调节剂，将细菌进一步培养3小时。3小时后，测定0D600以估计细菌数目，将培养物在M9最小培养基(抗生素-氯霉素或氨苄西林和调节剂以两倍浓度加入)中稀释。最终的细菌接种物约为10,000cfu/孔。
因为在最小培养基中细菌生长较慢，所以在24和48小时之后读取光密度。
实施例7-700个嘌呤衍生物的虚拟库的停靠研究
从Available Chemicals Directory(ACD，MDL InformationSystems，San Leandro，CA)获得的不具有反应性或毒性官能团的，且可从Aldrich获得的MW＜300的一组700个脂族伯胺。
使用Cerius2程序的Analog Builder模块(MSI，Accelrys，Inc.，San Diego，CA)生成在6-位被所选的胺取代的700个嘌呤衍生物的文库。
使用Catalyst程序(Aceelrys，Inc.，San Diego，CA)对这700个类似物进行构象检索。由此产生了一组关于每一个化合物的代表性构象异构体。然后进行簇分析以排除重复。如果在刚性体叠加后，相应坐标之间的均方根值低于1.0_，则相同分子的两个构象异构体视为重复。在这样的情况下，仅保留两个构象异构体中的一个。用EUDOC程序(Dr.Yuan-Ping Pang，Mayo Clinic提供的)将所选构象异构体停靠到D-Ala-D-Ala连接酶的活性位点内。下表是用于停靠计算的代表性输入文件代表性停靠计算输入文件的表检索模块(1＝配体预测；2＝虚拟筛选)2不同配体的数目14258x-轴的Box原点-44.5y-轴的Box原点-11.5z-轴的Box原点9x-轴的Box大小9.0y-轴的Box大小3.5z-轴的Rox大小5 5旋转增加(10、20或30°的弧)30平移增加(0-6.0_)0.5分子间相互作用能的截断(0至-60kcal/mol)1000.0平台(1＝MPP；2＝同簇；3＝异簇)1可用处理器的数目10用在程序CSCORE(Tripos，Inc.，St.Louis，MO)中实施的一组5个另外的计分函数以及使用函数SCORE(Beijing University)给具有最小计算的结合能的每种化合物的定向重新计分。根据一致得分将化合物分级，并相应地选择100个候选化合物进行合成。
实施例8--D-Ala-D-Ala连接酶序列比较对于下列51种细菌D-Ala-D-Ala连接酶，我们已经制作了蛋白序列比对表。该比对结果如附图10所示。附图10中给出；很多结构要素(见接触码)。
Seq 0001>00_ECOLI_DDLB P07862大肠杆菌(305res).
Seq 0002>01A_CHLPN_DDL Q9Z701肺炎衣原体(Chlamydophilapneumoniae)(340res).
Seq 0003>01B_CHLTR_DDL 084767砂眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)(337res).
Seq 0004>02_YERPES_DDL Sanger_632鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)株CO-92 chrom 4(304res).
Seq 0005>03_HAEIN_DDL P44405流感嗜血菌(306res).
Seq 0006>04_HAEDUC_DDL HTSC_730杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)株35000HP(297res)Seq 0007>05_PSEUDAE_DDL 11348402铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)株PAO1(319res).
Seq 0008>06_PSEUPUT_DDL TIGR恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440(292res).
Seq 0009>07_YLFAS_DDL 11272188柯养木杆菌(Xylella fastidiosa)株9a5c(320res).
Seq 0010>08_BORPER_DDL Sanger_520百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)Contig845(296res).
Seq 0011>09_THIFER_DDL TIGR_6140氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillusferrooxidans)(296res).
Seq 0012>10_NEISMNA_DDL 11272192脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)A组菌株Z2491(304res).
Seq 0013>11_NEISMNB_DDL 11272194脑膜炎奈瑟氏球菌B组菌株MD58(304res).
Seq 0014>12_NEISGON_DDL OUACGT_485淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)Ngon_Contigl(296res).
Seq 0015>13_BUCAP_DDL 051927蚜虫巴克纳氏菌(Buchneraaphidicola)(306res).
Seq 0016>14_BACHAL_DDL 10174238 Bacillus halodurans(305res).
Seq 0017>15_GEOSUL_DDL TIGR_35554 Geobacter sulfurreducensgsulf 5(299res).
Seq 0018>16_RICPR_DDL Q9ZDS6普氏立克次氏体(Rickettsiaprowazekii)(321res).
Seq 0019>17_ZYMOB_DDL 5834367运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)(321res).
Seq 0020>18_AQUIAEO_DDL 066806 Aquifex aeolicus thermophile(291res).
Seq 0021>19_THEMA_DDL P46805海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(303res).
Seq 0022>20_CLOSDIF_DDL Sangerl496艰难梭菌(Clostridiumdifficile)Contig890(294res).
Seq 0023>21_ENTFCM_VANA P25051屎肠球菌(Enterococcus faecium)VanA(343res).
Seq 0024>22_ENTFCM_VANB Q06893屎肠球菌VanB(342res).
Seq 0025>23_ENTFCM_VAND 5353567屎肠球菌VanD(343res).
Seq 0026>24_STRPTOY_DDL 2228595丰加链霉菌(Streptomycestoyocaensis)(340res).
Seq 0027>25_AMYCOR_DDL 4405962东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)(348res).
Seq 0028>26_ENTGAL_VANC P29753鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)(343res).
Seq 0029>27 ENTHR_DDL Q47827小肠肠球菌(Enterococcus hirae)(358res).
Seq 0030>28_ENTFCM_DDL 12231521屎肠球菌AAG49141.1(358res).
Seq 0031>29 ENTFCS_DDLF Q47758粪肠球菌(Enterococcus faecalis)DDL_f(348res).
Seq 0032>30_STRPN_DDL 6634564肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)(347res).
Seq 0033>31_STRPY_DDL OUACGT_1315酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)Contig_1(331res).
Seq 0034>32_STAPHCOL_DDL TIGR_1280金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)COL Contig_8089(338res).
Seq 0035>33_STAPHMRSA_DDL Sanger金黄色葡萄球菌MRSA Contig_17(338res).
Seq 0036>34_BACSU_DDL P96612枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(354res).
Seq 0037>35_BACSTER_DDL UOKR_1442嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)Contig_505(345res).
Seq 0038>36_DEIRAD_DDL 7471790耐放射异常球菌(Deinococcusradiodurans)株R1(339res).
Seq 0039>37_SYNEC_DDL P73632集胞蓝细菌属菌株PCC 6803(354res).
Seq 0040>38_ECOLI_DDLA P23844大肠杆菌DDLA(364res).
Seq 0041>39_SALTY_DDLA P15051鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)DDLA(363res).
Seq 0042>40_MYCTUB_DDL P95114结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)株H37rv(373res).
Seq 0043>41_MYCTUB_DDL_CLIN TIGR结核分枝杆菌CSU#93-clinical(373res).
Seq 0044>42_MYCAV_DDL TIGR/NIADD鸟结核分枝杆菌(Mycobacteriumavium)株104 contig 5490(364res).
Seq 0045>43_MYCSMG_DDL Q9ZGN0耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)(373res).
Seq 0046>44_LEGPNU_DDL CUCGC 446侵肺军团菌(Legionellapneumophila)(343res).
Seq 0047>45_LEUCMES_DDL Q48745肠膜明串菌株(Leuconostocmesenteroides)(377res).
Seq 0048>46_BORBURG_DDL 051218布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)株B31(356res).
Seq 0049>47_TREPA_DDL 083676苍白密螺旋体(Treponema pallidum)(396res).
Seq 0050>48_VIBCHO_DDL霍乱弧菌(Vibrio cholerae)株ASM893(319res).
Seq 0051>49_HELPYR_DDL P56191幽门螺杆菌(347res)。
其它实施方案应当理解，虽然已经结合其详细说明描述了本发明，但是上面的描述仅是举例说明，而不是限制本发明范围，本发明范围由权利要求书限定。其它方面、优点和变型都在权利要求书范围内。
权利要求
1.评价化学实体缔合下列物质的可能性的方法包含结合口袋的分子或分子复合物，所述结合口袋依据附图8由D-Ala-D-Ala连接酶大肠杆菌氨基酸Lys144，Glu180，Lys181，Leu183，Glu187，Asp257和Glu270的结构坐标所限定；或所述分子或分子复合物的同源物，其中所述同源物包含结合口袋，所述结合口袋具有与所述氨基酸主链原子不超过10_的均方根偏差，所述方法包括下列步骤采用计算方法在化学实体与结合口袋之间进行拟合操作，其中所述结合口袋由D-Ala-D-Ala连接酶大肠杆菌氨酸Lys144，Glu180，Lys181，Leu183，Glu187，Asp257和Glu270的结构坐标+/-不超过10_的与所述氨基酸主链原子的均方根偏差所限定；和分析所述拟合操作的结果以定量化学实体与结合口袋之间的缔合。
2.确定D-Ala-D-Ala连接酶的可能的抑制剂的方法，所述方法包括下列步骤使用依据附图8的大肠杆菌D-Ala-D-Ala连接酶的Lys144，Glu180，Lys181，Leu183，Glu187，Asp257和Glu270的原子坐标+/-不超过10_的与所述氨基酸主链原子的均方根偏差来产生D-Ala-D-Ala连接酶结合口袋的三维结构；使用所述三维结构设计或筛选可能的抑制剂；合成或获得所述抑制剂；和将所述抑制剂与D-Ala-D-Ala连接酶接触以确定所述可能的抑制剂抑制D-Ala-D-Ala的能力。
3.权利要求2的方法，其中所述使用的步骤包括设计这样的分子，当停靠在所述三维结构内时，其具有距离Glu 180侧链的一个或两个羧酸氧原子2.4至3.5_处的氢键供体，距离Lys 181的主链酰胺氧2.4至3.5_处的氢键供体，距离Leu 183的主链酰胺氮2.4至3.5_处的氢键受体，距离Leu 183的主链酰胺氧2.74至3.5_处的氢键供体，和距离Lys 144的侧链氮2.4与3.5_处之间的氢键受体。
4.权利要求3的方法，其中所述分子还包括分别距离Leu269和Met154侧链上的CD1碳和SD硫原子3.5-4.5_的疏水相互作用。
5.权利要求2的方法，其中所述可能的抑制剂是双底物类似物。
6.权利要求2的方法，其中所述方法还包括使用酶分析来确定可能的抑制剂对连接酶的Ki。
7.权利要求2的方法，其中所述方法还包括使用截流研究来检测在可能的抑制剂与连接酶之间的相互作用。
8.权利要求2的方法，其中所述方法还包括通过测定连接酶的固有的色氨酸荧光的淬灭来检测在可能的抑制剂与连接酶之间的相互作用。
9.权利要求2的方法，其中所述方法还包括通过测定连接酶的蛋白酶解的防护来检测在可能的抑制剂与连接酶之间的相互作用，所述防护与可能的抑制剂对连接酶的稳定作用有关。
10.权利要求2的方法，其中所述方法还包括确定可能的抑制剂对野生型细菌生长与对D-Ala-D-Ala连接酶-过度表达的菌株的细菌生长的影响作用。
11.确定D-Ala-D-Ala连接酶或其同源物的可能的抑制剂的方法，所述方法包括下列步骤设计或选择这样的分子，其使得D-Ala-D-Ala连接酶的Ile142或其在同源物中的相应部分处于D-Ala-D-Ala连接酶的Met259或其在同源物中的相应部分的12_以内，而且D-Ala-D-Ala连接酶的Met154或其在同源物中的相应部分处于Leu269的12_以内；合成或获得所述抑制剂；和将所述抑制剂与D-Ala-D-Ala连接酶接触以确定所述可能的抑制剂抑制D-Ala-D-Ala的能力。
12.权利要求11的方法，其中所述方法还包括使用酶分析来确定可能的抑制剂对连接酶的Ki。
13.权利要求11的方法，其中所述方法还包括使用截流研究来检测在可能的抑制剂与连接酶之间的相互作用。
14.权利要求11的方法，其中所述方法还包括通过测定连接酶的固有的色氨酸荧光的淬灭来检测在可能的抑制剂与连接酶之间的相互作用。
15.权利要求11的方法，其中所述方法还包括通过测定连接酶的蛋白酶解的防护来检测在可能的抑制剂与连接酶之间的相互作用，所述防护与可能的抑制剂对连接酶的稳定作用有关。
16.权利要求11的方法，其中所述方法还包括确定可能的抑制剂对野生型细菌生长与对D-Ala-D-Ala连接酶-过度表达的菌株的细菌生长的影响作用。
全文摘要
本发明是基于下述发现一些小分子可结合D－Ala－D－Ala连接酶的ATP结合位点，甚至在没有酶底物存在的情况下也是如此，并且可引起类似于在ATP和底物与酶结合时所发生的酶结构的构象改变。虽然不希望受敷于理论，但据信，这样的构象改变是激活或抑制酶所必需的。从该发现所获得的信息已使得能够鉴定酶活性位点中的关键相互作用，以及设计和优化抑制剂。
文档编号C12N9/00GK1539020SQ02815270
公开日2004年10月20日 申请日期2002年6月28日 优先权日2001年6月28日
发明者M·A·纳维亚, P·J·阿拉, J·P·格利菲斯, J·A·阿里, C·H·法尔曼, S·T·莫, A·S·马吉, P·R·康纳利, E·佩罗拉, M A 纳维亚, 康纳利, 格利菲斯, 法尔曼, 莫, 蘩, 阿拉, 阿里, 马吉 申请人:医贤治疗学公司, 普利瓦股份公司