专利名称：甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶促化学发光底物，特别是涉及一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物 系统。
背景技术：
近年来随着分子生物学，基础免疫学和免疫化学等学科的进展以及应用现代高新技术 建立的仪器分析日趋发展，免疫标记技术也不断完善和更新；放射免疫，酶联免疫技术已 逐步被免疫发光技术所取代。现今，酶促底物发光技术已成为推广及应用最快的免疫分析 方法。酶促底物发光技术是将酶联免疫方法中的显色底物更换为发光底物，与相应的酶发 生氧化还原反应，产生光量子；通过计数光量子来确定待检测物质的量。用于酶促发光法 中的首选标记物即辣根过氧化物酶(HRP)，均以鲁米诺(Luminol)类物质作为发光底物， 但必需加入增强剂(液)及催化剂等多种成分以解决光信号弱，灵敏度底和量程短的问题， 经查阅国内，外文献后发现，大多数研究者都是在增强剂上进行改进以提高技术水平，少 有对发光底物系统，尤其对不需要增强剂的底物系统进行研究。酶促发光免疫检测技术中 关键试剂即发光底物，其原理是底物在特定条件下，经标记在抗原或抗体上的辣根过氧化 物酶(HRP)催化，发生氧化还原反应，产生光子，经化学发光仪测量光信号的强度，以标 准物发光信号的强度为纵坐标(Y轴)以标准物浓度为横坐标(X轴)得以检测被测物质的 含量。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种不需要增强剂就可以应用于化学发 光酶免疫测定技术中的甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统。 本发明的技术方案概述如下
一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由 0. 90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9. 6的0. 01M-0. 05 M碳酸盐缓 冲液组成，所述B试剂由pH为9. 6的0. 01M-0. 05 M碳酸盐缓冲液、0. 05mM- 0. lmM过氧 化脲和0. 15mM- 0. 30mM过氧苯酚组成。
优选的是:所述B试剂由pH为9. 6的0. 03 M碳酸盐缓冲液、0. 07rnM过氧化脲和0. 20mM 过氧苯酚组成。
本发明的优点是
1.检测范围广，本发明的甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统的发光强度在4 6个 量级之间与测定物质浓度间呈现良好的线性关系，在较广的检测范围内确保了高灵敏度， 完全能满足临床检测之需。2. 灵敏度高，本发明的底物系统具有高信号强度和低背景，且无需其它的信号增强剂。
3. 光信号持续时间长，该本发明的底物系统的光信号稳定时间可持续2.5小时，为临 床检测中的多次重复测量提供了可靠的保证。
4. 减少抗体用量2-3倍，极大的保证了应用本发明制备的试剂盒系列的低成本。
5. 分析方法简便快速。
6. 与现有的化学发光底物相比具有组成成份简单，价格低廉，制备方法简单。 将本发明的一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，应用于化学发光酶免疫测定技
术中，拟建立一系列新的临床检测试剂盒。
图l为不同辣根过氧化物酶(HRP)化学发光底物系统发光信号强度和持续时间比较。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 实施例1
一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由 0. 90rnM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9. 6的0. 03 M碳酸盐缓冲液组 成，所述B试剂由pH为 9. 6的0. 03 M碳酸盐缓冲液、0. 07mM过氧化脲和0. 20mM过氧 苯酚组成。
实施例2
一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由 0. 90rnM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9. 6的0. 01M碳酸盐缓冲液组 成，所述B试剂由pH为 9. 6的0. 01M碳酸盐缓冲液、0. 08rnM过氧化脲和0. 15rnM过氧苯 酚组成。
实施例3
一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由 0. 90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9. 6的0. 05 M碳酸盐缓冲液组 成，所述B试剂由pH为 9. 6的0. 05 M碳酸盐缓冲液、0. 05mM过氧化脲和0. 30mM过氧 苯酚组成。
实施例4
一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由 0. 90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9. 6的0. 03 M碳酸盐缓冲液组 成，所述B试剂由pH为9. 6的0. 03 M碳酸盐缓冲液、0. ImM过氧化脲和0. 20mM过氧苯 酚组成。
本发明所用的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺制备可以按本领域公知常识进 行制备，其中之一的方法是 (一)试剂 1甲醇
42镁带需要用6NHC处理镁带，或用砂纸打亮，称取2.5克 3碘片 4浓硫酸 5浓盐酸
6 1N氢氧化钠
7 N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺 (二)操作步骤
1、 无水甲醇的制备将镁带2.5克，碘片0.3克加入圆底烧瓶中，再加入30ml甲醇， 可见发生沸腾反应，Mg在I的引发下与水作用生成Methoxide (甲醇盐)。反应1小时后， 再加入700 ml甲醇，加热沸腾回流反应30分钟后，蒸馏，收集流出液即为无水甲醇。
2、 N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺的甲酯化采用蒸馏回流反应装置附加安全瓶将 N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺，无水甲醇，浓硫酸，浓盐酸及1N氢氧化钠分别以适当 的浓度加入到不同反应瓶中，经甲酯化反应后，在20。C-30。C下放置18-30小时，使N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺完全甲酯化，将产物减压抽干，加入5 ml无水甲醇再减压抽 干，再加入5 ml无水甲醇减压抽干，获得干粉即为甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁 米诺，在室温下可长期保存。
效果验证数据检测灵敏度0. lpg/ml信号持续时间2小时 抗血清稀释度可达1: 20万 保质期暂定9个月 保存条件室温
优点本公司所发明的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺作为酶发光底物与当前现
有的产品比较有下述优点
1灵敏度高
2不需要增强剂
3持续发光时间长
4低的背景信号
以上特点可通过图1显示。 图1中
0. 90 mM甲酯化H- (4-氨基丁酰)-H-乙基-异魯米诺发光信号 ~3—加入增强剂的l. H- (4-氨基丁酰〕-N-乙基-异鲁米诺发光信号 ^A—加入增强剂的0. 9mM H- (4-氨基丁醜)-H-乙基-异鲁米诺发光信号 +无增强剂的l. 5rnM H- (4-氨基丁翻)-H-乙基-异鲁米诺发光信号
1. 5mM N- (4-氨基丁酰)-H-乙基-异魯米诺背景信号 ~^~0.90 mM甲酯化H-(4-氨基丁酰)-H-乙基-异鲁米诺背景信号。
权利要求
1.一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，其特征是由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9.6的0.01M-0.05M碳酸盐缓冲液组成，所述B试剂由pH为9.6的0.01M-0.05M碳酸盐缓冲液、0.05mM-0.1mM过氧化脲和0.15mM-0.30mM过氧苯酚组成。
2. 根据权利要求l所述的一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，其特征是所述B 试剂由pH为9. 6的0. 03 M碳酸盐缓冲液、0. 07mM过氧化脲和0. 20mM过氧苯酚组成。
全文摘要
本发明公开了一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9.6的0.01M-0.05M碳酸盐缓冲液组成，所述B试剂由pH为9.6的0.01M-0.05M碳酸盐缓冲液、0.05mM-0.1mM过氧化脲和0.15mM-0.30mM过氧苯酚组成。本发明的甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统的发光强度在4～6个量级之间与测定物质浓度间呈现良好的线性关系，在较广的检测范围内确保了高灵敏度，完全能满足临床检测之需。
文档编号G01N21/76GK101526479SQ20081005236
公开日2009年9月9日 申请日期2008年3月4日 优先权日2008年3月4日
发明者徐嘉辙, 赵学勤 申请人:天津遄赫工贸有限公司