专利名称：用于治疗帕金森病的多巴胺能神经元和具有增殖能力的前体细胞的制作方法
相关申请的参考本申请要求提交于2001年6月21日的美国实用专利申请09/888,309和提交于2002年5月28目的10/157,288的优先权。为了在获得许可的美国和其它管辖区域进行申请的目的，这里全文引用了上述两个优先权申请以及国际专利申请WO01/51616和WO 01/88104作为参考。
背景对于适合于人类服用的细胞系的衍生和扩展的新的研究有希望引导出一个美好的新的医疗世界。如果科学继续从神经元和神经元前体细胞的细胞生物学的重要的新发现中受益，那么毁灭性的和以前难以治疗的病症就可能产生获得再生药物的希望。
病症中需要临床治疗的是那些有关神经功能异常的疾病。在这些疾病的列表中接近顶部的是帕金森病，一种自发的、缓慢发展的、中枢神经系统退化性的疾病，特征为运动缓慢和减少、肌肉僵硬、静止震颤和姿势不稳。由黑质、蓝斑以及其它脑干多巴胺能细胞中着色的神经元的持续恶化产生的症状，导致神经递质多巴胺的缺失。帕金森病在中年以上的人群中是第四种最常见的神经退化疾病，影响0.4％的年过40岁的人，和1％的年过65岁的人。不管所提出的年龄，对于那些受折磨的患者该疾病常常造成毁灭性的结果。
造成神经系统的痛苦如此难以对付的原因是常常遭受到的破坏是不可逆的。对于这些疾病主要希望是发展能够重建神经网络的细胞群体，并使神经系统的功能恢复协调。有趣的证据显示胎儿多巴胺能神经元移植可恢复帕金森病的化学异常。但是非常缺乏适当的组织。
由于这个原因，在神经祖细胞方面具有浓厚的兴趣。各种类型的谱系-限制前体细胞更新它们自己并驻留于中枢神经系统的选择性的位点(Kalyanl等，BiochemCell Biol，61051，1998)。推断的神经限制前体(Mayer-Proschel等，Neuron，19773，1997)细胞表达神经细胞粘着分子的聚唾液酸化(polysialylated)同种型(PS-NCAM)。据说它们具有产生各种类型神经元的能力，但不产生神经胶质细胞。另一方面，推断的神经胶质限制前体(Rao等，Dev.Biol，18848，1997)明显地具有形成神经胶质而不是神经元的能力。推断的来自胎儿或成人组织的神经前体进一步描述于美国专利5,852,832；5,654,183；5,849,553；以及5,968,829；以及WO09/50526和WO 99/01159中。
不幸的是，尚未显示从神经组织中分离的祖细胞具有足够的复制能力以产生用于人类临床治疗所必需的细胞数量。
另一个来源是从早期的胚胎组织中分离的多能细胞。在25年前胚胎干(ES)细胞最初分离自小鼠的胚胎(G.R.Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.787634，1981)。人们认为ES细胞能够产生相同种类的实际上任何组织类型的子代。Li.Smith等(Cur.Biol.8971，1998)报道了通过谱系选择从小鼠ES细胞产生神经元前体。Bjorklund等报道了从小鼠ES细胞生产功能性多巴胺能神经元(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.192344，2002)。
仅仅最近才分离出人的ES细胞(Thomson等，Science 282114，1998)。人ES细胞需要非常不同的条件来保持它们处于未分化的状态，或指导它们沿着具体的分化途径进行分化(美国专利6,090,622和6,200,806；澳大利亚专利AU 729377，和PCT出版物WO 01/51616)。由于这一原因，如何从人的ES细胞制备相对同源的细胞群体了解得非常少。
PCT出版物WO 01/88104(Carpenter，Geron Corporation)描述了通过分化人ES细胞获得的神经祖细胞群体。获得的群体中超过90％的呈NCAM阳性，35％呈β-微管蛋白阳性，和75％呈A2B5阳性。Zhang等(Nature Biotech.191129，2001)随后报道了神经前体从人的ES细胞的分化。
迫切需要生产用于某些临床病症的治疗的进一步优化的神经细胞群体的技术。
综述本发明提供了有效生产已从多能细胞分化为神经谱系细胞的灵长类细胞的系统。本发明的前体和末端分化的细胞可用于许多重要的应用，包括药物试验和恢复神经系统功能的药物的生产。
本发明的一个方面是包括高比例的具有神经谱系特征的细胞的细胞群体，例如神经元细胞和它们的前体。这些细胞可基于表型标记鉴别，例如A2B5、NCAM、MAP-2、干蛋白、β-微管蛋白III以及本发明后面列出的其它标记，和通过特征形态学和功能标准鉴别。
本发明的另一个方面是制备含有来自多能细胞的神经细胞的群体的方法，这些多能细胞例如胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、初级胚胎组织、或来自具有分化(或被改编)为含有神经表型的细胞的能力的胎儿或成人组织的干细胞。该方法包括用可溶性因子和有助于具有某些所需特性的神经细胞生长的环境条件的组合培养细胞。本发明包括优化用于分化多能干细胞为神经细胞的分化方法的策略，其中候选因子根据功能分组，并且所述干细胞或它们的子代用各种组合的因子组培养。鉴别对于生产所欲细胞类型重要的组，然后将每个组的各个成分一个一个地除去以确定所需的最小量的组合物。
通过例证，多能干细胞可通过在含有添加了例如头蛋白和促滤泡素抑制素的一种或多种TGF-β超家族拮抗物的固体表面上直接分化进行生产。另外，多能干细胞可培养为丛聚的或胚状体。各种成熟程度的神经细胞的富集包括在含有添加了促细胞分裂原或生长因子(例如EGF和FGF)的培养基中培养，同时或随后以各种优化的组合添加神经营养蛋白(例如NT-3或BDNF)和其它因子(例如EPO)。在某些情况下使用的分化因子的列表在以下概括的描述和说明实施例中列出。任选地，专业人员还可使用进一步促进细胞富集的物理分离技术或操纵技术。
根据本发明制备的成熟的神经元及其前体可表征为细胞群体的子代或一个已建立的细胞系，成熟的神经元及其前体从这一细胞系衍生。这可通过诸如标准DNA指纹分析等一些适当的技术显示基本上与亲本群体一致的神经细胞的基因组得以证实。另外，可通过检查神经细胞衍生过程中的记录建立这一关系。神经细胞衍生自亲本细胞群体的特征在一些方面是重要的。特别地，未分化的细胞群体可用于生产具有共有基因组的附加细胞—或者另一批神经细胞，或者可用于治疗的另一种细胞类型—例如能够使患者预先耐受(pretolerize)神经异源移植的组织相容性类型的群体。
在本发明的一个实施例中，神经细胞从如所描述的分化为神经元前体细胞的人多能细胞制备，然后在培养物中传代。使用胚胎干细胞作为起始细胞类型，促进快速发展的群体的产生，尽管如此该群体仍然保持最终分化为功能神经元的全部活性—或者当用缺乏促细胞分裂原的神经营养蛋白培养时，或者当给予适当的受检者时。某些前体细胞群体在培养物中具有进行至少10、20或40倍群体加倍的能力，而当进一步分化时不会丢失它们形成高度富集的神经元群体的能力。根据使用的条件，可生产前体群体，该群体具有分化为分化为高比例的酪氨酸羟化酶阳性细胞的能力。这种表型与多巴胺能神经元一致，是治疗帕金森病所希望的。
本发明的细胞可用于筛选神经细胞毒性的化合物、调节神经元细胞功能的能力、或辅助神经元衍生和增殖的能力。
本发明的细胞还可用于在一个个体中重建或添加神经系统的功能，其中该给予该个体本发明的分离的细胞或细胞群体。为了这一目的，该分离的细胞或细胞群体被配制成为一种用于治疗影响神经系统的疾病的药物。
这些和本发明其它的实施例将在随后的描述中揭示。
附1是显示神经元细胞的荧光显微照相，该神经元细胞是通过在使用分化因子的混合物的固体基质上直接分化ES细胞获得的。显示的三个区域都取自包含神经营养蛋白和TNF-β超家族拮抗物头蛋白和促滤泡素抑制素的处理。观察到许多细胞对于神经元标记物β-微管蛋白-III进行神经元加工和着色。MAP-2阳性细胞，同时也对酪氨酸羟化酶(一种多巴胺能神经元标记物)呈阳性的细胞比例高达约15％。
图2显示通过直接分化从hES细胞制备神经元的情况。当未分化的细胞在层粘连蛋白上铺板并用TGF-β超家族拮抗物头蛋白(N)和促滤泡素抑制素(F)(A组)培养时β-微管蛋白阳性神经元的产量很高。在干细胞因子存在而促细胞分裂原不存在的情况下(处理F，B组)产量被进一步提高。视黄酸提高了产生的神经元的数量(C组)，但是减少了神经元对酪氨酸羟化酶(TH)阳性染色的比例(D组)。
图3显示制备神经元的情况，其中通过培养hES形成胚状体引发分化。然后该细胞在促细胞分裂原中培养，进行不同的胰蛋白酶消化，然后在含有促细胞分裂原或神经营养因子混合物的培养基中多次传代。当促细胞分裂原和神经营养蛋白一起使用时，细胞可传代约40倍(A组)，保持增殖的能力和分化为成熟神经元的能力(B组)。
图4显示在表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、脑衍生神经营养因子(BDNF)和神经营养蛋白3(NT)的混合物中传代细胞，产生神经前体群体，该前体群体依据分化产生TH-阳性细胞占群体中所有细胞的约7％的细胞群体(A组)。用于前体细胞末端分化的混合物还可改进TH-阳性细胞的生产(B组)。
详细描述人们已经发现当多能干细胞在选择的分化试剂存在的情况下培养时，衍生出含有相当高比例的具有成熟神经细胞或其前体的表型特征的细胞的细胞群体。这些细胞适合用于药物筛选和与神经系统异常有关的病症的治疗。
本发明包含的系统通过从一个已建立的人胚胎干(hES)细胞系获得的细胞群体说明。可通过下文描述的一些技术引发分化，例如形成胚状体，或通过在一个具有一种或多种TGF-β超家族拮抗物存在的适当的基质上培养hES细胞。获得前体细胞，该前体细胞属于神经元谱系，并且它可进一步分化为成熟神经元。
如图3(A)中所显示的，从hES细胞形成的神经元前体可在培养基中被传代约40倍。值得注意的是，如图3(B)所显示的，甚至在多次传代后，这些细胞仍保持了分化为成熟神经元的全部能力。以前在人的神经细胞的培养中，没有利用这种增殖能力和分化能力强有力的结合。
根据本发明获得的成熟神经元延伸了这种细胞类型的特征，显示对于神经元-特异性标记物如神经丝和MAP-2的着色，并且如通过对突触小泡蛋白染色检测到的，显示突触形成的证据。这些细胞对各种神经递质物质做出反应，并且如在标准膜片钳系统中测定的具有动作电位。在所有这些方面中，该细胞明显具有全部的神经功能。
特别的重要性是该系统可被调节以优化能够产生具有医疗重要特性的神经元的前体的比例的能力。
图1显示了对于酪氨酸羟化酶染色为阳性的神经元，这是多巴胺能神经元的特征。这种类型的细胞对于帕金森病的治疗的特别需要的，但是以前没有描述过其它来源可提供具有足够丰度的适当种类的细胞。如图4中所显示的，在含有促细胞分裂原EGF和FGF-2，以及神经营养蛋白BDNF和NT-3的培养基中传代前体细胞，产生能够产生TH-阳性细胞占群体全部细胞的约7％的增殖细胞群体。
既然本发明的多能干细胞和一些谱系-限制性前体在培养基中大量增殖，本公开描述的系统提供了神经元细胞无限制的供给。可在未分化的多能干细胞水平上，或在属于神经前体的水平上发生大规模的扩展。本发明的细胞在研究、药物开发和CNS异常的治疗上具有重要的用途。
定义为了本公开的目的，术语“神经祖细胞”或“神经前体细胞”是指能够产生或者是神经元细胞(例如神经元前体或成熟神经元)或者是神经胶质细胞(例如胶质前体、成熟星形胶质细胞或成熟少突神经胶质细胞)的子代的细胞。典型地，当它们自身体外培养时，它们不产生其它胚胎胚层的子代，除非以某种方式去分化或重编程序。
“神经元祖细胞”或“神经元前体细胞”是能够产生成熟神经元子代的细胞。这些细胞也可能或不可能具有产生神经胶质细胞的能力。一个“神经胶质祖细胞”或“神经胶质前体细胞”是能够产生成熟星形胶质细胞或成熟少突神经胶质细胞子代的细胞。这些细胞也可能或不可能具有产生神经元细胞的能力。
一种“分化试剂”，如本公开中所使用的，是指一种化合物的收集，该化合物用于本发明的培养系统中以产生神经谱系的分化细胞(包括前体细胞和末端分化的细胞)。对于化合物的作用方式无意限制。例如，该试剂可通过诱导或辅助表型变化、促进具有特殊表型的细胞生长或延缓其它细胞的生长、或与其它试剂合作通过未知机制发挥作用来辅助分化过程。
原型“灵长类多能干细胞”(pPS细胞)是衍生自受精后任一时间的胚前期、胚胎或胎儿的多能细胞，并具有能够在适当的条件下生产一些不同的细胞类型的子代的特征，该不同细胞类型是所有三个胚层(内胚层，中胚层和外胚层)的衍生物，根据标准的本领域已接受的检验，例如在8-12周大的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力。包含于pPS细胞定义的是各种类型的胚胎细胞，例如人胚胎干(hES)细胞，和人胚胎生殖细胞(hEG)。该pPS细胞较佳地不是衍生自恶性来源。细胞是整倍体的是理想的(但不总是必需的)。
当群体中大部分的干细胞和它们的衍生物显示未分化细胞的形态特征时pPS细胞培养物被描述为“未分化的”，将他们与胚胎或成人来源的分化细胞相区别。应理解群体内未分化细胞的集落常常为邻近的分化细胞所包围。
“饲养细胞”或“饲养者”是用于描述与另一种类型的细胞共培养的一种类型的细胞的术语，以提供一种环境，在这种环境种第二种类型的细胞可以生长。据说pPS细胞群体“基本上不含”饲养细胞，如果在分裂后这些细胞生长至少一轮，其中没有加入新鲜的饲养细胞以支持pPS细胞的生长。
术语“胚状体”指当pPS细胞在单层培养物上过量生长或保持在悬浮培养物中时出现的分化的和未分化的细胞的聚集体。胚状体是典型地来自几个胚层的不同细胞类型的混合物，可通过形态学标准和使用免疫细胞化学可检测的细胞标记物区别。
“生长环境”是一种感兴趣的细胞可以在其中体外增殖、分化或成熟的环境。环境的特征包括培养细胞的培养基，可存在任何生长因子或分化诱导因子，以及如果存在的话一种支撑结构(例如在固体表面上的基质)。
当一个多核苷酸通过任何适当的人工操作手段转移到细胞时，或者其中细胞是遗传了该多核苷酸的最初改变的细胞的子代，细胞被称做“遗传改变”、“转染”或“遗传转化”。该多核苷酸常常包含编码感兴趣的蛋白质的可转录的序列，它能使细胞以提高的水平表达蛋白质。如果改变的细胞的子代具有相同的改变那么遗传改变是“可遗传的”。
一般技术分子遗传学和遗传基因工程的一般方法描述于最近出版的《分子克隆实验手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)》(Sambrook等，Cold Spring Harbor)；《哺乳动物的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cell)》(Miller & Calos编)；和《分子生物学现代流程(Current Protocols in MolecularBiology)》(F.M.Ausubel等编，Wiley & Sons)。细胞生物学、蛋白质化学和抗体技术可在《蛋白质科学现代方案(Current Protocol in Protein Science)》(J.E.Colligan等编，Wiley & Sons)；《细胞生物学现代方案(Current Protocol inCell Biology)》(J.S.Bonifacino等，Wiley & Sons)和《免疫学现代方案(CurrentProtocol in Immunology)》(J.E.Colligan等编，Wiley & Sons)中发现。
细胞培养方法通常描述于最近出版的《动物细胞培养基础技术手册(Cultureof Animal CellsA Manual of Basic Technique)》(R.I.Freshney编，Wiley & Sons)；《细胞培养一般技术(General Techniques of Cell Cul ture)》(M.A.Harrison &I.F.Rae，Cambridge Univ.Press)，以及《胚胎干细胞方法和流程(Embryonic StemCellsMethods and Protocols)》(K.Turksen编，Humana Press)。
关于神经系统异常的详细描述、以及各种类型的神经细胞、标记物和相关可溶因子的特征，读者可参考《CNS再生基础科学和临床进展(CNS RegenerationBasic Science and Clinical Advances)》，M.H.Tuszynski & J.H.Kordower编，Academic Press，1999。神经细胞的管理和饲养描述于《神经元细胞和分子生物学(The NeuronCell and Molecular Biology)》第三版，I.B.Levitan & L.K.Kaczmarek，Oxford U.Press，2001；和《组织培养中的神经元(The Neuron in TissueCulture)》，L.W.Haynes编，John Wiley & Son Ltd，1999。
干细胞的来源本发明可使用各种类型的干细胞进行。具体适用于本发明的是衍生自怀孕后形成的组织的灵长类多能干(pPS)细胞，例如胚泡、或胎儿或取自怀孕过程中的任何时间的胚胎组织。如下文所描述的，非限制性的例子是胚胎干细胞或胚胎生殖细胞的初级培养物或已建立的细胞系。本发明的技术还可用初级胚胎或胎儿组织直接进行，直接从初级胚胎细胞衍生神经细胞，而不需要最初建立一个未分化的细胞系。
胚胎干细胞可从灵长类成员的胚泡中分离(美国专利5,843,780；Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995)。可使用Thomson等(美国专利6,200,806；Science 2821145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38133 ff.，1998)和Reubinoff等(Nature Biotech.18399，2000)描述的技术从人的胚泡细胞中制备人的胚胎干(hES)细胞。与hES细胞等价的细胞类型包括它们的多能衍生物，例如原始外胚层样(EPL)细胞，描述于WO 01/51610(Bresagen)。
人胚胎生殖(hEG)细胞可从存在于取自末次月经后约8-11周的人胎儿材料中的原生殖细胞制备。适当的制备方法描述于Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9513726，1998和美国专利6,090,622。
使用促进增殖而不是促进分化的培养条件，PPS细胞可在培养物中连续繁殖。典型的含血清的ES培养基用80％的DMDM(如敲除DMEM(Knockout DMEM)，Gibco)、20％的或者限定的胎牛血清(FBS，Hyclone)或者血清替代物(WO 98/30679)、1％的非必需氨基酸、1mM的L-谷氨酰胺和0.1mM的β-巯基乙醇制备。当使用前，加入人的bFGF至4ng/ml(WO 99/20741，Geron公司)。
常规地，ES细胞在一层饲养细胞上培养，典型地一个混合的细胞群体衍生自胚胎或胎儿组织(美国专利6,200,806)。在Geron的科学家发现即使没有饲养细胞pPS细胞也能保持未分化的状态。可在细胞外的基质上(例如Matrigel或层粘连蛋白)支撑不含饲养细胞的培养物，并在含有支持细胞的增殖而不支持分化的因子的营养培养基中培养。典型的是通过用分泌这种因子的细胞预培养获得调整的培养基，例如照射初级小鼠胚胎成纤维细胞(或衍生自人胚胎干细胞的成纤维细胞样细胞)，在调整前和调整后添加8ng/ml的碱性FGF。在显微镜下，ES细胞出现高的核/胞质比、显著的核仁和紧密的群体形成，典型地表达例如SSEA 3和4的特征表型标记物。在国际专利申请WO 99/20741和WO 01/51616中提供了关于胚胎干细胞的管理和饲养的进一步详细的描述。
描述于本发明的一些技术还可用于保持或推进从胎儿或成体组织获得的神经细胞或神经前体的分化(美国专利5,852,832；5,654,183；5,849,553；和5,968,829；和WO 09/50526和WO 99/01159)。除非特别指出，本发明可使用任何脊椎动物种类的细胞进行，包括人、非-人灵长类、家畜和其它非-人哺乳动物。
制备神经前体和末端分化细胞的材料和步骤本发明的神经祖细胞和成熟神经元可通过使用适当的分化示例分化干细胞。
典型地，分化过程是在含有适当的基质和添加了分化试剂的营养培养基的培养环境中进行。适当的基质包括包被有正电荷的固体表面，例子为聚-L-赖氨酸和聚鸟氨酸。基质可用细胞外基质成分包被，例子为粘连蛋白和层粘连蛋白。其它允许的细胞外基质包括Matrigel(来自Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的细胞外基质)。还有适当的基质是组合基质，例如聚-赖氨酸结合粘连蛋白、层粘连蛋白或二者都结合。
本发明的神经谱系细胞是在支持所欲的细胞类型增殖或存活的培养基上培养的。常常需要使用提供如游离氨基酸而不是血清的营养素的限定的培养基。向培养基中添加开发用于神经细胞持续培养的添加剂也是有益的。例子是N2和B27添加剂，从Gibco商业购得。
沿神经分化途径发展细胞通过包含于培养基中得以促进，该培养基是一种增加所欲的细胞类型生长的分化试剂的混合物。这可能涉及指导细胞或它们的子代接受分化的细胞类型的表型特征，促进具有所欲表型的细胞的生长或抑制其它细胞类型的生长。为了实施本发明通常不需要理解试剂的作用方式。
适当的分化试剂包括各种类型的生长因子，例如表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、任何类型的成纤维细胞生长因子(例子为FGF-4、FGF-8，和碱性成纤维细胞生长因子＝bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1和其它)、高浓度的胰岛素、sonic hedgehog、神经营养蛋白家族的成员(例如神经生长因子＝NGF、神经营养蛋白3＝NT-3、脑衍生神经营养因子＝BDNF)、骨形态发生蛋白(特别是BMP-2和BMP-4)、视黄酸(RA)和于gp130混合的受体的配体(例如LIF、CNTF和IL-6)。还有其它适当的分化试剂是另一种与前面提到的因子的各个细胞-表面受体结合的配体和抗体。典型地，使用了许多分化试剂，它们可含有2、3、4或更多上文列出的或下文实施例中所描述的试剂。
在一种分化方法中，pPS细胞在一个适当的基质上直接铺板，例如粘着的玻璃或塑料表面，例如用聚赖氨酸包被、具有或不具有例如纤连蛋白和层粘连蛋白的神经元-友好基质蛋白的盖玻片。然后该细胞培养于适当的营养基中，该营养基适合于促进向神经细胞的分化。这被称做“直接分化”方法，它进一步描述于国际专利申请WO 01/51616和具有优先权的美国专利申请09/888,309。TGF-β超家族拮抗物例如头蛋白和促滤泡素抑制素在指导神经分化和增加带有通过直接分化获得的神经细胞的表型特征的细胞比例中特别有用(实施例4)。
在另一种分化方法中，pPS细胞首先通过形成细胞簇预分化为异源细胞群体。在一个典型的变化中，通过在悬浮液中培养pPS细胞形成胚状体。任选地，前面列出的一种或多种分化试剂(例如视黄酸)可包含于培养基中以促进胚状体内的分化。胚状体达到足够大小或成熟后(典型地3-4天)，它们在分化培养的基质上铺板。胚状体可直接铺板于基质上而不分散细胞。这使得神经细胞前体移出胚状体并到达细胞外基质上。在一些步骤中，该细胞首先培养于促细胞分裂原混合物中，例如EGF、bFGF、PDGF和IGF-1，然后在促细胞分裂原和神经营养蛋白的组合物中传代以选择出神经祖细胞。
本发明包括鉴别有效产生具体神经表型的因子组合物的策略。根据对来自其它组织或种类的神经细胞的已知作用，已知的受体结合活性，与其它已知功能的因子的结构同源性或其它适当的标准，将已知或怀疑增强神经分化或生长的各种因子分为各种功能类别。各个类别中的因子以适当的工作浓度集合。然后以各种组合，用各个因子类别一起培养细胞，并且评估因子促进前体细胞或所欲类型的成熟神经元生长的能力。鉴别必需的因子类别，当这些因子缺乏时导致混合物丢失其促进所欲表型的能力。一旦鉴定了必需因子并除去其它因子，那么通过除去单一的成分仔细分析各个类别直到鉴定出最低限度的混合物。实施例4中举例说明了这一策略的实施。
如果需要，分化的细胞可被分类以富集某些群体。例如，细胞可用与神经细胞的标记物特征(例如NCAM)结合的抗体或配体接触，随后使用适当的免疫技术，例如固项吸附或荧光-活化细胞分类，分离特异性识别的细胞。还适合的是差别铺板或收获技术，其中使用所欲细胞类型的粘附或可释放性从一个异源群体的其它细胞中分离所欲的细胞。
已经发现神经前体表型可使用促细胞分裂原(例如bFGF和EGF)的组合，加之一种或多种神经营养蛋白(例如BDNF、NT-3或二者)，在增殖培养物中传代。这在实施例2、4和5中举例说明。根据本方法，该细胞可被传代达40倍(图3)，而保持增殖的能力和制成成熟神经元的能力。
假定定向祖细胞在人的治疗中具有特别的价值，因为它们操作起来更具有弹性，并且将保持迁移到靶组织的更大的能力并以功能相容的形式整合。祖细胞可在如实施例5中说明的固体表面上或悬浮液培养物中生长，在那里它们倾向于形成簇或球形结构。通过举例说明当接近融合时使用胰蛋白酶收集神经祖细胞。然后细胞以约一半的密度在无粘着力的加样孔中接种，并培养于含有10ng/ml的BDNF、NT-3、EGF和bGFG的补充培养基中，每周更换3次。
在神经祖细胞衍生或保持过程中培养基其它成分的明智选择可影响它们能产生的成熟细胞的范围和特征。如实施例4中所描述的，在神经祖细胞直接分化过程中包含于培养基中的视黄酸提高了最终分化时产生的MAP-2细胞的比例-但是降低了与多巴胺能神经元有关的对酪氨酸羟化酶(TH)呈阳性的细胞的比例。另一方面，人们发现在神经祖细胞形成过程中包含于培养基中的红细胞生成素(EPO)或提高环状AMP水平的试剂增强了形成TH阳性神经元的能力。另外，细胞可用活化EPO途径的某些抗体或拮抗物培养，或细胞可在适度的含氧量低的条件下培养(低O2水平指3-6％)。使用EPO增加多巴胺能表型的形成描述于实施例3中。
根据这些步骤中的任一步骤制备的神经前体细胞可进一步分化为成熟成熟神经元。完全分化的细胞是本发明的各种应用所希望的，例如体外评估和筛选各种化合物对神经组织的作用。对于使完全分化的细胞表征产生完全分化的细胞的神经祖细胞的功能性也是有用的。
可通过使用成熟因子培养神经前体细胞形成成熟神经元，成熟因子例如毛喉素(或其它提高细胞内cAMP水平的化合物，例如霍乱毒素、异丁基甲基黄嘌呤、二丁基腺苷环状一磷酸)、c-试剂盒配体(c-kit ligand)、视黄酸或来自神经营养蛋白家族的任何因子或因子组合物。特别有效的是神经营养蛋白-3(NT-3)与脑衍生神经营养因子(BDNF)结合。其它候选物是GDNF、BMP-2和BMP-4。另外，可通过除去一些或全部促进神经前体增殖的因子增进成熟，例如EGF、FGF或其它预先用于维持培养的促神经分裂素。
进一步的合理修改本发明的神经细胞前体群体具有相当大的增殖能力。如果需要，可通过提高细胞中端粒酶逆转录酶(TERT)的水平，或者通过从内源基因提高转录，或通过导入转基因进一步增强复制能力。特别适合的是国际专利申请WO 98/14592提出的人端粒酶(hTERT)催化成分。人的细胞中端粒酶的转染和表达描述于Bodnar等，Science279349，1998和Jiang等，Nat.Genet.21111，1999。根据标准方法，遗传改变的细胞可通过TR-PCR评估hTERT的表达，端粒酶的活性(TRAP测定)，hTERT的免疫细胞化学染色或复制能力。
为了在治疗和其它应用中使用，常常需要前体或成熟神经细胞的群体为基本上游离的未分化的pPS细胞。从群体中减少未分化的干细胞的一条途径是用载体转染它们，在这个载体中一个在启动子控制下的效应基因引起未分化的细胞优先表达。适当的启动子包括TERT启动子和OCT-4启动子。效应基因可直接溶解于细胞(例如编码一种毒素或编程性细胞死亡的介质)。另外，效应基因可使细胞对外部试剂的毒性效应敏感，例如一种抗体或一种前体药物。典型的例子是单纯疱疹胸苷激酶(tK)基因，它引起它被表达的细胞对鸟嘌呤的敏感。适当的pTERT-tK构建物描述于国际专利申请WO 98/14593(Morin等)中。
神经前体和末端分化的细胞的特征细胞可依据许多表型标准进行表征，例如形态学特征、表达的细胞标记物的检测或定量、酶活、或神经递质及它们的受体和电生理机能。
包含于本发明的某些细胞具有神经细胞或神经胶质细胞的形态学特征。这些特征为那些熟练评估这种细胞存在的技术人员是容易地理解。例如，神经元的特征是小细胞体，多数具有轴突和树突。本发明的细胞还可根据它们是否表达各种神经细胞的表型标记物特征进行表征。
感兴趣的标记物包括但不限于β-微管蛋白III、微管相关蛋白2(MAP-2)、或神经丝，神经元的特征；存在于星形胶质细胞中的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)；半乳糖脑苷(GalC)或髓磷脂碱性蛋白(MBP)，少突神经胶质细胞的特征；Oct-4，未分化的hES细胞的特征；和干蛋白，神经前体和其它细胞的特征。已经描述了A2B5(一种糖脂)和聚唾液酸化(polysialylated)的神经细胞粘着分子(简写为NCAM)。而当研究神经谱系细胞时，A2B5和NCAM是指示标记物，应理解有时这些标记物可在其它细胞类型上显示，例如肝或肌肉细胞。以前认为β-微管蛋白III对神经细胞是特异性的，但已发现hES细胞的亚群体也呈β-微管蛋白III阳性。MAP-2对于全部各种类型的分化神经元是更加严格的标记物。根据本发明制备的某些细胞群体含有至少30％、50％、75％、90％或更多的对这些标记物具有检验阳性的细胞，这些标记物或者是单一的或者是以各种组合存在。
列于本公开的和本领域已知的组织-特异性标记物可使用任何适当的免疫技术检测—例如用于细胞表面标记物的流式免疫细胞化学，用于细胞内或细胞表面标记物的免疫组织学(例如，固定细胞或组织切片的免疫组织学)，细胞提取物的蛋白质印迹分析，和用于细胞提取物或分泌进入培养基的产物的酶-联免疫分析。如果任选地在细胞固定后，和任选地使用标记的第二抗体或其它偶联物(例如生物素-抗生物素蛋白偶联物)扩增标记物，在标准免疫细胞化学或流式细胞仪分析中明显的可检测数量的抗体将与抗原结合，那么通过细胞的抗原的表达被称做“可检测的抗体”。
组织特异性基因产物的表达还可通过RNA印迹分析、斑点印迹杂交分析，或使用标准扩增方法中的序列特异性引物通过逆转录酶引发的聚合酶链反应(RT-PCR)在mRNA水平上检测。关于更详细的描述参见美国专利5,843,780。列于本公开中的具体的标记物的序列数据可从公共数据库例如GenBank(URL www.ncbi.nlm.nih.gov80/entrez)获得。根据本公开描述的分析方法中的一种，如果在一个典型的控制试验中根据标准步骤进行对细胞样品的分析产生明显可鉴别的杂交或扩增产物，那么在mRNA水平上的表达被称做“可检测的”。如果表达水平至少为2倍，和较佳地大于对照细胞10或50倍，例如未分化的pPS细胞、成纤维细胞或其它无关的细胞，那么当在蛋白质或mRNA水平上检测时，组织特异性标记物的表达被认为是阳性的。
还是神经细胞的特征的是，具体是末端分化的细胞，涉及生物合成、释放和神经递质的再摄取的受体和酶，和涉及有关突触传递的去极化和复极化事件的离子通道。突触形成的证据可通过突触小泡蛋白的染色获得。某些神经递质的感受性的证据可通过检测γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸、多巴胺、3，4-二羟苯丙氨酸(DOPA)、去甲肾上腺素、乙酰胆碱和血清素的受体获得。
本发明具体的神经前体细胞群体的分化(例如使用NT-3和BDNF)可产生至少为20％、30％或40％的MAP-2阳性的细胞群体。一个基本的比例，如5％、10％、25％或更多的NCAM或MAP-2阳性的细胞(在细胞计数的基础上)将能够合成神经递质，例如乙酰胆碱、甘氨酸、谷氨酸、去甲肾上腺素、血清素或GABA。本发明的某些细胞群体含有NCAM或MAP-2阳性细胞，通过免疫细胞化学或mRNA表达测定，该细胞中1％、5％、10％或更多对酪氨酸羟化酶(TH)呈阳性—或者作为NCAM或MAP-2阳性细胞的百分比，或者存在于群体中的所有细胞。本领域中通常认为TH是多巴胺能细胞的标记物。
为了进一步阐明存在于分化群体中的成熟神经元，可根据功能标准测定细胞。例如，可使用任何标准技术、对神经递质的反应、或已知影响体内神经元的其它环境条件测定钙通量。首先，通过形态学标准、或通过例如NCAM的标记物鉴别群体中的神经元样细胞。然后神经递质或条件应用于细胞，并监测反应。还可对细胞运用标准膜片钳技术，以测定是否有动作电位的证据，以及外加电势和反应之间的滞后时间是怎样的。
这里衍生自己建立的pPS细胞系的本发明的细胞群体和分离的细胞可表征为具有与它们衍生自的细胞系相同的基因组。这意味着在pPS细胞和神经细胞之间染色体DNA将具有超过90％的同一性，如果神经细胞是通过正常的有丝分裂过程从未分化的细胞系获得的，那么这是可以推断的。既然保留了所有非-操作的遗传因子，用重组方法以导入一个转基因(例如TERT)或敲除一个内源基因处理的神经细胞仍被认为与它们衍生自的细胞系具有相同的基因组。
神经前体和末端分化的细胞的应用本发明提供了生产大量的神经前体细胞和成熟神经元和神经胶质细胞的方法。这些细胞群体可用于重要的研究、开发和商业目的。
本发明的细胞可用于制备cDNA文库，该cDNA文库相对地没有为来自其它谱系的细胞中优选表达的cDNA所污染。例如，通过在1000rpm离心5分钟收集多能神经祖细胞，然后制备mRNA，逆转录，并任选地减去来自成熟神经元、星形胶质细胞、或少突神经胶质细胞或未分化的星形胶质细胞的cDNA。神经元的表达模式可通过显微排列分析与其它细胞类型相比较，通常参考Fritz等，Science 288316，2000；《微阵列生物芯片技术(Microarray Biochip Technology)》，L Shi，www.Gene-Chips.com。
本发明分化的细胞还可用于制备抗体，该抗体对多能神经祖细胞、属于神经元或神经胶质细胞谱系的细胞和成熟神经元、星形胶质细胞和少突神经胶质细胞的标记物具有特异性。可以免疫原性的形式用本发明的细胞注射脊椎动物制备多克隆抗体。单克隆抗体的生产描述于如Harrow和Lane(1988)，美国专利4,491,632，4,472,500和4,444,887，和《酶法(Methods in Enzymology)》73B3(1981)的标准参考书中。
商业兴趣的应用包括使用细胞筛选小分子药物，和制备含有用于临床治疗的神经元的药物组合物。
药物筛选本发明的神经前体细胞可用于筛选影响神经前体细胞和它们的各种子代的特征的因子(如溶剂、小分子药物、肽、多核苷酸)或环境条件(例如培养条件或操作)。
在一些应用中，pPS细胞(未分化的或分化的)用于筛选促进神经细胞成熟或促进这种细胞在长期培养中增殖和保持的因子。例如，通过在不同的加样孔中向细胞中加入候选成熟因子或生长因子检验它们，然后测定获得的任何表型变化，根据所需的标准进一步培养和使用细胞。
本发明的其它筛选应用涉及检验药物化合物对神经组织或神经传导的影响。进行筛选可能或者是由于设计的化合物具有对神经细胞的药物作用，或者是由于设计的化合物在别处有作用，可能对神经系统具有意想不到的副作用。可使用本发明的任何神经前体细胞或末端分化的细胞进行筛选，例如多巴胺能、5’-羟色胺能、胆碱能、感觉和运动神经元、少突神经胶质细胞和星形胶质细胞。
读者通常参考标准教科书《药物研究的体外方法(In vitro Methods inPharmaceutical Research)》，Academic Press，1997，和美国专利5,030,015。候选药物化合物活性的评估通常包括将本发明分化的细胞与候选化合物结合，或者单独的或者与其它药物结合。研究者测定可归因于化合物的细胞的形态、标记物表型或功能活性的任何变化(与未处理的细胞或用无活性的化合物处理的细胞比较)，然后把化合物的作用与观察到的变化联系起来。
首先通过对细胞生活力、存活、形态和某些标记物和受体的表达的影响确定细胞毒性。药物对染色体DNA的影响可通过测定DNA合成或修复确定。尤其是在细胞周期中以不定期的次数，或者在超出细胞复制所需要的水平上，[3H]-胸苷或BrdU的掺入与药物的作用一致。副作用还可包括通过中期扩散测定的姊妹染色单体交换的异常比率。关于进一步详细的描述读者可参考A.Vickers的《药物研究的体处方法(In vitro Methods in Pharmaceutical Research)》375-410页，Academic Press1997)。
细胞功能的作用可使用任何标准分析观察神经细胞的表型或活性进行评估，例如受体结合、神经递质合成、释放或吸收、电生理和神经元突起和髓鞘的生长—或者在细胞培养物中或者在一个适当的模型中。例如，药物改变突触性接触和可塑性的能力可通过突触或突触小泡蛋白的免疫细胞化学染色在培养物中测定。电生理可通过测定IPSP和EPSP(抑制和刺激突触后电位)进行评估。另外，使用双电极系统，刺激一个细胞，评估系统中第二个细胞的反应。有候选药物存在的系统的行为与药物不存在的系统的行为进行比较，并与药物影响突触性接触或细胞可塑性的能力联系起来。
治疗用途本发明还对可能是由于功能上的先天性障碍、疾病的影响或外伤的结果造成的需要这种治疗的受检者提供了使用神经前体细胞恢复一定程度的中枢神经系统(CNS)功能的用途。
为了确定用于治疗给予的神经前体细胞的适用性，首先可在适当的动物模型中检验该细胞。首先，评估细胞体内存活和保持它们的表型的能力。神经前体细胞在可观察的位点，例如在脑腔中或脊髓中给予免疫缺乏的动物(例如裸鼠、或通过化学或辐射致使免疫缺乏的动物)。在几天到几周或更多的一段时间后收集组织，并评估是否pPS衍生细胞仍然存在。
这可通过给予表达被预标记(例如用BrdU或[3H]-胸苷)的可检测的标记物(例如绿色荧光蛋白、或β-半乳糖苷酶)的细胞进行；或通过构成细胞标记物的随后检测(例如使用人特异性抗体)进行。在啮齿类动物模型中检验神经前体细胞时，给予的细胞的存在和表型可使用人特异性抗体通过免疫组织化学或ELISA评估，或使用引起对人的多核苷酸序列具有特异性的扩增的引物和杂交条件通过RT-PCR分析评估。在本公开的其它地方提供了用于在mRNA或蛋白质水平上评估基因表达的适当的标记物。
用于检验神经系统功能的各种动物模型描述于《CNS再生基础科学和临床进展(CNS RegenerationBasic Science and Clinical Advances)》，M.H.Tuszynski和Kordower编，Academic Press，1999。帕金森病可通过外伤诱导黑质纹状体损伤，从而阻碍脑中主要的多巴胺途径在大鼠中建立模型。另一种标准动物模型是在具有MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)的小鼠或非人灵长类的黑质中多巴胺能神经元的化学损伤。在Furns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804546，1983；Freed等，Appl.Neurophysiol.4716，1984；和Bjorklund等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 192344，2002中提供了例证。
在需要治疗的人类患者中，本发明分化的细胞还可用于组织重建或再生。这些细胞以允许它们移植或迁移到预定的组织位点并重建或再生功能缺乏区域的方式给予。通过例证，依据所治疗的疾病，神经干细胞直接移植到中枢神经系统的实质或鞘内位点。使用单一的细胞悬浮液或密度为25,000-500,000细胞/μL的小的聚集体进行移植(美国专利5,968,829)。包含于本发明的某些神经祖细胞设计用于神经系统急性或慢性损伤的治疗。例如，兴奋性神经毒性为各种条件所影响，这些条件包括癫痫、中风、局部缺血和阿尔茨海默病。可配制多巴胺能神经元用于治疗帕金森病，GABA能神经元用于治疗亨庭顿氏病，和运动神经元用于治疗脊髓损伤或肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
根据本发明，神经祖细胞和末端分化的细胞可以药物组合物的形式供给，该组合物含有在充分消毒的条件下制备的用于人的给予的等渗的赋形剂。关于药物配制的一般原则读者可参考由G.Morstyn和W.Sheridan编的《细胞疗法干细胞移植，基因疗法和细胞免疫疗法(Cell TherapyStem Cell Transplantation，GeneTherapy，and Cellular Immunotherapy)》，剑桥大学出版社，1996；和《造血干细胞疗法(Hematopoietic Stem Cell Therapy)》，E.D.Ball，J.Lister和P.Law，Churchill Livingstone，2000。
该组合物可任选地包装于适当的容器中，该容器上写出了对于所需目的的用法说明，例如CNS功能的重建以改善某些神经异常。
提供下面的实施例用于进一步无限制地说明本发明具体的实施例。
实施例实施例1胚胎干细胞分化为成熟神经元如以前所描述的(AU 729377；WO 01/51616)，从不含饲养细胞的培养物中获得人胚胎干细胞(hES)。如下生产胚状体。hES细胞的融合的单层培养物通过在1mg/ml的胶原酶中培养5-20分钟获得，随后从平板上刮下细胞。然后细胞被分离成簇，并在包含80％的KO(“敲除”)DMEM(Gibco)和20％的非-加热-灭活的FBS(Hyclone)，添加有1％的非必需氨基酸，1mM的谷氨酰胺，0.1mM的β-巯基乙醇的培养基中的非-粘着细胞培养平板(Costar)中铺板。细胞在每孔2ml的培养基中(6孔平板)以1∶1或1∶2的比例接种。
在悬浮液中4天后，在添加了10ng/mL的人EGF、10ng/mL的人bFGF、1ng/mL的PDGF-AA和1ng/mL的人IGF-1的限定的培养基中，胚状体在纤连细胞包被的平板上铺板。胚状体粘着到平板上，并且细胞开始迁移到塑料上，形成单细胞层。
3天后，观察到许多具有神经元形态的细胞。神经前体被鉴别为对BrdU掺入、干蛋白染色和谱系特异性分化标记物缺乏呈阳性的细胞。推定的神经元和神经胶质祖细胞被鉴定为对聚唾液酸化的NCAM和A2B5呈阳性。如通过流式细胞仪测定的，41-60％的细胞表达NCAM，20-66％的细胞表达A2B5。发现NCAM-阳性细胞的亚群体表达β-微管蛋白III和MAP-2。这里没有与例如GFAP或GalC的神经胶质标记物的协同定位。A2B5阳性细胞似乎生产神经元和神经胶质。A2B5细胞的亚群体表达β-微管蛋白III或MAP-2，而另一个分离的亚群体表达GFAP。具有神经元形态的一些细胞对A2B5和NCAM进行双重染色。NCAM阳性和A2B5阳性群体含有的神经元都远比神经胶质多。
通过在不含促细胞分裂原，但是含有10ng/mL的神经营养蛋白-3(NT-3)和10ng/mL的脑衍生神经营养因子(BDNF)的培养基中将细胞重复铺板进一步分化细胞群体。约7天后观察到具有大量突起的神经元。衍生自保存于视黄酸(RA)的胚状体的培养物比那些衍生自保存于不含RA的胚状体的培养物(约5％)显示更多的MAP-2阳性细胞(约26％)。观察到GFAP阳性细胞呈斑点状。鉴别到GalC阳性细胞，但是该细胞大而扁平而不具有复杂的突起。
评估神经递质合成的存在。鉴定到GABA-免疫活性细胞共表达β-微管蛋白III或MAP-2，并具有神经元细胞的形态特征。鉴定到偶尔有些GABA-阳性细胞不共表达神经元标记物，但却具有星形胶质细胞样形态。鉴定到神经元细胞表达酪氨酸羟化酶(TH)和MAP-2。通过用突出小泡蛋白抗体染色鉴定到突出的形成。
在从人的ES细胞的H9细胞系分化的培养物中观察TH染色。胚状体保存于10μM的视黄酸中4天，然后在EGF、碱性FGF、PDGF和IGF中、在纤连蛋白包被的平板上铺板3天。接着它们在添加了10ng/mL的NT-3和10ng/mL的BDNF的N2培养基中的层粘连蛋白上传代，并使之进一步分化14天。分化的细胞用4％的多聚甲醛在室温下固定20分钟，然后使用抗体对TH显影，TH是多巴胺能细胞的标记物。
实施例2多巴胺能细胞的富集群体胚状体培养于具有10μm的视黄酸的悬浮液中4天，然后铺板于添加了EGF、bFGF、PDGF和IGF-1的限定的培养基中3-4天。接着，通过磁珠分选或免疫淘选将细胞分离为A2B5-阳性或NCAM-阳性富集的群体。
免疫-选择的细胞保存于添加了10ng/mL的NT-3和10ng/mL的BDNF的限定的培养基中。14天后，25±4％的NCAM-分选的细胞为MAP-2阳性—其中1.9±0.8％的细胞为GABA-阳性，3±1％的细胞对酪氨酸羟化酶(TH)呈阳性用于多巴胺合成的速度限制酶，常常被认为是多巴胺合成细胞的代表。
在对于NCAM分选的细胞群体中，NCAM阳性的细胞不表达神经胶质标记物，例如GFAP或GalC。这些资料表明含有神经元限制前体的群体可从hES细胞培养物直接分离，基本上不含神经胶质前体杂质。
另一方面，对于A2B5分选的细胞具有产生神经元和星形胶质细胞的能力。富集后，细胞放入添加了NT-3和BDNF的限定的培养基中，并使之分化14天。铺板后最初1-2天内，A2B5富集群体中的细胞开始延伸突触。两周后，细胞呈现成熟神经元的形态，并且32±3％的细胞为MAP-2阳性。重要的是，3±1％的MAP-2细胞为TH-阳性，而只有0.6±0.3％具有GABA免疫反应性。这些资料表明可从含有星形胶质细胞和神经元的祖细胞的hES细胞中获得细胞群体，包括合成多巴胺的细胞群体。
关于获得TH-表达神经元的条件的进一步详细的说明如下。胚状体通过在1mg/mL的胶原酶中培养(37℃，5-20分钟)传代32次时从H7细胞系的融合hES细胞产生，刮削培养皿，并将细胞放入非-粘着培养平板中(Costar)。获得的EB培养于含有FBS和10μM的全-反(all-trans)视黄酸的培养基中的悬浮液中。4天后，收集聚集体并使之沉淀于离心管中。然后吸出上清液，并且聚集体在增殖培养基中(添加N2的DMEM/F12 1∶1，半强度B27，10ng/mL的EGF(R&D系统)，10ng/mL的bFGF(Gibco)，1ng/mL的PDGF-AA(R和D系统)，和1ng/mL的IGF(R和D系统))的聚L-赖氨酸和纤连蛋白包被的平板上铺板。
使EB附着并增殖3天；然后通过胰蛋白酶消化约1分钟(Sigma)收集并以1.5×105个细胞/孔的密度铺板于增殖培养基中的聚L-赖氨酸和层粘连蛋白包被的4-孔分室玻片上1天。然后将培养基改为Neural Basal培养基，该培养基添加了B27，以及下面的生长混合物之一·10ng/mL的bFGF(Gibco)，10ng/mL的BDNF，和10ng/mL的NT-3·10ng/mL的bFGF，5000ng/mL的sonic hedgehog，和100ng/mL的FGF8b·仅10ng/mL的bFGF细胞保存于这些条件下6天，隔天饲养。在第7天，培养基改为具有B27的NeuralBasal培养基，添加了如下的混合物之一·10ng/mL的BDNF，10ng/Mld NT-3·1μM的cAMP，200μM的抗坏血酸·1μM的Camp，200μM的抗坏血酸，10ng/mL的BDNF，10ng/mL的NT-3培养物隔天饲养直到第12天，这时固定它们并用抗-TH或MAP-2进行标记用于免疫细胞化学。标记物的表达通过使用40X的物镜计数3个孔的每一个孔中的4个区域定量。
结果显示于表1中。最初培养于bFGF、BDNF和NT-3的产生最高比例的TH阳性细胞。
表1生产多巴胺能神经元的条件培养条件MAP-2阳性 TH阳性的MAP-1-6天 6-12天细胞的％2细胞的％BDNF，NT-3，bFGFBDNF，NT-3 26％ 5.5％BDNF，NT-3，bFGFcAMP，AA(抗坏血酸) 35％ 4.0％BDNF，NT-3，bFGFcAMP，AA，BDNF，NT-3 25％ 8.7％bFGF，FGF8，SHH BDNF，NT-3 37％ 3.7％bFGF，FGF8，SHH cAMP，AA 34％ 3.9％bFGF，FGF8，SHH cAMP，AA，BDNF，NT-3 21％ 5.8％bFGFBDNF，NT-3 28％ 3.5％bFGFcAMP，AA 26％ 4.1％bFGFcAMP，AA，BDNF，NT-3 22％ 5.7％实施例3通过用促红细胞生成素培养提高多巴胺能细胞的比例在后来的实验中，胚状体在聚赖氨酸纤连蛋白包被的加样孔上铺板，并用10ng/mL的EGF、1ng/mL的PDGF-AA、10ng/mL的bFGF和1ng/mL的IGF-1培养。第四天，向混合物中添加5U/mL的EPO、700μM的cAMP，或二者。细胞被重新铺板，并用10ng/mL的BDNF、10ng/mL的NT-3，和任选的EPO、cAMP和200μM的抗坏血酸处理7天。结果显示于表2中。在这个试验中培养物中MAP-2阳性的总的细胞比例异常地低。
表2生产多巴胺能神经元的条件培养条件TH阳性MAP-2细胞的％(SD)1-3天 4-5天 6-12天EGF，bFGF，PDGF，IGF-1 EGF，bFGF，PDGF，IGF-1BDNF，NT-3 20％(13％)(相同) (相同)BDNF，NT-3，EPO，cAMP，AA 24％(3％)(相同) 相同+EPO BDNF，NT-3，EPO，cAMP，AA 31％(13％)(相同) 相同+cAMP BDNF，NT-3，EPO，cAMP，AA 47％(2％)(相同) 相同+EPO和cAMPBDNF，NT-3，EPO，cAMP，AA 57％(7％)这些数据提供了最初的证据，即在神经前体细胞衍生的过程中加入cAMP和EPO提高了最终获得的表达酪氨酸羟化酶的神经元的百分比。Studer等报道在EPO存在或低氧分压的情况下中脑前体的增殖或分化产生较高数量的多巴胺能神经元(J.Neurosci.207377，2000)。人们认为EPO在含氧量低的条件下具有神经保护作用，推动多能祖细胞趋向神经元通路(Shingo等，J.Neurosci，219733，2001)。这一作用可能是Janus激酶-2和核因子卡巴(NF-KB)之间通讯、Bcl-x(L)表达的正调节、或AP-1(Jun/Fos)通路的活化的结果。在pPS衍生的神经细胞中通过其它方法调节这些通路可模拟EPO的作用。
实施例4hES细胞直接分化为多巴胺能神经元这一研究评估用于分化人的ES细胞成为神经元而不形成胚状体的各种例子。
开发了一种策略，其中根据同源性和/或功能的重复性将检验因子分成几组(表3)。分组因子提高了组内相关活性在ES细胞群体上将被引发的可能性。假设混合物中的某些因子将引发分化级联。当分化进行并细胞的受体表达特征改变时，它们将开始对混合物中的其它因子作出反应。
在整个治疗期间持续地提供复杂的因子混合物避免精确地限定如何和何时改变细胞的反应的需要。当混合物被鉴定引起所欲的分化过程时，它可被系统地简化以获得最小量的最佳的混合物。进一步检验后，最少量的处理可能最终包括一个、两个、三个或更多所列出的因子，根据依据经验确定的步骤同时或者依次使用。
表3检验因子组组1 组2 组3神经营养蛋白促细胞分裂原 干细胞因子30ng/mL的NGF30ng/mL的EGF 8ng/mL的LIF30ng/mL的NT-3 30ng/mL FGF-2(碱性FGF)3ng/mL的IL-630ng/mL的NT-4 37ng/mL的FGF-8b 3ng/mL的IL-1130ng/mL的BDNF 30ng/mL的IGF-13ng/mL的SCF30ng/mLPDGF-AA30ng/mL的CNTF组4 组5 组6分化因子TGF-β超家族TGF-β超家族拮抗物分化因子30ng/mL的BMP-2 150ng/mL的头蛋白 37ng/mL的SHH37ng/mL的GDF-5 30ng/mL的促滤泡素抑制素3ng/mL的GDNF30ng/mL的Neurturin组7 组8 组9神经营养因子分化因子 存活因子/抗氧化剂37ng/mL的中期因子 17μM的视黄酸 166μM的抗坏血酸组10组11分化因子/神经递质 存活因子10μM的多巴胺 100μM的联丁酰基cAMP如下进行试验。通过培养于胶原酶IV 5-10分钟收获人ES细胞系的单层培养物，然后从平板上刮落细胞。通过研磨将细胞分离，并使其几乎铺满用减少了生长因子的Matrigel预处理的96孔组织培养平板，该平板置于敲除DMEM(Knock DMEN)培养基(Gibco BRL)中，培养基中含有用小鼠胚胎饲养细胞调节了24小时的敲除血清替换物(Knockout Serum Replacement)(Gibco BRL)。铺板1天后，该培养基为添加了0.5mM的谷氨酰胺、B27补充物(Gibco BRL)和如下文描述的检验因子组的神经基础(Neurobasal)(NB)培养基(Gibco BRL)取代。每天用含有谷氨酰胺、B27和检验因子的新鲜神经基础培养基饲养细胞，饲养11天。
11天后，通过在胰蛋白酶中培养5-10分钟收获细胞，在用层粘连蛋白预处理的96孔组织培养平板上以1∶6的稀释重新铺板，并每天用含有谷氨酰胺、B27和检验因子的新鲜神经基础培养基再饲养5天。细胞在4％的多聚甲醛中固定20分钟，并用抗体对早期神经元标记物-β-微管蛋白-III、晚期神经元标记物-MAP-2和酪氨酸羟化酶—一种与多巴胺能神经元有关的酶进行染色。细胞核用DAPI标记，并通过目视检查定量。结果显示于表4中。
表4hES细胞直接分化为神经元B-微管蛋白-IIIMAP-2 酪氨酸羟化酶包含于细胞培养物中的检验化合阳性 阳性 阳性物组细胞/孔 ％总量 细胞/孔 细胞/孔 ％总量对照 102 - 21 -处理A 1，2，3，4，6，7，8，9，10，1100 00 -处理B 1，2，3，5，6，7，8，9，10，11362 6％ 13214 0.2％处理C 1，2，4，6，7，8，9，10，11 -- -- -处理D 1，2，5，6，7，8，9，10，11 378 11％ 162 16 0.5％处理E 1，3，4，6，7，8，9，10，11 6- 24 -处理F 1，3，5，6，7，8，9，10，11 282 12％ 92 4 0.2％处理G 1，4，6，7，8，9，10，11 17-02 --＝未测定在另一个试验中，细胞象前面一样培养于添加有谷氨酰胺、B27和检验因子组的神经基础培养基中，在第8天时用胰蛋白酶收获，并重新铺板5天。结果显示于表5中。
表5hES细胞直接分化为神经元β微管蛋白 酪氨酸羟化 对TH也呈MAP-2阳性包含于细胞培养物中的-III阳性酶阳性阳性的MAP-检验化合物组2阳性细胞细胞/孔 细胞/孔 细胞/孔的百分比对照 4 4 0处理 1，2，3，4，6，7，8，9，10，11 12 8 3处理 1，2，3，5，6，7，8，9，10，11 268 12 4处理 1，2，4，6，7，8，9，10，1112 0 0处理 1，2，5，6，7，8，9，10，11372 48 7 15％处理 1，3，4，6，7，8，9，10，110 0 0处理 1，3，5，6，7，8，9，10，11196 56 0处理 1，4，6，7，8，9，10，11 16 0 9一些处理范例诱导神经元的直接分化。包括第5组因子的处理(头蛋白和促滤泡素抑制素)是最有效的。
图1显示了使用处理B、处理D和处理F获得、并对β-微管蛋白-III染色的直接分化的细胞的典型区域。根据形态学和β-微管蛋白-III染色，大约5-12％的细胞是神经元。根据MAP-2染色，其中大约1/3是成熟的神经元。神经元总量的大约2-5％(5-15％的MAP-2阳性神经元)也对酪氨酸羟化酶染色，这与多巴胺能表型一致。
进行随后的试验以进一步说明某些因子混合物的作用和分化动力学。
图2(A)显示一个试验的结果，其中TGF-β超家族拮抗物头蛋白和促滤泡素抑制素用于不同的时间周期。H7细胞系的分会合hES细胞用处理D(除cAMP浓度为700μg外)处理15天。结果表明头蛋白和促滤泡素抑制素都会促成神经元的分化，并相互协作。头蛋白明显地在约1周时(第5-8天)重要，而促滤泡素抑制素在约2周时(第13-15天)重要，最大化的生产成熟神经元而不是小的轴突。
图2(B)显示使用表4中含有TGF-β超家族拮抗物的处理混合物的神经元诱导的时程。图2(C)进一步说明了头蛋白和促滤泡素抑制素在直接分化中的作用。由第一个条形代表的hES细胞用组1、4、6、7、9、10和11的因子(表3)处理，其中具有700μM的Camp、5U/mL的EPO，加上30ng/mL的FGF-8(组2)。实际上，在缺乏头蛋白和促滤泡素抑制素的情况下没有形成β-微管蛋白阳性神经元。然而，仅头蛋白和促滤泡素抑制素或与视黄酸结合通过神经元诱导的第一步直接诱导hES细胞。假定最初的头蛋白/促滤泡素抑制素诱导产生神经祖细胞，随后可通过加入其它因子诱导它形成神经元。
图2(D)显示从需要得到多巴胺能神经元的混合物中除去视黄酸(RA)的好处。细胞根据前面描述的处理F(左边2个条形)或除去视黄酸(右边2个条形)进行分化。包含视黄酸稍微提高了β-微管蛋白阳性神经元的百分比，但是降低了那些神经元对酪氨酸羟化酶的阳性着色的比例。
实施例5通过系列传代神经前体的增殖再生本发明的神经祖细胞可在培养物中传代和扩展，表明它们的一些独特的和有益的特性。
在一个典型的实施例中，收获人胚胎干细胞并放置于悬浮培养物中以在含有20％的FBS加上10μM的视黄酸的基因敲除DMEM中形成胚状体。4天后，胚状体在DMEM/F12培养基中在聚-L-赖氨酸/层粘连蛋白包被的平板上铺板，该DMEM/F12培养基添加了N2添加物、通常量的一半的B27、10ng/mL的人EGF、10ng/mL的人bFGF、1ng/mL的人PDGF-AA和1ng/mL的人IGF-1。
培养细胞3天，通过如下简单的胰蛋白酶处理收获细胞。0.53mM的EDTA(Gibco#25300-054)中的0.5mL的0.5％的胰蛋白酶铺在6孔平板的各个孔中，然后立即从平板上除去。等待15秒钟后(室温)，将加有B27添加物的神经基础培养基放置在加样孔中，然后除去并离心以回收释放的细胞(在细胞的1和10％之间)。
6孔平板用1mL/孔的15μg/mL的聚-L-赖氨酸(Sigma # 1274)包被，随后是1mL/孔的20μg/mL的人胎盘层粘连蛋白(Gibco # 23017-015)过夜。从不同的胰蛋白酶化获得的细胞颗粒在含有B27添加物、10ng/mL的NT-3和10ng/mL的BDNF的神经基础培养基中重悬浮，并以500,000-750,000细胞/孔在包被的孔上铺板。
5天后，细胞通过完全胰蛋白酶化回收，计数，并以100,000-500,000细胞/孔在有各种因子混合物存在的新的聚-赖氨酸/层粘连蛋白包被的孔中重新铺板。使用的浓度如下各种组合的10ng/mL的NT-3、10ng/mL的BDNF、10ng/mL的人EGF、10ng/mL的人bFGF、或10ng/mL的LIF。每周更换三次培养基，每次更换一半以饲养细胞。每7天，细胞被胰蛋白酶化，计数，并在含有相同因子的新鲜培养基中再次传代。
图3(A)显示本试验的生长曲线。仅在BDNF和NT-3中传代的细胞约1周后停止了生长，主要分化成神经元。然而，向培养基中加入EGF和bFGF使细胞以前体的形式继续增殖。这些细胞的标记物特征显示于表5中。
表5神经祖细胞的表型标记物混合物 传代 β-微管细 酪氨酸干蛋白 PS-NCAM A2B5GFAPMAP2胞III 羟化酶NT-3，BDNF，p4+++ +++ ++ ++ - -EGF，bFGF，LIF P8+++ +++ + ++ - -NT-3，BDNF，p4+++ +++ + ++ - -EGF，bFGF， P8+++ +++ - ++ - -p4++ ++ + ++ - -EGF，bFGF，LIFP8++ ++ - +- - -p4++ ++ - -- - -EGF，BfgfP8+ +- -- - -因此，在BDNF、NT-3、EGF和bFGF的组合物中传代的细胞大量地表达神经祖细胞标记物干蛋白和NCAM。
图3(B)显示当仅在BDNF和NT-3中这些细胞被诱导进行最终分化时获得的结果。在BDNF、NT-3、EGF和bFGF的组合物中传代的细胞在最终分化时产生更多的神经元，与在分化前较高比例的神经前体一致。
图4(A)显示对酪氨酸羟化酶染色阳性的细胞的比例。在检验的组合物中BDNF、NT-3、EGF和bFGF的组合物又一次提供了最佳的收获量。
图4(B)显示甚至更多的TH-阳性神经元可通过诱导最终分化生产，这种分化不是仅由BDNF和NT-3诱导，还包括添加的因子，例如NT-4、神经生长因子、抗坏血酸、cAMP和多巴胺(以表3中显示的浓度)。群体中相当于细胞总量的5％的细胞显示多巴胺能标记物的表型。
来自H7 hES细胞系的神经祖细胞在含有B27添加物、30％的血清替代物和10％的DMSO的神经基础培养基中在传代10次时冷冻(5×105细胞/冷冻瓶)。约6个半月后细胞解冻。解冻的细胞具有许多与它们冷冻前相同的特征60-80％的β-微管蛋白和MAP-2阳性，约5％的对酪氨酸羟化酶呈阳性。
在一个相关试验中，细胞呈簇生长和传代，而不是在培养基上。当接近融合时使用胰蛋白酶从6孔平板中收获神经祖细胞(约3或4×105细胞/孔)。然后它们以约2.5×105细胞/孔在非粘着的加样孔中接种，并培养于2mL的含有B27添加物、10ng/mL的BDNF、10ng/mL的EGF和10ng/mL的bFGF的神经基础培养基中。随后的一天通过更换一半培养基饲养细胞，并继续培养4天。然后它们在含有10ng/mL的BDNF和10ng/mL的NT-3但不含有促细胞分裂原的培养基中分化。
本公开中描述的发明的适应是常规优化的问题，并且可在不偏离本发明的精神或下文权利要求的范围的情况下进行。
权利要求
1.一种体外培养的分化的细胞群体，其特征在于，所述细胞群体中至少约30％的MAP-2阳性细胞具有它们是灵长类多能干(pPS)细胞子代的特征，并具有一个或多个如下特性·它们表达酪氨酸羟化酶；·它们一经活化就释放多巴胺。
2.一种体外培养的分化的细胞群体，其特征在于，至少群体所有细胞的约5％具有它们是灵长类多能干(pPS)细胞子代的特征，并具有一个或多个如下特性·它们表达酪氨酸羟化酶；·它们一经活化就释放多巴胺；·它们在帕金森病的黑质纹状体损伤模型中提供临床改善。
3.一种体外培养的神经元前体细胞群体，其特征在于，所述细胞群体中至少约60％的细胞表达A2B5、聚唾液酸化的NCAM或干蛋白，并用附加的神经营养蛋白3(NT-3)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白4(NT-4)和神经生长因子(NGF)，但不加入促细胞分裂原培养7天，产生如权利要求1或2所述的分化的细胞群体。
4.如权利要求3所述的神经元前体细胞群体，其特征在于，所述细胞群体能在培养物中至少进行20次群体加倍，并且在其20次加倍后，用NT-3、BDNF、NT-4和NGF但不加入促细胞分裂原培养时，保持形成如权利要求1或2所述的分化的细胞群体的能力。
5.一个两种细胞群体的组，其特征在于，所述组由上述任一权利要求所述的细胞群体和获得该细胞群体的未分化的pPS细胞系组成。
6.如权利要求1-4所述的细胞群体，其特征在于，所述细胞群体属于如权利要求5所述的一组细胞群体。
7.一种制备神经元前体细胞群体的方法，其特征在于，所述方法包括a)在含有一种或多种神经营养蛋白和一种或多种促细胞分裂原的培养基中培养灵长类多能干(pPS)细胞或它们的子代，和b)从培养物中收获一个细胞群体，其中至少约60％的细胞表达A2B5、聚唾液酸化的NCAM或干蛋白；它在培养基中至少能20次加倍，并在20次加倍后保持分化成含有至少20％MAP-2阳性细胞的群体的能力。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括在用神经营养蛋白和促细胞分裂原培养前通过形成胚状体预分化pPS细胞。
9.如权利要求7-8所述的方法，其特征在于，所述方法包括在用神经营养蛋白培养前用一种或多种附加的促细胞分裂原培养细胞。
10.如权利要求7-9所述的方法，其特征在于，所述方法包括选择粘着到固体基质上但通过简单的酶消化便从基质上释放的细胞。
11.一种制备神经元前体细胞群体的方法，其特征在于，所述方法包括a)在含有一种或多种附加的TGF-β超家族拮抗物的培养基中培养pPS细胞的子代，和b)从培养物中收获细胞群体，其中至少50％的细胞表达聚唾液酸化的NCAM或者β-微管蛋白III。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述培养基进一步包含一种或多种神经营养蛋白和一种或多种促细胞分裂原。
13.如权利要求11-12所述的方法，其特征在于，所述细胞群体是通过将pPS细胞平铺在固体表面制造的，而无需形成胚状体或细胞聚集体。
14.如权利要求12-13所述的方法，其特征在于，所述细胞群体是通过在含有头蛋白和促滤泡素抑制素的培养基中培养pPS细胞的子代制造的。
15.如权利要求7-14所述的方法，其特征在于，所述附加的促细胞分裂原选自表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)，所述附加的神经营养蛋白包括神经营养蛋白3(NT-3)或脑衍生神经营养因子(BDNF)。
16.如权利要求7-15所述的方法，其特征在于，所述附加的促细胞分裂原包括红细胞生成素(EPO)。
17.如权利要求7-16所述的方法，其特征在于，所述方法包括在含有附加的神经营养蛋白和附加的促细胞分裂原的培养基中传代细胞至少6次。
18.如权利要求7-17所述的方法，其特征在于，所述经20次加倍后的神经元前体细胞保持形成分化的细胞群体的能力，其中，在用NT-3、BDNF、NT-4和NGF而不用促细胞分裂原培养时，至少约30％的MAP-2阳性细胞表达酪氨酸羟化酶。
19.如权利要求7-18所述的方法，其特征在于，所述神经元前体细胞经20次加倍后的保持形成分化的细胞群体的能力，其中，在用NT-3、BDNF、NT-4和NGF而不用促细胞分裂原培养时，至少群体所有细胞的约5％表达酪氨酸羟化酶。
20.一种制造分化细胞的方法，其特征在于，所述方法包括，在含有一种或多种选自神经营养蛋白、cAMP和抗坏血酸的因子，而不含有附加的促细胞分裂素的培养基中培养用权利要求7-19所述方法制备的神经元前体细胞。
21.一种鉴定因子的方法，所述因子适合用权利要求7-20中任一项所述方法制备的神经元前体细胞衍生、维持或分化，其特征在于，所述方法包括用按照功能分组的因子的组合培养细胞，用已除去一些官能团的较小组合培养细胞，然后鉴定细胞衍生、维持或分化需要哪些因子。
22.一种筛选化合物对神经细胞或神经细胞活性的作用的方法，其特征在于，所述方法包括a)将化合物与权利要求1-4所述的细胞群体，或用权利要求7-20所述方法制造的细胞群体结合；b)确定由于与化合物结合而产生的群体中细胞表型或活性的任何变化；和c)将该变化与化合物对神经细胞或神经细胞活性的作用相联系。
23.如权利要求22所述的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下一项或多项·确定该化合物对细胞是否具有毒性；·确定该化合物是否影响细胞在培养物中维持的能力；·确定该化合物是否改变神经递质的合成、释放或被细胞摄取；或·确定该化合物是否改变细胞的电生理学。
24.一种药物，其特征在于，所述药物含有如权利要求1-4所述的细胞群体，或用权利要求7-20所述方法制造的细胞群体，用于通过外科手术或疗法进行人或动物体的治疗。
25.如权利要求1-4所述的细胞群体、或用权利要求7-20所述方法制造的细胞群体在制备用于在个体中重建或补充中枢神经系统(CNS)功能的药物中的应用。
26.如权利要求1-4所述的细胞群体、或用权利要求7-20所述方法制造的细胞群体在制备用于治疗帕金森病的药物中的应用。
27.如任何前述权利要求所述的细胞群体、方法或应用，其特征在于，所述pPS细胞分离自人胚泡，或是这种细胞的子代。
28.如任何前述权利要求所述的细胞群体、方法或用途，其特征在于，所述pPS细胞是人胚胎干细胞。
全文摘要
本公开提供了改进的从多能干细胞获得神经祖细胞和分化的神经元群体的方法。该技术可用于制造通过至少40次加倍增殖，但却保持分化成为各种不同神经表型的能力的祖细胞。获得的细胞群体含有高比例的对酪氨酸羟化酶着色的细胞，这是多巴胺能神经元的一个特征。可大量生产本发明的神经祖细胞和末端分化的神经元以用于药物筛选和临床上重要的神经疾病，例如帕金森病的治疗。
文档编号C12N15/10GK1630713SQ02815144
公开日2005年6月22日 申请日期2002年6月20日 优先权日2001年6月21日
发明者M·K·卡朋特, J·J·邓汉姆, M·S·因诺库马, S·R·希斯 申请人:杰龙公司