专利名称：定向固定抗体的光纤生物探针及其制备方法
技术领域：
本发明涉及用于免疫检测用的倏逝波光纤生物传感器上的光纤生物探 针，特别是一种在光纤表面上定向固定抗体的光纤生物探针及其制备方法。
背景技术：
目前，广泛使用的基于光纤倏逝波生物传感器的生物检测系统，是采用 光波在光纤内以全反射方式传输过程中产生的倏逝波激发以生物亲和反应而 结合于光纤探针表面生物分子上标记的荧光染料。把表面固定了一种捕获生 物分子的光纤探针置于被检测样品中，该样品中如果存在与固定在光纤探针 表面的生物分子同种生物物质，则两者将发生亲和反应形成复合分子，样品 中的被测生物分子则结合到光纤探针的表面。然后再把该光纤探针置于具有 荧光染料标记的识别生物分子溶液中，同样两者也会发生特异反应，该溶液 中的识别生物分子与光纤生物探针上的复合分子结合，则将荧光染料固定于 光纤探针的表面。通过倏逝波激发光纤探针表面倏逝波场范围内的荧光染料， 从而检测被检测分子的生物物质的属性及其含量。
影响光纤生物传感器的效率主要由两大因素光纤传感器的工程设计和 生物学问题，生物学因素与工程学一样，决定着光纤传感器的成败。光纤表 面生物敏感分子的固定对于检测的敏感性和特异性至关重要。然而被直接固 定在光纤纤芯表面上的抗体分子的生物活性通常低于溶液中的抗体分子，生 物活性降低的主要原因是被直接固定在纤芯表面上的抗体分子空间位阻增
大，不利于抗体一 抗原的结合，如文献《A quantitative assessment of heterogeneityforsurface-immobilizedproteins 》(Anal. Chem.
73(2001),471-480)所述，界面的微环境导致生物分子的构象改变甚至会发生 变性。另外一个原因是被直接固定在纤芯表面上的抗体分子的功能域在纤芯 表面上趋向向下或趋向侧面时，不利于抗原一抗体的结合；如果抗体分子上 与抗原结合的功能域吸附在纤芯表面上，抗体分子就不能同抗原发生结合， 如图1所示，抗体分子5含有两个抗原结合域7，其中一个与固相表面结合 在一起，从而失去了与抗原分子结合的能力。
发明内容
本发明的目的在于，为克服上述被直接固定在固相表面上的抗体分子的 空间位阻大、抗体分子的功能域在固相表面上趋向向下或趋向侧面、抗体分 子上与抗原结合的功能域吸附在固相表面上，不利于抗体一抗原结合，以及 抗体分子容易失活的缺点，为了提高光纤生物探针上的抗体与抗原的结合能 力，提供一种定向固定抗体的光纤生物探针及其制备方法。
本发明定向固定抗体的光纤生物探针，由光纤和固定在该光纤表面上的 捕获抗体分子层构成，其特点是在光纤和捕获抗体分子层之间还包括一层蛋 白G分子层。
为更好的促进蛋白G分子层的形成，在所述的光纤和蛋白G分子层之间 还有一层亲水极化层。
本发明定向固定抗体的光纤生物探针使用蛋白G来定向固定抗体分子。 蛋白G是细菌胞壁蛋白，它能够同抗体的Fc片段8特异性结合。蛋白G特 异性的结合抗体分子的Fc片段8，使抗体分子上同抗原分子特异性结合的两 个功能域Fab7伸向表面外以便于同抗原分子结合。如图2所示，通过蛋白G 特异性结合而定向固定在光纤纤芯表面上的抗体分子5同抗原分子6结合的 两个功能域7伸向表面外，自由的同抗原分子6结合。结合在光纤纤芯表面 上的蛋白G起到桥梁的作用，使被连接的抗体分子在溶液中充分伸展，极大 的降低了空间位阻效应，使抗体一抗原之间的结合类似于在溶液中一样自由。
另外，蛋白G分子层还能够钝化光纤的表面，有效的降低光纤表面的非特异 性吸附，提高免疫检测即检测抗原的分析灵敏度。
所述的捕获抗体分子层的抗体包括各种用于免疫检测的抗体，如抗体人
免疫球蛋白G (antilgG)、抗体牛血清白蛋白(antiBSA)或抗体人血清凝血 蛋白原(antiFIB)。
本发明定向固定抗体的光纤生物探针的制备方法包括以下步骤
a. 选择所需直径大小的光纤，用常规清洁处理方法进行表面清洁处理；
b. 将经过上述步骤a清洁处理干净的光纤浸入到蛋白G溶液中，浸泡的 时间依赖溶液浓度来定，以达到饱和吸附为止，取出后用去离子水洗净，即 得到蛋白G的饱和吸附分子层；
c. 将经过上述步骤b处理的光纤浸入到捕获抗体分子溶液中，浸泡的时 间依赖溶液浓度来定，以蛋白G结合捕获抗体分子至饱和状态为止，取出后 用去离子水洗净，得到捕获抗体分子层，即制得定向固定抗体光纤生物探针。
本发明提供的定向固定抗体的光纤生物探针制备方法还可以进一步包括 在光纤纤芯的表面和蛋白G分子层之间的亲水极化表面层的制备方法，其制
备方法步骤如下
a. 选择所需直径大小的光纤，经常规清洁处理后，在洗液1中清洗30 分钟，再在清洗液2中清洗30分钟，然后在清洗液3中煮沸10分钟，用去 离子水清洗至中性，即得到表面上具有亲水极化层的光纤；
其中所述清洗液l为浓HC1:乙醇-1:1 (V/V) 清洗液2为浓硫酸 清洗液3为超纯水；
b. 将经过上述步骤a处理的光纤浸入到蛋白G溶液中，浸泡的时间依赖 溶液浓度来定，以达到饱和吸附为止，取出后用去离子水洗净，即得到蛋白 G的饱和吸附分子层；
C.将经过上述步骤b处理的光纤浸入到捕获抗体分子溶液中，浸泡的时
间依赖溶液浓度来定，以蛋白G结合捕获抗体分子至饱和状态为止，取出后
用去离子水洗净，得到捕获抗体分子层，即制得定向固定抗体光纤生物探针。 该方法是在光纤表面上首先形成亲水极化层，然后在亲水极化表面层上
形成蛋白G分子层，再在蛋白G分子层上形成捕获抗体分子层。该亲水极化 表面层有利于在蛋白G分子层的制备过程中从溶液中吸附蛋白G，促进蛋白 G分子层的形成。
本发明提供的定向固定抗体的光纤生物探针的用途包括
1) 优化免疫测定；
2) 内分泌激素检测；
3) 药物筛选；
4) 毒素检测
5) 污染物检测。
本发明定向固定抗体的光纤生物探针可对多种生物分子溶液进行免疫检 测。将本发明的光纤生物探针浸入到待测分析物溶液，经一定反应时间(时 间长短依赖溶液浓度)，溶液中的分子与光纤生物探针上的捕获抗体分子特异 性结合形成抗原一抗体复合物。然后放入荧光物质标记的识别分子溶液，识 别分子与复合分子特异性结合把荧光物质固定在光纤生物探针的表面，荧光 物质的荧光通过倏逝波光纤生物传感器系统观察到，以此判定溶液中待测生 物分子是否存在。
本发明的优点及效果
1. 本发明提供的定向固定抗体的光纤生物探针克服了纤芯表面上直接固
定抗体引起的抗体生物活性下降的缺点；
2. 本发明的光纤生物探针，定向固定抗体分子，使抗体分子上的抗原结 合域伸向纤芯表面外，自由的同抗原结合；
3. 本发明的光纤生物探针，其中蛋白G起到了桥梁的作用，减少了抗 体分子的空间位阻；
4. 蛋白G分子层还能够钝化表面，有效的降低了表面的非特异性吸附， 提高检测抗原的分析灵敏度；
图1是直接固定在光纤表面上的抗体分子示意图； 图2是本发明的定向固定的抗体分子示意图3是本发明的实施例1制备的定向固定抗体的光纤生物探针的结构示 意图中l为光纤纤芯，2为亲水极化表面层，3为蛋白G分子层，4为捕 获抗体分子层，5为抗体分子，6为抗原分子,7为抗原结合域，8为抗体的Fc 片段
具体实施方式
实施例1
制备在光纤表面上定向固定抗BSA的光纤生物探针，其结构包括如图 3所示，光纤l，在光纤的表面上形成单分子层的亲水极化层2，在亲水极化 层2上形成的蛋白G单分子层3，以及在蛋白G分子层3上形成的捕获抗BSA 抗体分子层4。
该光纤生物探针的制备按以下步骤进行
1. 光纤表面的清洁处理
用常规清洁处理方法对其进行表面清洁处理。
2. 亲水极化层的形成
将上述步骤1清洁处理干净的光纤纤芯先在清洗液1中清洗30分钟，再 在清洗液2中清洗30分钟，然后在清洗液3中煮沸10分钟，制备出在光纤 纤芯上具有亲水的极化层。其中清洗液l为浓HC1:乙醇4:1 (V/V) 清洗液2为浓硫酸
清洗液3为超纯水
3. 蛋白G分子层的制备
将经过步骤2处理的光纤浸入到lmg/mL的蛋白G溶液中，浸泡30分钟 后，取出后用去离子水将上面的残存物清除干净，即形成了第三层蛋白G的 分子层。
4. 捕获分子层的制备
把上述步骤3形成的蛋白G的分子层浸入到浓度为lmg/mL的antiBSA 溶液中，浸泡30分钟后，取出用去离子水洗净，即在蛋白G分子层上得到 捕获抗BSA分子层，从而制得在光纤纤芯表面上定向固定抗BSA的光纤生 物探针，其结构如图3所示。
定向固定抗BSA的光纤生物探针对BSA的检测
把本实施例制备的定向固定抗BSA的光纤生物探针全部浸入到待测溶液 中，如果溶液中含有BSA分子，就会同光纤生物探针上的抗体发生特异性结 合，形成复合分子，然后放入荧光物质标记的识别分子溶液，识别分子与复 合分子特异性结合把荧光物质固定在光纤生物探针的表面，荧光物质的荧光 通过倏逝波光纤生物传感器系统观察到，以此判定溶液中待测生物分子是否 存在。
实施例2
制备一在光纤纤芯表面上定向固定抗HbsAg的光纤生物探针，其结构包 括光纤纤芯l，在光纤纤芯的表面上形成单分子层的亲水表面极化层2，在 亲水极化层2上形成的蛋白G单分子层3，以及在蛋白G分子层3上形成的 抗HbsAg捕获抗体分子层4。
采用实施例1中的步骤得到蛋白G分子层，捕获分子层的制备，把上述步骤3形成的蛋白G的分子层浸入到浓度为lmg/mL的抗HbsAg 溶液中，浸泡30分钟后，取出用去离子水洗净，即在蛋白G分子层上得到 捕获抗体分子抗HbsAg分子层，从而制得在光纤纤芯表面上定向固定抗 HbsAg的光纤生物探针，其结构如图3所示。
定向固定抗HbsAg的光纤生物探针对BSA的检测
把本实施例制备的定向固定抗HbsAg的光纤生物探针全部浸入到待测溶 液中，如果溶液中含有HbsAg分子，就会同光纤生物探针上的抗体发生特异 性结合，形成复合分子，然后放入荧光物质标记的识别分子溶液，识别分子 与复合分子特异性结合把荧光物质固定在光纤生物探针的表面，荧光物质的 荧光通过倏逝波光纤生物传感器系统观察到，以此判定溶液中待测生物分子 是否存在。
权利要求
1. 一种定向固定抗体的光纤生物探针，由光纤和固定在该光纤表面上的捕获抗体分子层构成，其特征在于在光纤和捕获抗体分子层之间还包括一层蛋白G分子层。
2. 根据权利要求l所述的定向固定抗体的光纤生物探针，其特征在于 在所述的光纤和蛋白G分子层之间还有一层亲水极化层。
3. 根据权利要求l所述的定向固定抗体的光纤生物探针，其特征在于 所述的蛋白G分子层、亲水极化表面层和捕获抗体分子层均为单分子层。
4. 一种权利要求1所述的光纤生物探针的制备方法，其特征在于包括以 下步骤a. 选择所需直径大小的光纤，用常规清洁处理方法进行表面清洁处理；b. 将经过上述步骤a清洁处理干净的光纤浸入到蛋白G溶液中，浸泡的 时间依赖溶液浓度来定，以达到饱和吸附为止，取出后用去离子水洗净，即 得到蛋白G的饱和吸附分子层；c. 将经过上述步骤b处理的光纤浸入到捕获抗体分子溶液中，浸泡的时 间依赖溶液浓度来定，以蛋白G结合捕获抗体分子至饱和状态为止，取出后 用去离子水洗净，得到捕获抗体分子层，即制得定向固定抗体光纤生物探针。
5. —种权利要求2所述的光纤生物探针的制备方法，其特征在于包括以 下步骤a.选择所需直径大小的光纤，经常规清洁处理后，在洗液1中清洗30 分钟，再在清洗液2中清洗30分钟，然后在清洗液3中煮沸10分钟，用去 离子水清洗至中性，即得到表面上具有亲水极化层的光纤；其中所述清洗液l为浓HC1:乙醇4:1 (V/V) 清洗液2为浓硫酸清洗液3为超纯水；b.将经过上述步骤a处理的光纤浸入到蛋白G溶液中，浸泡的时间依赖溶液浓度来定，以达到饱和吸附为止，取出后用去离子水洗净，即得到蛋白 G的饱和吸附分子层；C.将经过上述步骤b处理的光纤浸入到捕获抗体分子溶液中，浸泡的时间依赖溶液浓度来定，以蛋白G结合捕获抗体分子至饱和状态为止，取出后用去离子水洗净，得到捕获抗体分子层，即制得定向固定抗体光纤生物探针。
全文摘要
本发明涉及用于免疫检测用的倏逝波光纤生物传感器上的光纤生物探针，特别是一种在光纤表面上定向固定抗体的光纤生物探针及其制备方法。该生物探针由光纤和固定在该光纤表面上的捕获抗体分子层构成，其特点是在光纤和捕获抗体分子层之间还包括一层蛋白G分子层。是将处理干净的光纤浸入到蛋白G溶液中，得到蛋白G的饱和吸附层后再浸入到捕获抗体分子溶液中，以蛋白G结合捕获抗体分子至饱和状态即制得定向固定抗体光纤生物探针。克服了纤芯表面上直接固定抗体引起的抗体生物活性下降的缺点，减少了抗体分子的空间位阻；并有效的降低了表面的非特异性吸附，提高检测抗原的分析灵敏度。
文档编号G01N33/53GK101387640SQ20081005130
公开日2009年3月18日 申请日期2008年10月22日 优先权日2008年10月22日
发明者刘晓敏, 孔祥贵, 孙雅娟, 张友林, 曾庆辉 申请人:中国科学院长春光学精密机械与物理研究所