专利名称：利用海洋微藻快速评价钻井液急性毒性的方法
技术领域：
本发明涉及钻井液的生物毒性评价，具体地说是利用海洋微藻快速评价钻井液急 性毒性的方法。
背景技术：
钻井液是一种由水以及各种化学处理剂组成的极其复杂的多相稳定胶态悬浮体， 其生物毒性主要来源于钻井液各组分。对于钻井液的生物毒性评价的研究始于20世纪60 年代，已发展了包括96h急性毒性和慢性毒性等多种评价方法，所采用的受试生物体多种 多样，包括糠虾、发光细菌、海洋微藻(如Skeletonema costatum,即本工作所选用的中肋 骨条藻)、桡脚类、蚤类和鱼类以及双贝类软体动物、片脚类动物。美国等国家主要检测钻井 液的毒性，以欧洲经济合作与发展组织(OECD)为代表的组织和国家则要求同时检测钻井 液及其组分的毒性。目前国内外对废弃钻井液的毒性检测及分级评价方法尚无统一标准。
20世纪70年代中期美国环保局(EPA)和石油工业协会(API)共同制订了巴西拟 糠虾(Mysidopsis bahia)%h急性毒性实验法，是美国环保局批准的钻井液毒性评价的唯 一方法，也是美国试验与材料学会(ASTM)和美国石油工业协会推荐的钻井液毒性的评价 标准。由于美国EPA推荐使用的巴西拟糠虾在我国无分布，我国学者致力于寻找新的可以 替代糠虾的受试生物。
与美国EPA糠虾法的96h急性毒性试验时间相比，发光细菌法和发光海藻法测量 时间大大缩短。其中发光细菌法是根据发光细菌的发光度随样品毒性总体浓度的增高而呈 线性降低的特性，测定发光细菌在接触样品15min后的发光量，得出样品的毒性水平。该检 测方法具有简易、快速、实时的特点，但由于多数钻井液的黑褐色在发光细菌的发光波段有 吸收，需要校正才能应用。另外，该方法与糠虾法的相关性较低，仅为0.3。而发光海藻法 采用专用的毒性检测仪，如QwikLiteTM 200，利用夜光发光藻Pyrocystislunula作为测试 物种，当海藻接触到污染物时，水中的毒性会杀死海藻，从死亡率预测污染物对人体和生态 环境危害的严重性，4 证时即可得出钻井液的毒性结果。但是发光海藻在实验室培养较 为困难，并且要求钻井液储备液的PH在7. 5-8. 0，通常钻井液储备液的pH值往往超出此范 围。
在海洋环境中生物种类繁多，对钻井液的耐受性差异也很大，钻井液对海域污染 评价至少需要从海水和沉积物两方面来衡量。因此，20世纪90年代一些欧洲北海沿岸国家 (North Sea countries 主要包括英国、挪威、荷兰、丹麦)出台了多种受试生物联合毒性 评价指标，如挪威石油工业协会采用海洋微藻Skeletonema costatum、桡脚类动物Acartia tonsa和双贝类软体动物Abra alba、片脚类动物Corophium volutator等分别检测合成基 钻井液对海洋生物和底栖生物的毒性。西澳矿业与能源部(WADME)采用三种生物评价钻井 液的毒性等边金藻Isochysis sp.、对虾Panaeus monodon以及桡脚类动物Gladioferens imparipes。
2001年我国颁布的国家标准《海洋石油勘探开发污染物生物毒性检验方法》GB/糠虾法黑褐新 糠虾法中华米 虾法中华对 虾法 幼鲤鱼 法发光海 藻法发光细 菌法卤虫法美国EPA-60013-84-067美国试验与材料学 会 ASTM (1988 年)96h LC50周名江等(2001年)96hLC 张保森等(1997年)96hLC5050王永艳等(1991年)96hLC50李长兴等(1999年)96hLC50美国路易斯安纳州 立大学(1991年)加拿大《Alberta Energy and Utilities Board Guide 50: Drilling Waste Management》指南 美国试验与材料协 会 ASTM (1990 年) 我国现行行业标准 《海洋石油勘探开 发污染物生物毒性4~5h EC500.25hEC5096h LC50 或 NOEC昂贵，国内无受 试生物。可操作性差。生物个体差异 大，数据重现性差。同上同上快速，但实验室 培养发光海藻有 难度，要求钻井 液 pH 在 7.5-8.0。快速，但受钻井 液的颜色干扰严 重，重现性不好， 与糠虾法相关性差。卤虫幼体的养殖 技术、养殖条件 等方面都受到限否否否否 否是是否类型 方法提出者检测指标 方法评价
CN 102031280 A说明书2/9 页T18420. 2-2001(国家技术监督局，2002)规定采用对虾的仔虾、卤虫幼体或蒙古裸腹蚤三 者中至少一种进行毒性实验(注尚未正式颁布的2006年该标准修订版中仍采用上述 试验动物)。钻井液的急性毒性评价方法列于表1。
表1钻井液的急性毒性评价方法一览表
一物型 单生模可应 否场用 是现
权利要求
1.利用海洋微藻快速评价钻井液急性毒性的方法，其特征在于1)按体积比取1份钻井液加入9份海水，搅拌静置后取上层混悬液做为贮备液；2)选择对钻井液敏感的海洋微藻进行培养至平稳期，得到进入平稳生长期后的海洋微 藻藻液；3)取锥形瓶10个或10个以上，将藻液与储备液于锥形瓶中进行混合培养3 8小时； 以每个锥形瓶中液体体积为140mL计，藻液体积为IOOmL,所加入的储备液体积从0至40mL 梯度变化，每个浓度设置2个平行样；若混合容器中藻液与储备液的体积不足的，以过滤灭 菌后的天然海水补充至140mL ；4)从锥形瓶中取样，采用荧光分光光度计测定发射荧光光谱，得到678 685nm处的活 体藻叶绿素荧光强度；5)以未加储备液的藻荧光强度作为对照，计算微藻的相对死亡率微藻的相对死亡率 =(未加钻井液的藻荧光强度-加钻井液的藻荧光强度)/未加钻井液的藻荧光强度；6)半数有效浓度EC5tl的计算根据微藻的相对死亡率，利用Curveexpert或Microsoft Excel 2003软件分别绘制 微藻死亡率与钻井液浓度关系曲线，得出微藻致死率为50%所对应的钻井液储备液的体积 V(mL)，根据 EC5tl = 0. IVX 1.02X1070. 14.(单位=Hig*!/1)计算相应时间的 EC5tl 值，其中， 钻井液储备液的密度近似地取海水密度1. 02g · mL—1。7)根据EC5tl值按照国家标准确定钻井液有无毒性。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述海洋微藻为中肋骨条藻 (Skeletonema costatum)、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)、亚心型扁藻(Platymonas subcordiforus)或小球藻(Chlorella pynenoidosa)。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于微藻的培养条件为(20士1)°C，4000 7000LUX，明暗周期12 12h，F/2培养基；接种后密度为1 4X104个/mL ；培养4 7d至 平稳期。
全文摘要
本发明涉及钻井液的生物毒性评价，具体地说是利用海洋微藻快速评价钻井液急性毒性的方法，将平稳生长期的海洋微藻液与钻井液贮备液进行混合培养3～8小时；取样，测定发射荧光光谱，得到678～685nm处的藻叶绿素荧光强度；以未加储备液的微藻荧光强度作为对照，计算微藻的相对死亡率根据微藻的相对死亡率，利用Curveexpert或Microsoft Excel2003软件绘制微藻死亡率与钻井液浓度关系曲线，根据7～8h EC50值按照国家标准确定钻井液有无毒性。本发明建立的微藻法对水基钻井液的毒性评价结果与卤虫的96h LC50的一致，比常规96h生物毒性实验时间缩短了88h，且能够在现场使用。
文档编号G01N21/64GK102031280SQ20091001952
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月30日 优先权日2009年9月30日
发明者刘丽萍, 张前前, 张妍, 李公让, 梁生康, 薛玉志, 闫学平 申请人:中国海洋大学