专利名称：细胞分析仪及细胞分析方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞分析仪及细胞分析方法。更详细地说，是涉及一种用激光照 射流经流动室的测定试样，利用该测定试样发出的光对测定试样中所含细胞进行分析的细 胞分析仪和细胞分析方法。
背景技术：
例如，国际公开第2006/103920号公报上曾经公布过，用激光照射含有待测细胞 的测定试样，并利用该测定试样发出的散射光和荧光测定各细胞大小和形状的流式细胞技 术法。在此流式细胞技术法中，用鞘液包裹着含待测细胞的测定试样，在鞘流室内形成细 流，使细胞排成一列通过。以此可以防止数个细胞同时通过鞘流室检测区。然而，细胞有时会在测定试样中凝集，一旦发生凝集细胞(数个细胞凝集而成)， 将很难正确得出测定试样中各细胞大小和形状等信息。因此，国际公开第2006/103920号公报上公布的分析仪，检测激光照射的测定试 样发出的前向散射光，用所得前向散射光信号波形的差分积分值和该信号波形的峰值之 比，判断信号波形是否存在波谷，判别凝集细胞和非凝集细胞(没有数个细胞凝集，仅作为 单一细胞存在)然而，从细胞中检出的前向散射光的信号波形高度会随细胞的凝集状态和细胞的 流动方向等发生变化，在前向散射光的信号波形中，其波峰和波谷的部分有时不甚清晰。因 此，在国际公开第2006/103920号公报上记述的分析仪在提高辨别凝集细胞和非凝集细胞 的精度上是有限的。
发明内容
本发明鉴于上述情况，提供一种能精确辨别凝集细胞和非凝集细胞的细胞分析仪 和细胞分析方法。本发明第一方面涉及的细胞分析仪是一种分析生物试样中所含待测细胞的细胞 分析装置，其特征之一是包括检测部件，让由生物试样和色素制备的测定试样流入流动 室，用激光照射流过该流动室的测定试样，检测该测定试样发出的荧光；信号处理部件，根 据此检测部件输出的荧光信号获取反映荧光信号波形高度的值和反映荧光信号波形棱线 长度的值；及分析部件，根据上述信号处理部件获取的上述反映荧光信号波形高度的值和 上述反映荧光信号波形棱线长度的值，辨别数个细胞凝集而成的凝集细胞和非凝集细胞。本发明第二方面涉及的细胞分析仪是一种分析生物试样所含待测细胞的细胞分 析装置，包括检测部件，让由生物试样和色素制备的测定试样流入流动室，用激光照射流 过该流动室的测定试样，检测该测定试样发出的荧光；信号处理部件，根据此检测部件输出 的荧光信号获取反映荧光信号波形高度的第一值、反映荧光信号波形棱线长度的第二值和 反映待测细胞核的DNA含量的第三值；及分析部件，根据上述信号处理部件获取的上述第 一值、上述第二值和上述第三值，从测定试样所含待测细胞中区分出异常细胞。
本发明第三方面涉及一种细胞分析方法，其特征在于该方法包括四个步骤第 一步骤，混合生物试样和色素，制备测定试样；第二步骤，使制备的测定试样流进流动室，激 光照射流经该流动室的测定试样，检测该测定试样发出的荧光；第三步骤，根据上述荧光生 成的荧光信号，获取反映荧光信号波形高度的值和反映荧光信号波形棱线长度的值；第四 步骤，根据上述反映荧光信号波形高度的值和上述反映荧光信号波形棱线长度的值，辨别 数个细胞凝集而成的凝集细胞和非凝集细胞。本发明第四方面涉及一种细胞分析方法，其特征在于该方法包括四个步骤第 一步骤，混合生物试样和色素，制备测定试样；第二步骤，使制备的测定试样流入流动室，激 光照射流经该流动室的测定试样，检测该测定试样发出的荧光；第三步骤，根据上述荧光生 成的荧光信号，获取反映荧光信号波形高度的第一值、反映荧光信号波形棱线长度的第二 值和反映待测细胞核DNA含量的第三值；第四步骤，根据上述第一值、上述第二值和上述第 三值，从测定试样所含待测细胞中区分出异常细胞。
图1为本发明的细胞分析仪一实施方式的斜视说明图；图2为图1所示细胞分析仪的结构框图；图3为构成系统控制装置的电脑的框图；图4为光学检测系统的结构图；图5为通过聚焦光斑的细胞的说明图；图6为以待测细胞荧光信号波形差分积分值除以峰值的商为纵坐标、以侧向散射 光信号的脉冲宽度为横坐标的散点图。图7为单一细胞的信号波形图。图8为2个细胞组成的凝集细胞的信号波形图。图9为3个细胞组成的凝集细胞的信号波形图。图10为以从测定试样获得的前向散射光信号峰值为纵坐标、前向散射光信号脉 冲宽度为横坐标的散点图。图11为系统控制装置CPU处理过程的流程图。图12为系统控制装置CPU进行细胞分析处理的流程图。图13为光学检测系统的侧视图。图14为光学检测系统的平面图。图15为以从测定试样获得的侧向荧光信号的脉冲面积为横坐标的直方图。图16为系统控制装置的CPU进行第二细胞分析处理的流程图。图17为系统控制装置的CPU进行第三细胞分析处理的流程图。图18为在测定试样流动方向上的光束形状的显示图。
具体实施例方式下面参照附图，详细说明本发明的细胞分析仪及细胞分析方法的实施方式。[细胞分析仪的整体结构]图1为本发明一实施方式涉及的细胞分析仪10的斜视说明图。此细胞分析仪10用于让含采自患者的细胞的测定试样流过流动室，激光照射流经此流动室的测定试样，检 测、分析测定试样发出的光(前向散射光、侧向荧光等)，以此判断上述细胞中是否含有癌 细胞和异型细胞。具体而言，细胞分析仪10用于用宫颈部位的上皮细胞筛查宫颈癌。细胞 分析仪10包括进行试样测定的仪器主体12、连接此仪器主体12并分析测定结果的系统控 制装置13。如图2所示，细胞分析仪10的仪器主体12包括用于从测定试样检测细胞及其核 大小等信息的光学检测系统3、信号处理电路4、测定控制系统16、电机、操作设备、电磁阀 等驱动设备17和各种传感器18。信号处理电路4包括对前置放大器(无图示)放大的光 学检测系统3的输出信号进行放大和滤波等处理的模拟信号处理电路、将模拟信号处理电 路输出的信号转换为数字信号的A/D转换器，以及对数字信号进行一定波形处理的数字信 号处理电路。测定控制系统16在处理传感器18的信号的同时，控制驱动设备17的动作， 以此进行测定试样的吸移和测定。当筛查宫颈癌时，可以使用对采自患者宫颈的细胞(上 皮细胞)进行离心(浓缩)、稀释(清洗)、搅拌(Tapping)和碘化丙啶(PI)染色等众所周 知的处理方式所制备的试样作为测定试样。将所制测定试样放入试管，放置在仪器主体12 的吸移管(无图示)下面，由该 吸移管吸移供给流动室。上述PI染色用含有色素的荧光染 色剂碘化丙啶(PI)进行。PI染色是有选择地对核染色，因此可以检测出核发出的荧光。[测定控制系统的结构]测定控制系统16包括微处理器20、存储器21、I/O控制器22、传感器信号处理电 路23、控制驱动设备的驱动电路24和外部通信控制器25等。存储器21由ROM、RAM等构 成，ROM中装有控制驱动设备17的控制程序和执行控制程序所需的数据。微处理器20可 将控制程序下载到RAM或直接从ROM执行。传感器18的信号通过传感器信号处理电路23和I/O控制器22传送到微处理器 20。微处理器20通过执行控制程序，可以按照传感器18的信号通过I/O控制器22和控制 驱动部件的驱动电路24控制驱动设备17。微处理器20处理过的数据和需要微处理器20处理的数据通过外部通信控制器25 与系统控制装置13等外部设备进行传输。[系统控制装置的结构]图3为系统控制装置13的框图。系统控制装置13由个人电脑等组成，主要由主 机27、显示器28和输入设备29构成。主机27主要由CPU27a、R0M27b、RAM27c、硬盘27d、 读取装置27e、输出输入接口 27f、图像输出接口 27g构成。以上这些均通过总线27h连接，
可互相通信。CPU27a可执行存储在R0M27b的计算机程序和读到RAM27c中的计算机程序。 R0M27b由掩模(Mask) ROM、PROM、EPR0M、EEPROM等构成，存储由CPU27a执行的计算机程序 及其所用数据等。RAM27c由SRAM和DRAM等构成。RAM27c用于读取存储在R0M27b和硬盘 27d的计算机程序。另外，它还可以作为CPU27a执行这些计算机程序时的工作空间。硬盘27d装有操作系统和应用程序等供CPU27a执行的各种计算机程序以及执行 计算机程序所需的数据。比如硬盘27d装有美国微软公司制售的windows (注册商标)等 提供图形用户界面的操作系统。硬盘27d还装有辨别凝集粒子和非凝集粒子的计算机程序 及其用于执行计算机程序的数据。
硬盘27d还装有操作程序，该程序负责传送细胞分析仪10向测定控制系统16下 达的测定指令(动作命令)，接受并处理仪器主体12测定的测定结果，显示处理的分析结果 等。此操作程序在上述操作系统上执行。读取装置27e由软驱、⑶-ROM驱动器或DVD-ROM驱动器等构成，可读取存储于便 携型存储介质的计算机程序或数据。输入输出接口 27f由比如USB、IEEE1394、RS-232C等 串行接口、SCSI、IDE、IEEE1284等并行接口以及由D/A转换器和A/D转换器等组成的模拟 信号接口构成。输入输出接口 27f连接由键盘和鼠标构成的输入设备29，用户可以用输入 设备29直接向电脑输入数据。另外，输入输出接口 27f与仪器主体12连接，可以与仪器主 体12相互传输数据等。图像输出接口 27g与由IXD或CRT等构成的显示器28连接，将与从CPU27a接收的 图像数据相应的映象信号输出到显示器28。显示器28按照输入的映像信号显示图像(画 面)°[光学检测系统的结构]图4为光学检测系统3的结构图。图中，透镜系列(光学系统)52将光源半导体 激光器53发出的激光聚焦于流经流动室51的测定试样，聚光镜54将测定试样中细胞发出 的前向散射光聚光于散射光检测器光电二极管55。为简单明了，上述透镜系列52仅图示 了单一的透镜，但更详细地如图13和图14所示，可以形成从半导体激光器53—侧起、由准 直镜52a、柱面透镜系列(平凸柱面透镜52b+双凹柱面透镜52c)和聚光镜系列(聚光镜 52d+聚光镜52e)构成的透镜群结构。如图13所示，从侧面看光学检测系统3，则半导体激光器53发出的放射状激光被 准直镜52a变为平行光，其径直通过平凸柱面透镜52b和双凹柱面透镜52c，由聚光镜52d 和聚光镜52e聚焦于流经流动室51的测定试样中的第一聚焦点A。另一方面，如图14所示，从上方俯瞰光学检测系统3，则半导体激光器53发出的放 射状激光被准直镜52a变为平行光，由平凸柱面透镜52b向与测定试样流动垂直的方向收 拢，并由双凹柱面透镜52c向与测定试样流动垂直的方向散射，由聚光镜52d和聚光镜52e 聚焦于流动室51后方的第二聚焦点B。通过这种透镜系列52，在第一聚焦点A的光束形状(从半导体激光器53 —侧看到 的光束形状)为向测定试样流动方向收缩，向测定试样流向垂直方向延伸的长椭圆形。具 体而言，一个顺流经流动室51的测定试样流向的直径为3 8μπκ垂直于测定试样流向的 直径为300 600 μ m的聚焦光斑，在顺测定试样流向通过的平面上形成其第一聚焦点A，并 照射在流经流动室51的测定试样上。关于透镜系列52不限定于上述结构，也可以适当变更。另一个聚光镜56将上述细胞和细胞核的侧向散射光和侧向荧光聚焦于分色镜 57。分色镜57将侧向散射光反射到散射光检测器光电倍增管58，让侧向荧光穿过荧光检测 器光电倍增管59。这些光反映测定试样中细胞及其核的特征。光电二极管55、光电倍增管 58和光电倍增管59将检测出的光转换为电信号，分别输出前向散射光信号(FSC)、侧向散 射光信号(SSC)和侧向荧光信号(SFL)。这些信号由无图示的前置放大器放大后，输送到前 述信号处理电路4 (参照图2)。
如图2所示，通过信号处理电路4进行滤波处理和A/D转换处理等信号处理所得的前向散射光数据(FSC)、侧向散射光数据(SSC)和侧向荧光数据(SFL)由微处理器20通 过外部通信控制器25输送至前述系统控制装置13。系统控制装置13根据前向散射光数据 (FSC)、侧向散射光数据(SSC)和侧向荧光数据(SFL)绘制用于分析细胞及其核的散点图和
直方图。 也可以用气体激光代替上述半导体激光作为光源，但从低成本、小型且低耗电的 观点来看，以采用半导体激光为宜，采用半导体激光不仅可以降低产品成本，还可以实现仪 器的小型化和省电。在本实施方式中使用的是有利于聚光的波长较短的蓝色半导体激光。 蓝色半导体激光对PI等的荧光励起波长也有效。也可以使用半导体激光中低成本、长寿 命、厂家稳定供货的红色半导体激光。本实施方式用上述透镜系列52(图4)等光学系统形成一定大小的聚焦光斑。具 体而言，在测定试样上形成略呈椭圆形的聚焦光斑，其顺测定试样在流动室51流向的直径 为3 8 μ m，垂直于测定试样流向的直径为300 600 μ m。图5为细胞通过聚焦光斑的说 明图，图中上下方向为测定试样流经流动室51的流动方向。在图5中，右侧的聚焦光斑是 用于检测血液中的红细胞和白细胞的普通仪器的聚焦光斑，左侧的聚焦光斑为本实施方式 的细胞分析仪的光学系统所形成的聚焦光斑。制图时聚焦光斑的长方向尺寸比与之垂直方 向(图中上下方向)的尺寸缩小了，但本实施方式实际的聚焦光斑截面形状非常细长。在本实施方式中，光电倍增管59检测流经流动室的测定试样发出的荧光，信号处 理电路4从光电倍增管59输出的荧光信号获取反映信号波形高度的值_荧光信号波形峰 值(PEAK)，同时获取信号波形的差分积分值(DIV)作为反映信号波形棱线长度的值。图 9(b)为图9(a)的细胞C3的信号波形显示图，纵坐标表示检出荧光的强度，横坐标表示光信 号的检出时间。如图9(b)所示，荧光信号波形(单点划线)的峰值(PEAK)表示检出荧光 的最大强度(图中的PEAK)，荧光信号波形的差分积分值(DIV)表示强度大于基线1 (Base Linel)的荧光信号波形的长度(点S 点T，点U 点V，点W 点X的波形长度合计)。系 统控制装置13通过外部通信控制器25接收包括荧光信号波形的差分积分值(DIV)和荧光 信号波形峰值(PEAK)在内的侧向荧光数据，将荧光信号波形的差分积分值(DIV)除以荧光 信号波形峰值(PEAK)所得商(DIV/PEAK)与一定阈值进行比较，辨别该细胞是凝集细胞还 是非凝集细胞。差分积分值是微分信号波形、将其绝对值加在一起所得的值，波形中没有波谷的 信号差分积分值几乎与其信号峰值的2倍值相同。另一方面，波形中有波谷的信号其差分 积分值大于该信号峰值2倍的值，波形中波谷越多，波谷越深，与峰值的2倍值之间的差也 越大。因此，系统控制装置13考虑到叠加在信号上的噪声等，将比“2”略大的值“2. 6” 作为辨别所测细胞是凝集细胞还是非凝集细胞的基准值、即上述“一定阈值”。另外，一定阈 值不限于2. 6，最好是2.2 3之间的值。荧光信号波形的差分积分值(DIV)除以荧光信号 波形峰值(PEAK)所得商(DIV/PEAK)大于一定阈值意味着荧光信号的波形中至少有一个波 谷，以此可以将待测细胞归类为数个细胞凝集而成的凝集细胞。图6为以待测细胞的荧光信号波形的差分积分值(DIV)除以峰值(PEAK)所得 商(DIV/PEAK)为纵坐标、以侧向散射光信号波形的脉冲宽度(SSCW)为横坐标的(DIV/ PEAK) -SSCW 散点图。
在图6中，分布在A所示区域内的细胞其纵坐标值(荧光信号波形的差分积分值 /峰值(DIV/PEAK))在约2 2. 6范围内，这些细胞是图7 (a)所示那种单一细胞(非凝集 细胞)Cl。图7(b)是细胞Cl的信号波形的显示图。如图7(b)所示，单一细胞时，信号波形 的峰值为一个，但与前向散射光的信号波形(实线)和侧向散射光的信号波形(虚线)相 比，荧光信号的波形(单点划线)波峰很分明。 在图6，分布在B所示区域内的细胞纵坐标值约在3. 5 4. 2范围内，这些细胞是 图8(a)所示那种2个细胞凝集而成的凝集细胞C2。在图6中，分布在C所示区域内的细胞 纵坐标值约在4. 5 7的范围内，这些细胞是图9 (a)所示那种3个细胞凝集而成的凝集细 胞C3。图8(b)是细胞C2的信号波形的显示图。从图8(b)和图9(b)可以看出，与前向散 射光的信号波形和侧向散射光的信号波形相比，荧光信号的波形中，波峰和波谷的部分都 很分明。如上所述，与前向散射光的信号波形和侧向散射光的信号波形相比，荧光信号的 波形其波峰和波谷的部分更分明，因此，可以精确地辨别是凝集细胞还是非凝集细胞。在本实施方式中，由于将在聚焦光斑处顺着测定试样流向的直径调为3 8μπι， 可以提高细胞核检测的S/N比。在本实施方式中，对细胞核实施PI染色，使用细胞核发出的 荧光信号，但是在PI染色中除细胞核以外，细胞膜也多少会被染色，残余的用于染色的染 料会流到流动室，从细胞核以外也会发出荧光。因此，作为荧光检测器的光电倍增管59 (图 4)可能检测出细胞核以外发出的作为噪声的荧光。然而，光学检测系统3的透镜系列52使 在聚焦光斑处顺着测定试样流向的直径缩小为3 8μπι，可以更明确地甄别细胞核发出的 荧光和细胞核以外发出的荧光。即，考虑细胞核的大小(5 7μπι)将聚焦光斑的直径缩小 为3 8μπι，以此减少噪声，使荧光信号脉冲的上升缘更尖锐，从而可以使波峰更加鲜明。要将聚焦光斑处的上述流向的直径缩小到小于3μπι，就要缩短透镜系列52的焦 距，激光在稳定区域(焦点深度)的强度就会变弱。图18为在测定试样流动方向上聚焦光 斑形状的显示图。如图18所示，焦点深度表示束径达到在聚焦光斑上的束径D的1. 1倍的 区域，束径越大，光的强度就越弱。焦点深度变浅，将不能使激光稳定地照射在20 100 μ m 大小的细胞核上。另一方面，在上述流向上的直径大于8 μ m，则检测出细胞核以外发出的噪 声荧光的比例会增大，从而荧光信号脉冲的上升缘变得平缓，荧光信号脉冲幅度的范围变 得模糊，使测定精度下降。并且，大量细胞核同时从聚焦光斑内通过的频度增加，从这一点 上也会造成测定精度下降。因此，最好考虑到上述焦点深度，来选定聚焦光斑处测定试样流 动方向上的直径。具体而言，最好形成的聚焦光斑使聚焦于测定试样流动方向上的激光焦 点深度为20 110 μ m。要稳定地向细胞核照射激光，以聚焦光斑的在上述流动方向上的直 径为3. 5 7. 5 μ m为宜，4 7 μ m更好。由于在聚焦光斑上垂直于测定试样流向的直径为300 600 μ m范围内，可以让宫 颈部位的全部上皮细胞(约60μπι)从激光光束的稳定区域(指设构成高斯分布的激光峰 值强度为1，则强度达到0.95以上的区域)通过。以此可以从细胞中获得稳定的散射光，可 以精确地测定细胞大小。因垂直于流向上的直径大于300 μ m，上述激光束的稳定区域变宽， 可以从细胞中获得稳定的散射光。另一方面，由于垂直于流向方向上的直径小于600 μ m，中 心附近的激光强度增强，可以获得稳定的散射光。要从细胞中获得稳定的散射光，最好垂直 于测定试样流向上的直径为350 550 μ m。
[异常细胞分类]细胞的癌化和畸变会加速细胞的分裂，致使DNA含量比正常细胞增多。因此可以 以此DNA含量为细胞癌化和畸变的指标。反映细胞核DNA含量的值可以用激光照射待测细 胞发出的荧光信号的脉冲面积(荧光量)(SFLI)来衡量。如图9(b)所示，荧光信号的脉冲 面积(荧光量)(SFLI)表示基线l(Base Line 1)和荧光信号波形之间围起来的部分的面 积。信号处理电路4从光电倍增管59输出的荧光信号获取荧光信号的脉冲面积(荧光量) (SFLI)作为反映待测细胞核的DNA含量的值。系统控制装置13判断此荧光量是否超过一 定阈值，如果超过一定阈值，则将该细胞归类于有异常DNA含量的癌化和畸变细胞。筛查宫颈癌中使用的样本大部分为正常细胞，因此，当以荧光信号的脉冲面积 (荧光量)为横坐标绘制图15所示直方图时，波峰出现在相当于正常细胞的位置。此波峰 位置的荧光量反映正常细胞的DNA含量，因此，系统控制装置13将显示出其2. 5倍以上荧 光量的细胞归类为异常细胞。可以想象，当2个以上细胞相互凝集通过激光的光束斑点时，光电倍增管59将检 出从多个细胞核发出的荧光，整体输出大面积的脉冲。然而，如前所述，本实施方式可以利 用荧光信号波形的差分积分值除以峰值的商(DIV/PEAK)精确地排除凝集细胞生成的数 据，从而可以提高异常细胞(癌化和畸变细胞)的划分精度。即可以防止误将因为凝集细 胞而被作为含有大量DNA的细胞检测出来归类于异常细胞。测定试样中有时除待测细胞以外还有粘液、血液残渣、细胞碎片等碎片。这些碎片 在测定试样中过多，则该碎片发出的荧光会作为噪声被检测出来，降低测定精度。此时，上 述碎片比待测细胞尺寸小，信号处理电路4会从光电二极管55输出的前向散射光信号获取 前向散射光信号波形的脉冲宽度(FSCW)和前向散射光信号波形的峰值(FSCP)作为反映含 待测细胞的粒子大小的数个参数。如图7(b)所示，前向散射光信号波形的峰值(FSCP)表 示检出的前向散射光的最大强度(图中的FSCP)。前向散射光信号波形的脉冲宽度(FSCW) 表示强度大于基线2 (Base Line 2)的前向散射光信号波形的宽度。系统控制装置13通过 外部通信控制器25从仪器主体12接收包括前向散射光信号波形的脉冲宽度(FSCW)和前 向散射光信号波形的峰值(FSCP)在内的前向散射光数据。然后，系统控制装置13使用前 向散射光信号波形的脉冲宽度(FSCW)和前向散射光信号波形的峰值(FSCP)绘制散点图， 根据散点图区分待测细胞和待测细胞以外的粒子(碎片)。图10为以前向散射光信号波形的脉冲宽度(FSCW)为横坐标、前向散射光信号波 形的峰值(FSCP)为纵坐标的FSCW-FSCP散点图。碎片比待测细胞尺寸小，故反映粒子大小 的前向散射光信号波形的峰值(FSCP)和前向散射光信号波形的脉冲宽度(FSCW)也分别比 待测细胞小。在图10中，分布在左下角的一群为碎片。因此，通过将G所示区域内的细胞 作为以后的分析目标，可以进一步提高辨别是否为异常细胞的精确度。[细胞分析方法]
下面就用细胞分析仪10(参照图1)对细胞分析方法的具体实施方式
进行说明。首先，使用者人工制备流入流动室的测定试样。具体而言，对从患者宫颈部位采集 的细胞(上皮细胞)进行离心(浓缩)、稀释(清洗)、搅拌(Tapping)和碘化丙啶(PI)染 色等众所周知的处理，制备测定试样。然后，使用者将制备的测定试样装入试管(无图示)， 将试管放到仪器主体的吸移管(无图示)下面。
下面，参照图11和图12说明系统控制装置13的处理流程。首先，接通系统控制装置13的电源，于是系统控制装置13的CPU27a对系统控制 装置13内的计算机程序进行初始化(步骤Si)。CPU27a判断是否收到了使用者的测定指 示(步骤S2)，如果收到测定指示，则通过I/O接口 27f向仪器主体12传送测定开始信号 (步骤S3)。若未收到测定指示，则CPU27a将处理移至步骤S6。
测定开始信号一传送到仪器主体12，在仪器主体12，装在试管中的测定试样便被 吸移管吸移到图4所示的流动室51中。流经流动室51的测定试样受到激光光束照射，测 定试样发出的前向散射光由光电二极管55检出，侧向散射光由光电倍增管58检出，侧向荧 光由光电倍增管59检出。然后，光学检测系统3输出的前向散射光信号(FSC)、侧向散射光信号(SSC)和荧 光信号(SFL)被输送到信号处理电路4，在信号处理电路4经过一定处理所获得的测定数据 通过外部通信控制器25传送至系统控制装置13。另一方面，系统控制装置13的CPU27a判断是否通过外部通信控制器25从仪器主 体12收到测定数据(前向散射光信号(FSC)、侧向散射光信号(SSC)和荧光信号(SFL))(步 骤S4)，如果收到测定数据，则在将该测定数据存入硬盘27d之后，进行细胞分析处理(步骤 S5)。如果未收到测定数据，CPU27a转到步骤S6进行处理。细胞分析处理结束后，CPU27a判断是否收到关机指示(步骤S6)，如果收到关机指 示则结束处理。如果未收到关机指示，则CPU27a返回步骤S2的处理。下面参照图12说明步骤S5的细胞分析处理。首先，CPU27a将从仪器主体12收到的前向散射光数据中前向散射光信号波形 的脉冲宽度(FSCW)和前向散射光信号波形的峰值(FSCP)从硬盘27d读取到RAM27c (步 骤S501)，以读取的脉冲宽度(FSCW)为横坐标，以峰值(FSCP)为纵坐标，绘制图10所示 FSCW-FSCP散点图(步骤S502)。然后，CPU27a将此散点图内G所示区域内的细胞作为以 后分析的目标。G所示区域外的粒子由此被作为待测细胞以外的碎片排除。接下来，CPU27a将待分析细胞的侧向荧光数据中荧光信号波形的差分积分值 (DIV)和荧光信号波形的峰值(PEAK)从硬盘27d读取到RAM27c，获取荧光信号波形的差分 积分值(DIV)除以荧光信号波形的峰值(PEAK)所得商(DIV/PEAK)，同时将待分析粒子的侧 向散射光数据中侧向散射光信号波形的脉冲宽度(SSCW)从硬盘27d读取到RAM27C (步骤 S503)。如图8(b)所示，侧向散射光信号波形的脉冲宽度(SSCW)表示强度大于基线3 (Base Line 3)的侧向散射光信号波形的宽度。CPU27a以荧光信号波形的差分积分值除以峰值的 商(DIV/PEAK)为纵坐标，以侧向散射光信号波形的脉冲宽度(SSCW)为横坐标，绘制图6所 示(DIV/PEAK)-SSCW 散点图(步骤 S504)。CPU27a将荧光信号波形的差分积分值(DIV)除以荧光信号波形的峰值(PEAK)的 商(DIV/PEAK)与阈值2. 6比较，判断分析目标细胞是凝集细胞还是非凝集细胞。在此，当 下列算式(1)成立时，该细胞为非凝集细胞，当算式(1)不成立时，该细胞为凝集细胞。DIV/PEAK ( 2. 6... (1)CPU27a对非凝集细胞和凝集细胞分别计数(步骤S505)。然后，CPU27a将待分析细胞的侧向荧光数据中反映待测细胞核DNA含量的值-表 示荧光信号脉冲面积的荧光量(SFLI)从硬盘27d读取到RAM27c (步骤S506)，该荧光量是反映待测细胞核DNA含量的值。CPU27a以荧光信号脉冲面积(荧光量)(SFLI)为横坐标， 绘制图15所示直方图(步骤S507)。在此直方图中波峰出现在相当于正常细胞的位置。CPU27a判断待分析细胞的荧光量(SFLI)是否超过图15所示直方图中波峰出现位 置的荧光量(SFLIP)的2. 5倍，即下列算式(2)是否成立。SFLI ≥ SFLIP · 2. 5... (2)在此，当式⑵成立时，CPU27a将该细胞归类于细胞核DNA含量异常的DNA含量 异常细胞，当式(2)不成立时，将该细胞归类于正常细胞。而且，CPU27a还对归类为DNA含 量异常细胞的细胞进行计数(步骤S508)。CPU27a从步骤S508获取的DNA含量异常细胞 的计数中减去在步骤S505获得的凝集细胞的计数，获取异常细胞数(步骤S509)。接下来，CPU27a计算出步骤S505获取的非凝集细胞数和步骤S509获取的异常细 胞数的比率，获取异常细胞比率(步骤S510)。此异常细胞比率是一个作为判断细胞分析仪 10分析的样本中是否存在一定数量以上的癌化和畸变细胞的指标数值。比如，当异常细胞 比率在1 %以上时，说明样本中有一定数量以上的癌化和畸变细胞，受检者由此可以知道自 己很可能受到癌症侵袭。CPU27a将步骤S510获取的异常细胞比率与在步骤S502绘制的FSCW-FSCP散点 图、在步骤S504绘制的(DIV/PEAK)-SSCW散点图以及在步骤S507绘制的直方图一起通过 图像输出接口 27g(图3)显示在系统控制装置13的显示器28上(参照图1)(步骤S511)。 CPU27a就是如上进行细胞分析处理的。此次公开的实施方式可以认为在所有方面均为例示，绝无限制性。本发明的范围 不受上述实施方式的说明所限，仅由权利要求书的范围所示，而且包括与权利要求范围具 有同样意思及权利要求范围内的所有变形。比如，本实施方式是判断采自受检者的样本中是否有一定数量以上的宫颈部位的 癌化和畸变细胞，但本发明的细胞分析仪不限于此，也可以用于判断采自受检者的样本中 是否有一定数量以上的口腔细胞、膀胱和咽喉等其他上皮细胞的癌化和畸变细胞、甚至脏 器的癌化和畸变细胞。又如，本实施方式在显示器上显示异常细胞比率，但本发明的细胞分析仪不限于 此，也可以在显示异常细胞比率的同时，显示受检者是否受癌症侵袭的文字表述。受检者可 以据此更容易地了解自己是否很可能已受到癌症侵袭。另外，本实施方式在获得凝集细胞数后，获取DNA含量异常细胞数，从DNA含量异 常细胞数减去凝集细胞数，求得异常细胞(癌化和畸变细胞)数，但本发明的实施方式不限 于此。图16为系统控制装置13的CPU27a进行第二细胞分析处理的流程图。下面参照图 16就第二细胞分析处理进行说明。在第二细胞分析处理中，CPU27a在步骤S5001 5004进行与图12所示细胞分析 处理步骤S501 504相同的处理。接着，CPU27a在步骤S5003对待分析细胞作出上述式(1)是否成立的判断，如果 式(1)成立，则该细胞作为非凝集细胞计数(步骤S5005)。然后，CPU27a将上述式(1)成立的非凝集细胞的荧光量(SFLI)从硬盘27d读到 RAM27c (步骤S5006)。CPU27a以荧光量(SFLI)为横坐标绘制直方图(步骤S5007)。CPU27a将在步骤S5007绘制的直方图中显示出荧光量超过波峰出现位置的荧光量(SFLIP) 2. 5倍的细胞划归为异常细胞(癌化和畸变细胞)，对该细胞进行计数(步骤 S5008)。CPU27a在步骤S5009进行与图12所示细胞分析处理的步骤S510相同的处理，获 取异常细胞比率。接着，CPU27a将步骤S5009获取的异常细胞比率与在步骤S5002绘制的 FSCff-FSCP散点图、在步骤S5004绘制的(DIV/PEAK) -SSCff散点图以及在步骤S5007绘制的 直方图一起通过图像输出接口 27g(图3)显示在系统控制装置13的显示器28上(参照图 1)(步骤S5010)。CPU27a就是如上进行第二细胞分析处理的。图17为系统控制装置13的CPU27a进行第三细胞分析处理的流程图。下面参照 图17就第三细胞分析处理进行说明。在第三细胞分析处理中，CPU27a在步骤S50001、50002进行与图12所示细胞分析 处理步骤S501、502相同的处理。CPU27a将步骤S50002获取的待分析细胞的侧向荧光数据中荧光信号波形的差分 积分值(DIV)、荧光信号波形的峰值(PEAK)和荧光信号的脉冲面积-荧光量(SFLI)从硬盘 27d读到RAM27C，求荧光信号波形的差分积分值(DIV)除以荧光信号波形的峰值(PEAK)所 得的商(DIV/PEAK)，同时，将待分析细胞的侧向散射光数据中侧向散射光信号波形的脉冲 宽度(SSCW)从硬盘27d读到RAM27c (步骤S50003)。CPU27a绘制以荧光信号波形的差分 积分值除以峰值的商(DIV/PEAK)为纵坐标、以侧向散射光信号波形的脉冲宽度(SSCW)为 横坐标的(DIV/PEAK)-SSCW散点图和以荧光信号脉冲面积(荧光量)(SFLI)为横坐标的直 方图(步骤S50004)。 CPU27a判断上述式(1)和式⑵是否都成立，当上述式(1)和式(2)都成立时，将 该细胞划归为异常细胞(癌化和畸变细胞)，并对该细胞计数(步骤S50005)。在本步骤的 处理中，CPU27a将仅式(1)成立的细胞作为非凝集细胞计数。CPU27a在步骤S50006进行与图12所示细胞分析处理的步骤S510同样的处理，获 取异常细胞比率。然后CPU27a将步骤S50006获取的异常细胞比率与在步骤S50002绘制的 FSCff-FSCP散点图、在步骤S50004绘制的(DIV/PEAK)-SSCW散点图以及直方图一起通过图 像输出接口 27g(图3)显示在系统控制装置13的显示器28上(参照图1)(步骤S50007)。 CPU27a就是如上进行第三细胞分析处理的。细胞分析仪10用可染色待测细胞核的色素制备测定试样，由检测部件检测该细 胞核发出的荧光。如前所述，从细胞发出的前向散射光信号波形中，根据细胞的凝集状态 和细胞的流动方向等，波形的峰谷部分有时不鲜明，但在荧光信号的波形中，峰谷部分很鲜 明，因此，利用此细胞核发出的荧光可以精确地判断是凝集细胞还是非凝集细胞。
权利要求
一种细胞分析仪，所述细胞分析仪是一种分析生物试样中所含待测细胞的细胞分析仪，包括检测部件，让由生物试样和色素制备的测定试样流入流动室，用激光照射流过所述流动室的所述测定试样，检测所述测定试样发出的荧光；信号处理部件，根据所述检测部件输出的荧光信号获取反映荧光信号波形高度的值和反映荧光信号波形的棱线长度的值；及分析部件，根据所述信号处理部件获取的所述反映荧光信号波形高度的值和所述反映荧光信号波形的棱线长度的值，辨别数个细胞凝集而成的凝集细胞和非凝集细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞分析仪，其特征在于所述信号处理部件获取荧光信号 波形的峰值作为所述反映荧光信号波形高度的值，获取荧光信号波形的差分积分值作为所 述反映荧光信号波形的棱线长度的值。
3.根据权利要求2所述的细胞分析仪，其特征在于所述分析部件将所述荧光信号波 形的差分积分值除以所述荧光信号波形的峰值所得商与一定阈值比较，以此辨别凝集细胞 和非凝集细胞。
4.根据权利要求1所述的细胞分析仪，其特征在于所述信号处理部件根据所述检测 部件输出的荧光信号获取反映非凝集细胞的细胞核DNA含量的荧光量；所述分析部件比较所述信号处理部件获取的所述荧光量和一定阈值，从所述测定试样 中所含待测细胞中分出异常细胞。
5.根据权利要求4所述的细胞分析仪，其特征在于所述待测细胞是宫颈部位细胞，所 述异常细胞是宫颈癌细胞。
6.根据权利要求1所述的细胞分析仪，其特征在于所述检测部件还检测所述测定试 样发出的散射光；所述信号处理部件根据所述检测部件输出的散射光信号，获取反映所述测定试样中含 待测细胞的粒子大小的数个参数；所述分析部件根据所述信号处理部件获取的所述数个参数，区分待测细胞和待测细胞 以外粒子，再辨别被判断为待测细胞的粒子是凝集细胞还是非凝集细胞。
7.根据权利要求1所述的细胞分析仪，其特征在于所述检测部件具有光学系统，能够 在流经所述流动室的所述测定试样上形成聚焦光斑，所述聚焦光斑顺着流经所述流动室的 测定试样流向的直径为3 8 μ m，垂直于所述测定试样流向的直径为300 600 μ m。
8.一种分析生物试样所含待测细胞的细胞分析仪，包括检测部件，让由生物试样和色素制备的测定试样流入流动室，用激光照射流过所述流 动室的所述测定试样，检测所述测定试样发出的荧光；信号处理部件，根据所述检测部件输出的荧光信号获取反映荧光信号波形高度的第一 值、反映荧光信号波形的棱线长度的第二值和反映待测细胞核的DNA含量的第三值；及分析部件，根据所述信号处理部件获取的所述第一值、所述第二值和所述第三值，从所 述测定试样所含待测细胞中分出异常细胞。
9.根据权利要求8所述的细胞分析仪，其特征在于所述分析部件将所述第二值除以 所述第一值所得的商小于第一阈值、所述第三值大于第二阈值的细胞归类为异常细胞。
10.一种细胞分析方法，包括第一步骤，混合生物试样和色素，制备测定试样；第二步骤，使制备的所述测定试样流入流动室，激光照射流经所述流动室的所述测定 试样，检测所述测定试样发出的荧光；第三步骤，根据所述荧光生成的荧光信号，获取反映荧光信号波形高度的值和反映荧 光信号波形的棱线长度的值；第四步骤，根据所述反映荧光信号波形高度的值和所述反映荧光信号波形的棱线长度 的值，辨别数个细胞凝集而成的凝集细胞和非凝集细胞。
11.根据权利要求10所述的细胞分析方法，其特征在于还包括第五步骤，根据所述第二步骤检出的所述荧光生成的荧光信号，获取反映非凝集细胞 核DNA含量的荧光量；第六步骤，比较所述荧光量和一定阈值，从所述测定试样所含待测细胞中分出异常细胞。
12.根据权利要求11所述的细胞分析方法，其特征在于所述待测细胞是宫颈部位细 胞，所述异常细胞是宫颈癌细胞。
13.一种细胞分析方法，包括第一步骤，混合生物试样和色素，制备测定试样；第二步骤，使制备的所述测定试样流入流动室，激光照射流经所述流动室的所述测定 试样，检测所述测定试样发出的荧光；第三步骤，根据所述荧光生成的荧光信号，获取反映荧光信号波形高度的第一值、反映 荧光信号波形的棱线长度的第二值和反映待测细胞核DNA含量的第三值；第四步骤，根据所述第一值、所述第二值和所述第三值，从所述测定试样所含待测细胞 中区分出异常细胞。
全文摘要
本发明提供一种能精确辨别凝集细胞和非凝集细胞的细胞分析仪。细胞分析仪(10)具有光学检测系统(3)，让由生物试样和色素制备的测定试样流入流动室(51)，用激光照射流过该流动室(51)的测定试样，检测该测定试样发出的荧光；信号处理电路(4)，根据此光学检测系统(3)输出的荧光信号，获取反映信号波形高度的值和反映信号波形棱线长度的值；及系统控制装置(13)，根据信号处理电路(4)获取的反映荧光信号波形高度的值和反映荧光信号波形棱线长度的值，辨别数个细胞凝集而成的凝集细胞和非凝集细胞。
文档编号G01N33/48GK101842688SQ20088011375
公开日2010年9月22日 申请日期2008年10月24日 优先权日2007年10月29日
发明者岸和希, 石坂正树, 福田正和 申请人:希森美康株式会社