专利名称：固定化生物催化剂的回收方法
技术领域：
本发明涉及在化学方法，特别是工业方法中在基质上的固定化酶的使用，更具体地说，涉及从所述方法回收所述固定化酶用以再利用。
背景技术：
酶的工业使用常受到它们的高成本和快速失活的限制。可溶性的酶随产物在方法结束时损失，并且必须进行补充。
对于工业方法而言改进酶的经济可行性的一种手段是通过将酶固定到基质上，这可以方便它们的再利用。固定研究一直集中于增强将酶转移到载体上的手段，以及确保固定化酶保持活性的手段。催化翻转期间酶的失活是限制酶介导的方法的经济可行性的另一个关键障碍。酶可以被极端的温度、pH、剪切失活，还被自由基和反应介质中存在的其它反应物种所失活。固定技术有潜力降低这种酶失活，因而延长它们的有效寿命。
Biochemical Engineering Journal，4，(2000)，137-141，Ganesh K等教导了在酶的生产或下游处理期间，总是使其经历剪切应力，这可能使酶失活。酶对剪切应力的这种敏感性是主要问题，因其导致酶活性的损失，因此是在涉及酶生产及其应用的方法的设计中的主要考虑。就此而言，使纤维素酶在搅拌的反应器中经历剪切应力，目的是研究它在各种条件下的失活，如不同的搅拌速度、酶的浓度、缓冲液的浓度、pH范围、缓冲系统和气液界面的存在。发现失活的程度取决于酶经历剪切的条件。
对于工业应用，仅克服这些障碍之一通常是不够的。举例来说，不能容易地被回收或再利用的稳定的固定化酶提供很少的优点。类似地，容易回收和再利用，但是不在长时间内保持其活性的固定化酶对由可溶性酶介导的方法提供很少的优点，因为在两种情况下，必须以频繁的间隔补充酶。主要目的是产生稳定的固定化酶，它还能有效且完全地被回收，因此其有效寿命比可溶性酶提供的一次使用高许多倍。因此，酶回收系统是无比重要的。
迄今为止，固定化酶/反应器技术已经集中于“原位”酶制剂，其中将酶保留在反应器内，而生产用液体(process fluid)从中通过。这阻止酶随生产用液体的损失，并且使酶可以被使用几次。实例包括，在填充床反应器中使用的固定在凝胶内的酶，以及附着于，或保留在半渗透性中空纤维膜内的酶。还已经将酶掺入整料(monolith)中，如那些在汽车催化转化器中使用的酶，其中含有底物的流体通过该整料。
不幸的是，“捕获”在凝胶内的酶相对于可溶性酶而言受到传质限制，这可以显著降低固定化酶的性能。酶在填充床中的使用看来是有吸引力的，因为固定化酶保留在反应器内，而含有底物的生产用液体和产物通过。但是，由于流体流在紧密填充颗粒周围的限制，这种方案在颗粒外面可能受到传质的限制。为了避免颗粒外的传质限制，对于固定化酶使用相对大的颗粒。但是，大颗粒导致颗粒内更大的传质限制，因此必须选择平衡颗粒内和颗粒外传质的粒度。另外，填充床方案仅在如果底物容易通过填充床传输的情况下是实用的。在这种反应器中替换固定化酶还可能是耗时的，从而导致显著的工艺“停工期(down-time)”。因此，仅在如果酶非常稳定而且其不需要频繁补充时才能实现经济效益。
填充床反应器和其它类型的“原位”固定化酶反应器，如整料和中空纤维，可能倾于堵塞。因此，如果底物是不溶性的，例如在浆液中时，它们可能是不适合的。在所有情况下，原位制剂依赖于底物通过对流或扩散而转运至固定化酶。如果流是“分离的”，例如在浆液中，或者没有充分混合，或者如果底物是庞大的并且具有低扩散速度时，这种底物-酶接触可能被阻碍并且导致效率和性能显著降低。因为一些关键的工业酶方法涉及浆液，例如淀粉水解和纸浆加工，所以需要不同于传统的“原位”固定化酶反应器的固定化酶反应器方法。
固定化酶反应器的具体实例是用于葡萄糖异构化为果糖的反应器。可溶性葡萄糖的溶液以一定速度通过固定葡萄糖异构酶的床，该速度确保特定的产物，即果糖在床的出口处浓缩。由于固定化酶的连续失活，通过填充床反应器的流速必须连续降低，从而确保流出物的果糖浓度保持恒定。在固定化酶的整个“有效”寿命中，通常需要十倍或更多倍地降低进料流速。但是，这种流速的降低也导致果糖产生速度的成比例降低。因此，一般使用20或更多个反应器阵列，每个反应器含有不同期的固定化葡萄糖异构酶，并且每个都具有不同的连续变化的流速(H.S.Olsen，Enzymatic Production of Glucose Syrups，in Handbook of Starch Hydrolysis Products and Their Derivatives，M.W.Kearsley和S.Z.Dziedzic，eds.，Blackie Academic and Prof.Publishers(Chapman and Hall)，Glasgow，1995)。通过合并来自每个反应器的流出物，果糖的平均生产率保持相对恒定。一旦固定化酶达到其有效寿命的终点时，阵列中的反应器停止使用，并且用新鲜的酶替换固定化酶。
不幸的是，由于需要大量反应器，这种工艺方案繁琐且复杂，并且资本成本高，而且需要复杂的装阀和工艺控制设备来管理阵列中每个反应器的流体流速调节。这种方案的另一缺点是产生“有色”或其它“异味(off-flavor)”的逆转副产物，它们更可能在低流速及因此的高停留时间下产生。因此，固定化酶技术和酶回收方法的改善能够显著简化这种方法并且提高其经济性。
1993年1月5日授予Lloyd及Antrim的美国专利第5177005号描述了涉及吸附到诸如树脂的载体上的葡萄糖异构酶的生产果糖的连续方法。反应器用过量作为载体的树脂填充，并且周期性地加入新鲜的可溶性葡萄糖异构酶来补偿不可避免的先前固定的酶的活性损失。试验中，大约平均每3周加入新鲜葡萄糖异构酶，以保持葡萄糖的转化在40至44％之间。在27周的试验后，所加可溶性酶的量约为反应器中最初存在的酶量的4倍。不幸的是，这种添加仅能继续至树脂上具有结合能力为止。一旦树脂完全负载，添加的可溶性葡萄糖异构酶就可能几乎没有益处，除非以某种方式从载体中除去失活的酶。此时，该方法必须被停止以更换凝胶，或者与上文中所述的传统固定化葡萄糖异构酶相似地，以“可变流速模式”来运转。
1977年7月5日授予Brouillard R.E.的美国专利第4033820号描述了基于改性用作酶载体的高度多孔的海绵状淀粉凝胶的另一种原位固定化酶制剂。公认这种途径仅适用于在水中可溶的底物，并且浆液不能被处理。该途径的另一个挑战是淀粉载体凝胶的降解。如果要将载体用于降解淀粉的酶，例如淀粉酶和葡糖淀粉酶时，需要几次外来的交联处理。将杀细菌剂，如甲醛或氯用来定期洗柱以防止细菌污染。
1980年6月24日授予Hendriks P.的美国专利第4209591号描述了涉及固定化酶和底物溶液的逆流的多级流化床方法。设计该系统，以使在其到达该多级单元的出口时几乎所有的固定化酶活性都已经丧失。因此，该操作还涉及酶的一次使用，因为酶没有得到回收或再利用。可以在每级之间或之内使用筛板或筛网以调节固定化酶和底物从一个室转运到下一个室。原则上，该方法可以使用底物浆液，但是底物和固定化酶的粒度必须足够小而通过筛板或筛网。另外，对于固定化酶而言，需要极窄的粒度分布以防止其在操作期间分离成不同大小的部分。公认对于适当的流化，底物溶液的流速在很大程度上由颗粒的大小和形状以及相对于流体的颗粒密度确定。
目的在于多次使用固定化酶的其它实例包括在1984年4月10日授予Harvey，D.G.的美国专利第4442216号、1985年4月16日授予Rohrbach等的美国专利第4511654号、1986年6月10日授予Thompson G.J.的美国专利第4594322号。前者描述了螺旋式反应器，该反应器包括螺杆提升机械装置和用来回收固定化酶、洗涤并将其返回到反应器入口的传送装置。美国专利第4511654号描述了具有借助超滤膜的随后底物循环的固定化葡糖淀粉酶填充床反应器。因此，该方法中的酶是原位的。该方法仅适用于可溶的糖给料。上述的美国专利第4594322号描述了类似的方法，其中将水解产物分离成富葡萄糖流和富多糖流，将其后者循环再次通过含有固定化酶的反应器。
1989年7月4日授予Yoshiro等的美国专利第4844809号描述了使用中空纤维膜以从反应溶液中除去细颗粒。尽管本发明人引用该发明是出于其它目的，如除去杂质，但是可以想到，这种技术也能够用于将固定在细颗粒上的酶保留在中空纤维反应器内，例如“Ultrafiltration Separation of Cellulase and Glucose for aLignocellulosic Biomass to Ethanol Process”，J.S.Knutsen和R.H.Davis，Conference Proceedings，Symposium on Biotechnology for Fuelsand Chemicals，Breckenridge，CO，2001年5月6-9日。
因此，固定化酶的应用已经基本上被限制于原位制剂，通常在填充床反应器中。尽管在技术上和偶而在经济上可行，但是这些方法可能不必要地繁琐。它们可能也不适于其中底物以浆液形式存在的生产用液体。能够加工浆液，和/或避免解决原位制剂中酶失活所需的复杂性的固定化酶方法，如HFCS的生产，将是非常有利的。
由于床或整料的堵塞，以及限制固定化酶-底物接触的传质问题，使用在填充床或整料反应器内的原位固定化酶不能加工浆液。其中在反应器内固定化酶自由循环的设计可以克服这些限制。但是，还需要帮助回收和再利用固定化酶的装置。
因此，需要能够使固定化酶被再利用，并且优选地在完整的酶处理设备内循环的固定化酶回收方法，其中底物给料用微粒固定化酶处理。
发明内容
本发明的目的是提供在工业设备中用以底物材料的酶反应的有效固定化酶回收方法。
因此，本发明一方面提供通过用微粒固定化酶酶处理底物而生产产物的改进方法，所述方法包括在生物反应器中处理包含所述底物的生产用液体，以产生包含流出物固定化酶和在流出物液体中的所述产物的浆液，改进包括对所述浆液进行诱导非固定化酶损伤剪切的有效分离方法，以提供a)所述流出物固定化酶；和b)含有所述产物的流出物液体；以及在随后的所述酶处理中再利用所述流出物固定化酶。
令人惊奇地，已经发现尽管现有技术有教导，但固定化酶可以在此前被认为太激烈而不能提供未损伤的酶的“诱导剪切”分离条件下从生物反应器方法流出物浆液中分离出来。因此，本发明提供实用的分离技术。举例来说，这种“诱导剪切”分离步骤包括旋液分离、连续离心等等。
在另一方面，本发明在流出物浆液还包含一种或多种其它微粒固体时提供这种分离。
在再一方面，本发明提供通过用微粒固定化酶酶处理微粒进料底物而生产产物的改进方法，所述方法包括在生物反应器中处理包含所述微粒底物和所述微粒固定化酶的进料浆液的生产用液体，以产生在包含流出物微粒固定化酶和流出物微粒底物的流出物浆液中的所述产物，其中所述微粒底物具有不同于所述微粒固定化酶的粒度分布，并且改进包括
i)对所述流出物浆液进行选自过筛、旋液分离和离心的方法，以分离所述流出物微粒底物和所述流出物浆液，从而提供(a)所述流出物微粒底物，和(b)在所述生产用液体中包含所述流出物微粒固定化酶的精制浆液；ii)对所述精制浆液进行选自过筛、旋液分离和离心的方法，从而提供(c)所述流出物微粒固定化酶，和(d)流出物生产用液体；和iii)在随后的所述酶处理中使用所述流出物固定化酶。
本发明的方法提供固定化酶从生产用物流，包括具有高固体含量的生产用物流中的回收和再利用。这种方法需要从生产用液体中分离微粒固定化酶，并且还可能需要分离固体固定化酶和其它固体，例如生产用物流中的进料底物。这种方法促进将固定化酶用于其中底物以浆液形式存在的方法，而且还避免目前基于原位酶制剂的方法的复杂性。本发明的方法导致固定化酶的有效回收和再利用，因此允许将固定化酶用于目前仅使用可溶性酶的方法中。与现有的可溶性和固定化酶方法相比，这显著降低了酶加工的成本。
如上文所述的本发明的方法可以应用于任何固定于微粒载体或基质的酶。理想地，所用的载体是具有相对窄的粒度分布的细粉末。但是，使用宽粒度分布的载体也是可行的。因为生产用物流可能含有其它微粒固体，所以固定化酶的颗粒特征，例如大小、密度、趋向于聚集等等，必须与生产用液体固体的颗粒特征足够地不同，从而使它们能够被分离。
优选地，在本发明的实践中使用的非损伤但有效的诱导剪切方法选自旋液分离、连续离心及它们的组合。
本领域技术人员容易理解，尽管酶在溶液和/或固定化酶浆液中的剪切介导的失活取决于几种相联系的参数，例如压降、流速、保留时间、rpm、重力、涡量和装置大小，但是为了显著降低或消除固定化酶的剪切介导的失活的可能性，技术人员可以容易地确定本发明的实践中其装置的可接受且有效的工艺操作条件。本发明的实践的指导还在上述的Biochemical Engineering Journal，2000，137-141中给出，该文献描述了在搅拌的反应器中纤维素酶在溶液中的失活。该作者考虑了机械剪切(搅拌)和界面剪切(气液界面)，并且提到了纤维素酶的剪切介导的失活的其它情况。剪切以搅拌速度表示，这是通常的，而不是以实际剪切测量s-1表示，或者可以以作为界面剪切指示的表面张力为单位来表示。
令人惊奇地，已经进一步发现可以用微粒固定化酶实现微粒进料底物的未预期的有效酶处理，尽管为了反应需要两种微粒实体来碰撞。因此，在更广泛的方面，本发明提供通过用微粒固定化酶酶处理微粒进料底物而生产产物的改进方法，所述方法包括在生物反应器中处理包含所述底物和所述固定化酶的进料浆液的生产用液体，以产生在包含流出物固定化酶和流出物底物的流出物浆液中的所述产物，改进包括i)对所述流出物浆液进行分离所述流出物底物和所述流出物固定化酶的方法；ii)收集所述流出物固定化酶；和iii)在所述酶处理中再利用所述固定化酶。
在再一方面，本发明提供通过用微粒固定化酶酶处理微粒进料底物而生产产物的改进方法，所述方法包括在生物反应器中处理包含所述底物和所述固定化酶的进料浆液的生产用液体，以生产在包含流出物固定化酶和流出物底物的流出物浆液中的所述产物，其中所述底物具有不同于所述固定化酶的粒度分布，并且改进包括i)对所述流出物浆液进行选自过筛、旋液分离和离心的方法，以分离所述流出物底物和所述流出物浆液，从而提供(a)所述流出物底物，和(b)在所述生产用液体中包含所述流出物固定化酶的精制浆液；ii)对所述精制浆液进行选自过筛、旋液分离和离心的方法，从而提供(c)所述流出物固定化酶，和(d)流出物生产用液体；和iii)在所述酶处理中再利用所述流出物固定化酶。
如上文所述的上述方法包括对浆液进行诱导非固定化酶损伤剪切的有效分离步骤。
从生物反应器工艺流出物流中分离并回收固定化酶的方法可能需要一个或多个步骤，这取决于生产用物流的性质。第一个步骤通常涉及在生物反应器生产用进料流，本文称作1号浆液内分离不同类型的固体。通常，该分离基于粒度，但是也受其它颗粒特性，例如密度的影响。该分离产生两种固体浆液，一种含有固定化酶。然后，将含有流出物固定化酶的浆液，本文称作2号浆液送入进一步加工，在此情况下是为了分离固定化酶和含有产物的生产用液体。然后将如此分离的固定化酶循环入生物反应器中，在其中它可以被再利用以进一步加工。可以将含有其它工艺流出物固体3号浆液的浆液送去以进一步加工，或者可以接受第二固体分离步骤，结果来自1号浆液的某些流出物固定化酶已经保留在该物流中。这种补充加工步骤的可取性受到1号浆液中负载的相对固体、固体的密度和不同固体组分的粒度分布的影响。如果需要随后的固体分离，则可以将从该步骤中回收的流出物固定化酶加入从2号浆液中回收的流出物固定化酶中，并且返回到酶生物反应器中。
举例来说，本发明的实践可以应用于下表所列的方法。
涉及固体底物和固定化酶的方法的实例包括(1)用于部分或完全水解淀粉以产生改性淀粉或糊精的淀粉酶，后者可能接受进一步的加工以产生单糖；(2)如在酶脱墨、生物漂白、纤维改性，或葡萄糖/木糖生产中，为了随后的发酵而用来部分或完全水解纸浆纤维的纤维素酶和/或木聚糖酶；以及(3)在洗涤剂中用于纤维改性和/或除去污染的纤维素酶、脂肪酶或蛋白酶。
涉及可溶性底物和固定化酶的方法实例包括用于将葡萄糖转化成葡糖酸的葡萄糖氧化酶、用于将糊精转化成单糖的葡糖淀粉酶、用于从葡萄糖生产高果糖玉米浆的葡萄糖异构酶、用于从L-酪氨酸生产L-DOPA或者在废水流中转化其它单或二酚醛塑料的酪氨酸酶，以及用于产生营养药物(nutraceuticals)的酶，如脂肪酶。
为了使本发明可以得到更好地理解，现在将参照附图，仅以实施例的方式来描述优选的实施方案，其中
图1-5表示本发明的各种实施方案的工艺流程图。
图6表示用spezyme可溶性酶进行的旋液分离测定图。
图7表示用liquozyme可溶性酶进行的旋液分离测定图，并且相同的字母表示类似的部分和方法步骤。
具体实施方案实施例1现在参照图1，其中方法步骤如下所列。
A＝含有固定化酶和其它生产用固体的生产用物流(浆液)B＝溢流，主要是大固体，几乎没有生产用液体C＝底流，由细固体和来自物流A的大部分生产用液体组成D＝溢流，几乎全部由生产用液体组成E＝底流，由细固体和小部分生产用液体组成图1的流程图基于固定化酶以细固体存在，而其它生产用固体以更大颗粒存在的前提。这意味着物流C含有要最终被循环入反应器中用于随后的酶反应的固定化酶。如果相反的情况是真实的，那么物流B将含有然后将被循环的固定化酶，并且借助旋液分离器提供的物流C的固体分离可能是不需要的。
根据图1加工30％玉米醪(平均700微米；98％＞350微米)和1.33％固定化酶(平均18微米；范围1至120微米)的混合物。使用355微米的筛网来分离两种固体。95％的玉米醪和7％的固定化酶前进至溢流(物流B)。剩余物(作为物流C)前进到具有2.5毫米(直径)入口的10毫米旋液分离器的歧管装置。基于穿过每个旋液分离器的2.7巴的压降，以及2.8升/分钟/旋液分离器的流速，物流C中65％的固体被导向底流(物流E)，35％前进到物流D。物流C中78％的生产用液体被导向物流D。因此，在这些条件下固定化酶的总回收率为60％。
实施例2参照图1，其中方法步骤如下所列。
A＝含有固定化酶和其它生产用固体的生产用物流(浆液)B＝溢流，主要是大固体，几乎没有生产用液体C＝底流，由细固体和来自物流A的大部分生产用液体组成D＝溢流，几乎全部由生产用液体组成E＝底流，由细固体和小部分生产用液体组成该流程图基于固定化酶以细固体存在，而其它生产用固体以更大颗粒存在的前提。这意味着物流C含有要最终被循环入反应器中的固定化酶。如果相反的情况是真实的，那么物流B将含有然后将被循环的固定化酶，并且借助旋液分离器提供的物流C的固体分离可能是不需要的。
根据图1加工30％玉米醪(平均700微米；98％＞350微米)和2.67％固定化酶(平均18微米；范围1至120微米)的混合物。使用355微米的筛网来分离两种固体。90％的玉米醪和6％的固定化酶前进至溢流(物流B)。剩余物(作为物流C)前进到具有2.5毫米(直径)入口的10毫米旋液分离器的歧管装置。基于穿过每个旋液分离器的2.7巴的压降，以及2.8升/分钟/旋液分离器的流速，物流C中81％的固体被导向底流(物流E)，19％前进到物流D。73％的生产用液体被导向物流D。因此，在这些条件下固定化酶的总回收率为76％。
实施例3参照图1，其中方法步骤如下所列。
A＝含有固定化酶和其它生产用固体的生产用物流(浆液)B＝溢流，主要是大固体，几乎没有生产用液体C＝底流，由细固体和来自物流A的大部分生产用液体组成D＝溢流，几乎全部由生产用液体组成
E＝底流，由细固体和小部分生产用液体组成该流程图基于固定化酶以细固体存在，而其它生产用固体以更大颗粒存在的前提。这意味着物流C含有要最终被循环入反应器中的固定化酶。如果相反的情况是真实的，那么物流B将含有然后将被循环的固定化酶，并且借助旋液分离器提供的物流C的固体分离可能是不需要的。
根据图1加工30％玉米醪(平均700微米；98％＞350微米)和2.0％固定化酶(平均18微米；范围1至120微米)的混合物。使用250微米的筛网来分离两种固体。100％的玉米醪和4％的固定化酶前进至溢流(物流B)。剩余物(作为物流C)前进到具有2.5毫米(直径)入口的10毫米旋液分离器的歧管装置。基于穿过每个旋液分离器的2.7巴的压降，以及2.8升/分钟/旋液分离器的流速，物流C中71％的固体被导向底流(物流E)，29％前进到物流D。物流C中82％的流体被导向物流D，而18％的流体前进到物流E。在这些条件下固定化酶的总回收率为68％。
实施例4参照图4，其中方法步骤如下所列。
A＝含有固定化酶和其它生产用固体的生产用物流(浆液)B＝溢流，主要是大固体，几乎没有生产用液体C＝底流，由细固体和来自物流A的大部分生产用液体组成D＝溢流，几乎全部由生产用液体组成E＝底流，由细固体和来自物流C的小部分液体组成F＝用以循环的生产用液体该流程图基于固定化酶以细固体存在，而其它生产用固体以更大颗粒存在的前提。这意味着物流C含有要最终被循环入反应器中的固定化酶。如果相反的情况是真实的，那么物流B将含有然后将被循环的固定化酶。可能需要借助旋液分离器提供的物流C的固体分离来稀释物流A中存在的固体以促进借助筛网进行的细和粗固体分离。
根据图4加工30％玉米醪(平均700微米；98％＞350微米)和2.0％固定化酶(平均25微米；范围5至90微米)的混合物。稀释后，筛网的进料含有15％玉米醪和1％固定化酶。使用250微米的筛网来分离两种固体。100％的玉米醪和1％的固定化酶前进至溢流(物流B)。剩余物(作为物流C)前进到具有2.5毫米(直径)入口的10毫米旋液分离器的歧管装置。基于穿过每个旋液分离器的2.7巴的压降，以及2.8升/分钟/旋液分离器的流速，物流C中78％的固体被导向底流(物流E)，22％前进到物流D。物流C中72％的流体被导向物流D，而28％的流体前进到物流E。在这些条件下固定化酶的总回收率为77％。
实施例5参照图2，其中方法步骤如下所列。
A＝含有固定化酶和其它生产用固体的生产用物流(浆液)B＝底流，主要是大固体，几乎没有生产用液体C＝溢流，由细固体和来自物流A的50～80％的生产用液体组成D＝溢流，几乎全部由生产用液体组成E＝底流，由细固体和来自物流C的小部分液体组成该流程图基于固定化酶以细固体存在，而其它生产用固体以更大颗粒存在的前提。这意味着物流C含有要最终被循环入反应器中的固定化酶。如果相反的情况是真实的，那么物流B将含有然后将被循环的固定化酶，并且借助旋液分离器提供的物流C的固体分离可能是不需要的。
根据图2加工30％玉米醪(平均700微米；98％＞350微米)和1％固定化酶(平均18微米；范围1至120微米)的混合物。使用具有3厘米(直径)入口的旋流分离器来分离两种固体。进料速度为6.6升/秒，并且穿过旋液分离器的压降为0.5巴。100％的玉米醪和29％的固定化酶前进至底流(物流B)。剩余物(作为物流C)前进到具有2.5毫米(直径)入口的10毫米旋液分离器的歧管装置。基于穿过每个旋液分离器的3.4巴的压降，以及9.4升/分钟/旋液分离器的流速，物流C中78％的固体被导向底流(物流E)，22％前进到物流D。因此，在这些条件下固定化酶的总回收率为55％。
实施例6参照图3，其中方法步骤如下所列。
A＝含有固定化酶和其它生产用固体的生产用物流(浆液)B＝底流，主要是大固体，有一些生产用液体C＝溢流，由细固体和来自物流A的50～80％的生产用液体组成D＝溢流，几乎全部由生产用液体组成E＝底流，由细固体和来自物流C的小部分液体组成F＝用以循环的生产用液体该流程图基于固定化酶以细固体存在，而其它生产用固体以更大颗粒存在的前提。这意味着物流C含有要最终被循环入反应器中的固定化酶。如果相反的情况是真实的，那么物流B将含有然后将被循环的固定化酶，并且借助旋液分离器提供的物流C的固体分离可能是不需要的。
根据图3加工30％玉米醪(平均700微米；98％＞350微米)和1.33％固定化酶(平均18微米；范围1至120微米)的混合物，同时具有足够的流体循环(物流F)以将装载到第一个旋液分离器中的固体降低到～20％。使用具有3厘米(直径)入口的旋流分离器来分离两种固体。进料速度为10.1升/秒，并且穿过旋液分离器的压降为0.5巴。100％的玉米醪和18％的固定化酶前进至底流(物流B)。剩余物(作为物流C)前进到具有2.5毫米(直径)入口的10毫米旋液分离器的歧管装置。基于穿过每个旋液分离器的2.7巴的压降，以及2.8升/分钟/旋液分离器的流速，物流C中78％的固体被导向底流(物流E)，22％前进到物流D。因此，在这些条件下固定化酶的总回收率为64％。
实施例7参照图5，其中方法步骤如下所列。
A＝含有固定化酶和其它生产用固体的生产用物流(浆液)B＝底流，主要是大固体，有一些生产用液体C＝溢流，由细固体和来自物流A的50～80％的生产用液体组成D＝溢流，几乎全部由生产用液体组成E＝底流，由细固体和来自物流D的小部分液体组成F＝用以循环的生产用液体D’＝溢流，几乎全部由生产用液体组成E’＝底流，由细固体和来自物流C的小部分液体组成F’＝用以循环的生产用液体该流程图基于固定化酶以细固体存在，而其它生产用固体以更大颗粒存在的前提。这意味着物流C含有要最终被循环入反应器中的固定化酶。如果相反的情况是真实的，那么物流B将含有然后将被循环的固定化酶，但是可能需要借助旋液分离的物流C和D的固体分离以产生循环流体，从而稀释物流A中的固体。
注意图5仅在以下方面不同于图3添加附加旋液分离器以改善细颗粒的分离/回收，并且增加循环以与物流A混合的生产用液体的百分比。如需要，可以将在这里所显示的两个以外的附加旋液分离器/离心机引入该方法中，加入流体循环物流F和F’，以及固体循环物流E和E’。
根据图5加工30％玉米醪(平均700微米；98％＞350微米)和1.33％固定化酶(平均18微米；范围1至120微米)的混合物，同时具有足够的流体循环(物流F和F’)以将装载到第一个旋液分离器中的固体降低到～10％。使用具有4.8厘米(直径)入口的旋流分离器来分离两种固体。进料速度为21升/秒，并且穿过旋液分离器的压降为0.5巴。100％的玉米醪和8％的固定化酶前进至底流(物流B)。剩余物(作为物流C)前进到具有2.5毫米(直径)入口的10毫米旋液分离器的歧管装置。基于穿过每个旋液分离器的2.7巴的压降，以及2.8升/分钟/旋液分离器的流速，物流C中78％的固体被导向底流(物流E)，22％前进到物流D。使用第二组旋液分离器来分离物流D中的固体，使70％的固体导向底流(物流E’)，30％到溢流(物流F’)。对于后面两个旋液分离器中的每一个，73％的流体被导向溢流(物流F和F’)，23％被导向底流(物流E和E’)。因此，在这些条件下固定化酶的总回收率为86％。
实施例8现在参照图1，其中方法步骤如下所列。
A＝含有固定化酶和其它生产用固体的生产用物流(浆液)B＝溢流，主要是大固体，几乎没有生产用液体C＝底流，由细固体和来自物流A的大部分生产用液体组成D＝溢流，几乎全部由生产用液体组成E＝底流，由细固体和小部分生产用液体组成该流程图基于固定化酶以细固体存在，而其它生产用固体以更大颗粒存在的前提。这意味着物流C含有要最终被循环入反应器中的固定化酶。如果相反的情况是真实的，那么物流B将含有然后将被循环的固定化酶，并且借助旋液分离器提供的物流C的固体分离可能是不需要的。
根据图1加工30％玉米醪(平均700微米；98％＞350微米)和2.66％固定化酶(平均140微米；范围1至220微米，中值120微米)的混合物。使用355微米的网筛来分离两种固体。99％的玉米醪和1％的固定化酶前进至溢流(物流B)。剩余物(作为物流C)前进到具有2.5毫米(直径)入口的10毫米旋液分离器的歧管装置。基于穿过每个旋液分离器的2.7巴的压降，以及2.8升/分钟/旋液分离器的流速，物流C中96％的固体被导向底流(物流E)。因此，在这些条件下固定化酶的总回收率为95％。
稀释的进料实施例9根据图1，以225升/分钟的进料速度加工17％玉米醪(平均750微米；85％＞350微米)和1.33％固定化酶(平均120微米；范围75至200微米)的混合物。使用d50＝186微米的筛网来分离固体。90％的＜355微米的固体前进到底流(物流C)，6％的固定化酶损失到溢流(物流B)。通过15个10毫米旋液分离器的歧管装置加工作为批料的物流C，穿过每个旋液分离器的压降为5.4巴，而流速为181升/分。70％的生产用液体被导向物流D，并且物流C中54％的固体被导向物流E。在这些条件下固定化酶的总回收率为50％。
双层筛实施例10根据图1，用双层筛加工含有35％固体(96％玉米醪)的物流。上筛具有d50＝562微米，而下筛具有294微米的d50。这样，固体在上筛上经历“粗”切，并在下筛上“细”切。89％的＜355微米的固体前进到物流C，12％的固定化酶损失到物流B。随后，物流C以132升/分钟，压降为5.6巴得到加工；87％的流体被导向溢流物流D。固定化酶的总回收率为69％。
两级筛实施例11根据图1，改进为使用两个串联在相对于水平倾斜30度的震动器上的筛网加工含有35％固体(96％玉米醪)的物流。第一个筛网具有863微米的d50，而第二个筛网具有387微米的d50。这样，固体在第一个筛网上经历“粗”切，并在第二个筛网上“细”切。对第一个筛网的进料速度是132升/分钟；允许筛网下物质(screen unders)积聚，然后以107升/分钟的速度进入第二个筛网中。87％的＜355微米的固体和94％的固定化酶被最终导入物流C中以借助旋液分离器分离，如上文实施例2中所述。固定化酶的总回收率为90％。
可溶性底物物流实施例12基本上根据图1从可溶性底物物流中回收固定化酶，而不过筛。固定化酶的装载量是2.1克/升。使悬浮液以147升/分钟的速度进料至15个10毫米旋液分离器的歧管装置，压降为3.8巴。约4％的流体被导向旋液分离器的底流，其中固体浓度为56克/升。因此，固定化酶的回收率为97％。
循环操作实施例13根据图4加工含有30％固体(97％玉米醪)的物流。筛网具有387微米的d50。浆液以93升/分钟的速度进料，导致筛网下物质物流C的流速为140升/分钟，物流F循环速度为76升/分钟。8％的＜355微米的固体损失到物流B，物流B包含5％的固定化酶。物流C中88％的＜250微米的固体在物流E中回收。
动力排水罐实施例14在800rpm下混合含有1％硬木浆和0.5克/升固定化纤维素酶(平均直径6微米)的物流。然后，使悬浮液快速排出通过100微米的筛网。85％的固定化酶在底流/滤液中回收。
大颗粒固定化酶实施例15根据图1，以50升/分钟的进料速度加工22％玉米醪(平均650微米；93％＞350微米)和1.6％固定化酶(范围850至1200微米)的混合物。使用850微米的筛网分离固体。实际上所有＞850微米的固体前进到溢流(物流B)；物流C中只有0.02％的固体大于850微米。这意味着物流B中固定化酶的回收率基本上为100％。将物流C送出以进一步加工，而将具有固定化酶的物流B循环用以进一步使用。
实施例16下文以16A和16B表示的两个实施例描述了建立剪切对酶影响的实验。
实验描述设备及材料设备由具有混合器的250升进料罐、容积式泵(最大6.8巴的排放量，容量达22升/分钟)和6个旋液分离器(10毫米，具有2.5毫米(直径)入口)的歧管装置组成。安置管道系统，以将流体从旋液分离器的溢流和底流返回至进料罐，从而使装置在连续循环下运转。进料罐最初用150升可溶性酶填充；收集该溶液样品用于随后的活性测定。在第一个实验中，使用来自Genencor International的Spezyme酶，而在第二个实验中，使用来自Novozymes的Liquozyme酶。使用玉米粉作为底物，使用还原糖来测定每种α-淀粉酶的活性。
程序将上述的可溶性酶以16升/分钟的速度泵过旋液分离器，入口和出口间的压降为2.7巴。70％的流体被导向溢流，30％被导向底流。以固定间隔收集可溶性酶样品，并且如下测定酶活性将1.0毫升酶样品加入24.0毫升缓冲液中，对于Spezyme酶缓冲液pH为6.9，或者对于Liquozyme酶pH为5.0。通过加入0.20克玉米粉引发反应。在时间零点和每隔3分钟收集样品，持续15分钟。将样品离心以沉淀任何悬浮的玉米粉。在试管中混合1.5毫升上清液与3毫升二硝基水杨酸试剂，并且在沸水浴中加热5分钟。然后，将混合物冷却至室温，并且在540纳米处测定吸光度。
结果16A1)用Spezyme酶进行的实验用Spezyme酶进行的实验的结果在图6中给出。数据表明，通过旋液分离器加工可溶酶导致活性在15分钟内降低约40％，并且活性在90分钟后降低约75％。相反，在正常贮存条件下，预期酶在4至6个月的时间内保持活性(厂商的技术表单)。
16B2)用Liquozyme酶进行的实验用Liquozyme酶进行的实验结果在图7中给出。数据表明，通过旋液分离器加工可溶性酶导致活性在15分钟内降低约25％，但此后没有进一步的活性损失。相比而言，在正常贮存条件下，预期酶能在4至6个月的时间内保持活性(厂商的技术表单)。
因此，从图6和7中显示的剪切结果可以看出，通过旋液分离器系统加工这些可溶性酶导致活性的快速损失，尽管Liquozyme酶比Spezyme酶对剪切失活更不敏感。
尽管本公开内容已经描述并例示了本发明的某些实施方案，但是应该理解，本发明不限于这些具体的实施方案。而是，本发明包括所有为已经被描述并例示的具体实施方案和特征的功能或机械等价物的实施方案。
权利要求
1.通过用微粒固定化酶酶处理底物而生产产物的改进方法，所述方法包括在生物反应器中处理包含所述底物的生产用液体，以产生包含流出物固定化酶和在流出物液体中的所述产物的浆液，改进包括对所述浆液进行诱导非固定化酶损伤剪切的有效分离方法，以提供a)所述流出物固定化酶；和b)含有所述产物的流出物液体；以及在随后的所述酶处理中再利用所述流出物固定化酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导非固定化酶损伤剪切的有效分离方法选自旋液分离、连续离心及它们的组合。
3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法包括将所述流出物固定化酶循环至所述生物反应器。
4.通过用微粒固定化酶酶处理微粒进料底物而生产产物的改进方法，所述方法包括在生物反应器中处理包含所述微粒底物和所述微粒固定化酶的进料浆液的生产用液体，以产生在包含流出物微粒固定化酶和流出物微粒底物的流出物浆液中的所述产物，改进包括i)对所述流出物浆液进行分离所述流出物微粒底物和所述流出物微粒固定化酶的方法；ii)收集所述流出物微粒固定化酶；和iii)在所述酶处理中再利用所述流出物微粒固定化酶。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述分离通过选自过筛、旋液分离、离心及它们的组合的方法进行。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述固定化酶具有不同于所述底物的粒度分布的粒度分布，从而能够实现所述分离。
7.如权利要求4～6之任一项所述的方法，所述方法包括将所述流出物微粒固定化酶循环至所述生物反应器。
8.通过用微粒固定化酶酶处理微粒进料底物而生产产物的改进方法，所述方法包括在生物反应器中处理包含所述底物和所述固定化酶的进料浆液的生产用液体，以生产在包含流出物固定化酶和流出物底物的流出物浆液中的所述产物，其中所述底物具有不同于所述固定化酶的粒度分布，并且改进包括i)对所述流出物浆液进行选自过筛、旋液分离和离心的方法，以分离所述流出物底物和所述流出物浆液，从而提供(a)所述流出物底物，和(b)在所述生产用液体中包含所述流出物固定化酶的精制浆液；ii)对所述精制浆液进行选自过筛、旋液分离和离心的方法，从而提供(c)所述流出物固定化酶，和(d)流出物生产用液体；和iii)在所述酶处理中再利用所述流出物固定化酶。
9.如权利要求6所述的方法，所述方法包括将所述流出物固定化酶循环至所述生物反应器。
10.如权利要求1～9之任一项所述的方法，其中所述底物是玉米醪。
11.如权利要求1～9之任一项所述的方法，其中所述底物包含纤维素给料。
12.如权利要求1～9之任一项所述的方法，其中所述底物包含半纤维素组分。
全文摘要
通过在生物反应器中处理含有底物的生产用液体而生产流出物固定化酶和在流出物液体中的产品的浆液，而用微粒固定化酶酶处理微粒底物的可溶物来生产产物的方法。对浆液进行诱导非固定化酶损伤剪切的有效分离方法，以提供流出物固定化酶，以及含有产品的流出物液体；并且在酶处理中再利用流出物固定化酶。即使在流出物/产品流中存在另外的微粒固体时，该方法也提供固定化酶的回收和再利用。
文档编号C12P19/14GK1688685SQ02815225
公开日2005年10月26日 申请日期2002年7月22日 优先权日2001年8月2日
发明者布拉德利·A.·萨维尔 申请人:布拉德利·A.·萨维尔