专利名称：一种检测鱼类精子线粒体损伤的方法
技术领域：
本发明属于水产养殖技术，涉及到一种检测鱼类精子线粒体损伤的方法
背景技术：
在养殖生产中常常需要对鱼类进行催产繁育，而鱼类精子质量的好坏是繁育中非 常重要的一个环节，直接影响受精率、孵化率和成活率等。鱼类精子排出体外后，其活力容 易受到外界各种环境因子的影响，不同的环境条件(温度、光照等)都会对精子造成一定损 伤，从而影响精子的质量，降低受精率、孵化率和成活率，给养殖生产带来极大损失。精子线 粒体是维持精子正常生理功能的能量来源，线粒体上含有多种参与能量代谢的酶，给精子 的运动提供所需的能量，因此线粒体功能的好坏直接反映了精子运动能力的强弱。目前检 测鱼 类精子线粒体损伤的方法是通过扫描电镜和透射电镜进行观察，但这种方法只能从外 观进行定性观察，不能定量分析和统计，且仪器价格昂贵，操作较为烦琐。
发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种检测鱼类精子线粒体损伤的方法。本发明采集一定数量的鱼类新鲜精子和经过低温处理的精子，将2份精液标本分 别用0. Olmol/L、PH 7. 4的PBS洗涤2次后300Xg离心5min ；PBS悬浮沉淀精子，调精子 密度为lX106/ml，加入Rhl23，37°C水浴孵育lOmin，离心弃上清，PBS重复洗涤离心2次， PBS悬浮，加入PI，终浓度10ug/ml，染色5min，利用FACSCalibur型流式细胞仪检测，仪器 状态设置前向散射FSC与侧向散射SSC为线性放大，荧光通道FLl和FL2对数放大，测每 个精子的荧光强度，每份悬液检测10000个精子，数据用Cell Quest软件进行分析；右下象 限Rhl23+/PI_为线粒体膜功能良好的精子，左下象限Rhl23+/PI_为线粒体膜功能丧失的精 子，左上象限Rhl237PI+为坏死精子。本发明与现有技术相比，本发明通过采用荧光双染法对线粒体正常和受到损伤的 精子进行染色，经过前处理后直接用流式细胞分析仪进行检测，可定量区分线粒体膜功能 良好的精子、线粒体膜功能丧失的精子和坏死精子，结果更直观，更可靠。
具体实施例方式在鱼类的繁殖季节，采集一定数量的鱼类新鲜精子和经过低温处理的精子，将2 份精液标本分别用PBS(0. 01mol/L, PH 7. 4)洗涤2次后300Xg离心5min。PBS悬浮沉 淀精子，调精子密度为IX 106/ml，加入Rhl23(终浓度10ug/ml)，37°C水浴孵育lOmin，离 心弃上清，PBS重复洗涤离心2次，PBS悬浮，加入PI (终浓度10ug/ml)染色5min，利用 FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司)检测，仪器状态设置前向散射FSC与侧向散 射SSC为线性放大，荧光通道FLl(绿)和FL2(红)对数放大，测每个精子的荧光强度，每 份悬液检测10000个精子，数据用Cell Quest软件进行分析。新鲜精液与处理精液结果比 较采用非参数the Mann-Whitney U test进行分析，P < 0. 05为差异显著。检测结果中右下象限Rhl23+/PI_(绿色)为线粒体膜功能良好的精子，左下象限Rhl23+/PI_(黑色)为线 粒体膜功能丧失的精子，左上象限Rhl237PI+(红色)为坏死精子。分别统计线粒体膜功能 良好、线粒体膜功能丧失和坏死精子的比例。
运用此方法能准确检测鱼类精子的线粒体损伤，对损伤程度进行量化，结果更直 观，更可靠，检测准确率达到99%以上。
权利要求
一种检测鱼类精子线粒体损伤的方法，采集一定数量的鱼类精子，其特征是将精液标本用0.01mol/L、PH 7.4的PBS洗涤2次后300×g离心5min；PBS悬浮沉淀精子，调精子密度为1×106/ml，加入Rhl23，37℃水浴孵育10min，离心弃上清，PBS重复洗涤离心2次，PBS悬浮，加入PI，终浓度10ug/ml，染色5min，利用FACSCalibur型流式细胞仪检测，仪器状态设置前向散射FSC与侧向散射SSC为线性放大，荧光通道FL1和FL2对数放大，测每个精子的荧光强度，每份悬液检测10000个精子，数据用Cell Quest软件进行分析；右下象限Rhl23+/PI-为线粒体膜功能良好的精子，左下象限Rhl23+/PI-为线粒体膜功能丧失的精子，左上象限Rhl23-/PI+为坏死精子。
全文摘要
一种检测鱼类精子线粒体损伤的方法，涉及水产养殖技术，需要提供一种检测鱼类精子线粒体损伤的方法，本发明采集一定数量的鱼类精子，其特征是精液标本用PBS洗涤后300×g离心5min；PBS悬浮沉淀精子，调精子密度为1×106/ml，加入Rhl23，37℃水浴孵育10min，离心弃上清，PBS重复洗涤离心，PBS悬浮，加入PI，染色5min，通过采用荧光双染法对线粒体正常和受到损伤的精子进行染色，经过前处理后直接用流式细胞分析仪进行检测，可定量区分线粒体膜功能良好的精子、线粒体膜功能丧失的精子和坏死精子。
文档编号G01N21/952GK101846637SQ20091004812
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月24日 优先权日2009年3月24日
发明者冯广朋, 刘鉴毅, 姚志峰, 庄平, 张涛, 江琪, 章龙珍, 赵峰, 闫文罡, 黄晓荣 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所