专利名称：一种三聚氰胺人工抗原的合成方法
技术领域：
一种三聚氰胺人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术：
三聚氰胺(Melamine， MM)简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰 胺、三聚酰胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料，主要用于生产三聚氰胺-甲 醛树脂，广泛用于塑料、涂料、皮革等行业。三聚氰胺在一般情况下较稳定， 但在高温时会分解释放出氰化物，因此，采用三聚氰胺制造的器具均需标明"不 可放进微波炉使用"。此外，三聚氰胺还可用作阻燃剂、粘合剂、甲醛清洁剂等。 通过水解作用，三聚氰胺可以转化为三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸三酰胺和三聚 氰酸。美国FDA研究表明，三聚氰胺与钙在体内尿pH维持下形成不溶解的复 合物，导致尿结石和膀胱癌，对人体造成巨大损害。由于目前在食品尤其是奶 制品中测定蛋白质含量主要是通过"凯氏定氮法"测出含氮量从而估算其蛋白 质含量，三聚氰胺分子含氮量高达66%左右，在奶品中添加三聚氰胺会增加其 蛋白质含量的测试值，且成本低廉，利润巨大，所以三聚氰胺常被不法商人用 作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，例如我国三鹿奶粉事件， 因此三聚氰胺也被人称为"蛋白精"，为此我国在2008年10月7日卫生部等 五部门联合发布公告，确定了三聚氰胺在乳与乳制品中的检测限量值。目前我 国对三聚氰胺检测有三种方法，即高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法 (GC-MS)和液相色谱-质谱法(LC-MS)，但这三种方法均需要昂贵的仪器设 备和专业技术人员，对检材要求较高，样品前处理和提纯过程费时费力，已不 能满足现代检测对方便、快速、准确的要求。近年来，国外己经开展了对三聚 氰胺免疫分析方法的研究，但国内尚没有此方面的报道，为弥补这一空白，有 必要制备三聚氰胺人工抗原。
发明内容
针对现有检测技术中存在的不足之处，本发明的目的是提供一种三聚氰胺 人工抗原的制备方法，所制备的产品可用于食品中三聚氰胺含量及免疫检测上， 具有检测快速、操作简便、成本低的优点，为今后的研究提供方便的途径。
本发明的技术方案 一种三聚氰胺人工抗原的制备方法，以三聚氰胺为半 抗原，利用其结构中原有的氨基，通过戊二醛使半抗原和牛血清蛋白发生结合， 制备三聚氰胺的人工抗原，即三聚氰胺-牛血清蛋白。其反应方程式为<formula>formula see original document page 4</formula>(BSA)
<formula>formula see original document page 4</formula> (人工抗原三聚氰胺-牛血清蛋白)
工艺步骤为
1、 人工抗原的制备
(1) 制备A液称取13mg的半抗原于25mL烧杯中，加入含质量浓度50% 甲醛的pH7.2的磷酸盐缓冲液4mL，在室温磁力搅拌下至充分溶解后，逐滴加 入质量浓度25°/。的戊二醛12mL，在室温磁力搅拌下反应3h，此液为A液；
磷酸盐缓冲液磷酸氢二钠10.9g，磷酸二氢钠3.2g，氯化钠90g加蒸馏水 至1000mL，调节pH至7.2，室温储存，用时稀释10倍即为工作液；
(2) 制备B液称取10mg的牛血清蛋白溶于pH9.6、 0.05mmol/L的碳酸 盐缓冲液2mL中，低温保存，此液为B液；
碳酸盐缓冲液称取碳酸钠1.08g，碳酸氢钠2.95g加蒸馏水至1000mL，调 节pH至9.6，室温保存；
(3) 在室温磁力搅拌下，将B液缓慢滴加到A液中，并在搅拌条件下继续 反应3h，期间分两次共加入2mL的磷酸盐缓冲液，即得到人工抗原混合液；
(4) 将人工抗原混合液移入透析袋中，用0.01mol/L、 pH7.2的磷酸盐缓冲 液透析3-4天，每天更换2次磷酸盐缓冲液；最后使用冻干法将透析袋中的液体 制成粉末，即得到人工抗原三聚氰胺-牛血清蛋白。
透析袋的预处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，然后将其放入 去离子水中分别煮两次，每次10分钟，再用60'C的去离子水冲洗3min，保存
在4t:去离子水中备用。
2、 三聚氰胺人工抗原的鉴定采用紫外分光光度法测定偶联比。 本发明的有益效果所制备的产品可用于食品中三聚氰胺含量及免疫检测
上，具有检测快速、操作简便、成本低的优点，合成步骤简洁，有效，完全可 用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对其研究的需要。
图l三聚氰胺人工抗原制备前后的紫外扫描图。
具体实施例方式
1. 人工抗原的制备
(1) 制备A液称取13mg的半抗原于25mL烧杯中，加入含质量浓度 50%甲醛的pH7.2的磷酸盐缓冲液4mL，在室温磁力搅拌下至充分溶解后，逐 滴加入质量浓度25%的戊二醛12mL，在室温磁力搅拌下反应3h，此液为A液。
磷酸盐缓冲液磷酸氢二钠10.9g，磷酸二氢钠3.2g，氯化钠90g加蒸馏水 至1000mL，调节pH至7.2，室温储存，用时稀释10倍即为工作液。
(2) 制备B液称取10mg的牛血清蛋白溶于pH9.6， 0.05mmol/L的碳酸 盐缓冲液2mL中，低温保存。此液为B液。
碳酸盐缓冲液称取碳酸钠1.08g，碳酸氢钠2.95g加蒸馏水至1000mL，调 节pH至9.6，室温保存。
(3) 在室温磁力搅拌下，将B液缓慢滴加到A液中，并在搅拌条件下继续 反应3h，期间分两次共加入2mL的磷酸盐缓冲液，即得到人工抗原混合液。
(4) 将人工抗原混合液移入透析袋中，用0.01mol/L， pH7.2的磷酸盐缓冲 液透析3-4天，每天更换2次磷酸盐缓冲液。使用冻干法将透析袋中的液体制成 粉末，即得到人工抗原三聚氰胺-牛血清蛋白。
透析袋的预处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，然后将其放入 去离子水中分别煮两次，每次10分钟，再用6(TC的去离子水冲洗3min，保存 在4'C去离子水中备用。
2、 三聚氰胺人工抗原的鉴定采用紫外分光光度法测定偶联比。 偶联比测定采用紫外分光光度法。如果半抗原结构中含有发色团，并且
与蛋白质连接后不影响发色团的结构，则可利用物质对光的吸收与其浓度呈比 例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度，在大分子与小分子偶联物中， 两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，根据吸收度加合性原理判断半抗原是 否和蛋白质偶联并计算偶联比。
摩尔吸收系数s:配制三聚氰胺浓度为O， 10， 20， 30吸mL"的甲醇溶液， 通过紫外扫描可知三聚氰胺的最大吸收波长为234nm，在234nm处测吸光值， 每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为s =吸光值/摩尔浓度。本实验计算 得￡=1015.61 L.mor1。
偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200吗'mL" 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，3(TC水浴 温热5min，每个浓度做平行样。在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光 值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得偶联物蛋白浓度 为1.38mg.ml/10
偶联比测定配制200 ^mL"牛血清蛋白的甲醇溶液，将偶联后产物用甲 醇稀释到200吸mL—1，在234nm处测吸光值，以甲醇溶液为空白，测出的吸光 值分别为A^ A2，则偶联比率Y为"[(^-^)/4t200xl0-3/66210)，本实验计 算得Y"27.9。
其中s为摩尔吸光系数(L.mor1), 66210为牛血清蛋白的分子量，200x10—3 为牛血清蛋白浓度(mgTnl/1)。
权利要求
1、一种三聚氰胺人工抗原的合成方法，其特征是以三聚氰胺为半抗原，利用其结构中原有的氨基，通过戊二醛使半抗原和牛血清蛋白发生结合，制备三聚氰胺的人工抗原，即三聚氰胺-牛血清蛋白；合成步骤为(1)制备A液称取13mg的半抗原于25mL烧杯中，加入含质量浓度50％甲醛的pH7.2的磷酸盐缓冲液4mL，在室温磁力搅拌下至充分溶解后，逐滴加入质量浓度25％的戊二醛12mL，在室温磁力搅拌下反应3h，此液为A液；(2)制备B液称取10mg的牛血清蛋白溶于pH 9.6、0.05mmol/L的碳酸盐缓冲液2mL中，低温保存，此液为B液；(3)在室温磁力搅拌下，将B液缓慢滴加到A液中，并在搅拌条件下继续反应3h，期间分两次共加入2mL的磷酸盐缓冲液，即得到人工抗原混合液；(4)将人工抗原混合液移入透析袋中，用0.01mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液透析3-4天，每天更换2次磷酸盐缓冲液；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原三聚氰胺-牛血清蛋白；(5)三聚氰胺人工抗原的鉴定采用紫外分光光度法测定偶联比。
全文摘要
一种三聚氰胺人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以三聚氰胺为半抗原，利用其结构中原有的氨基，通过戊二醛使半抗原和牛血清蛋白发生结合，制备三聚氰胺的人工抗原，即三聚氰胺-牛血清蛋白；所制备的产品可用于食品中三聚氰胺含量及免疫检测上，具有检测快速、操作简便、成本低的优点，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对其研究的需要。
文档编号G01N33/53GK101402683SQ200810234130
公开日2009年4月8日 申请日期2008年11月3日 优先权日2008年11月3日
发明者刘丽强, 孙凤霞, 尹丽梅, 彭池方, 徐丽广, 胥传来, 媛 袁, 谢会玲 申请人:江南大学