专利名称：一种检测鱼类精子质膜损伤的方法
技术领域：
本发明属水产养殖技术，涉及到鱼类精子质膜损伤的检测方法。
背景技术：
在养殖生产中常常需要对鱼类进行催产繁育，鱼类精子质量的好坏是繁育中非常 重要的一个环节，直接影响受精率、孵化率和成活率。鱼类精子排出体外后，其活力容易受 到外界各种环境因子的影响，不同的环境条件(温度、光照等)都会对精子造成一定损伤， 从而影响精子的质量，降低受精率、孵化率和成活率，给养殖生产带来极大损失。精子质膜 是包在精子头部外面的一层膜，具有丰富的膜蛋白，在受精过程中起着非常重要的作用，但 这层膜对外界环境因子极为敏感，容易受到损伤导致破裂或脱落。目前检测鱼类精子质膜 损伤的方法是通过扫描电镜和透射电镜进行观察，但这种方法只能从外观进行定性观察， 不能定量分析和统计，且仪器价格昂贵。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种检测鱼类精子质膜损伤的方法。本发明采集一定数量的鱼类新鲜精子和经过低温处理的精子，其特征是将新鲜精 子和经过低温处理的精子分别收集到IOmL的离心管中，800 X g离心5min，弃去上清液，用 缓冲液稀释，使待测样本精子数为(2 3) X IO5 · mL—1 ；加入2uL胰蛋白酶消化5min，然后用缓冲液洗涤2次，800 X g离心5min，再 用缓冲液重新悬浮精子，使精子细胞浓度为IjXlOSmr1 ；取195 μ L精子悬液，加入 5 μ LAnn-FITC,在室温下孵化lOmin，然后加入10 μ LPI染液，室温下避光孵育10_15min ；利 用FACSCalibur型流式细胞仪检测，流式细胞仪氩离子激发光波长为488nm，光源为200mw ； 用Cel-Iquest 9. 3版检测每个精子的前向角散光和侧向角散光；用波长为520nm的通带 滤器检测FITC荧光，另一波长大于eiOnm的滤器检测PI ；在精子凋亡早期位于质膜内侧 的磷脂酰丝氨酸迁移至质膜外侧，可与一种钙依赖性的磷脂结合蛋白V相结合；因此，将 Annexin V标记上荧光素可以作为探针检测暴露在质膜外侧的磷脂酰丝氨酸；同时结合使 用碘化吡啶PI进行双染色后，用流式细胞仪即可检测质膜完整的正常活精子、质膜损伤的 凋亡精子及质膜完全破裂的坏死精子。本发明与现有技术相比，本发明通过采用荧光双染法对受到不同损伤的精子进行 染色，经过前处理后直接用流式细胞分析仪进行检测，可定量区分质膜完整的精子和质膜 不完整的精子，结果更直观，更可靠。
具体实施例方式在鱼类的繁殖季节，采集一定数量的鱼类新鲜精子和经过低温处理的精子，将这 2份精子分别收集到IOmL的离心管中，SOOXg离心5min，弃去上清液，用缓冲液(Armexin V-PI检测试剂盒，美国BD公司)稀释，使待测样本精子数为(2 3) X IO5 · mL—1。
加入2 μ L胰蛋白酶消化5min，然后用缓冲液洗涤2次，800 X g离心5min，再 用缓冲液重新悬浮精子，使精子细胞浓度为1-2X IO5 ^mr115取195 μ L精子悬液，加入 5yL Ann-FITC (Annexin V-PI检测试剂盒，美国BD公司)，在室温下孵化lOmin，然后加 入10 μ LPI染液，室温下避光孵育10-15min。利用FACSCalibur型流式细胞仪(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)检测，流式细胞仪氩离子激发光波长为488nm，光源为 200mw。用 Cel-Iquest 9. 3 版(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)检测每个精子的前 向角散光(ESC)和侧向角散光(SSA)。用一波长为520nm的通带滤器检测FITC荧光(FLl)， 另一波长大于eiOnm的滤器检测PI (FL3)。在精子凋亡早期位于质膜内侧的磷脂酰丝氨酸 (PS)迁移至质膜外侧，可与一种钙依赖性的磷脂结合蛋白V(Annexin V)相结合。因此，将 Annexin V标记上荧光素可以作为探针检测暴露在质膜外侧的磷脂酰丝氨酸。同时结合使 用碘化吡啶PI进行双染色后，用流式细胞仪即可检测质膜完整的正常活精子、质膜损伤的 凋亡精子及质膜完全破裂的坏死精子。质膜有损伤的精子DNA可被PI染色产生红色荧光，质膜保持完好的精子则不会有 红色荧光产生。因此，在双变量流式细胞仪的散点图上，上方两个象限为PI阳性，表示精子 质膜不完整，为非活性精子；下方两个象限精子质膜完整，为活性精子。每个待测样本检测 200个精子，计算待测样本质膜完整率。运用此方法能准确检测鱼类精子的质膜损伤，可对质膜的完整率进行量化，结果 更直观，更可靠，检测准确率达到99%以上。
权利要求
一种检测鱼类精子质膜损伤的方法，采集一定数量的鱼类精子，其特征是将精子收集到10mL的离心管中，800×g离心5min，弃去上清液，用缓冲液稀释，使待测样本精子数为(2～3)×105·mL-1；加入2μL胰蛋白酶消化5min，然后用缓冲液洗涤2次，800×g离心5min，再用缓冲液重新悬浮精子，使精子细胞浓度为1-2×105·mL-1；取195μL精子悬液，加入5μLAnn-FITC，在室温下孵化10min，然后加入10μL PI染液，室温下避光孵育10-15min；利用FACSCalibur型流式细胞仪检测，流式细胞仪氩离子激发光波长为488nm，光源为200mw；用Cel-lquest 9.3版检测每个精子的前向角散光和侧向角散光；用波长为520nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于610nm的滤器检测PI；将Annexin V标记上荧光素作为探针检测暴露在质膜外侧的磷脂酰丝氨酸；同时结合使用碘化吡啶PI进行双染色后，用流式细胞仪检测质膜完整的正常活精子、质膜损伤的凋亡精子及质膜完全破裂的坏死精子。
全文摘要
一种检测鱼类精子质膜损伤的方法，涉及水产养殖技术，需要提供一种检测鱼类精子质膜损伤的方法，本发明采集鱼类精子，其特征是将精子收集到10mL的离心管中，加入2uL胰蛋白酶消化5min，用缓冲液洗涤重新悬浮精子，使精子细胞浓度为1-2×105·mL-1；取195μL精子悬液，加入5μLAnn-FITC，在室温下孵化，然后加入10μLPI染液，室温下避光孵育10-15min；通过采用荧光双染法对受到不同损伤的精子进行染色，经过前处理后直接用流式细胞分析仪进行检测，可定量区分质膜完整的精子和质膜不完整的精子。
文档编号G01N21/952GK101846638SQ20091004812
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月24日 优先权日2009年3月24日
发明者冯广朋, 刘鉴毅, 姚志峰, 庄平, 张涛, 江琪, 章龙珍, 赵峰, 闫文罡, 黄晓荣 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所