专利名称：血球凝集素多肽和其相关试剂和方法
血球凝集素多肽和其相关试剂和方法
优先权的主张
本申请案根据35 USC 119(e)主张2006年8月14日申请的共同待决美国临时专利申请案第60/837,868号以及2006年8月14日申请的共同待决美国临时专利申请案第60/837,869号的优先权。这些现有申请案中每一者的完整内容是以引用的方式并入本文中。
政府支持
本发明是由美国国立综合医学研究所(National Institute of General MedicalSciences )依据合同号U54 GM62116和美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)依据合同号GM57073所授予的美国政府支持下进行。美国政府对本发明享有某些权利。
背景技术：
流感具有流行性、传染性、复发性和爆发性的长久历史。禽流感(包括H5N1菌株)是高度感染性且潜在致命病原体，但其现在仅具有有限感染人类的能力。然而，已在历史上观察发现禽流感病毒积聚改变其宿主特异性并使其易于感染人类的突变。实际上，上个世纪的主要流感流行病中的两者是源自于已改变遗传组成、从而允许人类感染的禽流感病毒。
对于当前H5N1、 H7N7、 H9N2和H2N2禽流感菌株可积聚改变其宿主特异性并使其易于感染人类的突变存在显著关注。因此，需要评估HA蛋白在此等菌株中实际上是否可以转化成可易于感染人类的形式，且进一步需要鉴别具有这种能力的HA变体。进一步需要理解通常允许或禁止不同受检者(尤其人类)感染的HA蛋白的特征。同时需:要用于有效地治疗或延迟由流感病毒所引起的疾病发作的疫苗和治疗策略。
发明内容
本发明提供具有特定聚糖结合特征的血球凝集素多肽。详细来说，本发明提供结合具有伞形拓扑的唾液酸化聚糖的血球凝集素多肽。在某些实施例中，本发明的HA多肽结合具有高亲和力和/或特异性的伞形聚糖。在一些实施例中，与锥形拓扑聚糖相比较，
本发明的HA多肽对伞形聚糖展示结合优选性。
本发明同时提供与包括疫苗的所提供血球凝集素多肽相关的诊断和治疗试剂和方法。
厲/,努全^ 游示范丝岸身必^W。磁i减疯毒济评教^库(http:〃www.ncbi,nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)获淳 卩》
,2; ft4褒^^^鍵/^^/#/^/。灰色结合唾液酸所涉及的保守氨基酸。红色
结合Neu5Aca2-3/6Gal基元所涉及的特定氨基酸。黄色影响Q226 ( 137、 138)和E190(186、 228)定位的氨基酸。绿色与连接到Neu5Acot2-3/6Gal基元的其它单糖(或修饰)结合所涉及的氨基酸。ASI30、 APR34、 ADU63、 ADS97和Viet04的序列是从其各自的晶体结构获得。其它序列是从SwissProt (http7Zus.expasv.org)获得。縮写ADA76，A/鸭/阿尔伯达(Alberta)/35/76 (H1N1); ASI30, A/猪/爱荷华(Iowa)/30 (H1N1); APR34,A/波多黎各(Puerto Rico) /8/34 (H1N1); ASC18， A/南卡罗来纳(South Carolina) /1/18(H1N1); AT91， A/得克萨斯(Texas) /36/91 (H1N1); ANY18， A/纽约(New York) /1/18(H1N1); ADU63， A/鸭/乌克兰(Ukraine) /1/63 (H3N8); AAI68， A/爱知(Aichi) /2/68(H3N2); AM99， A/莫斯科(Moscow) /10/99 (H3N2); ADS97, A/鸭/新加坡(Singapore)/3/97(H5N3); Viet04， A/越南(Vietnam) /1203/2004 (H5N1)。
说欲//7 ft4游保伊ff身特^"游,/^^/。
^4..说^沼ffi4游保宁f,身淳^"游,身怂者。房5:说^/Z5/M游保伊f^W錄,游,^/怂^。
^76, ^f潘,豕瀞受沐特弄丝游嚴架。(x2-3-和/或cc2-6-连接聚糖可采用不同拓扑。根据本发明，HA多肽结合某些所述拓扑的能力赋予其介导不同宿主(例如，人类)感染的能力。如本图中所说明，本发明指定两种尤其相关的拓扑"锥形"拓扑和"伞形"拓扑。ct2-3-和/或(x2-6-连接聚糖都可采用锥形拓扑，且锥形拓扑为连接到核心的短链寡糖或分枝寡糖所特有(但某些长链寡糖也可以采用这种拓扑)。仅a2-6-连接聚糖可以采用伞形拓扑(这可能归因于a2-6-键联中存在的额外C5-C6键所提供的构象多样性增加)，;且伞形拓扑主要是由长链寡糖或具有长链寡糖分枝、尤其含有Neu5Aca2-6Gal(31-3/4GlcNAc-基元的分枝聚糖采用。如本文中所述，HA多肽结合伞形;聚糖拓扑的能力赋予对人类受体的结合和/或介导人类感染的能力。
房7.* /M残基与薪形^伞彤豕,务//裙互伊屑游^梦。HA-聚糖共晶体的分析表明，Neu5Ac的位置相对于HA结合位点几乎无变化。与Neu5Ac的接触涉及诸如F98、S/T136、W153、 H183和L/I194等高度保守的残基。与其它糖的接触涉及不同残基，这取决于糖键联是cx2-3还是(x2-6以及聚糖拓扑为锥形还是伞形。举例来说，在锥形拓扑中，主要接触Neu5Ac和Gal糖。E190和Q226对于此结合起到特别重要的作用。本图还说明可参与结合锥形结构的其它位置(例如，137、 145、 186、 187、 193、 222)。在一些情况中，不同残基可引起与不同聚糖结构的不同接触。这些位置中的氨基酸的类型可影响HA多肽与在聚糖结构中具有不同修饰和/或分枝模式的受体结合的能力。在伞形拓扑中，与除Neu5Ac和Gal外的糖发生接触。本图说明可参与结合伞形结构的残基(例如，137、145、 156、 159、 186、 187、 189、 190、 192、 193、 196、 222、 225、 226)。在一些情况中，不同残基可引起与不同聚糖结构的不同接触。这些位置中的氨基酸的类型可影响HA多肽与在聚糖结构中具有不同修饰和/或分枝模式的受体结合的能力。在一些实施例中，190位的D残基和/或225位的D残基引起与伞形拓扑的结合。
厲S;示范丝麥形务//。本图说明采用锥形拓扑的某些示范性(但不详尽)聚糖结构。
厲9;示^丝伞麽/《//。本图说明采用伞形拓扑的某些示范性(但不详尽)聚糖结构。
yt类玄^,J:皮潘應,乂类薪羼J:座潘應游覆潜分恭。为进一步研究上呼吸道组织中的聚糖多样性，从HBE (代表性上呼吸道细胞系)分离N-连接聚糖并使用MALDI-MS分析。通过使用唾液酸酶S ((x2-3特异性)和唾液酸酶A (裂解和SA)预处理样本来证实ot2-6在HBE中的显著表达。通过代表性质峰(以蓝绿色突出)的TOF-TOF片段化分析来证实具有长链分枝拓扑的聚糖的显著表达。为提供上呼吸道组织中聚糖多样性的参考，获得人类结肠上皮细胞(HT29;代表性肠管细胞系)的N-连接聚糖分布。选择所述细胞系的原因是已展示当前H5N1病毒感染肠管细胞。唾液酸酶A和S预处理调控展示cx2-3聚糖(以红色突出)在HT-29细胞中的显著表达。此外，长链分枝聚糖拓扑并不如对HBE所观察到的情形般普遍。因此，H5N1HA的人类适应作用将涉及将能够实现在人类上呼吸道组织中表达的不同聚糖(例如伞形聚糖)的高亲和力结合的HA突变。
房7h嚴薪挖薪^台。(A)中展示数据挖掘平台的主要组件。特征是从提取自数据库的数据对象得到。将所述特征制备成分类方法中所使用的数据集以导出模式或规则。B展示使用户能将数据挖掘方法应用于聚糖阵列数据的关键软件模块。
曆"教^^^^"分沐^伊I游錄^"。本图展示在本文中指定为代表性基元的特征，其说明从聚糖微阵列上的聚糖提取的不同类型的对、三联体和四联体。选择所述特征的基本原则是基于二-(四糖)与HA的聚糖结合位点的结合。最终数据集包含来自聚糖的特.征以及在所述阵列上筛选的各HA的结合信号。在不同分类方法中，使用规则归纳分类
7法。所述方法的主要优势之一为其产生当与其它统计或数学法相比时可更易于解释的IF-THEN规则。分类的两个主要目标为(1)鉴别一组高亲和力聚糖配体上存在的增强结合的特征；和(2)鉴别处于低亲和力聚糖配体中的不利于结合的特征。
房U, ^f教薪^^漱分界游分类器。本图提供分类器id和规则的表。
房〃,A^"5Am2-3Ga/浙Wew5Aca2-6Ga/基^游称家激 ^/^^丝。图A展示Neu5Aca2-3Gal键联的构象图。经包围区域2为在APR34—HI—23、 ADU63—H3—23和ADS97—H5—23共晶体结构中观察到的反式构象。经包围区域1为在AAI68_H3—23共晶体结构中观察到的构象。图B展示Neu5Aca2-6Gal的构象图，其中顺式构象(经包围区域3)在所有HA-a2-6唾液酸化聚糖共晶体结构中都可观察到。图C展示在个别HA-聚糖共晶体结构中Neu5Ac cx2-3与a2-6唾液酸化寡糖的溶剂可及表面积(SASA)之间的差异。红色和蓝绿色柱分别指示a2-6(正值)或(x2-3 (负值)唾液酸化聚糖中的Neu5Ac造成与聚糖结合位点的更多接触。图D展示结合猪和人类H1 (Hla2.3)、禽类和人类H3(H3a2.3)的a2-3唾液酸化聚糖中的NeuAc的SASA与结合猪和人类HI (Hla2.6)的a2-6唾液酸化聚糖中的NeuAc的SASA之间的差异。蓝绿色的H3a2.3负值柱指示与禽类H3相比，人类H3 HA与Neu5Aca2-3Gal的接触较少。扭转角一O: C2-Cl-0-C3 (对于Neu5Aca2-3/6键联)；\(/: Cl-0-C3-H3 (对于Neu5Aca2-3Gal)或Cl-0-C6-C5 (对于Neu5Aca2-6Gal): ro: 0-C6-C5-H5 (对于Neu5Aca2-6Gal)键联。O、 \|/图是从GlycoMapsDB (http:〃www.glvcosciences.de/modeling/glvcomapsdb/)获得，其是由马丁'富兰克博士(Dr. Martin Frank)和克洛斯-维尔姆范德利特博士 (Dr. Claus-Wilhelm von der Lieth)(德国癌症研究院(German Cancer Research Institute)，德国海姆堡(Heidelberg, Germany))开发的。从高能量到低能量的着色方案分别为从亮红色到亮绿色。
房"，历、7/3浙H5 与a2-3/6麼液邀众,薪游錄^W,涉J!游嫂基。图A-D展示ASI30—H1、APR34—H1、ADU63—H3和ADS97—H5共晶体结构中分别与a2-3和a2-6唾液酸化聚糖相互作用的残基的溶剂可及表面积(SASA)的差异(横坐标的A)。绿色柱对应于与聚糖直接相互作用的残基且浅橙色柱对应于与Glu/Asp190和Gln/Leu226临近的残基。绿色柱的△的正值指示所述残基与a2-6唾液酸化聚糖的接触较多，而△的'负值指示与a2-3唾液酸化聚糖的接触较多。图E以表格形式概述结合Hl、 H3和H5 HA中的oc2-3/6唾液酸化聚糖所涉及的残基。结合cx2-3唾液酸化聚糖所涉及的某些关键残基为蓝色且结合(x2-6唾液酸化聚糖所涉及的某些关键残基为红色。
激M, Wef04—//5 与现敏a2-6麼液潔众覆薪f统形l/"游碧^。表面的立体视图呈现利用Neu5Aca2-6Gal键联的呈延长构象的Viet04—H5聚糖结合位点(从百日咳;毒素共晶体结构获得；PDBID: 1PT0)。 Lysl93 (橙色)与呈此构象的聚糖无任何接触。结合呈此构象的聚糖潜在涉及的其它氨基酸为Asnl86、 Lys222和Ser227。然而，结合呈顺式构象的ct2-6唾液酸化寡糖的HA中所观察到的某些接触在延长构象中并不存在。不希望受仟何特定理论的束缚，应注意，这表明延长构象与HA的结合可能不如顺式构象理想。其中Neu5Aca2-6Gal(31-4GlcNAcb分枝连接到Manal-3Man (PDB ID: 1LGC)和Manal-6Man (PDB ID: 1ZAG)的分枝N连接聚糖的结构附加于Neu5Aca2-6Gal键联的顺式和延长构象的Viet04一H5 HA结合位点中的Neu5Aca2-6Gal键联上。所述附加展示，具有连接到核心的Manal-6Man的Neu5Aca2-6Gal(31-4GlcNAc分枝的结构与结合位点具有不利的空间重叠(在两种构象中)。另一方面，具有所述连接到核心的Manal-3Man的分枝的结构(如图中所示，其中三甘露糖核心呈紫色)与顺式构象中的Lysl93具有空间重叠，但尽管不太理想，仍能在不与延长构象中的Lysl93具有任何接触的情况下结合。
房〃，WT///、 //3浙H5/M游产全。图A展示在4-12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上跑胶且印迹于硝酸纤维素膜上的来自H1N1 (A/南卡罗来纳/1/1918)、 H3N2 (A/莫斯科/10/1999)禾卩H5N1 (A/越南/1203/2004)的HA蛋白的可溶形式。H1N1HA是使用山羊抗流感A抗体和抗山羊IgG-HRP探査。H3N2是使用雪貂抗H3N2 HA抗血清和抗雪貂HRP探查。H5N1是使用抗禽类H5N1 HA抗体和抗兔IgG-HRP探查。H1N1 HA和H3N2HA是以HAO提供，而H5N1 HA是以HAO与HA1提供。图B展示在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上跑胶且印迹于硝酸纤维素膜上的全长H5N1 HA和两种变体(Glul90Asp、'Lysl93Ser、 Gly225Asp、 Gln226Leu ， "DSDL";禾Q GLul90Asp Lysl93Ser Gln223LeuGly228Ser， "DSLS")。 HA是使用抗禽类H5N1抗体和抗兔IgG-HRP探查。
房M,丄呼欲遣邀织级#游凝桌*:染经。利用木菠萝凝集素Uacalin)(绿色)和刀豆凝集素(ConA)(红色)的气管组织共染色揭示木菠萝凝集素(特异性结合O连接聚糖)优先与气管顶表面上的杯状细胞结合，且刀豆凝集素(特异性结合N连接聚糖)优先结合气管纤毛上皮细胞。不希望受任何特定理论的束缚，应注意，此发现表明杯状细胞主要表达O连接聚糖，而纤毛上皮细胞主要表达N连接聚糖。利用木菠萝凝集素和SNA(红色；特异性结合(x2-6)的气管共染色展示SNA与杯状细胞和纤毛细胞的结合。另一方面，木菠萝凝集素(绿色)和特异性结合a2-3唾液酸化聚糖的MAL (红色)的共染色展示MAL与假复层气管上皮的结合很弱甚至不结合，但与所述组织的底层区域广泛结合。总的说来，凝集素染色数据指示分别作为气管上皮顶面上的纤毛和杯状细胞中的N连接和0连接聚糖的一部分的a2-6唾液酸化聚糖的显著表达和广泛分布。
9f邀丝//7、 MT/M与J:伊欲遭资织级/f,7^F欲遣邀织级/f游浙量友应^f会。针对碘化丙啶染色(红色)，以绿色展示HA结合。气管组织的顶面主要表达具有长链分枝拓扑的a2-6聚糖。另一方面，肺泡组织主要表达a2-3聚糖。HI HA显著结合气管的顶表面且其结合随着从40吗/ml稀释到10 ^g/ml而逐渐降低。HI HA仅在最高浓度下也展示与肺泡组织的某些弱结合。H3 HA的结合模式不同于HI HA的结合模式。举例来说，H3 HA在40 pg/ml和20 pg/ml下展示与气管和肺泡组织切片显著结合。然而，在10pg/ml的浓度下，H3HA展示主要结合气管组织的顶面，且几乎不与肺泡组织结合。总的说来，这些组织结合数据突出与气管组织的顶面以高亲和力结合的重要性。此外，此等数据还揭示，由于H3 HA对a2-3唾液酸化聚糖展示某些亲和力，因此并非绝对需要对a2-6唾液酸化聚糖的高特异性(如通过H1HA所证实)来介导人类感染。
房20, ///、 /W//7//5WT/M游苴麥禁会^/量f应。从上到下分别展示野生型Hl、H3和H5 HA在各种浓度下的结合信号(正规化为约800000的饱和水平)。聚糖的图例是展示为插图，其中LN对应于Galbl04GlcNAc且3'SLN和6'SLN分别对应于在LN处的a2-3和(x2-6连接唾液酸。适于感染人类的Hl和H3 HA的特征结合模式为在从40pg/ml稀释下降到5 pg/ml的范围内在饱和水平下结合长链ct2-6 (6'SLN-LN)聚糖。尽管HI HA对于结合长链a2-6唾液酸化聚糖高度特异，H3 HA也以高亲和力结合短链a2-6唾液酸化聚糖(6'SLN)并相对于a2-6以较低亲和力结合长链a2-3。 Hl和H3 HA的此直接结合剂量反应与组织结合模式相一致。此外，Hl和H3 HA对长链a2-6唾液酸化聚糖的高亲和力结合与其与气管组织的顶面(其表达具有长链分枝拓扑的a2-6唾液酸化聚糖)的广泛结合有关。此相关性提供对人类适应性Hl和H3 Has的上呼吸道组织嗜性的有益洞察。另一方面，H5 HA展示相反的聚糖结合趋势，即与其对a2-6唾液酸化聚糖的相对低亲和力(显著信号仅在20-40吗/ml可见)相比较，以高亲和力结合a2-3 (饱和信号从40ng/ml下降到2.5 ^g/ml)。因此，不希望受任何特定理论的束缚，本发明者提出HA多肽(例如禽类H5HA)的人类适应作用的必要条件是获得以高亲和力结合主要表达在人类上氣管中的长链a2-6唾液酸化聚糖(例如伞形拓扑聚糖)的能力。
HA序列元件的说明
HA序列元件1
/M ^^/《元斧7为近似对应于天然流感分离株中所见的许多HA蛋白的残基97-185(其中使用H3 HA作为参考来指定残基位置)的序列元件。所述序列元件具有基本结构C (Y/F) P X， C X2 W X3 W X4 H H P，其中X,近似30-45个氨基酸长；X2近似5-20个氨基酸长；
X3近似25-30个氨基酸长且 X4近似2个氨基酸长。
在一些实施例中，X,为约35-45,或约35-43，或约35、 36、 37、 38、 38、 40、 41、 42或43个氨基酸长。在一些实施例中，X2为约9-15，或约9-14，或约9、 10、 11、 12、 13或14个氨基酸长。在一些实施例中，X3为约26-28，或约26、 27或28个氨基酸长。 在一些实施例中，X4具有序列(G/A)(I/V)。在一些实施例中，X4具有序列GI;在一些实 施例中，X4具有序列GV;在一些实施例中，X4具有序列AI;在一些实施例中，X4具 有序列AV。在一些实施例中，HA序列元件1包含二硫键。在一些实施例中，所述二硫 键桥残基对应于97位和139位(基于本文中所用的标准H3编号系统)。
在一些实施例中，且尤其在H1多肽中，X,为约43个氨基酸长，和/或X2为约13 个氨基酸长，和/或X3为约26个氨基酸长。在一些实施例中，且尤其在H1多肽中，HA 序列元件1具有以下结构
C Y P X, A T (A/T) (A/S) C X2 W X3 W X4 H H P，其中
X,a近似27-42，或近似32-42,或近似32-40,或近似26-41，或近似31-41，或近 似31-39,或近似31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39或40个氨基酸长，且X2-X4 如上所述。
在一些实施例中，且尤其在H1多肽中，HA序列元件1具有以下结构
C Y P X1A T (A/T) (A/S) C X2 W (I/L) (T/V) X3A W X4 H H P，其中
Xm近似27-42，或近似32-42，或近似32-40，或近似32、 33、 34、 35、 36、 37、
38、 39或40个氨基酸长；
Xm近似23-28，或近似24-26，或近似24、 25或26个氨基酸长，且X2和X4如上所述。
在一些实施例中，且尤其在H1多肽中，HA序列元件1包括以下序列 GLS S IS S FEK，
其通常在X,内(包括在X,a内)且尤其约在X,的残基12处开始(如在例如图l-3
中所说明)。
在一些实施例中，且尤其在H3多肽中，X,为约39个氨基酸长，和/或X2为约13 个氨基酸长，和/或X3为约26个氨基酸长。
在一些实施例中，且尤其在H3多肽中，HA序列元件1具有以下结构 C YPX1AS (S/N) (A/S)CX2WX3WX4HHP，其中
11XtA近似27-42，或近似32-42，或近似32-40，或近似23-38，或近似28-38，或近 似28-36,或近似28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39或40个氨基酸
长，且X2-X4如上所述。
在一些实施例中，且尤其在H3多肽中，HA序列元件1具有以下结构
C Y P X, a S (S/N) (A/S) C X2 W L (T/H) X3A W X4 H H P，其中
X，a近似27-42，或近似32-42，或近似32-40，或近似32、 33、 34、 35、 36、 37、
38、 39或40个氨基酸长；
Xm近似23-28，或近似24-26，或近似24、 25或26个氨基酸长，且X2和X4如上所述。
在一些实施例中，且尤其在H3多肽中，HA序列元件1包括以下序列 (L/I) (V/I) ASSGTLEF,
其通常在X,内(包括在X,a内)且尤其约在X,的残基12处开始(如在例如图l、 2和4中所说明)。
在一些实施例中，且尤其在H5多肽中，Xi为约42个氨基酸长，禾B/或X2为约13 个氨基酸长，和/或&为约26个氨基酸长。
在一些实施例中，且尤其在H5多肽中，HA序列元件1具有以下结构 CYPXiASSACX2WX3WX4HHP，其中
X,a近似27-42，或近似32-42，或近似32-40，或近似23-38，或近似28-38，或近 似28-36，或近似28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39或40个氨基酸
长，且X2-X4如上所述。
在一些实施例中，且尤其在H5多肽中，HA序列元件1具有以下结构 C YPX1AS SACX2WLIX3AWX4HHP,其中
X,a近似27-42，或近似32-42，或近似32-40，或近似32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39或40个氨基酸长；且
Xm近似23-28，或近似24-26，或近似24、 25或26个氨基酸长，且乂2和乂4如上 所述。
在一些实施例中，且尤其在H5多肽中，HA序列元件1经以下序列延长(即在对应 于残基186-193的位置) N D AAE X X (K/R)。
在一些实施例中，且尤其在H5多肽中，HA序列元件1包括以下序列 YEELKHLXSXXNHFEK，其通常在X,内且尤其约在X,的残基6处开始(如在例如图l、 2和5中所说明)。 HA序列元件2
ft4 ^/y无伴2为近似对应于天然流感分离株中所见的许多HA蛋白的残基324-340 (再次使用基于H3HA的编号系统)的序列元件。所述序列元件具有基本结构 G AIAG F IE。
在一些实施例中，HA序列元件2具有以下序列 PX!GAIAGFIE，其中
X,近似4-14个氨基酸长，或约8-12个氨基酸长，或约12、 11、 10、 9或8个氨基 酸长。在一些实施例中，所述序列元件提供HA0裂解位点，从而允许产生HA1和HA2。 在一些实施例中，且尤其在H1多肽中，HA序列元件2具有以下结构 PS(I/V)QSRXIAGAIAGFIE，其中 X，a近似3个氨基酸长；在一些实施例中，X^为G(L/I)F。 在一些实施例中，且尤其在H3多肽中，HA序列元件2具有以下结构 PXKXTRX1AGAIAGFIE，其中 X^近似3个氨基酸长；在一些实施例中，XtA为G(L/I)F。 在一些实施例中，且尤其在H5多肽中，HA序列元件2具有以下结构 PQRXXXRXXRX,aGAIAGFIE，其中 X!a近似3个氨基酸长；在一些实施例中，X!a为G(L/I)F。 定义
7黄//7力如所属领域中已知，"亲和力"为特定配体(例如，HA多肽)与其搭配物 (例如，HA受体)结合的紧密度的量度。亲和力可以不同方式测量。
生笏活丝如本文所使用，短语"生物活性"是指在生物系统且尤其在生物体中具 有活性的任何试剂的特征。举例来说，认为当投与生物体时，对所述生物体具有生物作 用的试剂具有生物活性。在特定实施例中，如果蛋白或多肽具有生物活性，那么共有所 述蛋白或多肽的至少一种生物活性的蛋白或多肽的一部分通常称为"生物活性"部分。
广谱乂类兹^ ^W/^Z/5/M多嚴，如本文所使用，短语"广谱人类结合H5HA" 是指结合人类上皮组织中所见的HA受体且尤其结合具有a2-6唾液酸化聚糖的人类HA 受体的H5 HA多肽的型式。此外，本发明的BSHBH5HA结合多种不同的ct2-6唾液酸 化聚糖。在一些实施例中，BSHB H5 HA结合大量人类样本中所见的不同a2-6唾液酸化 聚糖，含有其的病毒具有感染人群且尤其结合所述群体中上呼吸道受体的显著能力。在 一些实施例中，BSHBH5HA结合如本文所述的伞形聚糖(例如，长链a2-6唾液酸化聚糖)。
獰ff^Ti^如本文所使用，短语蛋白或多肽的"特征部分"为含有连续氨基酸片段 或者一起为蛋白或多肽的特征的大量连续氨基酸片段的部分。各所述连续片段通常将含 有至少两个氨基酸。此外，所属领域技术人员将了解，蛋白的特征通常需要至少5、 10、 15、 20或更多个氮基酸。 一般来说，特征部分为除上文所指定的序列一致性外与相关完 整蛋白共有至少一个功能特征的部分。
獰赵—^^力"特征序列"为见于多肽或核酸家族所有成员中的序列，且因此所属领 域技术人员可将其用于定义所述家族的成员。
^"艰/f办短语"锥形拓扑"在本文中用于指某些聚糖且尤其HA受体上的聚糖所 采用的三维排列。如图6中所说明，a2-3唾液酸化聚糖或(x2-6唾液酸化聚糖都可采用 锥形拓扑，且其为短寡核苷酸链所特有，但一些长链寡核苷酸也可以采用此构象。锥形 拓扑是由Neu5Aca2-3Gal键联的糖苷扭转角来表征，其抽取由约-60、 60或180的$ (Cl-C2-0-C3/C6)值以及-60到60的V (C2-0-C3/C6-H3/C5)样本所指定的具有最小能 量构象的三个区域(图14)。图8呈现采用锥形拓扑的聚糖的某些代表性(但不详尽) 实例。
^//i f,如本文所使用，术语"对应于"通常用于表示HA多肽中氨基酸残基的位 置/一致性。所属领域技术人员将了解，出于简化的目的，本文中利用标准编号系统(基 于野生型H3HA)(如在例如图1-5中所说明)，因此，例如"对应于"l卯位残基的氨 基酸实际上无需为特定氨基酸链中的第190个氨基酸，而是对应于在野生型H3 HA中 190位所见的残基；所属领域技术人员易于了解如何鉴别对应氨基酸。
^;^游力SCff度，如本文所使用，作为"去除的分离程度"的氨基酸为对聚糖结合 具有间接影响的HA氨基酸。举例来说，去除的l度分离氨基酸可(1)与直接结合氨 基酸相互作用；和/或(2)以其它方式影响直接结合氨基酸与宿主细胞HA受体所缔合 的聚糖相互作用的能力；所述去除的l度分离氨基酸可或可不直接结合聚糖本身。去除 的2度分离氨基酸(1)与去除的1度分离氨基酸相互作用；和/或(2)以其它方式影响 去除的l度分离氨基酸与直接结合氨基酸相互作用的能力等。
羞麥-智^氯基發..如本文所使用，短语"直接结合氨基酸"是指与一个或一个以上 与宿主细胞HA受体缔合的聚糖直接相互作用的HA多肽氨基酸。
经—I荐众如本文所使用，术语"经工程化"描述一种氨基酸序列已由人类选择的 多肽。举例来说，经工程化的HA多肽具有不同于天然流感分离株中所见的HA多肽的 氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，经工程化的HA多肽具有不同于NCBI数
14据库中所包括的HA多肽的氨基酸序列的氨基酸序列。
//7多嚴，当将"HI多肽"用于本文中时，所述术语为氨基酸序列包括至少一个作 为HI的特征且使HI与其它HA亚型相区别的序列元件的HA多肽。代表性所述序列元 件可通过比对诸如图1-3中所说明的序列来确定，且其包括例如本文中关于HA序列元 件的HI特异性实施例所述的序列。
当将"H3多肽"用于本文中时，所述术语为氨基酸序列包括至少一个作 为H3的特征且使H3与其它HA亚型相区别的序列元件的HA多肽。代表性所述序列元 件可通过比对诸如图1、 2和4中所述的序列来确定，且其包括例如本文中关于HA序 列元件的H3特异性实施例所述的序列。
//5^#,当将"H5多肽"用于本文中时，所述术语为氨基酸序列包括至少一个作 为H5的特征且使H5与其它HA亚型相区别的序列元件的HA多肽。代表性所述序列元 件可通过比对诸如图1、 2和5中所述的序列确定，且其包括例如本文中关于HA序列 元件的H5特异性实施例所述的序列。
i承凝桌,多嚴；如本文所使用，术语"血球凝集素多肽"(或"HA多肽") 是指氨基酸序列包括至少一个HA特征序列的多肽。所属领域中已知多种来自流感分离 株的HA序列；事实上，美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)保留到本申请案申请时为止包括9796个HA序列的数据库 (www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/flu.html)。所属领域技术人员参考此数据库可易于 鉴别通常为HA多肽和/或特定HA多肽(例如，Hl、 H2、 H3、 H4、 H5、 H6、 H7、 H8、 H9、 H10、 Hll、 H12、 H13、 H14、 H15或H16多肽)或介导例如禽类、骆驼、犬、猫、 香猫、环境、马、人类、豹、貂、小鼠、海豹、石燕(stone martin)、猪、虎、鲸等特 定宿主感染的HA的特征的序列。举例来说，在一些实施例中，HA多肽包括一个或一 个以上见于天然流感病毒分离株中所见的HA蛋白的约残基97与185、 324与340、 96 与100和/或130-230之间的特征序列元件。在一些实施例中，HA多肽具有包含如本文 中所定义的HA序列元件1和2中至少一个的氨基酸序列。在一些实施例中，HA多肽 具有包含HA序列元件1和2的氨基酸序列，在一些实施例中，所述元件彼此分隔约 100-200,或约125-175，或约125-160，或约125-150，或约129-139,或约129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138或139个氨基酸。在一些实施例中，HA多 肽具有包括区域96-100和/或130-230内参与聚糖结合的各位置处的残基的氨基酸序列。 举例来说，许多HA多肽包括一个或一个以上以下残基Tyr98、 Ser/Thrl36、 Trpl53、 Hisl83和Leu/Ile194。在一些实施例中，HA多肽包括至少2、 3、 4或全部5个所述残基。
经分,；如本文所使用，术语"经分离"是指试剂或实体(i)己从至少一些当最初 产生(在自然界或实验环境中)时其所缔合的组分分离；或(ii)由人工产生。经分离 试剂或实体可与至少约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或90% 以上其最初所缔合的其它组分分离。在一些实施例中，经分离试剂为超过90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%纯。
长錢—^#,出于本揭示案的目的，如果寡糖包括至少一个具有至少4个糖残基的直 链，那么通常将其视为"长"的。
求天然氯著^:短语"非天然氨基酸"是指具有氨基酸的化学结构(即，
o
II
H2N-CH—C-OH
R )且因此能够参与至少两个肽键但R基团不同于自然界中所见的基
团的实体。在一些实施例中，非天然氨基酸也可以具有非氢的另一 R基团，和/或可在 氨基或羧酸部分上具有一个或一个以上其它取代。
一般说来，"多肽"为具有至少两个彼此通过肽键连接的氨基酸的链。在一 些实施例中，多肽可包括至少3-5个氨基酸，其各自借助于至少一个肽键与其它氨基酸 连接。所属领域技术人员将了解，多肽有时包括"非天然"氨基酸或仍能够任选整合入 多肽链中的其它实体。
/發，如本文所使用，如果试剂或实体实质上无其它组分，那么其为"纯"的。举例 来说，通常将含有超过约90%特定试剂或实体的制剂视为纯制剂。在一些实施例中，试 剂或实体为至少91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%<或99%纯。
出于本揭示案的目的，如果寡糖在任何直链中具有不到4个或当然不到 3个残基，那么通常将其视为"短"的。
錄岸丝如所属领域中已知，"特异性"为特定配体(例如，HA多肽)区别其结合 搭配物(例如人类HA受体，且尤其是人类上呼吸道HA受体)与其它潜在结合搭配物 (例如，禽类HA受体)的能力的量度。
翁^f/f.如本文所使用，短语"治疗剂"是指引起所需生物或药理作用的任何试剂。
滑#,如本文所使用，术语"治疗"是指用于减轻疾病、病症或病状的一种或一种 以上症状或方面、延缓其发作、降低其严重程度或发病率或引起其预防的任何方法。出 于本发明的目的，治疗可在症状发作之前、期间和/或之后投与。
短语"伞形拓扑"在本文中用于指某些聚糖且尤其HA受体上的聚糖所采用的三维排列。本发明涵盖关于结合伞形拓扑聚糖为介导人类宿主感染的HA蛋白的 特征的认知。如图6中所说明，通常仅a2-6唾液酸化聚糖采用伞形拓扑，且伞形拓扑为 长链(例如大于四糖)寡糖所特有。伞形拓扑的实例是由为约-60的Neu5Aca2-6Gal键 联的O角提供(参看例如图14)。图9呈现采用伞形拓扑的聚糖的某些代表性(但不详 尽)实例。
度滞麥辨，如本文所使用，术语"疫苗接种"是指投与预期会例如对致病因子产生 免疫反应的组合物。出于本发明的目的，疫苗接种可在暴露于致病因子之前、期间和/ 或之后投与，且在某些实施例中，疫苗接种可在暴露于所述因子之前、期间和/或之后不 久投与。在一些实施例中，疫苗接种包括间隔适当时间的疫苗接种组合物的多次投与。
,沐，如本文所使用，术语"变体"为描述所关注的特定HA多肽与进行序列比较 的"母体"HA多肽之间的关系的相关术语。如果所关注的HA多肽具有与母体HA多 肽一致但在特定位置具有少量序列变化的氨基酸序列，那么将所关注的HA多肽视为母 体HA多肽的"变体"。通常，当与母体相比较时，所述变体中不到20%、 15%、 10%、: 9%、 8%、 7%、 6%、 5%、 4%、 3%、 2%的残基经取代。在一些实施例中，当与母体相 比较时，变体具有10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2或1个经取代残基。通常，变体具有 极少量(例如，不到5、 4、 3、 2或1个)经取代功能性残基(即，参与特定生物活性 的残基)。此外，当与母体相比较时，变体通常具有不超过5、 4、 3、 2或1个添加或缺 失，且通常不具有添加或缺失。另外，任何添加或缺失通常不到约25、 20、 19、 18、 17、 16、 15、 14、 13、 10、 9、 8、 7、 6个残基，且通常不到约5、 4、 3或2个残基。在一些 实施例中，母体HA多肽为见于天然流感病毒分离株中的多肽(例如，野生型HA)。
载沐，如本文所使用，"载体"是指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。 在一些实施例中，载体能够在诸如真核细胞或原核细胞等宿主细胞中染色体外复制和/ 或表达与其连接的核酸。能够引导可操作性连接的基因的表达的载体在本文中称为"表 达载体"。
^F主星y,如所属领域中所了解，短语"野生型" 一般是指如在自然界中所见的蛋白 或核酸的标准形式。举例来说，野生型HA多肽见于天然流感病毒的分离株中。多种不 同的野生型 HA 序列可见于 NCBI 流感病毒序列数据库 http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html中。
具体实施例方式
本发明提供结合伞形拓扑聚糖的HA多肽。在一些实施例中，本发明提供结合特定标靶物种的HA受体上所见的伞形拓扑聚糖的HA多肽。举例来说，在一些实施例中， 本发明提供结合人类HA受体(例如，人类上皮细胞上所见的HA受体)上所见的伞形 拓扑聚糖的HA多肽，且尤其提供结合上呼吸道内的人类HA受体上所见的伞形拓扑聚 糖的HA多肽。
本发明提供结合人类上呼吸道细胞上所见的HA受体的HA多肽，且尤其提供以经 指示的亲和力和/或特异性结合所述受体(和/或其聚糖，尤其其伞形聚糖)的HA多肽。
本发明涵盖以下认知获得结合伞形拓扑聚糖(例如长链(x2-6唾液酸化聚糖)的能 力和尤其以高亲和力结合的能力可赋予HA多肽变体感染人类的能力(其中其亲本HA 多肽则不能)。不希望受任何特定理论约束，本发明者提出结合伞形拓扑聚糖可为极为 重要的且尤其提出可不要求与其它聚糖类型结合的损失。
本发明进一步提供与本发明的HA多肽相关的各种试剂和方法，包括例如用于鉴别 其的系统、用于制备其的策略、结合其的抗体和各种与其相关的诊断和治疗方法。下文 提供本发明的这些和其它方面的某些实施例的进一步描述。
血球凝集素(HA)
流感病毒为核糖核酸病毒，其表征在于脂膜包膜含有经嵌埋入特定病毒的膜内的两 个糖蛋白、血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)。存在16种已知HA亚型和9种NA 亚型，且不同流感菌株是基于菌株HA和NA亚型的数目来命名。基于氨基酸序列一致 性和晶体结构的比较，已将HA亚型分成两个主要的组和四个较小的种系分枝。不同HA 亚型不必共有强烈氨基酸序列一致性，但不同HA亚型的总体三维结构彼此相似，具有 数种可用于分类目的的细微差异。举例来说，膜远端子域相对于中心a-螺旋的特定取向: 为一种通常用以测定HA亚型的结构特征(拉塞尔(Russell)等人，病毒学(Virology), 325:287,2004)。
HA以称为H1-H16的16种亚型中的一种的同源三聚体形式存在于膜中。迄今为止， 这些亚型中仅三种(hi、 h2和h3)已适应于人类感染。ha的已适应于感染人类的一 种经报道特征(例如来自流行性H1N1 (1918)禾B H3N2 ( 1967-68)流感亚型的HA的 特征)为与优选地结合a2-3唾液酸化聚糖的禽类祖细胞相比较，其优选地结合cx2-6唾 液酸化聚糖的能力(斯科尔和怀利(Skehel & Wiley),生物化学年度评论(Annu Rev Biochem)， 69:531,2000;罗格和波尔逊(Rogers & Paulson),病毒学，127:361,1983; 罗格等人，自然(Nature), 304:76,1983;苏特(Sauter)等人，生物化学(Biochemistry), 31:9609,1992;康诺(Connor)等人，病毒学，205:17,1994;吐穆佩(Tumpey)等人， 科学(Science), 310:77， 2005)。然而，本发明涵盖以下认知感染人类宿主的能力与
18结合特定键联的聚糖的相关性较小，且与结合特定拓扑的聚糖的相关性较大。因此，本 发明证实介导人类感染的HA结合伞形拓扑聚糖，借此通常展示伞形拓扑聚糖优先于锥 形拓扑聚糖的优选性(即使锥形拓扑聚糖可为(x2-6唾液酸化聚糖)。
可利用来自HI (人类和猪)、H3 (禽类)和H5 (禽类)亚型的HA的结合(a2-3 与a2-6键联的)唾液酸化寡糖的数种晶体结构，且其提供对HA与此等聚糖的不同相互 作用所涉及的特异性氨基酸的分子洞察(艾森(Eisen)等人，病毒学，232:19， 1997; 哈(Ha)等人，美国国家科学院院刊(ProcNatl AcadSciUSA)， 98:11181,2001;哈等 人，病毒学，309:209, 2003;盖博林(Gamblin)等人，科学，303:1838, 2004;史蒂文 斯(Stevens)等人，科学，303:1866,2004;拉塞尔等人，糖连接物杂志(Glycoconj J)， 23:85,2006;史蒂文斯等人，科学，312:404,2006)。
举例来说，单独或结合a2-3或(x2-6唾液酸化寡糖的H5 (A/鸭/新加坡/3/97)的晶 体结构鉴别直接与所结合聚糖相互作用的某些氨基酸，以及去除的一度或一度以上分离 氨基酸(史蒂文斯等人，美国国家科学院院刊，98:11181,2001)。在一些情况下，所述 残基的构象在结合对未结合状态方面有所不同。举例来说，Glul90、 Lysl93和Gln226 全部都参与直接结合相互作用且在结合对未结合状态中具有不同构象。接近Glul90的 Asnl86的构象在结合对未结合状态方面也显著不同。
本发欲游ft4游潜^殍f
如上所述，本发明涵盖以下发现结合伞形拓扑聚糖与介导特定宿主(包括例如人 类)的感染的能力有关。因此，本发明提供结合伞形聚糖的HA多肽。在某些实施例中， 本发明的HA多肽以高亲和力结合伞形聚糖。在某些实施例中，本发明的HA多肽通常 以高亲和力和/或特异性结合多种不同的伞形拓扑聚糖。
在一些实施例中，本发明的HA多肽以高亲和力结合伞形拓扑聚糖(例如长链a2-6 唾液酸化聚糖，诸如Neu5Aca2-6Gal卩l-4GlcNAc(31-3Galpl-4GlcNAc-)。举例来说，在一 些实施例中，本发明的HA多肽以与关于介导人类感染的野生型HA (例如H1N1 HA或 H3N2HA)所观察到的亲和力相当的亲和力结合伞形拓扑聚糖。在一些实施例中，本发 明的HA多肽以至少为以下值的亲和力结合伞形聚糖在与介导人类感染的野生型HA 相当的条件下所观察到的值的25%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 ％%、 97%、 98%、 99%或100%。在一些实施例; 中，本发明的HA多肽以大于在与介导人类感染的野生型HA相当的条件下所观察到的 值的亲和力结合伞形聚糖。
在某些实施例中，在某一浓度范围内评估本发明的HA多肽的结合亲和力。这种策
19略尤其在多价结合检定中提供比单一浓度分析显著更多的信息。举例来说，在某些实施 例中，在高出至少2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10倍或10倍以上的浓度范围内评估本发 明的HA多肽的结合亲和力。
在某些实施例中，如果本发明的HA多肽在诸如本文所述的多价聚糖阵列结合检定 中展示饱和信号，那么其展示高亲和力。在一些实施例中，如果本发明的HA多肽在所 述研究中展示高于约400000或更高(例如高于约500000、 600000、 700000、 800000等) 的信号，那么其展示高亲和力。在一些实施例中，HA多肽展示在至少2倍、3倍、4倍、 5倍或5倍以上的浓度范围内，且在某些实施例中在达IO倍或IO倍以上的浓度范围内 饱和结合伞形聚糖。
此外，在一些实施例中，本发明的HA多肽比其结合锥形拓扑聚糖更强烈地结合伞 形拓扑聚糖。在某些实施例中，本发明的HA多肽对于伞形聚糖对锥形聚糖展示为约10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3或2的相对亲和力。
在一些实施例中，本发明的HA多肽结合a2-6唾液酸化聚糖；在一些实施例中，本 发明的HA多肽优选地结合a2-6唾液酸化聚糖。在某些实施例中，本发明的HA多肽结 合多种不同的a2-6唾液酸化聚糖。在一些实施例中，本发明的HA多肽不能结合a2-3 唾液酸化聚糖，且在其它实施例中，本发明的HA多肽能够结合a2-3唾液酸化聚糖。
在一些实施例中，本发明的HA多肽结合人类上呼吸道上皮细胞上所见的受体。在 某些实施例中，本发明的HA多肽结合支气管和/或气管中的HA受体。在一些实施例中，: 本发明的HA多肽不能结合深肺中的受体，且在其它实施例中，本发明的HA多肽能够 结合深肺中的受体。
在一些实施例中，本发明的HA多肽结合至少约10%、 15%、 20%、 25%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或95%以上 的在人类上呼吸道组织(例如上皮细胞)内的HA受体上所见的聚糖。
在一些实施例中，本发明的HA多肽结合图9中所说明的一种或一种以上聚糖。在 一些实施例中，本发明的HA多肽结合图9中所说明的多种聚糖。在一些实施例中，本 发明的HA多肽以高亲和力和/或特异性结合图9中所说明的聚糖。在一些实施例中，与 结合图8中所说明的聚糖相比较，本发明的HA多肽优选地结合图9中所说明的聚糖。
本发明提供经分离的具有指定结合特异性的HA多肽，以及提供关于伞形聚糖具有 指定结合特征的经工程化HA多肽。
在一些实施例中，本发明的具有指定结合特征的HA多肽为Hl多肽。在一些实施 例中，本发明的具有指定结合特征的HA多肽为H2多肽。在一些实施例中，本发明的具有指定结合特征的HA多肽为H3多肽。在一些实施例中，本发明的具有指定结合特 征的HA多肽为H4多肽。在一些实施例中，本发明的具有指定结合特征的HA多肽为 H5多肽。在一些实施例中，本发明的具有指定结合特征的HA多肽为H6多肽。在一些 实施例中，本发明的具有指定结合特征的HA多肽为H7多肽。在一些实施例中，本发 明的具有指定结合特征的HA多肽为H8多肽。在一些实施例中，本发明的具有指定结 合特征的HA多肽为H9多肽。在一些实施例中，本发明的具有指定结合特征的HA多 肽为H10多肽。在一些实施例中，本发明的具有指定结合特征的HA多肽为Hll多肽。 在一些实施例中，本发明的具有指定结合特征的HA多肽为H12多肽。在一些实施例中， 本发明的具有指定结合特征的HA多肽为H13多肽。在一些实施例中，本发明的具有指 定结合特征的HA多肽为H14多肽。在一些实施例中，本发明的具有指定结合特征的 HA多肽为H15多肽。在一些实施例中，本发明的具有指定结合特征的HA多肽为H16 多肽。
在一些实施例中，本发明的具有指定结合特征的HA多肽不为Hl多肽、不为H2 多肽且/或不为H3多肽。
在一些实施例中，本发明的HA多肽并不包括来自以下任一菌株的Hl蛋白A/南 卡罗来纳/l/1918; A/波多黎各/8/1934; A/台湾(Taiwan) /1/1986; A/得克萨斯/36/1991; A/北京(Beijing) /262/1995; A/约翰内斯堡(Johannesburg) /92/1996; A/新喀里多尼亚 (New Caledonia) /20/1999; A/所罗门群岛(Solomon Islands) /3/2006。
在一些实施例中，本发明的HA多肽不为来自1957-58的亚洲型流感传染病的任一 菌株的H2蛋白。在一些实施例中，本发明的HA多肽并不包括来自以下任一菌株的H2 蛋白A/日本(Japan) /305+/1957: A/新加坡/l/1957; A/台湾/l/1964; A/台湾/1/1967。
在一些实施例中，本发明的HA多肽并不包括来自以下任一菌株的H3蛋白A/爱 知/2/1968; A/菲律宾(P函pines) /2/1982; A/密西西比(Mississippi) /1/1985; A/列宁 格勒(Leningrad) /360/1986; A/四川(Sichuan) /2/1987; A/上海(Shanghai) /11/1987; A/北京/353/1989; A/山东(Shandong)/9/1993; A/约翰内斯堡/33/1994; A/南昌(Nanchang) /813/1995; A/悉尼(Sydney)/5/1997; A/莫斯科/10/1999; A/巴拿马(Panama)/2007/1999; A/怀俄明(Wyoming) /3/2003; A/俄克拉荷马(Oklahoma) /323/2003; A/加利福尼亚 (California) /7/2004; A/威斯康星(Wisconsin) /65/2005。
/M多嚴
在某些实施例中，HA多肽为母体HA多肽的变体，由于除少量特定序列变化之外， 其氨基酸序列与母体HA的氨基酸序列一致。在一些实施例中，母体HA为流感病毒的例如野生型HA多肽)。
在一些实施例中，本发明的HA多肽变体具有与其对应的母体HA多肽不同的聚糖 结合特征。在一些实施例中，本发明的HA变体多肽对于伞形聚糖(例如与锥形聚糖相 比较)具有比其同源母体HA多肽大的亲和力和/或特异性。在某些实施例中，所述HA 多肽变体为工程化变体。
在一些实施例中，具有经改变的聚糖结合特征的HA多肽变体在残基中具有序列交 替或具有影响聚糖结合位点的序列交替。在一些实施例中，这些取代为直接与所结合的 聚糖相互作用的氨基酸；在其它实施例中，这些取代为从与所结合的聚糖相互作用的氨 基酸去除的1度分离的氨基酸，这是由于去除的1度分离氨基酸(1)与直接结合氨基 酸相互作用；(2)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，但不与聚糖 本身直接相互作用；或(3)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力， 且同时与聚糖本身直接相互作用。本发明的HA多肽变体含有一种或一种以上直接结合 氨基酸、 一种或一种以上第一程度分离氨基酸、 一种或-种以上第二程度分离氨基酸或 所述情况的任何组合的取代。在一些实施例中，本发明的HA多肽变体可含有具有甚至 更高分离程度的一种或一种以上氨基酸的取代。
在一些实施例中，具有改变的聚糖结合特征的HA多肽变体在接触除Neu5Ac和Gal 以外的糖的残基中具有序列变化(参见，例如图7)。
在一些实施例中，与野生型母体HA相比较，HA多肽变体具有至少一种氨基酸取 代。在某些实施例中，与同源野生型母体HA相比较，本发明的HA多肽变体具有至少 两种、三种、四种、五种或五种以上氨基酸取代；在某些实施例中，本发明的HA多肽 变体具有两种、三种或四种氨基酸取代。在一些实施例中，所有这些氨基酸取代都位于 聚糖结合位点内。
在一些实施例中，HA多肽变体在对应于残基137、 145、 156、 159、 186、 187、 189、 190、 192、 193、 196、 222、 225、 226和228中的一者或一者以上的位置处具有序列取 代。在一些实施例中，HA多肽变体在对应于残基156、 159、 189、 192、 193和196中 的一者或一者以上的位置处具有序列取代；和/或在对应于残基186、 187、 189和190 中的一者或一者以上的位置处具有序列取代；和/或在对应于残基190、 222、 225和226 中的一者或一者以上的位置处具有序列取代；和/或在对应于残基137、 145、 190、 226 和228中的一者或一者以上的位置处具有序列取代。在一些实施例中，HA多肽变体在 对应于残基190、 225、 226和228中的一者或一者以上的位置处具有序列取代。
在某些实施例中，HA多肽变体和尤其H5多肽变体相对于野生型母体HA (例如H5)在选自由以下残基组成的群组的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代残基98、 136、 138、 153、 155、 159、 183、 186、 187、 190、 193、 194、 195、 222、 225、 226、 227和228。在其它实施例中，HA多肽变体和尤其H5多肽变体相对于野生型母体HA 在选自位于直接结合聚糖的受体的区域中的氨基酸的残基处具有一种或一种以上氨基 酸取代，所述残基包括(但不限于)残基98、 136、 153、 155、 183、 190、 193、 194、 222、 225、 226、 227和228。在其它实施例中，HA多肽变体和尤其H5多肽变体相对于 野生型母体HA在选自位于直接结合聚糖的受体的区域的临近处的氨基酸的残基处具有 --种或一种以上氨基酸取代，所述残基包括(但不限于)残基98、 138、 186、 187、 195 和228。
在一些实施例中，本发明的HA多肽变体和尤其H5多肽变体相对于野生型母体HA 在选自由以下残基组成的群组的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代残基138、 186、 187、 190、 193、 222、 225、 226、 227和228。在其它实施例中，本发明的HA多肽变 体和尤其H5多肽变体相对于野生型母体HA在选自位于直接结合聚糖的受体的区域中 的氨基酸的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代，所述残基包括(但不限于)残基190、 193、 222、 225、 226、 227和228。在其它实施例中，本发明的HA多肽变体和尤其H5 多肽变体相对于野生型母体HA在选自位于直接结合聚糖的受体的区域的临近处的氨基 酸的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代，所述残基包括(但不限于)残基138、 186、 187和228。
在其它实施例中，HA多肽变体和尤其H5多肽变体相对于野生型母体HA在选自由' 以下残基组成的群组的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代残基98、 136、 153、 155、 183、 194和195。在其它实施例中，HA多肽变体和尤其H5多肽变体相对于野生型母体 HA在选自位于直接结合聚糖的受体的区域中的氨基酸的残基处具有一种或一种以上氨 基酸取代，所述残基包括(但不限于)残基98、 136、 153、 155、 183和194。在其它实 施例中，本发明的HA多肽变体和尤其H5多肽变体相对于野生型母体HA在选自位于 直接结合聚糖的受体的区域的临近处的氨基酸的残基处具有一种或一种以上氨基酸取 代，所述残基包括(但不限于)残基98和195。
在某些实施例中，HA多肽变体和尤其H5多肽变体相对于野生型母体HA在选自从 与所结合的聚糖相互作用的氨基酸去除的1度分离的氨基酸的残基处具有一种或一种以 上氨基酸取代，这是由于去除的l度分离氨基酸(1)与直接结合氨基酸相互作用；(2) 以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，但不与聚糖本身直接相互作 用；或(3)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，且同时与聚糖本
23身直接相互作用，所述残基包括(但不限于)残基98、 138、 186、 187、 195和228。
在其它实施例中，HA多肽变体和尤其H5多肽变体相对于野生型母体HA在选自从 与所结合的聚糖相互作用的氨基酸去除的1度分离的氨基酸的残基处具有一种或一种以 上氨基酸取代，这是由于去除的l度分离氨基酸(1)与直接结合氨基酸相互作用；(2) 以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，但不与聚糖本身直接相互作 用；或(3)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，且同时与聚糖本 身直接相互作用，所述残基包括(但不限于)残基138、 186、 187和228。
在其它实施例中，HA多肽变体和尤其H5多肽变体相对于野生型母体HA在选自从 与所结合的聚糖相互作用的氨基酸去除的1度分离的氨基酸的残基处具有一种或一种以 上氨基酸取代，这是由于去除的l度分离氨基酸(1)与直接结合氨基酸相互作用；(2) 以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，但不与聚糖本身直接相互作 用；或(3)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，且同时与聚糖本 身直接相互作用，所述残基包括(但不限于)残基98和195。
在某些实施例中，HA多肽变体和尤其H5多肽变体相对于野生型母体HA在残基 159处具有氨基酸取代。
在其它实施例中，HA多肽变体和尤其H5多肽变体相对于野生型母体HA在选自: 190、 193、 225和226的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代。在一些实施例中，HA 多肽变体和尤其H5多肽变体相对于野生型母体HA在选自190、 193、 226和228的残 基处具有一种或一种以上氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明的HA多肽变体和尤其H5变体具有以下氨基酸取代中的 一者或一者以上Serl37Ala、Lysl56Glu、 Asnl86Pro、 Aspl87Ser、 Aspl87Thr、 Alal89Gln、 Alal89Lys、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Glul90Thr、 Lysl93Arg、 Lysl93Asn、 Lysl93His、 Lysl93Ser、 Gly225Asp、 Gln226Ile、 Gln226Leu、 Gln226Val、 Ser227Ala、 Gly228Ser。
在一些实施例中，本发明的HA多肽变体和尤其H5变体具有以下氨基酸取代组中 的一者或一者以上
Glul卯Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp和Gln226Leu;
Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gln226Leu和Gly228Ser;
Alal89Gln、 Lysl93Ser、 Gln226Leu、 Gly228Ser;
Alal89Gln、 Lysl93Ser、 Gln226Leu、 Gly228Ser;
Aspl87Ser/Thr、 Alal89Gln、 Lysl93Ser、 Gln226Leu、 Gly228Ser;
Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gln226Leu、 Gly228Ser;
24Aspl87Ser/Thr、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Lysl56Glu、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Lysl93His、 Gln226Leu/Ile/Val、 Gly228Ser; Lysl93Arg、 Gln226Leu/Ile/Val、 Gly228Ser; Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gly225Asp; Lysl56Glu、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gly225Asp; Serl37Ala、 Lysl56Glu、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gly225Asp; Glul90Thr、 Lysl93Ser、 Gly225Asp;
Aspl87Thr、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp; Asnl86Pro、 Aspl87Thr、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp; Asnl86Pro、 Aspl87Thr、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp、 Ser227Ala。
在某些所述实施例中，与野生型HA相比较，HA多肽具有至少一种其它取代，使得变 体对伞形聚糖的亲和力和/或特异性增加。
在一些实施例中，本发明的HA多肽(包括HA多肽变体)具有包括D190、 D225、 L226禾Q/或S228的序列。在一些实施例中，本发明的HA多肽具有包括D190和D225 的序列；在一些实施例中，本发明的HA多肽具有包括L226和S228的序列。
在一些实施例中，与母体HA且尤其与母体野生型HA相比较，本发明的HA多肽 变体具有开放结合位点。
ft4多it游教分或/f皮
本发明进一步提供本发明的HA多肽的特征部分和其编码核酸。通常，特征部分为 含有连续氨基酸片段或者一起为HA多肽的特征的大量连续氨基酸片段的部分。各所述 连续片段通常将含有至少两个氨基酸。此外，所属领域技术人员将了解，H5HA多肽的 特征通常需要至少5、 10、 15、 20或更多个氨基酸。 一般来说，特征部分为除上文所指 定的序列一致性外还与相关完整H5多肽共有至少一个功能特征的部分。在一些实施例 中，本发明的HA多肽的特征部分与相关全长HA多肽共有聚糖结合特征。
产主/M多嚴
可通过任何可用方式产生本发明的HA多肽和/或其特征部分或其编码核酸。 举例来说，可通过使用经工程化以表达本发明的HA多肽编码核酸的宿主细胞系统
产生本发明的HA多肽(或特征部分)。
可使用任何系统产生HA多肽(或特征部分)，所述系统诸如卵、杆状病毒、植物、
酵母、马-达二氏犬肾脏(Madin Darby Canine Kidney， MDCK)细胞或Vero (非洲绿猴肾脏)细胞。或者或另外，可使用重组技术，诸如通过使用表达载体将HA多肽(或特 征部分)表达在细胞中(萨布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆实验手册(Molecular Cloning: A Laboratory Manual),冷泉港实验室出版社(CSHL Press), 1989)。
或者或另外，可通过合成方式产生本发明的HA多肽(或其特征部分)。 或者或另外，可在完整病毒环境中产生本发明的HA多肽(或其特征部分)，而无 论所述病毒是否另外为野生型、经减毒、经杀死等。也可以在病毒样颗粒环境中产生本 发明的HA多肽或其特征部分。
在一些实施例中，可由流感病毒分离和/或纯化HA多肽(或其特征部分)。举例来 说，病毒可在诸如含胚鸡蛋等卵中生长，在所述情况下所收集的材料通常为尿囊液。或 者或另外，可由使用组织培养使病毒生长的任何方法获得流感病毒。用于使病毒生长的 适当细胞底物包括例如狗肾脏细胞(诸如MDCK或来自MDCK、 MDCK样细胞的克隆 的细胞)，猴肾脏细胞(诸如包括Vero细胞的AGMK细胞)，作为连续细胞系的经培养 上皮细胞，293T细胞，BK-21细胞，CV-1细胞，或适于产生用于疫苗目的的流感病毒 的任何其它哺乳动物细胞类型，其易于由商业来源获得(例如美国马里兰州的罗克维尔 的美国典型培养物收藏中心(ATCC，Rockville，Md))。适当细胞底物又包括人类细胞， 诸如MRC-5细胞。适当细胞底物并不局限于细胞系；例如，也包括诸如鸡胚胎纤维母 细胞等初级细胞。
同时，所属领域技术人员将了解可通过在允许迅速筛选和/或选择能够结合伞形拓扑 聚糖的HA多肽的条件下培养产生HA (无论单独或作为复合物的部分，包括作为病毒 颗粒或病毒的部分)的细胞或生物体，来制备、鉴别、分离和/或产生如本文所述的HA 多肽和尤其变体HA多肽。为仅提供一个实例，在一些实施例中，在揭示和/或有利于结 合伞形拓扑聚糖(例如以特定特异性和/或亲和力)的变体的条件下产生和/或研究许多 HA变体可能适用。在一些实施例中，由在自然界中进化产生所述许多HA变体。在一 些实施例中，由工程化产生所述许多HA变体。在一些实施例中，由工程化与自然进化 的组合产生所述许多HA变体。
HA受体
HA通过结合糖蛋白受体与细胞表面相互作用。
HA受体上的N-连接聚糖主要介导HA与HA受体的结合。具体说来，流感病毒颗 粒表面上的HA识别与细胞宿主表面上的HA受体相缔合的唾液酸化聚糖。识别和结合 后，宿主细胞吞没病毒细胞且病毒能够复制并产生更多分配到邻近细胞的病毒颗粒。
通过受体的HA结合位点附近的a2-3或(x2-6唾液酸化聚糖来修饰HA受体，且受体结合的聚糖的键联类型影响受体的HA结合位点的构象，因此影响受体对不同HA的 特异性。
举例来说，禽类HA的聚糖结合口袋变窄。根据本发明，此口袋结合cx2-3唾液酸化 聚糖的反式构象和/或cx2-3或a2-6连接的锥形拓扑聚糖。
禽类组织以及人类深肺和胃肠(GI)道组织中的HA受体都由oc2-3唾液酸化聚糖键 联表征，且另外(根据本发明)由包括a2-3唾液酸化和/或(x2-6唾液酸化聚糖在内的主 要采用锥形拓扑的聚糖表征。
相比之下，在支气管和上呼吸道气管中的人类HA受体是经ot2-6唾液酸化聚糖修饰。 与a2-3基元不同，a2-6基元因C6-C5键而具有额外的构象自由度(拉塞尔(Russell) 等人，糖结合物杂志(GZycocow' /) 23:85, 2006)。结合所述a2-6唾液酸化聚糖的HA 具有开口较大的结合口袋来容纳由此构象自由所引起的结构多样性。此外，根据本发明， HA可能需要结合伞形拓扑的聚糖(例如，a2-6唾液酸化聚糖)且尤其可能需要结合具 有强亲和力和/或特异性的所述伞形拓扑聚糖，以便有效地介导人类上呼吸道组织的感 染。
归因于这些空间受限的糖基化特征，人类通常不会感染含有许多野生型禽类HA(例 如，禽类H5)的病毒。具体说来，由于最有可能遭遇病毒的人类呼吸道部分(即，气 管和支气管)缺乏具有锥形聚糖(例如，a2-3唾液酸化聚糖和/或短链聚糖)的受体， 且野生型禽类HA通常主要或仅结合与锥形聚糖(例如，a2-3唾液酸化聚糖和/或短链聚 糖)缔合的受体，所以人类很少感染禽类病毒。只有在与病毒足够紧密地接触以致其可 进入深肺和/或胃肠道中时，具有伞形聚糖(例如，长链a2-6唾液酸化聚糖)的受体才 使人类受到感染。
聚糖阵列
为了迅速扩充关于已知的特异性聚糖-聚糖结合蛋白(GBP)相互作用的当前知识， 一个国际性协作研究发起组织一功能糖原组学联盟(Consortium for Functional Glycomics, CFG; www.functionalglvcomics.org)已开发出聚糖阵列，其包含数种使得 能针对新颖聚糖配体特异性高通量筛选GBP的聚糖结构。聚糖阵列包含单价与多价聚 糖基元(即，连接到聚丙烯酰胺主链)且各阵列包含264个具有低(10 nM)和高(100 ) 浓度和针对各浓度的 6 个点的聚糖(参见 http:〃www.functionalglvcomics,org/static/consortium/resources/resourcecoreh5.shtml )。
所述阵列主要包含捕集N和O连接聚糖的生理学多样性的合成聚糖。除合成聚糖 外，得自不同哺乳动物糖蛋白的N连接聚糖混合物也呈现于所述阵列上。如本文所使用，聚糖"阵列"是指一组一种或一种以上的聚糖，其任选地固定化于 固体支撐物上。在一些实施例中，"阵列"为在空间上物理分离的两个或两个以上位置 处作为有组织的排列或模式而存在的许多聚糖。通常，聚糖阵列将具有至少4、 8、 16、 24、 48、 96或数百或数千个离散位置。通常，本发明的聚糖阵列可具有多种形式中的任 一种。所属领域中已知可适用于生物分子的各种不同阵列形式。举例来说，熟知极大数 目的蛋白和/或核酸阵列。所属领域技术人员将迅速了解适合于本发明的聚糖陣列的标准 阵列形式。
在一些实施例中，本发明的聚糖阵列以"微阵列"形式存在。微阵列通常可具有相 隔50-200微米或以下的距离的样本位置和在毫微到微莫耳浓度范围内或毫微到皮克范 围内的固定化样本。所属领域中已知的阵列形式包括例如各离散样本位置具有例如10 微米的尺度的形式。
在一些实施例中，本发明的聚糖阵列包含多个在空间上固定化于支撑物上的聚糖。 本发明在支撑物上提供聚糖分子阵列。如本文所使用，"支撑物"是指适合用于阵列聚 糖分子的任何材料。所属领域技术人员将理解，可采用多种材料中的任一种。为仅提供 数个实例，可用于本发明的支撑物材料包括疏水性膜，例如硝化纤维素、PVDF或尼龙 膜。所述膜为所属领域中所熟知且可获自例如英国赫默尔亨普斯特德的伯乐公司 (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK)。
在其它实施例中，承载聚糖阵列的支撑物可包含金属氧化物。适当金属氧化物包括 (但不限于)氧化钛、氧化钽和氧化铝。所述材料的实例可获自英国多赛BH12 4QH想 象路西格玛奥德里奇有限公司(Sigma-Aldrich Company Ltd, Fancy Road, Poole， Dorset-BH12 4QHUK)。在其它实施例中，所述支撑物为金属氧化物凝胶，或包含金属氧化物 凝胶。认为金属氧化物凝胶在给定的肉眼可见区域内提供大的表面积以辅助含碳水化合 物的分子的固定化。
可根据本发明使用的其它或替代支撑物材料包括凝胶，例如硅胶或氧化铝凝胶。所 述材料的实例可获自例如德国达姆施塔特的默克集团(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)。
在本发明的某些实施例中，使聚糖阵列固定化在可在正常使用期间抵抗尺寸或形状 变化的支撑物上。举例来说，支撑物可为涂布有适用于阵列聚糖的组分材料的载玻片。 同时，某些复合材料可合意地向支撑物提供牢固性。
如本文所证实，本发明的阵列适用于鉴别和/或表征不同的HA多肽和其结合特征。 在某些实施例中，在所述阵列上对本发明的H5多肽加以测试，以评估其结合伞形拓扑聚糖(例如，a2-6唾液酸化聚糖和尤其以伞形拓扑排列的长链(x2-6唾液酸化聚糖)的 能力。
事实上，本发明提供可用于表征HA多肽结合能力和/或作为例如检测人类结合的 HA多肽的诊断物的a2-6唾液酸化聚糖和任选a2-3唾液酸化聚糖的阵列。在一些实施 例中，本发明的阵列含有呈伞形拓扑形式的聚糖(例如(x2-6唾液酸化聚糖和尤其长链 cx2-6唾液酸化聚糖)。所属领域技术人员将显而易见，所述阵列适用于表征或检测任何 HA多肽，包括例如天然流感分离株中所见的HA多肽以及研究人员所设计和/或制备的 HA多肽。
在一些实施例中，所述阵列包括表示人类HA受体和尤其人类上呼吸道HA受体上 所见的聚糖(例如，伞形聚糖，其通常将为a2-6唾液酸化聚糖，尤其长链a2-6唾液酸 化聚糖)的约腦、15%、 20%、 25%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或95%以上的聚糖。在一些实施例中，本发明的阵 列包括图10中所述的某些或全部聚糖结构。在一些实施例中，阵列包括至少约10%、 15%、 20%、 25%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或95%以上的这些所述聚糖。
本发明提供使用聚糖阵列来鉴别或表征HA蛋白的方法。在一些实施例中，举例说 来，所述方法包含以下步骤(1)提供含有HA多肽的样本；(2)使样本与聚糖阵列接 触；和(3)检测HA多肽与阵列上的一种或一种以上聚糖的结合。
含有将与根据本发明的聚糖阵列接触的HA多肽的样本的适当来源包括(但不限于) 病理样本，诸如血液、血清/血浆、外周血液单核细胞/外周血液淋巴细胞(PBMC/PBL)、 唾液、尿、粪便、喉拭子、皮肤病变拭子、脑脊髓液、宫颈刮片、脓样本、食物基质和 来自身体的各种部分(诸如大脑、脾脏和肝脏)的组织。或者或另外，含有HA多肽的 样本的其它适当来源包括(但不限于)诸如土壤、水和植物群的环境样本。其它样本包 括例如由研究人员设计和/或制备的工程化HA多肽的实验室样本。也可以应用尚未列举 的其它样本。所属领域中已知适于检定结合本发明聚糖阵列的HA多肽的多种检测系统。 举例来说，HA多肽可以在与阵列接触之前或之后经可检测性标记(直接或间接)；然后， 可通过检测局部化标记来检测结合。在一些实施例中，可使用扫描装置来检查阵列上的 特定位置。
或者或另外，可使用例如量热、荧光或放射性检测系统或其它标记方法或其它并不 要求标记的方法来测量与排列成阵列的聚糖的结合。通常，荧光检测通常涉及以荧光分 子直接探査阵列并监控荧光信号。或者或另外，可以经标记(例如以生物素标记)用于间接荧光检测的分子探查阵列(在所述情况下，通过测试荧光标记的抗生蛋白链菌素的 结合)。或者或另外，可使用荧光淬灭法，其中排列成阵列的聚糖经荧光标记并以测试 分子(其可经或可不经不同荧光团标记)探查。在所述实施例中，与阵列的结合起作用 以消除由排列成阵列的聚糖发出的荧光，因此通过荧光发射的损失来检测结合。或者或 另外，可以已在放射性物质存在下生长(从而得到经放射性标记的探针)的活组织样本 探査排列成阵列的聚糖。可通过测量放射性发射来检测所述实施例中的结合。所述方法 适用于测定HA多肽与本发明的聚糖阵列的结合和/或结合程度。在本发明的某些实施例 中，可进一步使用所述方法来鉴别和/或表征干扰或者改变聚糖-HA多肽相互作用的试 剂。例如，下文所述的方法尤其可用于鉴别被认为能够与碳水化合物相互作用的分子是 否实际上可确实如此，或鉴别分子是否出乎意料地具有与碳水化合物相互作用的能力。
本发明也提供使用本发明的阵列来例如检测测试样本中的特定试剂的方法。举例来 说，所述方法可包含以下步骤(1)使聚糖阵列与测试样本(例如，被认为含有HA多 肽的样本)接触；和(2)检测测试样本中的任何试剂与所述阵列的结合。
另外，可使用与本发明阵列的结合来例如测定结合剂与聚糖之间的相互作用的动力 学。举例来说，本发明的用于测定相互作用动力学的方法可包括以下步骤(1)使聚糖 阵列与所测试分子接触；和(2)测量结合剂与排列成阵列的聚糖之间的相互作用的动 力学。
可通过例如如上文所详述的比色或荧光信号的实时变化来测量结合剂与本发明阵 列中的任一聚糖的相互作用的动力学。所述方法尤其可用于例如测定特定结合剂是否能 够以比与特定碳水化合物相互作用的不同结合剂高的结合程度与同一碳水化合物相互 作用。
当然，应了解可针对阵列形式本身中不存在的聚糖样本或来源来评估本发明的HA 多肽的聚糖结合。举例来说，可使本发明的HA多肽结合组织样本和/或细胞系以评估其 聚糖结合特征。适当细胞系包括例如多种哺乳动物细胞系中的任一种，尤其表现含有伞 形拓扑聚糖(例如，其中至少一些可为a2-6唾液酸化聚糖和尤其长链a2-6唾液酸化聚 糖)的HA受体的细胞系。在一些实施例中，所使用的细胞系表现具有伞形拓扑的个别 聚糖。在一些实施例中，所使用的细胞系表现多种聚糖。在一些实施例中，细胞系是获 自临床分离株；在一些情况下，其经维持或操纵以具有所需聚糖分布和/或普遍性。在一 些实施例中，组织样本和/或细胞系表现哺乳动物上呼吸道上皮细胞的聚糖特征。
数据挖掘平台
如此处所讨论，根据本发明，可通过来自聚糖结合研究的挖掘数据、结构信息(例如HA晶体结构)和/或蛋白结构预测程序来鉴别和/或表征HA多肽。
图11中说明本发明者所使用(且本文中例示)的特定数据挖掘方法中涉及的主要 步骤。这些步骤涉及针对三个元件的操作数据对象、特征和分类器。"数据对象"为 存储于数据库中的原始数据。在聚糖阵列数据的情况下，聚糖结构在单糖和键联方面的 化学描述以及其与所筛选的不同GBP的结合信号构成数据对象。数据对象的特性为"特 征"。选择基于特征所获得的规则或模式来描述数据对象。"分类器"为用于将数据对象 群集成特定类别或确定特征之间的关系的规则或模式。分类器提供以高亲和力结合GBP 的聚糖所满足的特定特征。这些规则分为两类(1)存在于一组高亲和力聚糖配体上的 特征，认为其可增强结合；和(2)不应存在于高亲和力聚糖配体中的特征，认为其对 结合不利。
本文使用的数据挖掘平台包含彼此相互作用的软件模块(图11)来执行上文所述的 操作。特征提取器将作为CFG数据库的界面以便提取特征，且CFG所使用的基于所述 对象的相关数据库有利于特征的灵活确定。
獰f楚欲浙教薪,备，
从聚糖阵列上的聚糖提取的代表性特征列于表l中。 表l.从聚糖阵列上的聚糖提取的特征。
基于规则的分类算法使用本表中所述的特征来鉴别表征与特异性GBP结合的模式。
所提取的特征 卓薪體
组成
明确组成
微辨, 对
三联体 四联体
特征描述
hex、 hexNAc、 dHex、唾液酸等的数量[在图1中，组成为Hex=5; HexNAc=4]。清楚地记录末端组成[在图1中，末端组成为Hex=2; HexNAc=2]。
Glc、 Gal、 GlcNAc、 Fuc、 GalNAc、 Neu5Ac、 Neu5Gc等的数量[在图 l中，明确组成为Man-5; GlcNAc=4]。明确记录末端明确组成[在图 l中，末端明确组成为Man=2; GlcNAc=2]。
对是指一对通过键联共价连接的单糖。所述对分为两类正规[B]和用 于区分对与以非还原端封端的一个单糖的末端[T][图2]。提取所述对 的频率作为特征。
三联体是指一组三个通过两个键联共价连接的单糖。现将其分为三 类，即正规[B]、末端[T]和表面[S][图2]。提取各类三联体的组成作为 特征。
与三联体特征类似，也提取具有四个单糖和其键联的四联体特征[图 2]。四联体分为两类，正规[B]和表面[S]。提取不同四联体的频率作 为特征。
在上述表面三联体和四联体的情况下，如果忽略键联信息，那么将得平均叶片深度 叶片数量
每个聚糖的平均信号 信噪比
到一组单糖群集，且将其出现频率(组成)列表。选择这些特征来分 析单糖之间键联类型的重要性。
作为探针有效长度的指示，提取树的还原端的平均深度作为聚糖特 征。在图2B中，叶片深度为3、 4和3，且平均值为3.34。 作为聚糖树扩展的量度,提取非还原单糖的数量作为特征。对于图2B， 叶片数量为3。对于图l，叶片数量为4。 莸淳伊1,述,身,遂游 0￡尸游这些存肥
对相同聚糖的三联体或四联体[视阵列型式而定]表示的原始信号值求 平均值。
根据阴性对照计算平均噪声[由CFG研发的标准化方法]以计算信噪比 岡。
选择所展示的这些特定特征的基本原理为GBP上的聚糖结合位点通常容纳二-四 糖。使用基于树的表示法来捕集关于聚糖结构中的单糖和键联的信息(树根在还原端)。 这种表示法有利于各种特征的抽取，包括高级特征，诸如经连接的单糖三联体组等(图 12)。数据准备涉及产生聚糖阵列中的所有聚糖以及所抽取的各聚糖的特征(表l)的分 栏式列表。针对基于规则的分类法(参看下文)，从聚糖和其特征的此主表中选择出一 个子集以确定控制与特定GBP或GBP组结合的特定模式。
已研发出不同类型的分类器且将其用于许多应用中。其主要分为三个主要类别数 学法、距离法和逻辑法。这些不同方法以及其优点和缺点详细论述于维斯(Weiss)及英 杜克亚(Indrukhya)(预测性数据挖掘一实践指南(fVe&c"ve dam m!'m'"g—A prac〃c^ 摩根考夫曼(Morgan Kaufmann)，圣弗朗西斯科(San Francisco), 1998)中。 对于此特定应用，我们选择一种称为规则归纳的方法，其属于逻辑法。规则归纳分类器 产生呈^7菜-J 4规则(/F-7W￡Wrule)形式的模式。
逻辑法且尤其产生^7菜-J74规则的诸如规则归纳法等分类器的一个主要优点在于， 当与其它统计学或数学法相比较时，分类器的结果可更容易地得到解释。这使得能探索 出所发现的规则或模式的结构和生物显著性。使用早前描述的特征所产生的示范性规则 (表l)为—亩菜聚糖"Galb4GlcNAcb3Gal『Bl"且^^f "Fuca3GlcNAc[B]"，遵 益聚糖将以较高亲和力结合半乳糖凝集素3。在此情况下使用的特定规则归纳算法为维 斯及英杜克亚(预测性数据挖掘一实践指南摩根考夫曼，圣弗朗西斯科，1998)所研 发的算法。
兹緒度
确定各聚糖阵列筛选数据集的区分低亲和力与高亲和力结合的临界值。核酸
在某些实施例中，本发明提供编码HA多肽或HA多肽的特征或生物学活性部分的 核酸。在其它实施例中，本发明提供与编码HA多肽或HA多肽的特征或生物学活性部 分的核酸互补的核酸。
在其它实施例中，本发朋提供与编码HA多肽或HA多肽的特征或生物学活性部分 的核酸杂交的核酸分子。可将所述核酸例如用作引子或探针。仅举数个实例，可将所述 核酸用作聚合酶链反应(PCR)中的引子、用于杂交(包括原位杂交)的探针和/或用于 逆转录PCR (RT-PCR)的引子。
在某些实施例中，核酸可为DNA或RNA且可为单链或双链的。在一些实施例中， 本发明的核酸可包括一种或一种以上非天然核苷酸；在其它实施例中，本发明的核酸仅 包括天然核苷酸。
抗体
本发明提供本发明的HA多肽的抗体。这些抗体可为单克隆或多克隆抗体，且可通 过所属领域技术人员已知的多种技术中的任一种来制备(参见例如，哈露(Harlow)及 兰尼(Lane)，抗体实验手册(A油》o&w A i^7orafo^y Ma""^),美国冷泉港实验室 出版社，1988)。举例来说，可通过包括产生单克隆抗体在内的细胞培养技术或经由将 抗体基因转染到适当细菌或哺乳动物细胞宿主中以允许产生重组抗体来制备抗体。
医药组合物
在一些实施例中，本发明提供医药组合物，所述组合物包括HA多肽、编码所述多 肽、所述多肽的特征或生物学活性片段的核酸或核酸、结合所述多肽或片段的抗体、与 所述多肽或结合其的聚糖相互作用的小分子等。
本发明包涵通过投与所述本发明的医药组合物来治疗流感感染。在一些实施例中， 通过投与疫苗实现治疗。迄今为止，尽管在研发流感疫苗方面己取得显著成就，但仍存 在进一步改善的空间。本发明提供包含本发明的HA多肽且尤其包含结合伞形聚糖(例 如(x2-6连接的伞形聚糖，诸如长链a2-6唾液酸化聚糖)的HA多肽的疫苗。
仅举一个实例，至少部分归因于H5HA的低免疫原性，在人类中产生对H5N1菌株 具有特异性的疫苗的尝试通常无法获得成功。在一个研究中，针对H5N1菌株的疫苗经 展示产生l:40的抗体效价，这并非足以确保防止受到感染的高效价。此外，产生甚至适 度的l:40抗体效价所需的剂量(2个剂量的90pg经纯化的杀死病毒或抗原)为常见季 节性流感病毒疫苗的情况下通常所用剂量的12倍(曲阿诺(Treanor)等人,新英格兰医 学杂志(NEngJMed) ,354:1343,2006)。其它研究已类似地展示当前的H5疫苗并不具有高度免疫原性(布瑞森(Bresson)等人，柳叶刀(Lancet), 367:1657,2006)。在一些 实施例中，使用一种或一种以上旨在允许使用较低剂量的H5 HA蛋白和/或达成较高免 疫原性的策略(参见例如，爱斯瑞克(E隨ink)，科学，309:996,2005)来调配本发明 的疫苗。举例来说，在一些实施例中，(例如经由使用树状聚合物)提高多价；在一些 实施例中，使用一种或一种以上佐剂，等等。在一些实施例中，本发明提供疫苗和这些 疫苗向人类受检者的投与。在某些实施例中，疫苗为包含以下各物中的一者或一者以上 的组合物(1)灭活病毒；(2)活减毒流感病毒，例如复制缺陷病毒；(3)本发明的 HA多肽或其特征或生物学活性部分；(4)编码HA多肽或其特征或生物学活性部分的 核酸；(5)编码HA多肽或其特征或生物学活性部分的DNA载体；和/或(6)表达系统， 例如表达一种或一种以上欲用作抗原的流感蛋白的细胞。
因此，在一些实施例中，本发明提供灭活流感疫苗。在某些实施例中，灭活流感疫 苗包含以下三种类型的抗原制剂中的一种灭活全病毒；亚病毒颗粒，其中由清洁剂或 其它试剂破坏经纯化的病毒颗粒以溶解脂质包膜("裂解"疫苗)；或经纯化的HA多肽
("亚基"疫苗)。在某些实施例中，可通过使用甲醛、e-丙内酯、乙醚、乙醚与清洁剂
(诸如吐温-80)、十六垸基三甲基溴化铵(CTAB)和曲通(Triton) NlOl、脱氧胆酸钠 和磷酸三(正丁酯)进行处理将病毒灭活。灭活可发生在(从在卵中制备的病毒)净化尿 囊液之后或之前；通过离心来分离并纯化病毒颗粒(尼克尔森(Nicholson)等人编，流 感教科书(Textbook of Influenza),美国布莱克威尔科学出版公司(Blackwell Science), 梅登(Maiden),马里兰州(MA)， 1998)。为评估疫苗的效能，可使用单向放射免疫扩 散(SRD)测试(斯切尔德(Schild)等人，世界卫生组织简报(Bull. World Health Organ.), 52:43-50 & 223-31, 1975;莫斯托(Mostow)等人，临床微生物学杂志(J. Clin. Microbiol), 2:531， 1975)。
本发明也提供活的减毒流感疫苗且减毒方法为所属领域所熟知。在某些实施例中， 经由使用诸如定点诱变等反向遗传学来实现减毒作用。
在一些实施例中，使用于疫苗的流感病毒在卵中生长，例如在含胚鸡蛋中生长，在 所述情况下，所收集的材料为尿囊液。或者或另外，可由使用组织培养使病毒生长的任 何方法获得流感病毒。用于使病毒生长的适当细胞底物包括例如狗肾脏细胞(诸如 MDCK或来自MDCK、 MDCK样细胞的克隆的细胞)，猴肾脏细胞(诸如包括Vero细 胞的AGMK细胞)，作为连续细胞系的经培养上皮细胞，293T细胞，BK-21细胞，CV-1: 细胞，或适于产生用于疫苗目的的流感病毒的任何其它哺乳动物细胞类型(包括上气道 上皮细胞)，其易于由商业来源获得(例如美国马里兰州的罗克维尔的美国典型培养物'收藏中心(ATCC，Rockville,Md))。适当细胞底物又包括人类细胞，诸如MRC-5细胞。 适当细胞底物并不局限于细胞系；例如，也包括诸如鸡胚胎纤维母细胞等初级细胞。
在一些实施例中，本发明的疫苗进一步包含一种或一种以上佐剂。举例来说，可使 用铝盐(拜勒(Baylor)等人，疫苗(Vaccine), 20:S18， 2002)和单磷酰基脂质A (MPL; 拉比(Ribi)等人，(1986),细菌内毒素免疫学与免疫药理学(Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins), 普莱南出版公司 (Plenum Publ. Corp.), 纽约(NY)，第407页，1986)作为人类疫苗中的佐剂。或者或另外，目前正在测试在 人类疫苗中用作佐剂的新化合物，诸如MF59 (美国凯龙集团(Chiron Corp.), http:〃www.chiron.com/investors/pressreleases/2005/051028.html ) 、 CPG 7909 (库柏 (Cooper)等人，f滞，22:3136, 2004)和皂角苷，诸如QS21 (弗奇克安(Ghochikyan) 等人，疫滞，24:2275,2006)。
另外，所属领域中己知某些增强流感疫苗的免疫原性的佐剂，诸如聚[二(羧根基苯 氧基)磷氮烯](PCCP;派恩(Payne)等人，疫苗16:92， 1998)、干扰素-Y (曹(Cao) 等人，疫苗，10:238,1992)、嵌段共聚物P1205 (CRL1005;卡茨(Katz)等人，疫苗， 18:2177， 2000)、介白素-2 (IL-2;姆乌克(Mbwuike)等人，疫苗，8:347, 1990)和聚 甲基丙烯酸甲酯(PMMA;克如特(Kreuter)等人，医药科学杂志(J. Pharm. Sci.)， 70:367， 1981)。 i
除疫苗外，本发明还提供其它适用于治疗病毒性感染的治疗组合物。举例来说，在 一些实施例中，通过投与干扰本发明的HA多肽的表达或活性的药剂实现治疗。举例来 说，可使用包含抗体(诸如识别含有特定HA多肽(例如结合伞形聚糖的HA多肽)的 病毒颗粒的抗体)、核酸(诸如与HA序列互补的核酸序列，其可用于RNAi)、竞争结 合HA受体的聚糖、竞争聚糖-HA多肽相互作用的小分子或糖模拟剂(glycomometics) 或其任何组合的组合物实现治疗。在一些实施例中，使用大量具有不同结构的不同药剂。 在一些实施例中，治疗组合物包含一种或一种以上多价药剂。在一些实施例中，治疗包 含在暴露或疑似暴露之后不久紧急投与。
通常，除一种或一种以上诸如无菌生物相容性载剂(包括(但不限于〉无菌水、生 理盐水、缓冲生理盐水或右旋糖溶液)等惰性试剂外，医药组合物还将包括治疗剂。或 者或另外，所述组合物可含有多种添加剂中的任一种，诸如稳定剂、缓冲液、赋形剂或 防腐剂。在某些实施例中，医药组合物将包括经囊封、捕获或结合在脂囊泡、生物可用: 和/或生物相容性和/或生物可降解底物或其它微粒内的治疗剂。
可单独或者组合一种或一种以上其他治疗剂(包括(但不限于)疫苗和/或抗体)投与本发明的医药组合物。"组合"并不打算暗示药剂必须同时投与或必须经调配用于一 起递送，虽然这些递送方法也在本发明的范围内。通常，将以针对各药剂所确定的剂量 和时程投与所述药剂。另外，本发明包涵组合可提高生物可用性、降低或改善新陈代谢、 抑制排泄或改善在身体内的分布的药剂来递送本发明的医药组合物。虽然可使用本发明 的医药组合物来治疗任何有需要的受检者(例如任何动物)，但最优选地使用其治疗人 类。
可通过多种途径投与本发明的医药组合物，包括经口、静脉内、肌肉内、动脉内、 皮下、心室内、经皮、皮内、经直肠、阴道内、腹膜內、局部(通过粉剂、软膏、乳膏 或滴剂)、经黏膜、经口腔，或以经口或经鼻喷雾剂或气溶胶形式投与。通常，最适当 的投与途径将依赖多种因素，包括药剂的性质(例如其在胃肠道环境中的稳定性)、患 者的状况(例如患者是否能够耐受经口投与)等。目前，经口或经鼻喷雾剂或气溶胶途 径最常用于将治疗剂直接递送到肺和呼吸系统。然而，考虑到药物递送科学的可能进步， 本发明包涵通过任何合适途径递送本发明的医药组合物。
用于递送本文所述的皮内医药组合物的适当装置包括短针装置，诸如描述于美国专 利第4,886,499号、美国专利第5,190,521号、美国专利第5,328,483号、美国专利第 5,527,288号、美国专利第4,270,537号、美国专利第5,015,235号、美国专利第5,141,496 号、美国专利第5,417,662号中的装置。也可以通过限制针在皮肤中的有效穿透长度的 装置投与皮内组合物，所述装置诸如描述于WO99/34850 (以引用的方式并入本文中) 中的装置，和其功能等效物。经由刺入角质层且产生达到真皮的射流的液体射流注射器 或针将液体疫苗递送到真皮的射流喷射装置同样合适。射流喷射装置是描述于例如以下 专利中美国专利第5,480,381号、美国专利第5,599,302号、美国专利第5,334,144号、 美国专利第5,993,412号、美国专利第5,649,912号、美国专利第5,569,189号、美国专 利第5,704,911号、美国专利第5,383,851号、美国专利第5,893,397号、美国专利第 5,466,220号、美国专利第5,339,163号、美国专利第5,312,335号、美国专利第5,503,627 号、美国专利第5,064,413号、美国专利5,520,639第号、美国专利第4,596,556号、美 国专利第4，790，824号、美国专利第4,941,880号、美国专利第4,940,460号、WO 97/37705 和WO 97/13537。使用压縮气体来加速粉末形式的疫苗穿过皮肤外层到达真皮的弹道粉 末/颗粒递送装置同样合适。另外，在皮内投药的典型曼托(mantoux)法中可使用常规 注射器。
医药剂的调配和制造中的通常考虑事项可见于例如雷明顿医药科学(Remington' s Pharmaceutical Sciences),第19版，麦克出版公司(Mack Publishing Co.),伊斯顿(Easton),宾夕法尼亚(PA), 1975中。 诊断/试剂盒
本发明提供用于检测病理样本中的HA多肽且尤其检测具有特定聚糖结合特征(例 如，结合伞形聚糖、a2-6唾液酸化聚糖、长链a2-6唾液酸化聚糖等)的HA多肽的试 剂盒，所述病理样本包括(但不限于)血液、血清/血浆、外周血液单核细胞/外周血液 淋巴细胞(PBMC/PBL)、唾液、尿、粪便、喉拭子、皮肤病变拭子、脑脊髓液、宫颈刮 片、脓样本、食物基质，和来自身体各部分(诸如大脑、脾脏和肝脏)的组织。本发明 也提供用于检测环境样本(包括(但不限于)土壤、水和植物群)中的所关注HA多肽 的试剂盒。也可以应用尚未列举的其它样本。
在某些实施例中，本发明的试剂盒可包括一种或一种以上特异性检测具有特定聚糖 结合特征的HA多肽的药剂。所述药剂可包括例如特异性识别某些HA多肽(例如，结 合伞形聚糖和/或a2-6唾液酸化聚糖和/或长链a2-6唾液酸化聚糖的HA多肽)的抗体， 其可用于通过ELISA、免疫荧光和/或免疫印迹法特异性检测所述HA多肽。这些抗体也 可以用于病毒中和测试，其中以所关注的HA多肽的特异性抗体处理样本并测试其相对 于未经处理样本感染所培养的细胞的能力。如果所述样本中的病毒含有所述HA多肽， 那么抗体将中和病毒并防止其感染所培养的细胞。或者或另外，也可以将所述抗体用于 HA抑制测试，其中从给定样本分离HA蛋白，以特定HA多肽或HA多肽组的特异性 抗体处理并测试其相对于未经处理样本凝聚红血球的能力。如果样本中的病毒含有所述 HA多肽，那么抗体将中和HA多肽的活性并防止其凝聚红血球(哈露及兰尼，抗体 实验手册，美国冷泉港实验室出版社，1988 ; http:〃www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHO CDS CSR NCS 2002 5/en/ index.html ;
施例中，所述药剂可包括特异性结合编码特定HA多肽且可用于通过RT-PCR或原位杂 交特异性检测所述 HA 多肽的核苷酸的核酸 (http:〃www.who.mt/csr/resources/publications/influenza/WHO CDS CSR NCS 2002 5/en /index.html ; http:〃www.who.int/csr/disease/avian influenza/guidelines/labtests/en/index.html)。在某些实 施例中，在检测之前扩增已从样本分离的核酸。在某些实施例中，诊断试剂可经可检测 性标记。
本发明同时提供含有本发明的用于产生流感病毒和疫苗的试剂的试剂盒。试剂盒的内含物包括(但不限于)含有编码所关注的HA多肽(或特征或生物学活性部分)的HA 核苷酸(或特征或生物学活性部分)的表达质粒。或者或另外，试剂盒可含有表达所关 注的HA多肽(或特征或生物学活性部分)的表达质粒。也可以包括不含病毒基因的表 达质粒，以便用户能够并入来自任何所关注的流感病毒的HA核苷酸。试剂盒也可以包 括哺乳动物细胞系，包括(但不限于)Vero和MDCK细胞系。在某些实施例中，诊断 试剂可经可检测性标记。
在某些实施例中，根据本发明使用的试剂盒可包括参考样本、用于处理样本、进行 测试的说明书、用于解释结果的说明书、缓冲液和/或进行测试所必需的其他试剂。在某 些实施例中，试剂盒可包含抗体组。
在本发明的某些实施例中，可使用如上文所讨论的聚糖阵列作为诊断剂和/或试剂盒。
在某些实施例中，使用本发明的聚糖阵列和/或试剂盒来进行剂量反应研究，以评估 HA多肽与伞形聚糖在多个剂量(例如，如本文所述)下的结合。所述研究提供对所测 试的HA多肽的结合特征的尤其有益洞察，且尤其适用于评估特异性结合。此种类型的 剂量反应结合研究发现许多适用的应用。仅举一个实例，其可有助于追踪相关系列的 HA多肽变体中结合特征的进化，而无论所述系列是经由自然进化、有意工程化还是两 者的组合所产生。
在某些实施例中，使用本发明的聚糖阵列和/或试剂盒来诱导、鉴别和/或选择HA 多肽，和/或具有所需结合特征的HA多肽变体。举例来说，在一些实施例中，使用本发 明的聚糖阵列和/或试剂盒对HA多肽的群体施加进化(例如，筛选和/或选择)压力。
例证
实例l:关于H1、 H3和H5HA与a2-3和ot2-6唾液酸化聚糖的结合特异性的框架 来自Hl (PDBID: 1RD8、 1RU7、 1RUY、 1RV0、 1RVT、 1RVX、 1RVZ)、 H3 (PDB ID: 1MQL、 1MQM、 1MQN)禾卩H5 (1JSN、 1JS0、 2FK0)的HA的晶体结构以及其 与(x2-3和/或a2-6唾液酸化寡糖的复合物已提供关于特异性HA-聚糖相互作用中所涉及 的残基的分子洞察。近来，已通过筛选包含多种cx2-3和(x2-6唾液酸化聚糖的聚糖阵列 上的野生型和突变体来详细描述禽类和人类Hl和H3亚型的聚糖受体特异性。
1918年人类流行性病毒的HA中的Asp 190Glu突变使其特异性从a2-6反向为cx2-3 唾液酸化聚糖(史蒂文斯等人，分子生物学杂志( /. A^/. 355:1143,2006;格拉
瑟(Glaser)等人，病毒学杂志(/. 79:11533， 2005)。另一方面，禽类HI (A/
鸭/阿尔伯达/35/1976)上的双重突变Glul90Asp禾fl Gly225Asp使其特异性从a2-3反向为a2-6唾液酸化聚糖。在H3亚型的情况下，1963年禽类H3N8病毒株与1967-68年流 行性人类H3N2病毒株之间Gln226变为Leu和Gly228变为Ser的氨基酸改变与其从a2-3 到a2-6唾液酸化聚糖的优选性的改变相关(罗杰斯(Rogers)等人，自然，304:76， 1983)。 在雪貂模型中，使用高致病性和毒力的1918 H1N1病毒来证实HA聚糖结合特异性与传 播效率之间的关系(塔姆佩T. M. (Tumpey， T. M.)等人，科学，315:655,2007)。
将受体结合特异性从亲本人类(x2,6唾液酸化聚糖(SC18)受体优选性转变成禽类 a2，3唾液酸化受体优选性(AV18)会产生无法传播的病毒。另一方面， 一种混合a2，3/a2,6 唾液酸化聚糖特异性病毒(A/纽约/1/18 (NY18))不展现传播性，意外的是同样为混合 a2，3Ax2,6唾液酸化聚糖特异性的A/得克萨斯/36/91 (Tx91)病毒能有效传播。此外，如上 文所述，各种高致病性H5N1病毒菌株也展示混合(x2，3/a2,6唾液酸化聚糖特异性(山田 S. (YamadaS.)等人，自然444:378,2006)，且仍能在人与人之间传播。关于HA的唾 液酸化聚糖特异性和传播的混合结果引起以下问题。第一，在人类上呼吸道中所见的唾 液酸化聚糖是否存在多样性，且这能否解释病毒的特异性和组织嗜性？第二，是否存在 可能对于a2-3和/或a2-6唾液酸化聚糖与HA聚糖结合口袋如何结合起作用的聚糖构象 的细微变化？总的来说，关于人类适应性，聚糖结合A型流感病毒HA的要求是什么？
幼覆瀞务//浙耽/《对亍W、沼浙//5 ffi4兹合a2-3麼#麼化褒靜,嚴》/7游兹裕銜
劍
所有HA-聚糖共晶体结构的分析指示Neu5Ac糖(SA)的定向是相对于HA聚糖 结合位点固定。锚定SA涉及不同HA亚型中高度保守的氨基酸Phe95、 Ser/Thr136、 Trpl53、 Hisl83、 Leu/Ile194组。因此，HA对a2-3或a2-6的特异性受HA聚糖结合位 点与糖苷氧原子和除SA外的糖的相互作用控制。
Neu5Aca2-3Gal键联的构象使得a2-3中的Gal和除Gal外的糖定位在受此键联处的 糖苷扭转角控制的锥形区中(图6)。最小能量构象的典型区域是通过约-60或60或180 的0)值指定，其中\|/从-60到60抽样(图14)。在这些最小能量区域中，a2-3中除Gal 外的糖伸出 HA聚糖结合位点外。这也可从HA与a2-3基元 (Neu5Aca2-3Gal(31-3/4GlcNAc-)的共晶体结构显而易见，其中①值通常为约180 (称 为反式构象)。反式构象使得a2-3基元伸出口袋外。这暗示，以三个糖(或三糖)a2-3 基元为中心在Gal禾n/或GlcNAc (或GalNAc)糖处分枝的结构变化(硫酸化和岩藻糖基 化)将对HA结合具有最大影响(图7)。此结构含义与从数据挖掘分析获得的关于HA 与(x2-3唾液酸化聚糖结合的三类不同分类器相符(表3)。所有这三个类别的共有特征 为不应存在Neu5Aca2-3Gal以及GalNAcot/pi-4Gal 。晶体结构分析表明，连接到Neu5Aca2-3Gal的Gal的GalNAc造成与蛋白的不利空间接触，这与分类器相符。
除唾液酸结合的保守锚定点外，结合Neu5Accx2-3Gal基元涉及两个关键残基Gln226 和Glul90。位于结合位点底部的Gln226与Neu5Aca2-3Gal键联的糖苷氧原子相互作用 (图15,图C、 D)。位于Gln226的相对侧上的Glul90与Neu5Ac和Gal单糖相互作用 (图15,图C、 D)。此外，在禽类HA中高度保守的残基Alal38 (邻近Gln226)和Gly228 (邻近Glul90)可涉及在促进供与a2-3唾液酸化聚糖最佳相互作用的Gln226和Glul90 的正确构象中(图15)。如在晶体结构中所观察到的，人类H1亚型APR34含有所有四 个氨基酸Alal38、 Glul90、 Gln226和Gly228且结合a2-3唾液酸化聚糖(图14,图B)。 在AAI68—H3—23、 ADU67JH3—23和APR34—Hl_23的晶体结构中附加聚糖结合位 点将提供关于Glul90侧链定位和其对HA与a2-3唾液酸化聚糖结合的影响的额外洞察。 HI HA中的Glul90的侧链伸入结合位点比H3 HA中的Glul90的侧链远(约1埃)。这 可归因于邻近Glul90残基的HI HA中的Pro 186与H3 HA中的Serl86的氨基酸差异。 如聚糖微阵列数据的数据挖掘分析所示，Glul90侧链构象的这种改变可与禽类Hl (且 非禽类H3)以适度亲和力结合一些a2-6唾液酸化聚糖相关(表3)。此外，以Gly228 取代Ser (禽类与人类H3亚型之间的标志性改变)将改变Glul90的构象且干扰人类H3 HA与反式构象的Neu5Aca2-3Gal的相互作用。这将通过在人类AAI68—H3—23共晶体结 构中所观察到的Neu5Aca2-3Gal基元的不同构象(非反式构象)进一步详述。此构象中 的Neu5Aca2-3Gal基元所提供的与人类H3 HA结合位点的最佳接触比呈反式构象的所 述基元所提供的与禽类H3 HA的最佳接触少(图14)。归因于这种接触损失，故人类 H3 HA中的Gly228Ser突变使其聚糖结合位点不太有利于与a2-3唾液酸化聚糖的相互作 用。此结构观察与由数据挖掘分析获得的结果(表3)相符，其展示人类H3HA对于一 些a2-3唾液酸化聚糖仅具有适度的亲和力。
关于Neu5Aca2-3Gal的结构变化如何影响HA-聚糖相互作用？定位在禽类H5中高 度保守的Lysl93 (图5)以使其与Neu5 Aca2-3Gal卩l-4GlcNAc中的6-0硫酸化Gal禾口/ 或6-0硫酸化GlcNAc相互作用。可通过数据挖掘分析来验证此观察结果，其中仅禽类 H5以高亲和力结合在Gal或GlcNAc处硫酸化的a2-3唾液酸化聚糖(表3)。 222位的 基本氨基酸可以类似方式与Neu5Aca2-3Galpl-3GlcNAc基元中的4-0硫酸化GlcNAc或 Neu5Aca2-3Gal(31-4GlcNAc基元中的6-0硫酸化GlcNAc相互作用。另一方面，诸如Hl 和H5中的Lys222和H3中的Trp222等庞大侧链潜在地干扰Neu5Aca2-3Galpl-4(Fucal-3) GlcNAc基元中的岩藻糖基化GlcNAc。这一结构观察确证关于禽类H3和H5菌株所观 察到的分类器规则a2-3C型(表3)，这表明在GlcNAc处岩藻糖基化对结合不利。由于
40Viet04—H5 HA与ADS97—H5 HA各自的聚糖结合位点中的氨基酸几乎相同，故二者与 a2-3唾液酸化聚糖的结合类似(表3)。
因此，对于结合oi2-3唾液酸化聚糖，除锚定Neu5Ac的残基外，在所有禽类Hl、 H3和H5亚型中高度保守的Glul卯和Gln226对于结合Neu5Aca2-3Gal基元至关重要。 与GlcNAc或GalNAc的接触以及(x2-3基元中的诸如硫酸化和岩藻糖基化等取代涉及 137、 186、 187、 193和222位的氮基酸。来自H1、 H3和H5的HA显示对于聚糖微阵 列中存在的不同ct2-3唾液酸化聚糖的不同结合特异性。这些位置中的氨基酸残基在不同 HA中并不保守，且这解释不同结合特异性。
^褒瀞务/////攻"对于//7 *沼ffi4潜^ 2-6摩液潔众覆游,嚴勿游翁賴A《激 在Neu5Aca2-6Gal键联的情况下，额外C6-C5键的存在提供增加的构象灵活性。a2-6 中Gal且随后的糖的位置将跨越比在(x2-3情况中的锥形区域大得多的伞形区域(图6)。 视寡糖的长度而定，结合a2-6将涉及与所述伞形拓扑底部处的Neu5Ac和Gal糖以及随 后的糖的最佳接触。诸如Neu5Ac(x2-6Gaipi-3/4Glc等短链a2-6寡糖将潜在地采用锥形 拓扑。另一方面，a2-6基元Neu5Aca2-6Gaipi-4GlcNAc-中GlcNAc而非Glc的存在将潜 在地有利于伞形拓扑，这可通过GlcNAc与Neu5Ac的乙酰碳之间的最佳范德华(ran der 接触得到稳定。然而，a2-6基元也可采用锥形拓扑，以致诸如分枝和HA结合 等额外因素可补偿由伞形拓扑所提供的稳定性。可通过糖内相互作用来稳定作为N连接 聚糖中多个短寡糖分枝的一部分存在的a2-6基元的锥形拓扑。另一方面，在长寡糖分枝 (至少四糖)中的a2-6基元有利于伞形拓扑。Hl禾P H3 HA与a2-6基元 (Neu5Aca2-6Gal(31-4GlcNAc-)的共晶体结构支持上述观点，其中约为-60的①(称为顺 式构象)引起除Neu5Aca2-6Gal外的糖朝着HA蛋白弯曲，从而与结合位点最佳接触(图 7)。
在Hl HA中，附加来自人类H1N1 (A/南卡罗来纳/1/1918)亚型的HA以及 ASI30—H1—26和APR34—Hl一26的聚糖结合结构域将提供关于提供对a2-6唾液酸化聚糖 的特异性所涉及的氨基酸的洞察。定位Lys222和Asp225以与Neu5Aca2-6Gal基元中的 Gal 的氧原子相互作用。定位 Aspl90 和 Ser/Asn193 以与 Neu5Aca2-6Galal-4GlcNAcal-3Gal基元的额外单糖GlcNAcal-3Gal相互作用(图15， 图A、 B)。
在1918年人类流行性病毒株的Hl HA中，Aspl90、 Lys222和Asp225高度保守。 尽管氨基酸Gln226在所有禽类和人类Hl亚型中高度保守，但与其在结合a2-3唾液酸 化聚糖中的作用(在禽类H1亚型中)相比，其似乎不涉及在结合a2-6唾液酸化聚糖(在人类H1亚型中)中。关于禽类和人类H1HA的野生型和突变形式的聚糖阵列结果的数 据挖掘分析进一步证实上述氨基酸在结合0t2-6唾液酸化聚糖方面的作用(表3)。禽类 HI HA的Glul90Asp/Gly225Asp双重突变体使其与a2-6唾液酸化聚糖的结合反向(表 3)。此外，人类ANY18—HI的Lys222Leu突变体去除其与所述阵列上所有唾液酸化聚糖 的结合，这与Lys222在聚糖结合中的重要作用相符。
为鉴别提供H3N2 HA结合a2-6唾液酸化聚糖的特异性的氨基酸，附加人类H3N2 (AAI68—H3)、 ADU63—H3—26和ASI30—HI—26的HA的聚糖结合域。对于这些附加结构 的分析展示，定位Leu226以提供与Neu5a2-6Gal基元的C6原子的最佳范德华接触且定 位Ser228以与唾液酸的09相互作用。人类H3中的Ser228也与Glul90相互作用(与 无法进行所述相互作用的禽类ADU63_H3中的Gly228不同)，从而影响其侧链构象。与 禽类H3 HA中的Glul90相比较，人类H3 HA中Glul90的侧链在结合位点中略微移位 约0.7埃。这些差异限制了人类H3 HA结合a2-3唾液酸化聚糖的能力且与其优选地结 合a2-6唾液酸化聚糖相关。因此，Gln226Leu和Gly228Ser突变引起在1967年流行病 期间禽类H3与人类H3亚型的聚糖受体特异性的反向。
来自1967-68年流行性H3N2的HA与来自近期(1990年后)H3亚型的HA的比较 展示，在近期亚型中，Glul90突变成Asp。由于定位人类H3中的Aspl90以有利地与 这些聚糖相互作用，故这一突变进一步增强人类H3与a2-6唾液酸化聚糖的结合。此结 构含义将通过关于人类H3亚型(A/莫斯科/10/1999)的聚糖阵列数据的数据挖掘分析进 一步确证。此HA包含Asp190、 Leu226和Ser228 (图2)且对a2-6唾液酸化聚糖展示 极强的优选性(表3)。
上述观察结果突显出Hl与H3 HA结合a2-6唾液酸化聚糖之间的相似性以及差异。 在Hl和H3 HA中，定位Aspl90和Ser/Asn193以使得能与除Neu5Aca2-6Gal基元外的 单糖有利地接触(图15,图A、 B)。 H1与H3 HA之间的氨基酸以及其与(x2-6唾液酸 化聚糖接触的差异提供用于结合这些聚糖的不同表面和离子互补性。Neu5Acct2-6Gal键 联具有比Neu5Aca2-3Gal多的构象自由度。因此，结合a2-6唾液酸化聚糖的HA具有 较大的结合口袋开口来容纳此构象自由。尽管定位人类H3 HA中的Leu226来提供与 Neu5Aca2-6Gal的最佳范德华接触，但由Hl HA中的Gln226所提供的与此基元的离子 接触并非最佳。另一方面，在Hl中，氨基酸Lys222和Asp225提供比H3中的Trp222 和Gly225更多的与a2-6唾液酸化聚糖的最佳离子接触。
关f梦主盧/Z7突变沐H5ffi4与ct2-6麼茨虔众褒^^兹^游兹裕腐^
由Hl和H3 HA中的不同氨基酸所提供的与a2-6唾液酸化聚糖的相互作用表明，当前禽类H5N1 HA可突变成H1样或H3样聚糖结合位点以便使其聚糖受体特异性反向。 根据上述框架，进一步确证H5 HA的假定的Hl和H3样突变并如下文所论述加以测试。
对于附加的ASI30—HI—26、 APR34—HI—26、 ADS97—H5—26禾卩Viet04_H5结构的分 析提供关于H5 HA与(x2-6唾液酸化聚糖的HI样结合的洞察。由于HI和H5 HA属于 相同结构进化枝，故其聚糖结合位点共有类似的拓扑和氨基酸分布(拉塞尔等人，病毒 学，325:287, 2004)。将在禽类H5 HA中高度保守的Lys222定位以提供类似于HI HA 中的类似Lys的与Neu5Aca2-6Gal基元的Gal的最佳接触。Viet04—H5中的Glul90和 Gly225 (替代Hl中的 Aspl90和 Asp225 ) 不提供类似于Hl 的与 Neu5Aca2-6Gal(3l-4GlcNAc基元的必要接触。因此H5 HA中的Glul卯Asp和Gly225Asp 突变可潜在地改进与a2-6唾液酸化聚糖的接触。
关于Neu5Aca2-6Gaipi-4GlcNAc(31-3Gal(31-4Glc寡糖中除GlcNAc外的相互作用以 及Hl和H5 HA的聚糖结合口袋的分析展示，尽管Hl HA中的Ser/Asn193提供与倒数 第二个Gal的有利接触，但H5中的类似Lysl93与GlcNAcpi-3Gal基元具有不利的空间 重叠。因此，Lysl93Ser突变可提供与a2-6唾液酸化聚糖的额外有利接触(连同Glul90Asp 和Gly225As突变一起)。
Hl HA中高度保守的Gln226在禽类H5 HA中也保守。由于Gln226在HI HA结合 ct2-6唾液酸化聚糖方面起到不太积极的作用(如上文所论述)，故此氨基酸突变成诸如 Leu等疏水性氨基酸可潜在地增强其与Neu5Aca2-6Gal基元中Gal的C6原子的范德华 接触。
附加ADU63—H3—26、 AAI68_H3、 ADS97—H5—26和Viet04—H5将提供关于H5 HA 与(x2-6唾液酸化聚糖的H3样结合的洞察。尽管此附加在结构上对准H5和H3 HA的聚 糖结合位点，但其不如H5与Hl之间的结构对准那样好。分别由H3 HA中的Leu226 和Ser228所提供的与Neu5a2-6Gal基元的有利范德华接触和离子接触在H5 HA (具有 Gln226和Gly228)中不存在。由于Leu226和Ser228对于结合人类H3 HA中的a2-6唾 液酸化聚糖至关重要，故H5 HA中的Gln226Leu和Gly228Ser突变可潜在地提供与a2-6 唾液酸化聚糖的最佳接触。此外，甚至在比较H3与H5时，将Lysl93定位，以致与经 定位以提供有利接触的人类H3 HA中的Serl93相比，Lysl93将与除Neu5Aca2-6Gal基 元外的单糖具有不利的空间接触。尽管来自1967-68年流行性H3N2的HA包含GIul90, 但H5 HA中的Asp 190将经定位从而提供与较长寡糖中的Neu5Aca2-6Gal基元的较佳 离子接触。
上述残基的作用将通过针对Viet04一H5的野生型和突变形式的聚糖阵列数据的数据
43挖掘分析得到进一步确证(表3)。双重突变体Glul90Asp/Gly225Asp不结合任何聚糖结 构，这是因为其失去结合a2-3唾液酸化聚糖的氨基酸GIul90且Lysl93对于结合a2-6 唾液酸化聚糖具有空间干扰。与双重突变体类似，Gln226Leu/Gly228Ser结合一些a2-3 唾液酸化聚糖(a2-3B型分类器)，而且还结合单个双触a2-6唾液酸化聚糖(a2-6A型 分类器)。
关于所述与双触a2-6唾液酸化聚糖结合的分析表明，此聚糖中的Neu5Aca2-6Gal 键联可潜在地以延长构象结合双重突变体，但仅具有较少接触(图16)。此外， Mala 1 -3Man分枝上的Neu5Aca2-6Gal比Mana 1 -6Man分枝上的相同基元更有利地结合， 所述Mancxl-6Man分枝上的相同基元与H5 HA的聚糖结合位点具有不利的空间接触(图 16)。Gln226Leu/Gly228Ser双重突变体对于a2-6唾液酸化聚糖的较窄特异性与干扰结合 的Lysl93 —致。
不希望受任何特定理论的束缚，发明者提出人类适应A型流感病毒HA的必要条件 为得到以高亲和力结合长a2-6 (主要在人上呼吸道中表达)的能力。举例来说，聚糖多 样性的一个方面为经唾液酸封端的乳糖胺分枝的长度。这通过由数据挖掘分析所得到的 (x2-6唾液酸化聚糖的两个不同特征来捕集(表3)。 一个特征通过连接到N连接核心的 Man的Neu5Aca2-6Gal(31-4GlcNAc表征且另一特征是通过连接到另一乳糖胺单元从而 形成较长分枝(通常采用伞形拓扑)的所述基元表征。因此，突变体H5 HA与上呼吸 道的广泛结合只有在这些突变体以高亲和力结合采用伞形拓扑的具有长a2-6的聚糖时 才可能。举例来说，根据本发明，理想结合模式包括结合图9中所述的伞形聚糖。
相比之下，我们注意到 一 则有关经修饰H5 HA蛋白(含有Gly228Ser和 Gln226Leu/Gly228Ser取代)的近期报导，其展示仅结合聚糖阵列上的单个双触a2-6唾 液酸基-乳糖胺聚糖结构(史蒂文斯等人，科学312:404,2006)。因此，如本文中所述， 所述经修饰H5 HA蛋白不是BSHB H5 HA。
实例2: HA的克隆、杆状病毒合成、表达和纯化
病毒中的血球凝集素以三聚体形式存在且固定到膜上。HA的全长构筑体具有N末 端信号肽和C末端跨膜序列。对于HA的重组表达来说，通常使用允许分泌蛋白的HA 的短构筑体。通过以Gp67信号肽序列置换HA的N末端信号肽来产生此短的可溶性构: 筑体，且C末端跨膜区域是经后接胰蛋白酶裂解位点和6X-His标记的'foldon'序列置 换(史蒂文斯等人，分子生物学杂志，355:1143， 2006)。 HA的全长与可溶性形式都表 达在昆虫细胞中。以含有全长或可溶性形式的HA的杆状病毒感染Sf-9细胞在Sf900 II SFM培养基(美国英杰生命技术公司(Invitrogen))中的悬浮培养物。感染后72-96小
44时收集细胞。
来自A/越南/1203/2004的血球凝集素(HA)是由呵道尔夫加-沙(Adolfo Garcia-Sastre)友善馈赠。使用速变(QuikChange) IIXL定点诱变试剂盒(美国斯特精 公司(Stratagene))和速变多定点诱变试剂盒(美国斯特精公司)，将此"野生型"(WT) HA用作产生两种不同的突变构筑体DSLS和DSDL的模板。使用基于网站的程序 PrimerX (http:脂oinfo腿tics.org/primerx/)来设计用于诱变的引子，且由美国英杰生命 技术公司合成。使用TOPO连接反应将WT和突变HA基因次克隆到入门载体pENTR-D TOPO (美国英杰生命技术公司)中。使用通路(Gateway)克隆技术将含有WT和突变 基因的入门载体与杆状病毒表达系统(BaculoDirect)线性DNA (美国英杰生命技术公 司)重组。在各次克隆步骤中进行DNA定序以证实序列的准确度。使用所制备的重组 杆状病毒DNA来转染草地粘虫(S/K^o/7"ra/rag!'peWa) Sf-9细胞(美国英杰生命技术 公司)以产生原始病毒储备物。
通过根据王(Wang)等人，(2006)疫苗，24:2176修正的方法从受感染细胞的膜部 分纯化全长HA。简要说来，通过离心来收集来自150 ml培养物的细胞，且在4。C下以 30ml在缓冲液A (20mM磷酸钠、1.0mMEDTA、 0.01%特级托(Tergitol) -NP9、 5% 甘油，pH5.93)中的l免特级托NP-9提取细胞小球达30min。然后，使提取物在6,000 g下经受离心达15 min。使用0.45微米过滤器过滤上清液且将其加载到先前已使用缓冲 液A达到平衡的Q/SP管柱(通用电气医疗集团(GE healthcare),皮斯卡塔韦 (Piscataway)，新泽西(NJ))上。加载后，以20 ml缓冲液A洗涤管柱。然后，断开阴 离子交换管柱Q且使用5个5 ml份的缓冲液B (20 mM磷酸钠、0.03%特级托、5%甘 油，pH8.2)和两个5ml份的缓冲液C (20mM磷酸钠、150 mM NaCl、 0.03%特级托、 5%甘油，pH 8.2)使用SP管柱来洗脱蛋白。将含有所关注蛋白的洗脱份汇集在一起且 使用艾米肯超滤(Amicon Ultra) IOOKNMWL膜过滤器(密理博公司(Millipore))使 其经受超滤。将蛋白浓縮且在PBS中重构。
使用史蒂文斯等人(2004)中所述的方案，由受感染细胞的上清液纯化可溶性形式 的HA。简要说来，浓缩上清液且通过使用Ni-NTA珠粒(全精公司(Qiagen))进行亲 和性层析而从浓縮的细胞上清液回收可溶性HA。汇集含有HA的洗脱份且针对10 mM Tris-HCl、 50mMNaCl; pH8.0透析。使用单-Q HR10/10管柱(法玛西亚(Pha觀cia))， 对透析样本进行离子交换层析法。将含有HA的洗脱份汇集在一起且使用艾米肯超滤100 KNMWL膜过滤器(密理博公司)使其经受超滤。将蛋白浓縮且在PBS中重构。
通过以抗禽类H5N1 HA抗体进行西方印迹分析来验证样本中蛋白的存在。经由斑点免疫检定(使用获自蛋白科学公司(Protein Sciences Inc)的WT H5 HA作为参考)， 测定WT和突变体的蛋白浓度。在所进行的各种实验中，发现H5HA (WT和突变体) 的蛋白浓度通常在20-50微克/毫升范围内。基于给定批次的蛋白浓度，使用在1:10-1:100 范围内的适当连续稀释液(参见图17)。
实例3:应用数据挖掘平台来研究HA的聚糖结合特异性
研发H5N1亚型与cx2-3/6唾液酸化聚糖的结合框架(图7)。这一框架包含两个互补 分析。第一个分析涉及使用Hl、 H3和H5 HA-聚糖共晶体结构系统性分析HA聚糖结合 位点以及其与a2-3和a2-6唾液酸化聚糖的相互作用(表2)。
这一分析提供对HA聚糖结合位点与多种(x2-3/6唾液酸化聚糖(包括伞形或锥形拓 扑的聚糖)的相互作用的重要洞察。第二个分析涉及分析关于不同Hl、 H3和H5HA的 聚糖阵列数据的数据挖掘方法。此数据挖掘分析使不同野生型和突变体HA的强、弱和 非结合剂与微阵列中的聚糖的结构特征相关(表3)。
重要的是，这些相关性(分类器)捕集a2-3/6唾液酸化键联的微小结构变化和/或 不同拓扑对结合不同HA的影响。如下文所论述，将从数据挖掘分析获得的聚糖特征的 相关性定位于HA聚糖结合位点上，从而提供系统地研究H1、H3和H5 HA与a2-3和a2-6 唾液酸化聚糖(包括不同拓扑的聚糖)的结合的框架。
仅举一个实例，将此框架应用于根据本发明的H5 HA来说明a2-6寡糖链的链长、 尤其在分枝程度的情况下如何变得比关于聚糖的结构变化的细微差别更重要。举例来 说，与针对关于个别(x2-6基元的结构变化相比较，具有单一a2-6基元的三触结构与具 有较长a2-6基元的双触结构将影响HA-聚糖结合。这可通过用于本文中从数据挖掘获得 的a2-6基元的不同长度依赖性分类器来确定(表3)。
实例4:广谱人类结合H5HA多肽
在本发明的一些特定实施例中，HA多肽为H5多肽。在一些所述实施例中，本发明 的H5多肽展示结合(例如高亲和力和/或特异性结合)伞形聚糖。在一些实施例中，将 本发明的H5多肽称为"广谱人类结合"(BSHB) H5多肽。
最初设计短语"广谱人类结合"(BSHB)来指H5多肽结合人类上皮组织中所见的 HA受体且尤其结合由(x2-6唾液酸化聚糖表征的人类HA受体。如以上通常关于HA多 肽所讨论，在一些实施例中，本发明的BSHBH5HA多肽结合人类上呼吸道上皮细胞上 所见的受体。此外，本发明的BSHB H5 HA多肽结合多种不同的a2-6唾液酸化聚糖。 在某些实施例中，BSHBH5HA多肽结合伞形聚糖。
在某些实施例中，本发明的BSHB HAHA多肽结合支气管和/或气管中的HA受体。在一些实施例中，BSHB H5 HA多肽不能结合深肺中的受体，且在其它实施例中，BSHB H5HA多肽能够结合深肺中的受体。在其它实施例中，BSHBH5HA多肽不能结合a2-3 唾液酸化聚糖，且在其它实施例中BSHBH5HA多肽能够结合a2-3唾液酸化聚糖。
在某些实施例中，本发明的BSHBH5HA多肽为母体H5HA (例如，天然流感分离 物中所见的H5HA)的变体。举例来说，在某些实施例中，与野生型H5HA相比较， 本发明的BSHB H5 HA多肽在聚糖结合位点内具有至少一个氨基酸取代或具有至少一 个影响聚糖结合位点的氨基酸取代。在一些实施例中，所述取代为直接与所结合的聚糖 相互作用的氨基酸；在其它实施例中，所述取代为从与所结合的聚糖相互作用的氨基酸 去除的1度分离的氨基酸，这是由于去除的1度分离氨基酸(1)与直接结合氨基酸相 互作用；(2)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，但不与聚糖本身 直接相互作用；或(3)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，且同 时与聚糖本身直接相互作用。本发明的BSHB H5 HA多肽含有一种或一种以上直接结合 氨基酸、 一种或一种以上第一程度分离氨基酸、 一种或一种以上第二程度分离氨基酸或 所述情况的任何组合的取代。在一些实施例中，本发明的BSHBH5HA多肽可含有具有 甚至更高的分离程度的一种或一种以上氨基酸的取代。
在某些实施例中，与野生型H5HA相比较，本发明的BSHB H5 HA多肽具有至少 两种、三种、四种、五种或五种以上氨基酸取代；在某些实施例中，本发明的BSHBH5 HA多肽具有两种、三种或四种氨基酸取代。在一些实施例中，所有这些氨基酸取代都 位于聚糖结合位点内。
在某些实施例中，BSHB H5 HA多肽相对于野生型H5 HA在选自由以下残基组成的 群组的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代残基98、 136、 138、 153、 155、 159、 183、 186、 187、 190、 193、 194 195、 222、 225、 226、 227和228。在其它实施例中， BSHB H5 HA多肽相对于野生型H5 HA在选自位于直接结合聚糖的受体的区域中的氨 基酸的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代，所述残基包括(但不限于)残基98、 136、 153、 155、 183、 190、 193、 194、 222、 225、 226、 227和228。在其它实施例中，BSHB: H5 HA多肽相对于野生型H5 HA在选自位于直接结合聚糖的受体的区域的邻近处的氨 基酸的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代，所述残基包括(但不限于)残基98、 138、 186、 187、 195和228。
在其它实施例中，BSHB H5 HA多肽相对于野生型H5 HA在选自由以下残基组成的 群组的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代残基138、 186、 187、 190、 193、 222、 225、 226、 227和228。在其它实施例中，BSHB H5 HA多肽相对于野生型H5 HA在选
47自位于直接结合聚糖的受体的区域中的氨基酸的残基处具有一种或一种以上氨基酸取 代，所述残基包括(但不限于)残基190、 193、 222、 225、 226、 227和228。在其它实 施例中，BSHB H5 HA多肽相对于野生型H5 HA在选自位于直接结合聚糖的受体的区域 的邻近处的氨基酸的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代，所述残基包括(但不限于) 残基138、 186、 187和228。
在其它实施例中，BSHB H5 HA多肽相对于野生型H5 HA在选自由以下残基组成的 群组的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代残基98、 136、 153、 155、 183、 194和 195。在其它实施例中，BSHBH5HA多肽相对于野生型H5HA在选自位于直接结合聚 糖的受体的区域中的氨基酸的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代，所述残基包括 (但不限于)残基98、 136、 153、 155、 183和194。在其它实施例中，BSHB H5 HA多 肽相对于野生型H5 HA在选自位于直接结合聚糖的受体的区域的邻近处的氨基酸的残 基处具有一种或一种以上氨基酸取代，所述残基包括(但不限于)残基98和195。
在某些实施例中，BSHB H5 HA多肽相对于野生型H5 HA在选自从与所结合的聚糖 相互作用的氨基酸去除的1度分离的氨基酸的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代， 这是由于去除的1度分离氨基酸(1)与直接结合氨基酸相互作用；(2)以其它方式影 响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，但不与聚糖本身直接相互作用；或(3)以 其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，且同时与聚糖本身直接相互作 用，所述残基包括(但不限于)残基98、 138、 186、 187、 195和228。 1
在其它实施例中，BSHB H5 HA多肽相对于野生型H5 HA在选自从与所结合的聚糖 相互作用的氨基酸去除的1度分离的氨基酸的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代， 这是由于去除的1度分离氨基酸(1)与直接结合氨基酸相互作用；(2)以其它方式影 响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，但不与聚糖本身直接相互作用；或(3)以 其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，且同时与聚糖本身直接相互作 用，所述残基包括(但不限于)残基138、 186、 187和228。
在其它实施例中，BSHB H5 HA多肽相对于野生型H5 HA在选自从与所结合的聚糖 相互作用的氨基酸去除的1度分离的氨基酸的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代， 这是由于去除的1度分离氨基酸(1)与直接结合氨基酸相互作用；(2)以其它方式影 响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，但不与聚糖本身直接相互作用；或(3)以 其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，且同时与聚糖本身直接相互作 用，所述残基包括(但不限于)残基98和195。
在某些实施例中，BSHB H5 HA多肽相对于野生型H5 HA在残基159处具有氨基酸取代。
在其它实施例中，BSHB H5 HA多肽相对于野生型H5 HA在选自190、 193、 225 和226的残基处具有一种或一种以上氨基酸取代。在一些实施例中，BSHB H5 HA多肽 相对于野生型H5 HA在选自190、 193、 226和228的残基处具有一种或一种以上氨基 酸取代。在一些实施例中，本发明的HA多肽变体和尤其H5变体具有以下氨基酸取代 中的一者或一者以上Serl37Ala、 Lysl56Glu、 Asnl86Pro、 Aspl87Ser、 Aspl87Thr、 Alal89Gln、 Alal89Lys、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Glul90Thr、 Lysl93Arg、 Lysl93Asn、 Lysl93His、 Lysl93Ser、 Gly225Asp、 Gln226Ile、 Gln226Leu、 Gln226Val、 Ser227Ala、 Gly228Ser。
在一些实施例中，本发明的HA多肽变体和尤其H5变体具有以下氨基酸取代组中 的一者或一者以上
Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp和Gln226Leu: Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gln226Leu和Gly228Ser; Alal89Gln、 Lysl93Ser、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Alal89Gln、 Lysl93Ser、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Aspl87Ser/Thr、 Alal89Gln、 Lysl93Ser、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Aspl87Ser/Thr、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Lysl56Glu、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Lysl93His、 Gln226Leu/Ile/Val、 Gly228Ser; Lysl93Arg、 Gln226Leu/Ile/Val、 Gly228Ser; Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gly225Asp; Lysl56Glu、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gly225Asp; Serl37Ala、 Lysl56Glu、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gly225Asp; Glul90Thr、 Lysl93Ser、 Gly225Asp;
Aspl87Thr、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp; Asnl86Pro、 Aspl87Thr、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp; Asnl86Pro、 Aspl87Thr、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp、 Ser227Ala。
在某些所述实施例中，与野生型HA相比较，HA多肽具有至少一种其它取代，使 得变体对伞形聚糖的亲和力和/或特异性增加。
在某些实施例中，本发明的BSHB H5 HA多肽具有Hl HA的胺基酸序列特征。举
49例来说，在一些实施例中，所述HI样BSHB H5 HA多肽具有取代Glul90Asp、Lysl93Ser、 Gly225Asp和Gln226Leu。
在某些实施例中，本发明的BSHB H5 HA多肽具有HI HA的胺基酸序列特征。举 例来说，在一些实施例中，所述H3样BSHB H5 HA含有取代Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gln226Leu和Gly228Ser。
在一些实施例中，与野生型H5HA相比较，本发明的BSHB H5 HA多肽具有开放 结合位点。在一些实施例中，本发明的BSHBH5HA多肽结合以下a2-6唾液酸化聚糖
(》 (》)、d)、(o^:^)、(c^^)、e^核心)、(^~核心)、
^x2;^ +六、
("Gh^"fe心)和其组合。在一些实施例中，本发明的BSHB H5 HA多肽结合以下结构
的豕鹏、H )、 )、 d )和其组合；和/或(^"^);和/或(^""^");
和/或r^"核心)、r^"核心)、r^^核心)；和其组合。在一些实施例中，:
本发明的BSHBH5HA多肽结合(，)、)和/或^°~ );在一些实施例中'结 合(O^Q--)；在一些实施例中，结合C^^"—);且在一些实施例中，结合
("^i-核心)(-S^"核心)和,或("fe^核心)
在一些实施例中，本发明的BSHB H5 HA多肽结合伞形拓扑聚糖。在某些实施例中， 本发明的BSHB H5 HA多肽结合图9中所述的至少一些聚糖(例如a2-6唾液酸化聚糖)。 在一些实施例中，本发明的BSHBH5HA多肽结合图9中所述的多种聚糖。
在些实施例中，本发明的BSHB H5 HA多肽结合至少约10%、 15%、 20%、 25%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95% 或95%以上的在人类上呼吸道组织(例如上皮细胞)内的HA受体上所见的聚糖。
实例5:人类上呼吸道组织中的聚糖多样性
凝集素结合研究展示a2-3和(x2-6在上呼吸道组织中的分布的多样性。染色研究指 示ct2-6唾液酸化聚糖作为N-连接(纤毛细胞)与O连接聚糖(在杯状细胞中)的一部 分在气管上皮的顶面上的显著分布(图18)。另一方面，气管组织的内部区域主要包含 分布于N-连接聚糖上的a2-3。长期探究何种(x2-6唾液酸化聚糖受体存在于人类肺中。
50MALDI-MS聚糖分布分析展示a2-6唾液酸化聚糖在人类上气道上的实质多样性(图 10)以及显著表达。显著地，使用MALDITOF-TOF的代表性质峰的片段化证实具有多 个乳糖胺(lactosamine)重复序列的较长寡糖分枝与短寡糖分枝相比广泛地分布的聚糖 拓扑(图10)。为提供上气道中聚糖分布和拓扑的多样性的参考，对来自人类结肠上皮 细胞(HT29)的N-连接聚糖进行MALDI-MS分析。已知当前的H5N1病毒主要感染肠 管，且因此选择这些细胞来作为代表性肠管细胞。HT29细胞的聚糖分布显著不同于HBE 的分布，其中a2-3分布显著且长链寡糖分枝聚糖拓扑并不如所观察到的那样(图IO)。
通过以下方法产生图18的数据。从美国生物科学公司(US Biological)购买由福尔 马林(Formalin)固定且由石蜡包埋的人类气管组织切片。将组织切片去石蜡且再水合 后，使用抗生蛋白链菌素/生物素阻断试剂盒(载体实验室(Vector Labs))来阻断内源 性生物素。然后，使用FITC标记的木菠萝凝集素(对O连接聚糖具有特异性)、生物素 化伴刀豆凝集素A (Concanavalin A) (Con A，对a连接甘露糖残基具有特异性，所述 残基为构成N连接聚糖的核心寡糖结构的-一部分)、生物素化怀槐(Maackiaamurensis) 凝集素(MAL，对SAa2，3-gal具有特异性)和生物素化西洋接骨木(Sambuccus nigra) 凝集素(SNA,对SAa2，6-gal具有特异性)(载体实验室；在具有0.5%吐温-20的PBS 中10 pg/ml)将切片培育3小时。以TBST洗涤(具有1%吐温-20的Tris缓冲生理盐水) 后，以阿拉克斯弗洛(Alexa fluor) 546抗生蛋白链菌素(在具有0.5%吐温-20的PBS 中2叫/ml)将切片培育1小时。使用TBST洗涤载玻片且在共聚焦顯微鏡(蔡斯(Zeiss) LSM510激光扫描共聚焦顯微鏡術)下检视。在室温下(RT)进行所有培育。
使用以下方法产生图10的数据。当细胞达到>90%長滿时，利用100mM柠檬酸盐 生理盐水缓冲液收集细胞(约70乂106个)，且在用蛋白酶抑制剂(卡百科姆生化公司 (Calbiochem))处理和均质化后分离细胞膜。以PNGaseF (纽英伦生物技术公司(New England Biolabs))处理细胞膜部分且将反应混合物在37'C下培育过夜。使反应混合物 沸腾10min以使酶失活，并使用赛普-巾白克(Sep-Pak)C18SPE料筒(沃特世公司(Waters)) 去除经脱糖基化的肽和蛋白。将聚糖进一步脱盐且使用石墨化碳固相萃取管柱(苏普克 公司(Supelco))纯化成中性(25%乙腈部分)和酸性(含有0.05%三氟乙酸的50%乙 腈)部分。使用软电离条件(加速电压22kV、栅极电压93%、导线0.3%和150ns的萃 取延迟时间)，通过MALDI-TOFMS分别以阳性和阴性模式分析酸性部分。将峰值校正 为未sodiated物质。由使用唾液酸酶A和S进行的样本预处理证实a2-6唾液酸化聚糖 的显著表达。然后，在37。C下，使用在lOOmL最终体积的50mM磷酸钠(pH6.0)中 的0.1U尿节杆菌(A"/iroZ7a""i^a/ade/w)唾液酸酶(唾液酸酶A，非特异性)或肺炎鏈球菌(&repfococaw/^ewwom'ae)唾液酸酶(唾液酸酶S，对a2-3唾液酸化聚糖具 有特异性)将经分离聚糖培育24小时。通过MALDI-TOFMS分别以阳性和阴性模式分 析中性和酸性部分。
实例6: Hl和H3 HA与人类肺组织的剂量反应结合
气管组织的顶面主要表达具有长分枝拓扑的a2-6聚糖。另一方面，肺泡组织主要表 达a2-3聚糖。Hl HA显著结合气管的顶表面且其结合随着从40 ing/ml稀释到10 |iig/ml 而逐渐降低(图19)。 Hl HA仅在最高浓度下也展示与肺泡组织的某些弱结合。H3HA 的结合模式不同于Hl HA，其中H3 HA展示在40和20 pg/ml下与气管和肺泡组织切片 显著结合(图19)。然而，HA在IO pg/ml的浓度下展示主要结合气管组织的顶面且与 肺泡组织的结合很弱甚至不结合。总的说来，组织结合数据指出1) H1和H3 HA与气 管组织的顶面的高亲和力结合；和2)当H3HA对a2-3展示亲和力(比a2-6相对较低) 时，HI HA对a2-6高度特异。
使用以下方法产生图19中的数据。分别从美国生物底物公司(USBiomax，Inc)和 美国生物科学公司购买由福尔马林(Formalin)固定且由石蜡包埋的人类组织肺和气管 切片。将组织切片去石蜡、再水合且使用PBS中的1% BSA培育30分钟以防止非特异 性结合。使H1N1和H3N2 HA分别与一级抗体(小鼠抗6X His标记，德硕公司(Abeam)) 和二级抗体(阿拉克斯弗洛488山羊抗小鼠，美国英杰生命技术公司)以4:2:1的比率 在冰上预复合20分钟。将所形成的复合物稀释于1% BSA-PBS中，达到40、20或10 pg/ml 的最终HA浓度。然后，将组织切片与HA抗体复合物一起在室温下培育3小时。将切 片用碘化丙啶(美国英杰生命技术公司；在TBST中1:100)复染色，充分洗涤且然后 在共聚焦顯微鏡(蔡斯LSM510激光扫描共聚焦顯微鏡術)下检视。
实例7:野生型HA多肽与不同拓扑的聚糖的剂量反应直接结合
如本文所述，本发明包涵以下认知HA多肽与具有本文中称为"伞形"拓扑的特 定拓扑的聚糖的结合与HA多肽介导人类宿主的感染的能力有关。本实例描述介导不同 宿主感染的不同HA多肽的直接结合研究的结果且说明人类感染与伞形聚糖结合之间的 相关性。
直接结合检定通常使用聚糖阵列，其中通常使用聚合物主链使指定的聚糖结构(例 如单价或多价)呈现于支撑物(例如玻璃载片或孔板)上。在所谓的"序列"检定中， 使三聚HA多肽与阵列结合且然后，例如使用经标记(例如经FITC或辣根过氧化物酶 标记)的一级和二级抗体进行检测。在"多价"检定中，首先使三聚HA与一级和二级 抗体(通常以4:2:1 HA: —级:二级比率)复合，使得每个预复合的HA存在12个聚糖结合位点，且然后使三聚HA与阵列接触。通常在一系列HA浓度内进行结合检定，以便 获得关于对阵列中的不同聚糖的相对亲和力的信息。
举例来说，使用具有不同聚糖的阵列进行直接结合研究，所述聚糖诸如3'SLN、 6'SLN、 3'SLN- LN、 6'SLN-LN禾P 3'SLN-LN-LN，其中LN表示Gal P l-4GlcNAc， 3'表 示Neu5Aca2-3且6'表示Neu5Acct2-6。具体来说，使用先前用PBS清洗三次的经抗生蛋 白链菌素涂布的高结合力384孔板将生物素化聚糖(50 pi 120pmol/ml)培育过夜(在 PBS中，在4。C下)。然后，使用PBS将板洗涤三次以去除过量聚糖，且无进一步处理 即直接使用。
以4:2:1 HA: —级:二级比率，将适量的His标记的HA蛋白、一级抗体(小鼠抗6X His 标记)和二级抗体(HRP结合的山羊抗小鼠IgG)在冰上培育15分钟。然后，使用PBS 中的1呢BSA将混合物(即，预复合的HA)补足到250 ^1的最终体积。然后，将50 pl 预复合的HA添加到384孔板中的经聚糖涂布的孔中且在室温下培育2小时。然后，使 用含有0.059b吐温-20的PBS将孔洗涤3次，且然后使用PBS洗涤3次。根据制造商的 说明书，使用埃普莱斯(Amplex)红过氧化物酶试剂盒(美国英杰生命技术公司，加利 福尼亚(CA))来评估HRP活性。研究HA预复合物的连续稀释液。包括适当的阴性(非 唾液酸化聚糖)和背景(无聚糖或无HA)对照，且将所有检定重复进行三次。将结果 提供于图20中。
已知的人类适应性Hl和H3 HA的结合模式的一个特征为其在从40叫/ml稀释下降 到5 pg/ml的范围内在饱和水平下结合长链a2-6 (6'SLN-LN)(图20)。尽管HI HA对 于结合长链a2-6高度特异，H3 HA也以高亲和力结合短链a2-6 (6'SLN)且相对于a2-6 以较低亲和力结合长链a2-3 (图20)。 H1禾BH3 HA的直接结合剂量反应与组织结合模 式相一致。此外，Hl和H3 HA与长链cx2-6的高亲和力结合与其与表达具有长分枝拓扑 的a2-6聚糖的气管组织的顶面的广泛结合有关。此相关性提供对人类适应Hl和H3 HA 的上呼吸道组织嗜性的有益洞察。另一方面，所测试H5HA展示相反的聚糖结合趋势， 其中与对a2-6的相对低亲和力(显著信号仅在20-40 pg/ml下可见)相比，其以高亲和 力结合a2-3 (饱和信号从40下降到2.5 |ag/ml)(图20)。
等效物
所属领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定 实施例的许多等效物。本发明的范围不打算限于上述实施方式，而是如随附权利要求中 所述。
权利要求
1.一种工程化HA多肽，其结合伞形拓扑聚糖。
2. 根据权利要求1所述的工程化HA多肽，其中所述伞形拓扑聚糖包含a2-6唾液酸化聚糖。
3. 根据权利要求1或2所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以高亲和力结合所述伞形拓扑聚糖。
4. 根据权利要求3所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以与介导人类感染的野生型人类适应性HA的亲和力相当的亲和力结合所述伞形拓扑聚糖。
5. 根据权利要求3所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以为介导人类感染的野生型HA的亲和力的至少50%的亲和力结合所述伞形拓扑聚糖。
6. 根据权利要求3所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以为介导人类感染的野生型HA的亲和力的至少70%的亲和力结合所述伞形拓扑聚糖。
7. 根据权利要求3所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以为介导人类感染的野生型HA的亲和力的至少80%的亲和力结合所述伞形拓扑聚糖。
8. 根据权利要求3所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以为介导人类感染的野生型HA的亲和力的至少90%的亲和力结合所述伞形拓扑聚糖。
9. 根据权利要求3所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以为介导人类感染的野生型HA的亲和力的至少100%的亲和力结合所述伞形拓扑聚糖。
10. 根据权利要求1或2所述的工程化HA多肽，其中与锥形拓扑聚糖相比较，所述HA多肽优选地结合所述伞形拓扑聚糖。
11. 根据权利要求IO所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以至少为2的相对亲和力相对于锥形拓扑聚糖结合伞形拓扑聚糖。
12. 根据权利要求10所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以至少为3的相对亲和力相对于锥形拓扑聚糖结合伞形拓扑聚糖。
13. 根据权利要求10所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以至少为4的相对亲和力相对于锥形拓扑聚糖结合伞形拓扑聚糖。
14. 根据权利要求IO所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以至少为5的相对亲和力相对于锥形拓扑聚糖结合伞形拓扑聚糖。
15. 根据权利要求IO所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以至少为IO的相对亲和力相对于锥形拓扑聚糖结合伞形拓扑聚糖。
16. —种结合伞形拓扑聚糖的经分离HA多肽，所述HA多肽不为来自以下任一菌株的Hl蛋白A/南卡罗来纳(South Carolina) /1/1 918 、 A/波多黎各(Puerto Rico) /8/1934 、A/台湾(Taiwan)/1/1986、 A/得克萨斯(Texas)/36/1991、 A/北京(Beijing)/262/1995、A/约翰内斯堡(Johannesburg)/92/1996、 A/新咯里多尼亚(New Caledonia)/20/1999、A/所罗门群岛(Solomon Islands) /3/2006;或来自以下任一菌株的H2蛋白A/日本(^口&11)/305+/1957、八/新加坡"11^&口(^)/1/1957、八/台湾/1/1964、八/台湾/1/1967;或来自以下任一菌株的H3蛋白A/爱知(Aichi) /2/1968、 A/菲律宾(Phillipines)/2/1982、 A/密西西比(Mississippi) /1/1985、 A/列宁格勒(Leningrad) /360/1986、A/四川(Sichuan) /2/1987、 A/上海(Shanghai) /11/1987、 A/北京/353/1989、 A/山东(Shandong) /9/1993、 A/约翰内斯堡/33/1994、 A/南昌(Nanchang) /813/1995、A/悉尼(Sydney) /5/1997、 A/莫斯科/10/1999、 A/巴拿马(Panama) /2007/1999、A/怀俄明(Wyoming) /3/2003、 A/俄克拉荷马(Oklahoma) /323/2003、 A/加利福尼亚(California) /7/2004、 A/威斯康星(Wisconsin) /65/2005。 '
17. —种工程化HA多肽的特征部分，其结合伞形拓扑聚糖。 .
18. —种HA多肽的特征部分，所述HA多肽不为来自以下任一菌株的H1蛋白A/南卡罗来纳/1/1918、 A/波多黎各/8/1934、 A/台湾/1/1986、 A/得克萨斯/36/1991 、 A/北京/262/1995、 A/约翰内斯堡/92/1996、 A/新喀里多尼亚/20/1999、 A/所罗门群岛/3/2006;或来自以下任一菌株的H2蛋白A/日本/305十/1957、 A/新加坡/1/1957、A/台湾/1/1964、 A/台湾/l/1967;或来自以下任一菌株的H3蛋白A/爱知/2/1968、-A/菲律宾/2/1982、 A/密西西比/1/1985、 A/列宁格勒/360/1986、 A/四川/2/1987、 A/上海/11/1987、 A/北京/353/1989、 A/山东/9/1993、 A/约翰内斯堡/33/1994、 A/南昌/813/1995、 A/悉尼/5/1997、 A/莫斯科/10/1999、 A/巴拿马/2007/1999、 A/福建(Fujian)/411/2002、 A/怀俄明/3/2003、 A/俄克拉荷马/323/2003、 A/加利福尼亚/7/2004、 A/威斯康星/65/2005，其中所述特征部分结合伞形拓扑聚糖。
19. 一种多肽，其包含根据权利要求17或18所述的特征部分。
20. —种核酸，其编码根据权利要求17或18所述的特征部分。
21. —种核酸，其编码根据权利要求19所述的多肽。
22. —种载体，其含有根据权利要求20所述的核酸。
23. —种载体，其含有根据权利要求21所述的核酸。
24. —种宿主细胞，其含有根据权利要求20所述的核酸。
25. —种宿主细胞，其含有根据权利要求21所述的核酸。
26. —种宿主细胞，其含有根据权利要求22所述的载体。
27. —种宿主细胞，其含有根据权利要求23所述的载体。
28. —种抗体，其与结合伞形拓扑聚糖的工程化HA多肽结合。
29. —种抗体，其结合HA多肽，所述HA多肽不为来自以下任一菌株的H1蛋白A/南卡罗来纳/1/1918、 A/波多黎各/8/1934、 A/台湾/1/1986、 A/得克萨斯/36/1991 、 A/北京/262/1995、 A/约翰内斯堡/92/1996、 A/新瞎里多尼亚/20/1999、 A/所罗门群岛/3/2006;或来自以下任一菌株的H2蛋白八/日本/305+/1957、 A/新加坡/1/1957、A/台湾/1/1964、 A/台湾/l/1967;或来自以下任一菌株的H3蛋白A/爱知/2/1968、A/菲律宾/2/1982、 A/密西西比/1/1985、 A/列宁格勒/360/1986、 A/四川/2/1987、 A/上海/U/1987、 A/北京/353/1989、 A/山东/9/1993、 A/约翰内斯堡/33/1994、 A/南昌/813/1995、 A/悉尼/5/1997、 A/莫斯科/10/1999 、 A/巴拿马/2007/1999 、 A/福建/411/2002、 A/怀俄明/3/2003、 A/俄克拉荷马/323/2003、 A/加利福尼亚/7/2004、 A/威斯康星/65/2005,其中所述HA多肽结合伞形拓扑聚糖。
30. 根据权利要求28或29所述的抗体，所述抗体为多克隆的。
31. 根据权利要求28或29所述的抗体，所述抗体为单克隆的。
32. —种病毒颗粒，其包括结合伞形拓扑聚糖的工程化HA多肽。
33. —种通过投与组合物来治疗流感感染的方法，所述组合物包含以下各物结合伞形拓扑聚糖的工程化HA多肽、包含结合伞形拓扑聚糖的工程化HA多肽的特征片段的多肽、与结合伞形拓扑聚糖的工程化HA多肽或其特征部分结合的抗体、编码结合伞形拓扑聚糖的工程化HA多肽或其特征部分的核酸，或其组合。
34. —种聚糖阵列，其包含至少约10%、 15%、 20%、 25%、 30%、 35%、 40%、 45%、'50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或95%以上的在人类上呼吸道组织内的HA受体上所见的聚糖结构。
35. —种用于鉴别或表征HA多肽的方法，所述方法包含以下步骤提供含有HA蛋白的样本；使所述样本与根据权利要求26所述的聚糖陣列接触；和检测HA与所述阵列上的一种或一种以上聚糖的结合。
全文摘要
本发明提供一种用于分析聚糖与结合其的相互作用搭配物之间的相互作用的系统。本发明同时提供结合伞形拓扑聚糖的HA多肽和其相关试剂和方法。
文档编号C07K16/00GK101553502SQ200780030072
公开日2009年10月7日 申请日期2007年8月14日 优先权日2006年8月14日
发明者S·拉古拉姆, 卡西克·维斯瓦那坦, 拉姆·萨西谢卡尔安, 拉胡尔·拉曼, 维斯瓦那坦·萨西谢卡尔安, 阿尔特·钱德拉塞卡朗, 阿拉温德·斯里尼瓦桑 申请人:麻省理工学院