专利名称：血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。
背景技术：
血小板抗体是由异体或自身血小板抗原作用机体而产生的，包括 同种异体抗体、自身抗体、同种抗体、药物依赖性抗体和非特异性抗 体五类，这些抗体作用于人体血小板可导致血小板发生破坏并引起胎
母同种异体免疫血小板减少症(FMAIT)、血小板输注无效症(PTR)、 输血后紫癜(PTP)等多种血小板免疫疾病。
同检测红细胞抗体的血清学方法相比，临床检测血小板抗体的实 验方法出现较晚。1987年Kiefel发明了单克隆抗体固着血小板抗原 分析(IPA)法，凭借其高灵敏度和特异性成为检测血小板抗体的 "金标准"。但该试验耗时长；技术要求高；如果待检血清中抗血小 板抗体与鼠单克隆抗体识别同一抗原决定簇则出现假阴性反应，这些 缺点也限制了它的广泛应用。近二十年，尽管出现了很多新方法如 单克隆抗体固相血小板抗体试验(MASPAT)、抗原捕获试验(ACE)、 修饰的抗原捕获试验(MACE)和微柱凝胶免疫分析技术(MGIA) 等，然而各自都有其缺陷和不足，在临床应用中尚缺乏一种灵敏度高、 特异性和稳定性好的简便方法。
抗人球蛋白实验是检査不规则抗体的一种有效的检测方法。本实 验分为直接和间接两种。直接实验主要检查细胞上是否结合了不规则 抗体，而间接实验是检查血清中有无游离的不规则抗体。
目前采用抗人球蛋白试验检测血小板抗原抗体反应，通常是将抗 人球蛋白试剂进行酶标记或荧光标记，通过显色反应或测定荧光强度 来判定结果。此类方法通常存在以下缺点和不足
1. 需要反复洗涤和多次孵育过程，操作繁琐，耗时长。
2. 每次只能检测少量的样本，很难开展大量样本的检测。
3. 技术要求高， 一般由实验室高年资技术人员操作或示范，技 术普及难度大。
4. 观察结果时间短，实验结果无法保存， 一旦出现医疗纠纷难 以判定责任。
发明内容
本发明的目的是提供一种血小板抗原抗体检测和交叉配型的固 相抗人球蛋白试剂盒。
本发明的试剂盒包括
a、 U型反应板其内表面已包被抗血小板单克隆抗体试剂；
b、 血小板从新鲜EDTA抗凝血中提取或直接采用机采血小板; C、指示细胞其表面已致敏人IgG;
d、 抗人IgG:用人丙种球蛋白免疫产蛋母鸡，从鸡蛋中提取抗 人IgG;
e、 低离子介质能增强抗原抗体反应；
f、 抗血小板血清含己知血小板特异性抗体；
g、 阴性对照血清与上述检测试剂不发生反应的健康成年人血 清，其血清中不含有抗血小板抗体；
h、 阳性对照血清与上述检测试剂发生反应的健康成年人血清， 其血清中含有抗血小板抗体。
本发明用于检测血小板抗原、抗体及进行血小板输注前的交叉配型。
本发明灵敏度高，检测过程耗时短(〈lh)，方法简便易行，结果 易于判定，可同时对大量样本进行检测，易于自动化。
图1是本发明反应板对照图，其中A是血小板与反应板中血小板 单克隆抗体结合并形成的血小板单层，B空白反应板对照；
图2是本发明固相抗人球蛋白试验检测血小板抗体结果图，其中 阳性反应为指示细胞铺满反应孔底部，而阴性反应为指示细胞在反应 孔底部中间形成红细胞聚集，弱阳性反应格局介于两者之间。
具体实施例方式
本发明的试剂盒包括
a、 U型反应板其内表面已包被抗血小板单克隆抗体试剂；
U型反应板制备采用96孔U型反应板，用pH9.6， 0.05M碳 酸盐缓冲液将将纯化的血小板单克隆抗体配制成10ug/ml浓度，按 100ul/孔加入反应孔中，置4。C冰箱中包被过夜，次日取出，用含有 0.05%吐温的pH7.2， 0.01M磷酸盐缓冲液洗涤5次，拍干，置-2(TC
保存备用。
b、血小板从新鲜EDTA抗凝血中提取或直接采用机采血小板；
取新鲜EDTA抗凝全血1500rpm离心10min,取上层2/3富血小板 血浆进行实验或直接用生理盐水将机采血小板作5-10倍稀释后得到 血小板悬液使用。
C、指示细胞其表面已致敏人IgG; 指示细胞的制备
(1) 取新鲜O型抗凝全血(D+)，用生理盐水洗涤3次。
(2) 将洗涤完的压积红细胞和效价为16 64的人IgG (抗D) 等体积混合，37i:水浴孵育30分钟。
(3) 用生理盐水洗漆上述致敏细胞三次后，用红细胞保护液将 其配制成0.2 0.5%浓度。
d、 抗人IgG:用人丙种球蛋白免疫产蛋母鸡，从鸡蛋中提取抗
人IgG;
抗人IgG的制备及提取方法用人丙种球蛋白免疫产蛋母鸡，至 效价合格后收集鸡蛋，用反复冻融法从鸡蛋中提取抗人IgG。
e、 低离子介质能增强抗原抗体反应；
低离子介质的配制称取NaC10.875g,甘氨酸9g于500ml烧杯中， 加入400ml去离子水溶解后，加入5.65ml 0.15M 1012 04和4.35ml 0.15M Na2HP04，充分混匀后，2.5mllO%NaN3，混匀后用去离子水定 容至500ml,最后用NaOH调节pH至6.7。
f、 抗血小板血清含已知血小板特异性抗体；
血小板特异性抗体血小板特异性抗原分为16个系统，特异性 抗体是指针对其中的某个或某些抗原而产生的抗体。
g、 阴性对照血清经国家规定的五项指标(转氨酶、乙肝、丙 肝、梅毒、艾滋病)检测合格且与上述检测试剂不发生反应的健康成 年人血清，表明其血清中不含有抗血小板抗体。
h、 阳性对照血清经国家规定的五项指标(转氨酶、乙肝、丙 肝、梅毒、艾滋病)检测合格的健康成年人，且与上述检测试剂发生 反应的人血清，表明其血清中含有抗血小板抗体。
制备及提取包被用抗血小板单克隆抗体的方法采用全血小板免 疫小鼠并制备鼠抗人血小板单克隆抗体，经硫酸铵沉淀及亲和层析提 纯得到包被用抗人血小板单克隆抗体。
抗血小板单克隆抗体的包被量为lug/孔。
本发明的原理血小板经离心洗涤后可与反应板中的血小板单抗 结合并形成血小板单层。加入血清在板中经过孵育后，若血清中不含 有血小板抗体则经过洗涤可去除，若含有血小板抗体则此抗体与反应 板中的血小板结合，加入抗人IgG及指示细胞，经离心后指示细胞结 合到血小板单层上。因此阳性反应为指示细胞铺满反应孔底部，而阴 性反应为指示细胞在反应孔底部中间形成红细胞聚集。从而可检测血 小板抗体及进行血小板交叉配型。
本发明用于检测血小板抗原、抗体及进行血小板输注前的交叉配型。
实施例1:
血小板抗原检测
前提是用户准备含血小板特异性抗体的抗血清。
1、 将试剂盒平衡至室温(18-25。C)。 30X浓縮洗涤液用蒸馏水按 l:29稀释成工作洗涤液。
2、 根据实验量取出反应板条，标记阳性对照、阴性对照及待检 样品孔，未使用的板条应储存于自封袋中，加入干燥剂密封后，2-8 "C储存。
3、 向反应孔中加入1滴(50ul)待检血小板悬液，轻摇反应板 (约10秒)使反应孔中的保护剂充分溶解。
4、 用平板离心机将反应板以50g离心5分钟，使血小板固定在 微孔底部。
5、 轻轻倒出未结合的血小板，并用滴管滴加工作洗涤液清洗3 次，洗涤过程中轻摇微孔板，然后再轻轻甩掉洗涤液。最后一次洗涤 后将反应板倒置于吸水纸上吸干残余液体。
6、 立即向每个反应孔中加入2滴(100ul)低离子强度溶液(1 分钟内)，并向相应孔中加入1滴(50ul)含血小板特异性抗体的抗血 清，阳性对照及阴性对照。7、将反应孔用封口胶纸封好，轻摇混匀 后置于湿盒中37。C水浴孵育30分钟或气浴孵育35分钟。
8、 取出已孵育完毕的反应板，弃去封口胶纸。按步骤5洗涤反 应板5次。
9、 立即加入1滴(50ul)抗人IgG试剂及1滴(50ul)指示红细 胞，轻轻振荡混匀。
10、 将反应板以200g离心5分钟。
11、 将待检孔与对照孔的结果进行比较，判读并记录试验结果。 指示细胞平铺在反应板的底部为阳性，说明待检血小板上具有与
已知抗血清相应的抗原；在反应孔的底部形成细胞聚集为阴性，说明 待检血小板上无与已知抗血清相应的抗原。 实施例2:
血小板抗体检领!J:
1、 将试剂盒平衡至室温(18-25。C)。 30X浓縮洗涤液用蒸馏水按 l:29稀释成工作洗涤液。
2、 根据实验量取出反应板条，标记阳性对照、阴性对照及待检 样品孔，未使用的板条应储存于自封袋中，加入干燥剂密封后，2-8 'C储存。
3、 向反应孔中加入l滴(50ul)三人份混合O型血小板悬液， 轻摇反应板(约10秒)使反应孔中的保护剂充分溶解。
4、 用平板离心机将反应板以50g离心5分钟，使血小板固定在 微孔底部。
5、 轻轻倒出未结合的血小板，并用滴管滴加工作洗涤液清洗3 次，洗涤过程中轻摇微孔板，然后再轻轻甩掉洗漆液。最后一次洗涤 后将反应板倒置于吸水纸上吸干残余液体。
6、 立即向每个反应孔中加入2滴(100ul)低离子强度溶液(1 分钟内)，并向相应孔中加入l滴(50ul)待检者血清或血浆，阳性对照 及阴性对照。
7、 将反应孔用封口胶纸封好，轻摇混匀后置于湿盒中37'C水浴
孵育30分钟或气浴孵育35分钟。
8、 取出已孵育完毕的反应板，弃去封口胶纸。按步骤5洗涤反 应板5次。
9、 立即加入1滴(50ul)抗人IgG试剂及1滴(50ul)指示红细 胞，轻轻振荡混匀。
10、 将反应板以200g离心5分钟。
11、 将待检孔与对照孔的结果进行比较，判读并记录试验结果。 指示细胞平铺在反应板的底部为阳性，说明待检血清中含有抗血
小板抗体；指示细胞在反应孔的底部形成细胞聚集为阴性，说明待检 血清中不含有抗血小板抗体。反应格局介于二者之间的为弱阳性。
实施例3:
血小板交叉配型
1、 将试剂盒平衡至室温(18-25。C)。 30X浓縮洗涤液用蒸馏水按 l:29稀释成工作洗涤液。
2、 根据实验量取出反应板条，标记阳性对照、阴性对照及待检 样品孔，未使用的板条应储存于自封袋中，加入干燥剂密封后，2-8 'C储存。
3、 向反应孔中加入1滴(50ul)供者血小板悬液，轻摇反应板 (约10秒)使反应孔中的保护剂充分溶解。
4、 用平板离心机将反应板以50g离心5分钟，使血小板固定在 微孔底部。
5、 轻轻倒出未结合的血小板，并用滴管滴加工作洗涤液清洗3 次，洗涤过程中轻摇微孔板，然后再轻轻甩掉洗涤液。最后一次洗涤 后将反应板倒置于吸水纸上吸干残余液体。
6、 立即向每个反应孔中加入2滴(lOOul)低离子强度溶液(1 分钟内)，并向相应孔中加入l滴(50ul)受血者血清或血浆，阳性对照 及阴性对照。7、将反应孔用封口胶纸封好，轻摇混匀后置于湿盒中 37"C水浴孵育30分钟或气浴孵育35分钟。
8、 取出已孵育完毕的反应板，弃去封口胶纸。按步骤5洗涤反 应板5次。
9、 立即加入1滴(50ul)抗人IgG试剂及1滴(50ul)指示红细 胞，轻轻振荡混匀。
10、 将反应板以200g离心5分钟。
11、 将待检孔与对照孔的结果进行比较，判读并记录试验结果。 指示细胞平铺在反应板的底部为阳性，介于二者之间的为弱阳
性，这说明供受者血小板不合；若指示细胞在反应孔的底部形成细胞 聚集为阴性，说明供受者血小板相合。
权利要求
1、一种血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒，其特征是a、U型反应板其内表面已包被抗血小板单克隆抗体试剂；b、血小板从新鲜EDTA抗凝血中提取或直接采用机采血小板；c、指示细胞其表面已致敏人IgG；d、抗人IgG用人丙种球蛋白免疫产蛋母鸡，从鸡蛋中提取抗人IgG；e、低离子介质能增强抗原抗体反应；f、抗血小板血清含已知血小板特异性抗体；g、阴性对照血清与上述检测试剂不发生反应的健康成年人血清，其血清中不含有抗血小板抗体；h、阳性对照血清与上述检测试剂发生反应的健康成年人血清，其血清中含有抗血小板抗体。
2、 根据权利要求1所述的血小板抗原抗体检测和交叉配型的固 相抗人球蛋白试剂盒用于检测血小板抗原、抗体及进行血小板输注前 的交叉配型。
全文摘要
一种血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒，属于生物技术领域。本发明的目的是提供一种血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒。包括U型反应板、血小板、指示细胞、抗人IgG、低离子介质、抗血小板血清、阴性对照血清、阳性对照血清。本发明灵敏度高，检测过程耗时短(＜1h)，方法简便易行，结果易于判定，可同时对大量样本进行检测，易于自动化。
文档编号G01N33/80GK101382540SQ20081005126
公开日2009年3月11日 申请日期2008年10月15日 优先权日2008年10月15日
发明者东 李, 勇 李, 段生宝, 军 童, 邰慧波 申请人:勇 李