专利名称：一种固相dna芯片杂交液及杂交方法
技术领域：
本发明涉及一种固相DNA芯片杂交液及简易杂交方法。
背景技术：
随着人类基因组(测序)计划(Human genome project)的逐步实施以及分子生 物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据 正在以前所未有的速度迅速增长。基因芯片(又称DNA芯片、生物芯片)技术就是顺应这 一科学发展要求的产物，它的出现为解决此类问题提供了光辉的前景。基因芯片技术已经 越来越多的应用于基因诊断、分析、以及基因治疗等方面。该技术系指将大量(通常每平方 厘米点阵密度高于400)探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检 测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。目前已有多种方法 可以将寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。这些方法总体上有两种，即合成点样与原位 合成(in situ synthesis)两种。支持物有多种如玻璃片、硅片等但需经特殊处理。作点 样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷 或多聚赖氨酸等。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基(视 所要固定的分子为核酸或寡肽而定)并与保护基建立共价连接。也有一些探针被固定到一 些微球上，并且在溶液中实现芯片杂交，这种芯片一般叫做液相芯片。基因芯片主要包括四个基本要点芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子反应和 信号的检测。其中生物分子反应，芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。杂 交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。通过选择合 适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中(如杂交温度，杂交时间，杂交液的组成 成分等)，减少生物分子之间的错配比率。寡核苷酸探针与靶分子之间进行生物分子反应一般需要用到杂交液，.Sambrook, E. F. Fritsch,T. Maniatis,Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ed. 2nd, 1989, vol. 1-3，据文献报道探针的长度， 杂交温度，以及其他一些因素都会影响到杂交效果的好坏。如果杂交过程在低于DNA分子 的熔解温度(Tm值)的5-10°C进行时，能够有效的减少错配或非Watson/Crick碱基配对， 加大Watson/Crick碱基配对的正确率。杂交液通常情况下都包括一种盐(含单价阳离子的盐)，金属离子螯合剂如EDTA、 以及防止非特异性杂交的封闭剂。含单价阳离子的盐，如SSPE、SSC能使杂交缓冲液的PH 维持在6. 8-8. 5之间。SDS为表面活性剂，鲑鱼精DNA和脱脂奶粉均可去除背景信号。一 般情况下杂交缓冲液包含6XSSPE(0. 9M NaCl，60mM磷酸盐(pH 7.4) ；6mM EDTA)；或者 6X SSC(0. 9M NaCl，90mM 柠檬酸钠(pH 7. 0)) ,0. 5% w/v sodium dodecyl sulfate (SDS)； 100 μ g/ml鲑鱼精DNA，0. 1 %的脱脂奶粉，去除背景信号。基因芯片杂交温度和时间取决于探针的组成(探针的长度及探针中所包含不同 碱基的含量)以及目标分子的复杂度，杂交温度一般在20°C到70°C之间，杂交时间一般在2h到2d之间。低的杂交温度在20°C到50°C之间(一般情况下在37°C -45°C范围内)，高 的杂交温度在50°C到70°C之间(一般情况下在60°C-65°C范围内)。高的杂交温度可以 提高Watson/Crick碱基的配对几率，低的杂交温度只能通过延长杂交时间来提高Watson/ Crick碱基配对几率。低的杂交温度杂交时一般需要过夜杂交或者更长的时间(8h-24h)。 杂交温度低经常会出现杂交信号不好，背景信号高，杂交结果有斑点等，这就影响了芯片的 品质。这个问题需要通过提高杂交温度和缩短杂交时间来解决。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够以较低成本，简单、快速的实现固相DNA芯片杂交 的杂交液及采用此杂交液进行杂交的方法。为了达到上述目的，本发明人经过大量不同类型芯片的杂交试验得到杂交液成分 及采用此杂交液进行杂交的优选方法。本发明的技术方案如下一种固相DNA芯片杂交液，其特征在于它是由NaCl，Na-MES，EDTA, SDS原料组成； 其 NaCl 717mM, Na-MES 400mM, EDTA 100 μ Μ, SDS 0. 2% (w/v)。本发明采用所述固相DNA芯片杂交液进行杂交的方法，按如下的步骤进行2)当PCR扩增产物用荧光素进行单链标记时，PCR标记产物于65°C烘干；2)用预热的去离子水回溶标记产物，再加入预热好的杂交液，充分混勻；3)混合液加入孵育室，孵育温度为探针Tm-10°C，并封闭好杂交仓，放入水浴锅 内，温度控制在50°C -60°C，杂交时间2-6小时；其中杂交时去离子水和杂交液以体积比为 1 1混合溶解产物。本发明对于在PCR扩增的同时进行标记的杂交方法1)当在PCR扩增的同时进行标记时，PCR产物在95°C充分退火；2)退火后的PCR产物迅速放到冰上，放置lOmin，使其淬灭；3)取淬灭后的PCR产物与去离子水和已充分预热的杂交液混合；其中杂交时去离 子水和杂交液以体积比为11混合溶解产物；4)混合液加入孵育室，封闭好杂交仓，水浴杂交。本发明所涉及杂交液具体的为杂交液包含717mM NaCl,400mM Na-MES(吗啉乙磺 酸钠盐)，100 μ M EDTA，0. 2% (w/v) SDS (十二烷基磺酸钠)。杂交液保存温度为-20°C也可 以存放于4°C。本杂交液为2X杂交液，使用时要用去离子水1 1稀释。杂交液和去离子 水回溶PCR产物前应放于65°C充分预热。具体的杂交方法为1、在第一次PCR扩增产物基础上用荧光素进行单链标记时的杂交方法1)PCR标记产物于65°C烘干。2)用10 μ 1预热的去离子水回溶标记产物，再向其中加入10 μ 1预热好的杂交液， 充分混勻。3)混合液加入孵育小室并封闭好杂交仓，放入水浴锅内。步骤3)所述混合液放入水浴锅中孵育，孵育温度为探针Tm-10°C，一般在55°C到 70°C之间最为适宜，杂交温度过高会引起PCR产物蒸干影响杂交结果，杂交温度过低会降 低Watson/Crick碱基配对几率引起错配。杂交时间一般控制在2_6小时即可。2、在PCR扩增的同时进行标记时的杂交方法
1)PCR产物在95°C充分退火。2)退火后的PCR产物迅速放到冰上，放置lOmin，使其淬灭。3)取适量的淬灭后的PCR产物与合适量的去离子水和10 μ 1已充分预热的杂交液
混合ο4)混合液加入孵育室，封闭好杂交仓，放入水浴锅水浴杂交。本发明的固相DNA芯片杂交的杂交液与现有使用的杂交液相比所具有的积极效 果在于(1)本杂交液配方简单，降低了生产成本且易保存。(2)本发明的方法简便易行，可以提高杂交温度，有效地缩短杂交时间。通过使用 本杂交液可以很好的控制杂交时产生的背景值，提高杂交信号，减小背景值对信号值所产 生的干扰，优化杂交效果。(3)本杂交液的杂交效果与使用商品化的杂交液的杂交效果对比实验说明利用 本杂交液与商品化杂交液对侵袭性真菌基因芯片，水产品特异基因芯片，奶粉基因芯片及 水产品间区基因芯片进行杂交得到如图5的杂交对比图。可以看出在缩短杂交时间的同 时，芯片杂交信号有所增强，背景杂点有所减少。
图1为侵袭性真菌基因芯片在不同温度梯度下杂交结果图，其中图IA-D分别为 55°C、57°C、59°C、61°C。图2为侵袭性真菌基因芯片在不同时间梯度下杂交结果图，其中图2A-D分别为 2h、4h、6h、8h。图3A-L为杂交液稳定性及保存条件试验杂交结果图，其中A-F中杂交液保存于 4°C，时间依次为一个月到六个月，G-L中杂交液保存于-20°C，时间依次为一个月到六个月。图4A为侵袭性真菌基因芯片杂交效果图。图4B为利用ITS序列检测水产品中主要致病菌基因芯片杂交效果图。图4C为利用特异基因检测水产品中主要致病菌基因芯片杂交效果图。图4D为奶粉基因芯片杂交效果图。图4E为致泻性大肠杆菌基因芯片杂交效果图。图5A-D为使用本杂交液的杂交效果与使用商品化的杂交液的杂交效果对比实 验，其中图Al、Bi、Cl、Dl为本杂交液杂交效果图，图A2、B2、C2、D2为商品化杂交液杂交效果图。
具体实施例方式下面通过最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。以下实施例仅仅是用于说明 而不是限制本发明，其中所用原料均有市售。实施例1杂交液的组成NaCl717mM,Na-MES 400mM,EDTA 100 μ Μ, SDS 0. 2% (w/v)。杂交 液的杂交方法
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1)当PCR扩增产物用荧光素进行单链标记时，PCR标记产物于65°C烘干；2)用10 μ 1预热的去离子水回溶标记产物，再加入10 μ 1预热好的杂交液，充分混 勻；3)混合液加入孵育室，杂交温度温度为探针Tm-10°C，并封闭好杂交仓，放入水浴 锅内；温度控制在50°C，杂交时间6小时。本发明所述的杂交液为2X杂交液，使用时要用去离子水1 1稀释。其中杂交 液和去离子水回溶PCR产物前应放于65°C充分预热。杂交液保存温度为4°C或-20°C。实施例2杂交液的组成:NaCl717mM, Na-MES 400mM, EDTA 100 μ Μ, SDS 0. 2% (w/v)。杂交液的杂交方法1)当PCR扩增产物用荧光素进行单链标记时，PCR标记产物于65°C烘干；2)用10 μ 1预热的去离子水回溶标记产物，再加入10 μ 1预热好的杂交液，充分混 勻；3)混合液加入孵育室，杂交温度为探针Tm-10°C，并封闭好杂交仓，放入水浴锅 内；温度控制在60°C，杂交时间4小时。本发明所述的杂交液为2X杂交液，使用时要用去离子水1 1稀释。其中杂交 液和去离子水回溶PCR产物前应放于65°C充分预热。实施例3杂交液的组成:NaCl717mM, Na-MES 400mM, EDTA 100 μ Μ, SDS 0. 2% (w/v)。杂交液的杂交方法1)当在PCR扩增的同时进行标记时PCR产物在95°C充分退火；2)退火后的PCR产物迅速放到冰上，放置lOmin，使其淬灭；3)取淬灭后的PCR产物与10 μ 1去离子水和10 μ 1已充分预热的杂交液混合；4)混合液加入孵育室，封闭好杂交仓，水浴杂交。本发明所述的杂交液为2Χ杂交液，使用时要用去离子水1 1稀释，杂交液保存 温度为4°C或_20°C。实施例4杂交液的实际应用侵袭性真菌基因芯片杂交试验选取侵袭性真菌基因芯片中的克柔氏念珠菌作为试验对象。1)按照侵袭性真菌基因芯片所要求的PCR程序和PCR体系扩增靶基因片段。2)利用荧光素cy3-dUTP对第一步PCR产物进行标记。3)标记产物放于65°C烘干，之后用已经过预热的去离子水和杂交液各10μ 1回溶。4)将回溶后的产物加入孵育小室中，封闭好杂交仓，放入水浴锅即可。其中的杂交液组成:NaCl717mM, Na-MES 400mM, EDTA 100 μ Μ, SDS 0. 2% (w/v)。使用侵袭性真菌基因芯片中的克柔氏念珠菌作为对象来研究杂交液的最适杂交 温度和杂交时间。侵袭性真菌基因芯片中克柔氏念珠菌有五根探针，探针的Tm值均在65°C 左右。选取55°C、57°C、59°C、61°C四个温度梯度来验证不同温度对芯片杂交效果的影响。同时选取2h、4h、6h、8h来验证不同时间梯度对杂交效果的影响。通过实验发现在探针Tm值-10°C范围内杂交效果相差不大，所以选择较低的杂交 温度57V。因为当杂交温度超过60°C以后很容易将PCR产物蒸干影响杂交结果。杂交时 间选取了四个梯度，通过实验发现2h时已经可以产生较强的杂交信号，4-8小时杂交效果 相差不大。所以为了更好的实现杂交效果又要尽可能的缩短杂交时间，杂交时间一般选取 2-6小时即可。实施例5利用ITS序列检测水产品中主要致病菌基因芯片杂交试验在利用ITS序列检测水产品中主要致病菌基因芯片检测范围中选取金黄色葡萄 球菌作为试验对象，按照上述实施例3中所述杂交液的杂交方法来进行杂交，得到如图4B 的杂交效果图。本芯片杂交温度为57°C，杂交时间为6h。实施例6利用特异基因检测水产品中主要病原微生物基因芯片杂交试验在利用特异基因检测水产品中主要致病菌基因芯片检测范围中选取志贺氏菌作 为试验对象，按照上述实施例3中所述杂交液的杂交方法来进行杂交，得到如图4C的杂交 效果图。本芯片杂交温度为56°C，杂交时间为5h。实施例7奶粉基因芯片杂交试验在奶粉基因芯片检测范围中选取蜡样芽胞杆菌作为实验对象，按照上述实施例 3中所述杂交液的杂交方法来进行杂交，得到如图4D的杂交效果图。本芯片杂交温度为 57°C，杂交时间为6h。实施例8致泻性大肠基因芯片杂交试验在致泻性大肠基因芯片检测范围中选择侵袭性大肠杆菌EIEC作为检测对象。1)按照致泻性大肠杆菌基因芯片所要求的PCR程序和PCR体系对本实验所选取的 靶基因进行扩增。2) PCR 产物在 95 °C 变性。3)变性后的PCR产物迅速放入碎冰中使PCR产物淬火。4)取2μ1 PCR产物与8μ 1去离子水和10μ 1杂交液混勻，将回溶后的产物加 入孵育小室中，封闭好杂交仓，放入水浴锅即可。图4Ε为杂交效果图，本芯片杂交温度为 60°C，杂交时间1. 5h。
权利要求
一种固相DNA芯片杂交液，其特征在于它是由NaCl，Na MES，EDTA，SDS原料组成；其NaCl 717mM，Na MES 400mM，EDTA 100μM，SDS 0.2％(w/v)。
2.一种采用权利要求1所述固相DNA芯片杂交液进行杂交的方法，其特征在于按如下 的步骤进行1)当PCR扩增产物用荧光素进行单链标记时，PCR标记产物于65°C烘干；2)用预热的去离子水回溶标记产物，再加入预热好的杂交液，充分混勻；3)混合液加入孵育室，孵育温度为探针Tm-IOV，并封闭好杂交仓，放入水浴锅内，温 度控制在50°C-60°C，杂交时间2-6小时；其中杂交时去离子水和杂交液以体积比为1 1 混合溶解产物。
3.一种采用权利要求1所述固相DNA芯片杂交液进行杂交的方法，其特征在于按如下 的步骤进行1)当在PCR扩增的同时进行标记时，PCR产物在95°C充分退火；2)退火后的PCR产物迅速放到冰上，放置lOmin，使其淬灭；3)取淬灭后的PCR产物与去离子水和已充分预热的杂交液混合；其中杂交时去离子水 和杂交液以体积比为11混合溶解产物；4)混合液加入孵育室，封闭好杂交仓，水浴杂交。
4.权利要求3所述的杂交方法，其中的杂交液为2X杂交液，使用时要用去离子水 1 1稀释。
5.权利要求2所述的杂交方法，其中杂交液和去离子水回溶PCR产物前应放于65°C充 分预热。
全文摘要
本发明涉及一种固相DNA芯片杂交液及杂交方法。它是由NaCl，Na-MES，EDTA，SDS原料组成；其NaCl 717mm，Na-MES 400mm，EDTA 100μm，SDS 0.2％(w/v)本杂交液主要成分包括NaCl，Na-MES，EDTA，SDS。杂交时只需将标记的PCR产物烘干，用已预热好的杂交液与去离子水1∶1混合溶解，然后将其加入孵育室孵育即可。本发明的方法简便易行，可以提高杂交温度，有效地缩短杂交时间。通过使用本杂交液可以很好的控制杂交时产生的背景值，提高杂交信号，减小背景值对信号值所产生的干扰，优化杂交效果。
文档编号C12Q1/68GK101948922SQ20101028798
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者冯露, 张恋心, 曹勃阳, 李荣荣, 杨磊, 王磊 申请人:天津生物芯片技术有限责任公司