专利名称：一种kim-1检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种肾脏疾病的检测方法，尤其是提供了一种应用免疫胶 体金技术研制的KIM-1检测试剂盒，同时还公开了其制备方法，属于疾病 检测技术领域。
背景技术：
急、慢性肾脏疾病是临床常见疾病，其发病率和死亡率都很高，寻找敏 感性和特异性的早期肾损伤生物标志物，对早期诊断、治疗和改善预后具 有重要意义。本发明涉及的肾损伤分子-1 (kidney injury molecule-1，简 称KIM-l)是一种新发现的跨膜糖蛋白，在正常肾脏中表达甚微，而在肾损伤 时表达明显增加。动物研究表明，KIM-1的外功能区断裂后产物能够通过尿 中排出，它可作为人类肾小管损伤的生物标志，因此检测尿中KIM-1水平 可以间接评价肾脏损伤的情况。
目前检测KIM-1的方法包括免疫组化、ELISA、 Western blot等，可用
于科学研究，但用于临床则存在很多弊端，如操作程序复杂，时间较长等。
发明内容
本发明公开一种KIM-1检测试剂盒，用于诊断肾脏疾病。 本发明还提供了 KIM-1检测试剂盒的制备方法，适用于工业化生产。 本发明提供的KIM-1检测试剂盒，在硝酸纤维素膜的两端分别设有金 标垫和吸收垫，金标垫上端为样品垫，金标垫包被有纯化的KIM-1抗体胶 体金偶联标记物，检测线包被有纯化的KIM-1抗体，质控线包被有正常抗小鼠IgG抗体，质控线侧贴有吸收垫。
本发明KIM-1检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤
本发明根据抗原抗体能特异结合的免疫学基本原理，将纯化的KIM-1
抗体用胶体金标记，喷点于玻璃纤维膜上制备成金标垫，将纯化的KIM-1
抗体和正常抗小鼠IgG抗体分别包被在硝酸纤维素膜(NC膜)上的检测线
处和质控线处，当被检样品中含有KIM-1抗原时，则于金标垫与胶体金标
记的KIM-1抗体结合，并在吸收垫的作用下，向前渗透泳动，与检测线上
的KIM-1抗体再次结合，出现肉眼可见的色带。
本发明试剂盒的使用方法如下取尿标本约0.5ml加入小试管中，然 后插入试纸条，待1-2分钟反应带清晰后观察结果(见图2)。出现l条红 色(对照)沉淀线，为尿检诊断阴性；出现2条红色(样品和对照)沉淀线， 为尿检诊断阳性，未出现沉淀线则为无效。
本发明的积极效果在于首次应用免疫胶体金技术制备KIM-1检测试
剂盒，并拟应用于临床，以推动KIM-1在临床的广泛应用，提高对肾脏疾病的
防治能力，可以快速，灵敏检测特定蛋白，避免了复杂的操作，无需特殊检
测仪器，结果易于观察判断，可以适应多种检测环境，以及多种检测需要。
并且检测结果可以长期保存，便于对照分析。可用于肉眼水平的免疫检测，
样本用量极小，对操作者无毒性，对环境无污染等。因此应用胶体金技术
研制KIM-1检测试剂盒具有重大的社会意义和广阔的市场前景。
图1. KIM-l检测装置示意图;
l.样品垫；2.金标垫；3.硝酸纤维素膜；4.吸收垫；5.检测线；6.质控线。
图2. KIM-1试剂盒检测结果判定。图3为胶体金颗粒的制备流程图； 图4为免疫胶体金的纯化流程图。
具体实施例方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明， 在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技 术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例l
根据图1所示，KIM-1检测试剂盒由经过处理的样品垫1、金标垫2、 硝酸纤维素膜3、检测线5、质控线6和吸收垫4组成，其中，金标垫2包 被有纯化的KIM-1抗体胶体金偶联标记物，检测线5包被有纯化的KIM-1 抗体，质控线6包被有正常抗小鼠IgG抗体，质控线6侧贴有吸收垫4。
实施例2
1、 胶体金颗粒的制备取1%氯金酸溶液1 ml加99 ml超纯水成终浓 度0. 01%的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1%柠檬酸三钠1. 6 ml —次性迅速 加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为 亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积(见流 程图)。在透射电镜下观察，可见金颗粒大小基本一致，分布均匀。测量 100个胶体金颗粒直径，计算平均直径约20nm。
胶体金颗粒的制备流程图见图3.
2、 免疫胶体金复合物的制备目测法确定胶体金与KIM-l抗体用量比 例。用0. 1 mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH至8. 2，取11支洁净 试管，每管分装胶体金溶液(l ml/管)。将KIM-1抗体逐级稀释后(由0.5 P g 5g另设对照管)，顺序加入一系列装有1 ml胶体金的试管中混匀；5min 后，在2 11管内分别加入10%氯化钠溶液0. lml，混匀，室温静置2 h以上观察结果；1号管既不加抗体也不加氯化钠溶液，为对照管；未加抗体的
ll号管也为对照(见表l);未加抗体及加入量不足以稳定胶体金的试管，
即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入量达到或超过最低稳定量的试管则保
持胶体金的红色不变。以此使胶体金红色不变而抗体含量最低试管的蛋白
量，即为稳定l ml胶体金的必需蛋白量，也即最低稳定量。在胶体金标记
KIM-1抗体最低稳定量的基础上再加上10%即为稳定胶体金所需KIM-1抗
体的实际所需用量，根据用以标记的胶体金的总量计算出所需要的KIM-1
抗体的总量。在电磁搅拌下，将标准KIM-1抗体溶液加入胶体金溶液中，
加入KIM-1抗体时应逐滴加入，lmg的KIM-1抗体大约5min加完；在磁性
搅拌下加入终浓度为17。的牛血清白蛋白(BSA)。
表1确定胶体金与KIM-1抗体用量比例 1号管 2-IO号管 11号管
~胶体金溶液i mit ; ;~~
KIM-1抗体 + + -
5min
10%氯化钠溶液0. lml - + +
2h
3、 免疫胶体金的纯化采用低温超速离心法纯化金标KIM-1抗体，以 除去溶液中未标记的KIM-1抗体和未充分标记的胶体金以及在标记过程中 可能形成的各种聚合物。先将金标KIM-1抗体在4-C下，3000r/min低速离 心40min，小心吸取上清液，弃去沉淀；上清再以10000r/min 4。C离心40min， 弃去上清。用0.01mol/L、 pH7.4的PBS(内含l"7。BSA， 0.02%叠氮钠)溶解 沉淀至原体积，充分稳定后过夜。再以4。C10000r/min离心40min，弃上清 液。用0.01mol/L、 pH7.4的PBS(内含1 %BSA， 0. 02%叠氮钠)溶解沉淀至 原体积的1/10， 4'C贮存备用(见流程图)。
免疫胶体金的纯化流程图见图4.
4、 金标垫(结合释放垫)的制备将胶体金标记KIM-1抗体作1: 5，1: 10， 1: 50， 1: 100， 1: 500， 1: 1000稀释后，均匀等量浸于同样大小 的玻璃纤维素膜制成金标垫。达到试纸条敏感度要求的最适胶体金复合物 的稀释度，为工作浓度。保存液稀释胶体金标记KIM-1抗体原液至工作浓 度，均匀浸于玻璃纤维素膜，冷冻真空干燥后密封保存。
5、 固相硝酸纤维素膜的制备硝酸纤维素膜的实验反应区，定义为检 测带，将KIM-1抗体以直线形包被于检测带，距离检测带5mm远的质控带 (C)以直线形包被正常抗小鼠IgG抗体。37'C干燥2 h， 4'C密封保存。
6、 样品垫的处理W的BSA作为封闭蛋白质均匀浸于玻璃纤维素膜， 室温干燥备用。
7、 吸收垫用硬质吸水滤纸制备。
8、 材料组装在塑料底板上分别将吸尿用玻璃纤维、冻干金标记抗 KIM-1玻璃纤维、已固定有抗KIM-1抗体和抗小鼠IgG抗体的硝酸纤维素膜 及硬质吸水滤纸按图1装配，配件与塑料底板的结合可用双面胶或其它粘 性材料粘接。装配好的纸板按纵向剪切，裁成宽度为4mm的条状即可。
实施例3试纸使用方法
(1) 样品制备
尿液:用尿液直接进行测试,如浑浊先离心取上清液或蒸馏水1:1稀释；
(2) 操作取尿标本约0.5ml加入小试管中，然后将样品垫l端插入 试纸条，注意不要超过样品垫1，待1分钟左右取出平放，5分钟读取结果。
(3) 检测结果参见图2，
出现l条红色(对照)沉淀线(质控线6)，为尿检诊断阴性；
出现2条红色(样品和对照)沉淀线(检测线5，质控线6)，为尿检诊 断阳性，未出现沉淀线则为无效。
权利要求
1、一种KIM-1检测试剂盒，在硝酸纤维素膜(3)的两端分别设有金标垫(2)和吸收垫(4)，金标垫(2)上端为样品垫(1)，其特征在于金标垫(2)包被有纯化的KIM-1抗体胶体金偶联标记物，检测线(5)包被有纯化的KIM-1抗体，质控线(6)包被有正常抗小鼠IgG抗体，质控线(6)侧贴有吸收垫(4)。
2、 权利要求1所述KIM-1检测试剂盒制备方法，包括下述步骤: 将纯化的KIM-1抗体用胶体金标记，喷点于玻璃纤维膜(3)上制备 成金标垫(2)，将纯化的KIM-1抗体和正常抗小鼠IgG抗体分别包 被在硝酸纤维素膜(3)上的检测线(5)处和质控线(6)处，当被 检样品中含有KIM-1抗原时，则于金标垫(2)与胶体金标记的KIM-1 抗体结合，并在吸收垫(4)的作用下，向前渗透泳动，与检测线(5) 上的KIM-1抗体再次结合，出现肉眼可见的色带。
全文摘要
本发明提供一种KIM-1检测试剂盒，在硝酸纤维素膜的两端分别设有金标垫和吸收垫，金标垫上端为样品垫，金标垫包被有纯化的KIM-1抗体胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的KIM-1抗体，质控线包被有正常抗小鼠IgG抗体，质控线侧贴有吸收垫。应用免疫胶体金技术制备KIM-1检测试剂盒，并拟应用于临床，以推动KIM-1在临床的广泛应用，提高对肾脏疾病的防治能力，可以快速，灵敏检测特定蛋白，避免了复杂的操作，无需特殊检测仪器，结果易于观察判断，可以适应多种检测环境，以及多种检测需要。并且检测结果可以长期保存，便于对照分析。可用于肉眼水平的免疫检测，样本用量极小，对操作者无毒性，对环境无污染等。
文档编号G01N33/558GK101419235SQ20081005120
公开日2009年4月29日 申请日期2008年9月24日 优先权日2008年9月24日
发明者于晓艳, 任立群, 波 孙, 才 李, 李相军, 杜玉君, 丹 王, 艳 石, 苗春生 申请人:吉林大学