专利名称：：一种舒肝解郁的中药组合物制剂及质量控制方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药组合物制剂及质量控制方法，特别涉及一种舒肝解郁，安神定志的中药组合物制剂及其质量控制方法。
背景技术：
：抑郁症以心烦，焦虑、失眠、健忘为典型症状。抑郁症严重困扰患者的生活和工作，给家庭和社会带来沉重的负担。世界卫生组织、世界银行和哈佛大学的一项联合研究表明抑郁症已经成为中国疾病负担的第二大疾病。目前，抑郁症的临床治疗药物普遍存在副作用，而传统中药在治疗疾病时具有副作用低的特点，因此用中药来治疗抑郁症已经成为了一个新的治疗思路。由栀子(炒)、白术(炒)、柴胡、大枣、石菖蒲等十六味中药组合而成的本发明组合物颗粒剂作为舒肝解郁，安神定志的中药，效果甚佳。
发明内容本发明第一个目的在于提供一种舒肝解郁，安神定志的中药组合物；本发明的第二个目的在于提供该中药组合物的制备方法；本发明的第三个目的在于提供该中药组合物制剂的质量控制方法。本发明目的是通过如下技术方案实现的本发明一种舒肝解郁，安神定志的中药组合物制剂的原料组成为柴胡20-60重量份、大枣10-50重量份、石菖蒲20-60重量份、半夏(制)10_50重量份、白术(炒)10—50重量份、浮小麦80-120重量份、远志(制)20-60重量份、甘草(炎)10-50重量份、栀子(炒)20-60重量份、百合80-120重量份、胆南星20-60重量份、郁金20-60重量份、龙齿80-120重量份、酸枣仁(炒)30-70重量份、茯苳30-70重量份、当归10-50重量份。本发明一种舒肝解郁，安神定志的中药组合物制剂的原料组成优选为柴胡40重量份、大枣30重量份、石菖蒲40重量份、半夏(制)30重量份、白术(炒)30重量份、浮小麦100重量份、远志(制)40重量份、甘草(炙)30重量份、栀子(炒)40重量份、百合100重量份、胆南星40重量份、郁金40重量份、龙齿100重量份、酸枣仁(炒)50重量份、茯苓50重量份、当归30重量份。上述中药组合物的制备方法为以上十六味药材，加水煎煮1-5次，每次1-5小时，合并煎液，滤过，滤液浓縮至干，粉碎，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的剂型，包括但不限于片剂、胶囊齐u、散齐u、软胶囊齐u、滴丸、蜜丸、丸齐u、颗粒齐u、蜜炼膏齐u、缓释制齐u、速释制齐u、控释制剂、口服液体制剂。本发明公开了一种舒肝解郁，安神定志的中药组合物制剂的质量控制方法，该方法包括如下含量测定和/或鉴别中的一种或多种A、含量测定色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以5-25:75-85比例的乙腈-水为流动相；检测波长为210-250nm;对照品溶液的制备精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成每lml含6-39yg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备取中药组合物制剂适量，研细，取约0.2-1.2g，精密称定，精密加甲醇、乙醇、水中的一种或一种以上的混合溶剂12.5-100ml，称定重量，超声处理15-45分钟，放冷，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，用0.2-0.45iim的滤膜滤过，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2-12iU，注入液相色谱仪，测定；鉴别B:取中药组合物制剂10-40g加水5-80ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)、氯仿、乙酸乙酯中的一种或一种以上的混合溶剂轻轻振摇提取3-5次，每次20-80ml，合并有机溶液层，水浴浓縮至约0.5-2ml，作为供试品溶液；另取白术对照药材0.5-2g加水20-80ml的水煎煮15-45分钟，放冷，上清液用石油醚(6090°C)、氯仿、乙酸乙酯中的一种或一种以上的混合溶剂轻轻振摇提取l-3次，每次10-40ml，合并醚层，水浴浓縮至约0.5-2ml，作为白术对照药材溶液.吸取上述两种溶液各105-50y1点于同一硅胶G板上，以5-15:l-2比例的石油醚(609(TC)-醋酸乙酯混合溶剂为展开剂，展开，取出，凉干，喷以5-20%的硫酸乙醇溶液，95-12(TC烘烤2-20分钟，置紫外光(365nm)下进行观察，供试品色谱中在与白术对照药材的相应的位置上显相同颜色的荧光斑点；鉴别C:取中药组合物制剂10-40g，加无水乙醇、甲醇、乙醇中的一种或一种以上的混合溶剂10-100ml，超声处理15-45分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇0.5_2ml，作为供试品溶液；另取栀子苷对照品，制成每lml无水乙醇、甲醇、乙醇中的一种或一种以上的的混合溶剂含0.2-2mg对照品的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液5-25iU、对照品溶液l-i5yi分别点于同一硅胶G薄层板上，以(io-i:i-3:i:i)为体积比例的醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水混合溶剂为展开剂，展开，取出，凉干后，喷以1-10%香草醛浓硫酸溶液，95-12(TC加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。上述质量控制方法优选包括如下含量测定和/或鉴别中的一种或多种含量测定色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(15:85)为流动相；检测波长为238nm;对照品溶液的制备精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成每lml含0.03mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备取中药组合物制剂，研细，取约1.Og，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45ym的滤膜滤过，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10iU，注入液相色谱仪，测定；鉴别方法白术薄层鉴别取中药组合物制剂20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为供试品溶液。另取白术对照药材lg加水40ml煎煮30分钟，放冷，上清夜用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取2次，每次30ml，合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为白术对照药材溶液.吸取上述两种溶液各30iU点于同一硅胶G板上，以石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(9:2)为展开剂，展开，取出，凉干，喷以io^的硫酸乙醇溶液，i05t:烘烤io分钟，置紫外光(365nm)下进行观察，供试品色谱中在与白术对照药材的相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。栀子薄层鉴别取中药组合物制剂20g，加无水乙醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇lml溶解，作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，制成每lml乙醇含lmg对照品的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液15ii1、对照品溶液5ii1分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)为展开剂，展开，取出，凉干后，喷以5^香草醛浓硫酸溶液，11(TC加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。上述质量控制方法中药组合物制剂优选原料组成为柴胡40重量份、大枣30重量份、石菖蒲40重量份、半夏(制)30重量份、白术(炒)30重量份、浮小麦100重量份、远志(制)40重量份、甘草(炙)30重量份、栀子(炒)40重量份、百合100重量份、胆南星40重量份、郁金40重量份、龙齿100重量份、酸枣仁(炒)50重量份、茯苓50重量份、当归30重量份的颗粒剂，并通过如下方法制备以上十六味，加水煎煮三次，第一次3小时，第二、三次各2小时，合并煎液，滤过，滤液浓縮至干，粉碎，加入蔗糖适量，制成颗粒，干燥，制成颗粒剂。图1:光谱图(a-栀子苷对照品b-本发明组合物颗粒剂供试品c-栀子对照药材d-栀子阴性对照品)图2:色谱图(a-栀子苷对照品、b-本发明组合物颗粒剂供试品、c-栀子阴性对照品、d-栀子对照药材、l-栀子苷对照品)图3:栀子苷标准曲线本发明组合物颗粒剂对抑郁模型大鼠游泳绝望行为有明显的对抗作用，使逃避电击的潜伏期明显縮短，绝望状态显著减轻。本发明具有很好的抗抑郁的效果。经实验证明本发明含量测定方法检测专属性好、稳定性高、重现性好、精密度高，更加适合工业化的生产，真正确保了临床用药的安全、有效、可靠。下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。本发明所有实验例所选用的制剂均为根据本发明实施例1制得的本发明颗粒剂，但是本发明实验结果并不仅限于该颗粒剂。实验例1:药效学实验1、对多种不良剌激致抑郁症模型大鼠的影响实验方法SD大鼠67只，雌性，体重175210g，按体重分为5组。实验前将大鼠单个置于盛有2/3自来水的塑料桶内(桶高42cm，<30cm，水温19°C)，游泳15min训练1次并熟悉环境。然后按表1所示剂量每天上午灌胃给药1次，按下列顺序给予不良剌激禁食不禁水48h(2d)-电击5min(36V，10mA，上下午各1次)(ld)-禁水不禁食24h(ld)-冰水游泳5min(ld)-夹尾悬吊5min(ld)，完成1轮剌激共6d。恢复ld，第7d称体重后，每笼2只(个别3只)饲养，禁食，并喂以1%蔗糖水溶液，测定2处蔗糖水饮用量(奖赏反应)。第8d恢复正常供食和供水，第9d开始同样方法第二轮剌激。完成第2轮剌激后同法测定蔗糖水饮用量。并连续2d给药后30min，将小鼠置于水桶内，lmin后开始记时，并用秒表记录5min内大鼠累计漂浮在水面上不动的时间。经多种不良剌激联合作用后大鼠体重增长速度明显下降，一般状态略差，活动减少，在第1轮剌激的7d中体重增长只有正常的一半左右，第2轮剌激的7d中体重增长约为正常组的2/3，给药组大鼠的体重在第1轮剌激中和对照组相比有增加的趋势，至第2轮剌激完成后给药组大鼠的体重明显比对照组高。大鼠在刚放入水桶中试图逃逸，经多次努力失败后出现绝望行为，表现为静止不动地漂浮在水面，静止不动时间长短可以代表大鼠绝望(抑郁)的程度。抑郁模型组大鼠的游泳不动时间比正常对照组大鼠明显增加，本发明组合物颗粒剂对抑郁模型大鼠游泳绝望行为有明显的对抗作用。在连续2次的测试中均使游泳不动时间明显縮短，大剂量组第1次和第2次测试游泳不动时间分别降低50%和45%，中小剂量组也明显縮短游泳不动时间，剂量关系明确，见表l。糖水饮用量反映动物对奖赏的反应程度，抑郁症的模型动物对奖赏的反应性下降，糖水饮用量显著降低。本实验中模型大鼠的饮水量在经过第1轮和第2轮剌激后仅为正常组的71%和59%。本发明组合物颗粒剂可以明显增加动物的糖水饮用量，提高对奖赏的反应，并有一定的剂量关系，见表1。2、对小鼠电击绝望状态的影响实验方法ICR小鼠80只，雌性，体重1821g，按体重分成6组。按表2剂量每天灌胃给药1次，第3次给药后将小鼠(除第l组外)置电激怒箱内，调节电压36V，电流0.7mA，波宽10ms，频率20Hz，电击5min，连续电剌激3d形成暂时的抑郁模型。在第6d调电压24v，电流0.4mA，其余参数和训练时一致，并在电激怒箱放1±央4X4X3cm的小木块。给药后30min将小鼠放入电激怒箱内，立即给予电剌激，记录小鼠从电击开始到跳到(逃避)小木块上时间。第2d同样方法再测试1次。小鼠连续3d接受不能逃避的电击后，在随后可逃避的电击条件下也失去了逃避的能力，形成获得性无助状态，逃避电击潜伏期明显延迟。本发明组合物颗粒剂使逃避电击的潜伏期明显縮短，绝望状态显著减轻。见表2。与模型组比较*P<0.05，**P<0.01;正常组比较#P<0.05，抑P<0.013、对阿扑吗啡致小鼠强迫嗜咬的影响实验方法ICR小鼠78只，雄性，体重2023g，按体重分为5组，按表3剂量给药。在第5d灌胃给药后30min尾静脉注射盐酸阿扑吗啡10mg/kg(0.lml/10g体重)，并立即将小鼠置于铺有皱纸(8K复印纸，皱褶高约lcm)的塑料笼内，每笼3只，lh后取出皱纸，测量皱褶边缘破损的长度，计算纸上被咬上小孔数量。并将每cm破损长度折算成IO孔，合并计算每鼠嗜咬孔数。大剂量的阿扑吗啡引起哺乳动物如人和狗呕吐反应，但不诱导啮齿类动物呕吐，而是引起强迫嗜咬行为，这和它对中枢多巴胺能神经元的剌激有关。一些抗抑郁药物能增强阿扑吗啡致小鼠强迫嗜咬行为。在本实验中，本发明组合物颗粒剂不同剂量均能明显增强阿8际迈，爲澳溫離卿，组别剂量(g/kg)动物数电击逃避潜伏期(s)1轮刺激后2轮剌激后正常对照组106.6±1.85.4±i.5模型对照组1434.5±10.8##23.5±9.1##万拉法新组(阳性药)60mg/kg1423.3±8.7"15.0±4.9**本发明组合物颗粒剂(小)0.91424.6±11.5*19.0±6.3本发明组合物颗粒剂(中)1.81420.5±7.5**15.0±3.4*本发明组合物颗粒剂(大)2.71419.2土8.8"14.9±7.(T表1发明组合物颗粒剂对抑郁模型大鼠游泳绝望状态和对奖赏反应的影响组别剂量动物数5min内不动时间(min)饮水量(ml/只"—1)(g/kg)(笼数)1轮刺激后2轮刺激后1轮刺激后2轮刺激后正常对照组11(5)2.01±0.662.45±0.5736.4±7.4肌2±6.7模型对照组12(6)2.56±0.7431.3士0.57s25.7±8.Is23.7±6.4"万拉法新组(阳性药)60mg/kg11(5)1.74±0.77*2.03±0.7(T33.7±8.332.4±6:1*本发明组合物颗粒剂(小)0.911(5)2.02±0.952.31±0.7132.6±5.430,1±4.4本发明组合物颗粒剂(中)1.811(5)1.63±0.91*2.02±0.64**30.4±4.232.6±5.9'本发明组合物颗粒剂(大)2.711(5)1.28±0.88"1.73±0,73"3.18±6.034.3±3.9*'a:括弧内为测饮水量时每组内的笼数；与模型组比较承P〈0.05,林P〈0.01;正常组比较共P〈0.05，##P<0.01表2本发明组合物颗粒剂对小鼠电击绝望状态的影响CN101773641As廿，t0044u^^丑f^f婢s^i!遄际疏爲4&,丝a:沐執〔0045u謝3抖沐S降^遂暨簿逢X尝SJ^^丑，毁、J:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>与模型组比较*P<0.05，**P<0.014、对大鼠长期隔离饲养引起的攻击行为的影响实验方法SD大鼠30只，雄性，体重150180g，在塑料笼内(30X16cm)单笼饲养，自由进食和饮水，连续饲养3个月后，在每笼内放1只雄性小鼠，观测大鼠对小鼠的攻击行为(衔叼、撕咬)和结果(杀死)。挑选有明显攻击行为或能将小鼠杀死的大鼠18只，继续饲养lw，同法测定大鼠的攻击性，然后每天在每笼加含本发明组合物颗粒剂80g/kg(每lkg饲料中拌入浸膏12g)的饲料20g，按400g体重计算相当于4g/kg生药。在下午俟含药饲料被吃完后再添加正常饲料，连续3w，在给药第7d、14d、21d同样方法测定大鼠的攻击行为，然后改为常规饲料继续饲养2w，每周测定大鼠攻击性1次。大鼠长期单独隔离饲养，会形成明显的抑郁症状，表现为进攻性。给予本发明组合物颗粒剂后动物的攻击行为逐渐减少，第2w、3w攻击行为比给药前显著降低，程度减轻。在停止给药后攻击行为又逐渐增加。结果见表4。表4本发明组合物颗粒剂对隔离喂养大鼠攻击行为的影响(出现反应的动物数)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>与给药前比较**P<0.01，微P<0.001;与给药3w比较#P<0.05实验例2:栀子苷含量测定方法实验1、测定方法的选择根据文献报道，栀子的含量测定方法有薄层色谱_紫外分光光度法，薄层色谱扫描法，高效液相色谱法等。本实验采用高效液相色谱法测定栀子苷含量，分析速度快，灵敏度高，专属性强，应用范围广，重现性与准确性均优于薄层色谱_紫外分光光度法、薄层色谱扫描法。2、检测波长的选择通过栀子苷、本发明组合物颗粒剂、栀子药材、缺栀子阴性对照溶液的全波长扫描光谱比较可以看出栀子苷在238nm处有紫外最大吸收，且在238nm下栀子苷峰形对称，栀子阴性对照溶液无干扰。故选择该波长为检测波长。结果见图l。3、流动相的优选本发明曾以乙腈_水，甲醇_水、甲醇_磷酸水等系统作为流动相作了系列比较。结果表明，采用乙睛-水(15:85)作为流动相，在该色谱条件下，桅子苷峰峰形及分离度较好，栀子苷峰与之相邻峰的分离度不低于2.0。栀子苷的保留时间约为14.7min，栀子苷与供试溶液中其它组分达到基线分离，阴性对照液溶液图谱在栀子苷峰位置无吸收峰，阴性对照无干扰。结果见图24、色谱柱考察为了保证色谱条件的广泛适用性，考察不同品牌色谱柱对栀子苷的分离，试验结果表明DiamonsilC18(5iim，250mmX4.6mm)、AgilentZORBAXExtend-C18(5iim，250mmX4.6mm)、AgilentZORBAXEclipseXDB(5iim，250mmX4.6mm)均对栀子苷有良好的分离。5、本发明组合物颗粒剂中栀子苷提取条件的考察为了确保测定结果真实、准确，本发明通过一系列考察，确保制备供试品溶液时将本发明组合物颗粒剂中的栀子苷提取完全。5.1提取溶剂的选择根据栀子苷的理化性质，选择甲醇、乙醇、50%甲醇进行考察，确定提取本发明组合物颗粒剂中栀子苷的最优溶剂取本发明组合物颗粒剂适量，研细，取约1.Og样品三份，精密称定，分别精密加甲醇、乙醇、50%甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷后用相应提取溶剂补足减失的重量，摇匀，0.45iim的滤膜过滤，取续滤液，即得。精密吸取上述3种供试品溶液10iiL注入液相色谱仪，结果见表5。表5不同提取溶剂的栀子苷提取率比较提取溶剂50%甲醇甲醇乙醇样品称样量(g)1.01211.02311.0012峰面积422.16432.16382.16峰面积/样品称样量417.11422.40381.70通过选用不同溶剂提取本发明组合物颗粒剂中栀子苷的含量，试验结果表明甲醇较乙醇提取率高；虽然50%甲醇与甲醇提取率相近，但50%甲醇提取水溶性杂质较多，延长了色谱分离的时间，所以最终选择甲醇作为提取溶剂。5.2提取方法的选择中药制剂常用的提取方法有超声波提取法、回流提取法、冷浸法。通过试验优选提取本发明组合物颗粒剂中栀子苷的最佳提取方法。方法一回流法提取取本发明组合物颗粒剂适量，研细，取约1.0g样品，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，回流处理30分钟，放冷后用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45iim的滤膜过滤，取续滤液，即得。方法二超声法提取取本发明组合物颗粒剂适量，研细，取约1.0g样品，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷后用甲醇补足减失的重量，摇匀，O.45iim的滤膜过滤，取续滤液，即得。方法三冷浸法提取取本发明组合物颗粒剂约l.Og，研细，取约l.Og样品，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，冷浸过夜，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45m的滤膜过滤，取续滤液，即得。精密吸取上述3种供试品溶液10L注入液相色谱仪，结果见表6。表6不同方法提取法提取栀子苷提取率的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>通过三种不同提取方法的比较发现超声法、回流法提取栀子苷的效率较冷浸高。超声法较回流法操作简单，所以选择超声法提取本发明组合物颗粒剂中栀子苷。5.3提取溶剂量考察溶剂量是影响提取效率的一个很重要的影响因素，溶剂量越大，提取效率越高，但是溶剂量增加到一定量以后，提取效率增加不大。所以我们对提取的溶剂量加以考察取本发明组合物颗粒剂适量，研细，取约1.0g样品三份，精密称定，分别精密加甲醇12.5ml、25ml、50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷后用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45m的滤膜过滤，取续滤液，即得。分别精密吸取上述3个供试品溶液5iiL、10iiL、20iiL注入液相色谱仪，结果见表7。表7不同提取溶剂量提取栀子苷提取率的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>试验结果表明，25mL甲醇即可将本发明组合物颗粒剂中栀子苷基本提取完全。5.4提取时间的考察提取时间对提取效率影响较大，提取时间短，提取效率不高，延长提取时间可以增加提取效率，但过长时间的提取耗时，而且对提高提取效率增加作用不大。所以我们对提取时间加以考察取本发明组合物颗粒剂适量，研细，取约1.0g样品三份，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，分别超声处理15、30、45分钟，放冷后用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45iim的滤膜过滤，取续滤液，即得。精密吸取上述3个供试品溶液10iiL注入液相色谱仪，结果见表8:表8:不同提取时间提取栀子苷提取率的比较提取时间15min30min45min样品称样量(g)1.01221.00931.0062峰面积382.16427.16429.16峰面积/样品称样量377.55423.22426.51由试验结果可以看出15min提取时间较短所以提取不完全，30min、45min提取率相差不大，表明30min即可将制剂中栀子苷提取完全，所以确定提取本发明组合物颗粒剂中栀子苷的时间为30min。综上试验最后确定本发明组合物颗粒剂中栀子苷含量测定的色谱条件及对照品和供试品制备方法为色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈_水(15:85)为流动相；检测波长为238nm。对照品溶液的制备精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成每lml含30iig的溶液，作为对照品溶液。供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约1.Og，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45iim的滤头滤过，即得。实验例3:栀子苷含量测定方法验证实验检测仪器Agilent1100型高效液相色谱仪进样器自动进样器色谱柱安捷伦(ZorbaxC184.6X150mm，5iim)流动相乙腈-水(15:85)流速1.0ml/min检测波长238nm柱温室温对照品来源栀子苷(购于中国药品生物制品检定所批号110749-200309)对照品溶液的制备精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成每lml含0.03mg的溶液，作为对照品溶液。样品批号:04012001、04012102、04012203供试品溶液的制备取本发明组合物颗粒剂适量，研细，取约l.Og，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45iim的滤头滤过，即得。缺栀子空白溶液的制备按本发明组合物颗粒剂制备工艺制备缺栀子的空白样品，并按供试品溶液的制备方法制备阴性对照液。测定方法分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照液各lOiU，注入液相色谱仪，测定。试验结果表明，对照品和供试品峰形良好，供试品分离良好。在对照品和供试品对应出峰处，阴性无干扰。1、方法学实验1.l线性关系考察取栀子苷对照品溶液(32.16ug/ml)摇匀，分别精密吸取2、4、6、8、10、12yl注入高效液相色谱仪，测定峰面积并绘制标准曲线，表明栀子苷在0.0643-0.3S59ug间呈线性关系，其回归方程为Area=1465.218577XAmt+2.1321944(r=0.9999)，数据见表9和附图3。表9栀子苷标准曲线进样量(ug)0.064320.128640.192960.257280.32160.38592峰面积94.3501189.9793286.0491383.5734473.5214564.42001.2稳定性实验制备供试品溶液，分别于配制后0、2、4、6、12、24小时，依法测定，进样体积10iU，结果表明，其在24小时内基本稳定，结果见表10。表10稳定性实验时间(hr)02461224峰面积473.5214460.2303470.6952456.8952462.6896472.6592RSD(%)1.51.3精密度实验精密吸取对照品溶液10iU，重复进样5次，求得相对标准偏差<2%，结果见表11。表ll精密度实验14<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>1.4重现性实验取同一批号(批号04012001)样品5份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液5份，对每份进行测定，求得相对标准偏差<2%，结果见表12。表12重现性实验<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>平均含量(mg/袋)3.4214RSD(%)1.61.5回收率实验精密称取已知含量的同一批号(批号04012001)的样品0.5g五份，分别置具塞锥形瓶中，精密量取栀子苷对照品溶液(80.4ug/ml)5ml，按供试品溶液的制备方法操作，测定其含量，并计算其回收率，测定结果见下表13。表13回收率实验<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2、含量测定对三批样品进行了含量测定，发明结果见下表14:表14样品的含量测定<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>根据以上数据，将含量限度定为本品每袋含栀子按栀子苷(C17H2401Q)计，不得少于2.74mg。实验例4:白术薄层鉴别试验白术药材中含有挥发油，为白术的有效成分。白术挥发油中主要含有苍术酮(atractylone)、白术内酯A、B(butenolideA，B)，另含3_P-乙酰氧基苍术酮、3-P-羟基苍术酮等。这类成分为脂溶性成分，极性低，易溶于低级性有机溶剂，如石油醚、氯仿、醋酸乙酯等。本处方药味较多，成分复杂，本发明中利用薄层色谱检测白术中的挥发油类成分，以此鉴定制剂中含有白术药材。1、薄层色谱方法的选择常见的薄层色谱有硅胶薄层层析、纸层析、聚酰胺薄层层析等。硅胶薄层适用于低极性成分，纸层析适用于大极性成分如多糖类成分，聚酰胺层析适用于含有羟基较多的成分，白术中成分多为挥发性成分，极性较小，所以选择硅胶层析进行试验。2、供试品的制备2.1白术有效成分的富集、纯化本处方中药味较多，成份复杂，提取溶剂为水，制剂中含的白术中低极性类成分在处方中所占比例较少，所以需要对制剂中的白术中的低极性成分进行富集、纯化。常用低极性有机溶液萃取的方法提取低极性类成分。通过比较未富集、纯化的样品和经过富集、纯化的样品的薄层色谱，确定供试品需富集、纯化的必要性方法一未富集、纯化的样品取本发明组合物颗粒剂20g加水40ml溶解，水浴浓縮至最小体积，作为供试品溶液1。方法二经过富集、纯化的样品取本发明组合物颗粒剂20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并石油醚层，水浴浓縮至约lml，作为供试品溶液2。取白术对照药材lg加水40ml，煎煮30分钟，放冷，上清夜用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取2次，每次30ml，合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为白术对照药材溶液.吸取上述三种溶液，供试品溶液1点样最大量，供试品溶液2、白术对照药材溶液点样30iU点于同一硅胶G板上，以石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(9:2)为展开剂，展开，取出，凉干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，1051:烘烤IO分钟，置紫外光(365nm)下进行观察。供试品溶液1中所含成分复杂，浓縮最小体积为15ml，溶液非常粘稠、混浊，点样量最大只能为5iU，且未在白术对照药材相对应的位置上显相同颜色的荧光斑点，且杂质很多。供试品溶液2颗浓縮至lml，溶液清澈，无混浊，点样量可以达到301，经富集、纯化后一次点样所承载的制剂量为未经富集、纯化所制成供试品溶液的90倍，在白术对照药材相对应的位置上显相同颜色的荧光斑点。斑点位置确定，显色清晰。大幅提高了白术药材的检出率。结果表明制备白术的供试品溶液需要富集、纯化。2.2萃取溶剂的选择萃取低极性类成分常用的有机溶剂为石油醚(6090°C)、氯仿、醋酸乙酯。通过试验选择最佳的萃取溶剂。方法一石油醚(6090°C):取本发明组合物颗粒剂20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并石油醚层，水浴浓縮至约lml，作为供试品溶液1。方法二氯仿取本发明组合物颗粒剂20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用氯仿轻轻振摇提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并氯仿层，水浴浓縮至约lml，作为供试品溶液2。方法三醋酸乙酯取本发明组合物颗粒剂20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用醋酸乙酯轻轻振摇提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并醋酸乙酯层，水浴浓縮至约lml，作为供试品溶液3。取白术对照药材lg加水40ml，煎煮30分钟，放冷，上清液用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取2次，每次30ml，合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为白术对照药材溶液.吸取上述四种溶液，试品溶液1、2、3、白术对照药材溶液点样30ii1点于同一硅胶G板上，以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(9:2)为展开剂，展开，取出，凉干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤IO分钟，置紫外光(365nm)下进行观察。供试品1、2色谱中，在白术对照药材相对应的位置上均显相同颜色的荧光斑点，但氯仿相比石油醚(6090°C)毒性较大。供试品3杂质较供试品1、2多，在白术对照药材相对应的位置有其他斑点，对鉴别有干扰。所以选择石油醚(6090°C)为最佳萃取溶剂。2.3萃取次数的选择萃取次数越多，样品的提取率越大，但萃取一定次数以后，提取率增加不大。所以对萃取次数进行优选，选择最佳的萃取次数。取本发明组合物颗粒剂20g三份，分别加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)轻轻振摇分别提取3次(40ml，40ml，30ml)、4(40ml，40ml，30ml，30ml)、5(40ml，40ml，30ml，30ml，30ml)次合并石油醚层，水浴浓縮至约lml，作为供试品溶液1、2、3。取白术对照药材lg加水40ml，煎煮30分钟，放冷，上清液用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取2次，每次30ml，合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为白术对照药材溶液.吸取上述四种溶液，试品溶液1、2、3、白术对照药材溶液点样30ii1点于同一硅胶G板上，以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(9:2)为展开剂，展开，取出，凉干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤IO分钟，置紫外光(365nm)下进行观察。供试品1、2、3在白术对照药材相对应的位置上均显相同颜色的荧光斑点，供试品2、3斑点的荧光较供试品1更强烈、更清晰，但供试品2、3的荧光斑点的荧光基本相似，无差17别，表明萃取四次基本可将制剂中的白术成分基本萃取完全。所确定萃取的最佳次数为四次(40ml，40ml，30ml，30ml)。2.4供试品的点样量薄层色谱的点样量有一定要求，点样量较小，斑点不清晰，点样量太大，增加点样困难，容易造成过载，斑点拖尾，降低分离度，增加分离的难度。所以需要对供试品浓的点样量进行考察。取本发明组合物颗粒剂20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并石油醚层，水浴浓縮至约lml，作为供试品溶液。取白术对照药材lg加水40ml，煎煮30分钟，放冷，上清液用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取2次，每次30ml，合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为白术对照药材溶液。分别吸取供试品溶液10、30、50ii1，白术对照药材溶液30y1点于同一硅胶G板上，以石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(9:2)为展开剂，展开，取出，凉干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤10分钟，置紫外光(365nm)下进行观察。点样量为10iU的供试品在白术对照药材相对应的位置上荧光斑点强度较低，不宜观察；点样量为30iU的供试品在白术对照药材相对应的位置上荧光斑点明显，斑点大小适中，无拖尾，前后无干扰；点样量为50iU的供试品在白术对照药材相对应的位置上荧光斑点较大，明显拖尾，斑点与前后荧光斑点相连，而且点样时由于点样次数较多，破坏了硅胶薄层的表面。所以确定供试品的最佳点样量为30iU。2.5白术对照药材溶液提取溶剂量、提取时间的考察为了保证对照药材的阳性对照效果，对照药材溶液制备时需要与供试品溶液处理过程相同。由于对照药材仅为一味药材，且药材提取量较小，所以对照药材提取溶剂量、提取时间与供试品有所不同。供试品萃取时选择40ml水溶解样品，而且40ml水为提取药材量(lg)的40倍，所用溶剂量可以保证提取充分，所以制备供试品时选择40ml水提取白术对照药材。需要通过试验确定提取时间。取白术对照药材1g三份，加水40ml，分别煎煮15、30、45分钟，放冷，上清液用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取2次，每次30ml，合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为白术对照药材溶液1、2、3。分别吸取白术对照药材溶液1、2、3各30iil点于同一硅胶G板上，以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(9:2)为展开剂，展开，取出，凉干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，105°〇烘烤10分钟，置紫外光(365nm)下进行观察。白术对照药材溶液1、2、3均显荧光斑点。比较荧光斑点情况，白术对照药材溶液1的荧光斑点较暗淡，不易观察；白术对照药材溶液2、3的荧光斑点明亮清晰，且无显著差异。表明提取30min白术中成分基本提取完全，所以确定白术对照药材的最佳提取溶剂量为40ml水，提取30min。2.6白术对照药材萃取次数的考察取白术对照药材lg三份，分别加水40ml，煎煮30分钟，放冷，上清液用石油醚(6Q9(TC)分别轻轻振摇提取1、2、3次，每次30ml，合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为白术对照药材溶液1、2、3。分别吸取白术对照药材溶液1、2、3各30ill点于同一硅胶G板上，以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(9:2)为展开剂，展开，取出，凉干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，105°〇烘烤10分钟，置紫外光(365nm)下进行观察。白术对照药材溶液1、2、3均显荧光斑点。比较荧光斑点情况，白术对照药材溶液1的荧光斑点较暗淡，不易观察；白术对照药材溶液2、3的荧光斑点明亮清晰，且无显著差异。表明提取30min白术中成分基本提取完全，所以确定白术对照药材的最佳提取溶剂量为40ml水，提取30min。2.7白术对照药材点样量的确定取白术对照药材lg加水40ml，煎煮30分钟，放冷，上清液用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取2次，每次30ml，合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为白术对照药材溶液.分别吸取白术对照药材溶液10iil、30ia、50ii1点于同一硅胶G板上，以石油醚(6090°C)醋酸乙酯(9:2)为展开剂，展开，取出，凉干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤IO分钟，置紫外光(365nm)下进行观察。白术对照药材溶液点样量为10iU时，荧光斑点强度较低，不宜观察；白术对照药材溶液点样量为30iU时，白术对照药材薄层上荧光斑点清晰，大小适中，无拖尾，前后无干扰；白术对照药材溶液点样量为50iU时，白术对照药材薄层上荧光斑点较大，与前后荧光斑点相连，且明显拖尾，另外，由于点样大，点样次数较多，易对硅胶薄层表面造成破坏。因此，确定白术对照药材溶液的最佳点样量为30iU。2.8展开剂溶剂的选择薄层层析展开剂溶剂的选择，应根据化合物的性质及"相似相溶"的原则选择合适的展开溶剂。白术成分极性较小，而且提取时选择石油醚(609(TC)为提取溶剂，因此所以选择石油醚(609(TC)和极性稍大的醋酸乙酯为展开剂，通过实验选择合适的比例，使所需成分得到分离。取本发明组合物颗粒剂20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并石油醚层，水浴浓縮至约lml，作为供试品溶液。取缺白术的白术阴性制剂20g按供试品制备方法制备缺白术阴性对照溶液。取白术对照药材lg加水40ml，煎煮30分钟，放冷，上清液用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取2次，每次30ml，合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为白术对照药材溶液。取5块硅胶G薄层板，每块薄层均点样供试品、白术对照药材、缺白术阴性对照溶液各30iU，分别以石油醚(6090。C)、石油醚(6090。C)-醋酸乙酯(10:1)、石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(9:2)、石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(10:5)、醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，凉干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤10分钟，置紫外光(365nm)下进行观察。结果如下薄层板1以石油醚为展开剂，由于展开剂极性太低，供试品、对照药材中白术成分均未展开；薄层板2以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(10:1)为展开剂，极性较低，展开不充分，供试品中白术成分未与其他斑点分离；薄层板3以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(9:2)为展开剂，极性适中，对照药材品中目标斑点Rf值为0.45，且与其他成分分离良好，供试品中在白术对照药材相对应的位置上显相同颜色的荧光斑点，且该白术成分目标斑点与其他成分斑点分离良好，阴性无干扰；薄层板4、5分别以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(10:5)、醋酸乙酯为展开剂，由于展开剂极性太大，供试品、对照药材中白术成分Rf值较大，与其他成分斑点重叠，分离失败。所以确定白术硅胶薄层最佳的展开剂为石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(9:2)。2.9显色条件的选择白术中的成分日光下没有颜色和紫外下也没有荧光，所以薄层层析后不能直接观察，需要利用通用型显色剂显色后观察。常用的通用型显色剂为10%的硫酸乙醇溶液、5%香草醛硫酸溶液、碘蒸汽。取本发明组合物颗粒剂20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并石油醚层，水浴浓縮至约lml，作为供试品溶液。取白术对照药材lg加水40ml，煎煮30分钟，放冷，上清液用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取2次，每次30ml，合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为白术对照药材溶液。取3块硅胶G薄层板，每块薄层均点样供试品、白术对照药材溶液各30iU，以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(9:2)为展开剂，展开，取出，凉干。方法一薄层1喷以10%的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤10分钟；方法二薄层2喷以5%香草醛硫酸溶液加热至斑点显色；方法三薄层3置碘缸中约3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘。方法一薄层在日光下观察，供试品色谱中在与白术对照药材相对应的位置上没有观察到明显颜色的斑点，但在紫外(365nm)下在与白术对照药材相对应的位置上有明显相同颜色的荧光斑点，斑点清晰，前后无干扰。方法二薄层在日光下观察，供试品中斑点较多，在与白术对照药材相对应的位置上有其他斑点干扰，紫外(365nm)下供试品色谱中在与白术对照药材相对应的位置上没有观察到明显颜色的斑点。方法三薄层在日光、紫外(365nm)下，供试品中斑点均较少，在与白术对照药材相对应的位置上没有观察到明显颜色的斑点。因此可以确定白术薄层层析的显色条件为喷以10%的硫酸乙醇溶液，1051:烘烤IO分钟，置紫外光(365nm)下进行观察。综上试验最后确定本发明组合物颗粒剂中白术的薄层色谱鉴别条件为供试品溶液的制备取中药组合物制剂20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为供试品溶液。另取白术对照药材lg加水40ml煎煮30分钟，放冷，上清液用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取2次，每次30ml，合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为白术对照药材溶液。吸取上述两种溶液各30iU点于同一硅胶G板上，以石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(9:2)为展开剂，展开，取出，凉干，喷以10X的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤10分钟，置紫外光(365nm)下进行观察，供试品色谱中，在与对照药材色谱的相应位置上显相同颜色的荧光斑点。实验例5:栀子薄层鉴别试验栀子苷(geniposide)是栀子化学成分中一种重要的环烯醚鹏类化合物，《中国药典》2005年版一部以栀子苷作为栀子的薄层色谱鉴别的对照品。本试验通过鉴别栀子苷验证制剂中是否加入栀子药材。栀子苷为环烯醚萜苷类成分，极性较大，易溶于甲醇、乙醇等20极型溶剂，可利用硅胶G薄层板进行薄层鉴别。1、供试品提取溶剂的选择以甲醇、乙醇、无水乙醇作为提取溶剂，通过实验比较、确定供试品最优的提取溶剂方法一取本发明组合物颗粒剂20g，加无水乙醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇lml，作为供试品溶液。方法二取本发明组合物颗粒剂20g，加乙醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇lml，作为供试品溶液。方法三取本发明组合物颗粒剂20g，加甲醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇lml，作为供试品溶液。取栀子苷对照品，制成每lml乙醇含lmg对照品的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液15ia、对照品溶液5iU分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)为展开剂，展开，取出，凉干后，喷以5%香草醛浓硫酸溶液，ll(TC加热至斑点显色清晰。三种方法供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，但方法二中由于乙醇含有一定水，提取时杂质较多，制成供试品溶液非常粘稠，造成点样困难，且供试品色谱中其他成分斑与栀子苷斑点未完全分离，干扰了栀子苷的检测。以甲醇作为提取溶剂，供试品制备效果虽然与方法一相近，但由于甲醇毒性较大，所以最终确定无水乙醇为供试品的最优提取溶剂。2、供试品提取溶剂量的选择超声提取提取效率高、操作方便，所以选择超声提取法提取。通过试验确定供试品最佳提取溶剂量。取本发明组合物颗粒剂20g三份，分别加无水乙醇、25、50、100ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇lml，作为供试品溶液1、2、3。取栀子苷对照品，制成每lml乙醇含lmg对照品的溶液，作为对照品溶液。分别吸取供试品溶液1、2、3各15ii1、对照品溶液5y1分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)为展开剂，展开，取出，凉干后，喷以5%香草醛浓硫酸溶液，1l(TC加热至斑点显色清晰。供试品1、2、3色谱中，在栀子苷对照品相对应的位置上均显相同颜色的斑点，供试品2、3色谱中，斑点的荧光强于供试品l，且供试品2、3斑点的荧光基本一致，表明50ml无水乙醇基本可将制剂中的栀子苷基本萃取完全。因此，确定最佳提取溶剂量为50ml无水乙醇3、供试品提取时间的选择取本发明组合物颗粒剂20g三份，各加无水乙醇50ml，分别超声处理15、30、45分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇lml，作为供试品溶液1、2、3。取栀子苷对照品，制成每lml乙醇含lmg对照品的溶液，作为对照品溶液。分别吸取供试品溶液1、2、3各15ii1、对照品溶液5y1分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)为展开剂，展开，取出，凉干后，喷以5%香草醛浓硫酸溶液，1l(TC加热至斑点显色清晰。供试品1、2、3色谱中，在栀子苷对照品相对应的位置上均显相同颜色的斑点，供试品2、3色谱中，斑点的荧光强于供试品l，且供试品2、3斑点的荧光基本一致，表明超声30min可将制剂中的栀子苷萃取完全。因此，确定最佳提取时间为30min。4、供试品及对照品最优点样量的选择取本发明组合物颗粒剂20g，加无水乙醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇lml，作为供试品溶液。取栀子苷对照品，制成每1ml乙醇含lmg对照品的溶液，作为对照品溶液。分别吸取供试品溶液5、15、25y1、对照品溶液1、5、10y1分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:1:1)为展开剂，展开，取出，凉干后，喷以5%香草醛浓硫酸溶液，ll(TC加热至斑点显色清晰。供试品溶液点样量为5iU时，供试品色谱中，在与栀子苷对照品相对应的位置上斑点强度较低，不宜观察；供试品溶液点样量为15iU时，供试品色谱中，在与栀子苷对照品相对应的位置上斑点明显，斑点大小适中，无拖尾，前后无干扰；供试品溶液点样量为25时，供试品色谱中，在与栀子苷对照品相对应的位置上荧光斑点偏大，斑点与前后斑点相连，明显拖尾，而且点样时由于点样次数较多，破坏了硅胶薄层的表面。因此，确定供试品的最佳点样量为15iU。栀子苷对照品溶液点样量为liU时，栀子苷对照品荧光斑点强度较低，不宜观察；点样量为5iU的栀子苷对照品荧光斑点明显，斑点大小适中，无拖尾；点样量为lOiU的栀子苷对照品荧光斑点偏大，明显拖尾。因此，确定供试品的最优点样量为15yl，栀子苷对照品的最优点样量为5iU。5、最优展开剂比例的选择栀子苷极性较大，所以展开剂选择极性较大的丙酮、水与醋酸乙酯进行搭配，调节极性。加入甲酸，既能够调节极性又起到抑制拖尾、优化斑点形态的作用。通过试验选择最优的展开剂比例。取本发明组合物颗粒剂20g，加无水乙醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇lml，作为供试品溶液。取栀子苷对照品，制成每lml乙醇含lmg对照品的溶液，作为对照品溶液。取缺栀子的栀子阴性制剂20g按供试品制备方法制备缺栀子阴性对照溶液。取4块硅胶G薄层板，每块薄层均点样供试品、缺栀子阴性对照溶液15iU、栀子对照品5iU，分别以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(io:3:i:1)、醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)、醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:5:i:1)、醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:io:i:i)为展开剂，展开，取出，凉干后，喷以5%香草醛浓硫酸溶液，ll(TC加热至斑点显色清晰。薄层板i以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(io:3:i:i)极性较低，展开不充分，供试品色谱中栀子苷斑点不能与其他斑点分离；薄层板2以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)为展开剂，极性适中，对照品色谱中斑点Rf值为o.51，且与其他成分分离良好，供试品色谱中，在与栀子苷对照品相应的位置上有相同颜色的斑点，且该半点与其他成分斑点分离良好，阴性无干扰；薄层板3、4分别以醋酸乙酯_丙酮_甲酸_水(5:5:i:1)、醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:io:i:i)为展开剂，由于展开剂极22性太大，栀子苷Rf值较大，供试品色谱中栀子苷与其他成分斑点重叠，分离失败。因此，确定栀子苷硅胶薄层最佳的展开剂为醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)。6、显色条件的选择栀子苷没有颜色，紫外下也没有荧光，所以薄层层析后不能直接观察，需要利用通用型显色剂显色后观察。常用的通用型显色剂为10%的硫酸乙醇溶液、5%香草醛硫酸溶液、碘蒸汽。取本发明组合物颗粒剂20g，加无水乙醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇lml，作为供试品溶液。取栀子苷对照品，制成每lml乙醇含lmg对照品的溶液，作为对照品溶液。取3块硅胶G薄层板，每块薄层均点样供试品溶液15ii1、栀子对照品5iU，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)为展开剂，展开，取出，凉干。方法一薄层1喷以10%的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤10分钟；方法二薄层2喷以5%香草醛浓硫酸溶液，ll(TC加热至斑点显色清晰；方法三薄层3置碘缸中约3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘。方法一、三薄层在日光、紫外(365nm)下观察，供试品色谱中在与栀子苷对照品相对应的位置上均没有观察到明显颜色的斑点；方法二薄层在日光下观察，在与栀子苷对照品相对应的位置上有明显相同颜色的斑点，斑点清晰，无干扰。因此，确定栀子薄层层析的显色条件为以5X香草醛浓硫酸溶液，11(TC加热至斑点显色清晰。综上试验最后确定本发明组合物颗粒剂中栀子的薄层色谱鉴别条件为供试品溶液的制备取中药组合物制剂20g，加无水乙醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇lml，作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，制成每lml乙醇含lmg对照品的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液15ii1、对照品溶液5ii1分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)为展开剂，展开，取出，凉干，喷以5^香草醛浓硫酸溶液，11(TC加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。下述实施例均能实现上述实验例的效果。具体实施方式实施例1柴胡40g、大枣30g、石菖蒲40g、半夏(制)30g、白术(炒)30g、浮小麦100g、远志(制M0g、甘草(炙)30g、栀子(炒)40g、百合100g、胆南星40g、郁金40g、龙齿100g、酸枣仁(炒)50g、茯苓、50g、当归30g以上十六味，加水煎煮三次，第一次3小时，第二、三次各2小时，合并煎液，滤过，滤液浓縮至干，粉碎，制成颗粒。干燥，制成IOO袋，即得。实施例2柴胡50g、大枣30g、石菖蒲50g、半夏(制)30g、白术(炒)40g、浮小麦100g、远志(制)40g、甘草(炙)30g、栀子(炒)40g、百合100g、胆南星40g、郁金40g、龙齿90g、酸枣仁(炒)40g、茯苓40g、当归40g以上十六B未，加水煎煮三次，第一次3小时，第二、三次各2小时，合并煎液，滤过，滤液浓縮至干，粉碎，制成胶囊。实施例3质量控制方法鉴别(下述本品为实施例1制备的颗粒剂)(1)取本品20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为供试品溶液。另取白术对照药材lg加水40ml煎煮30分钟，放冷，上清液用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取2次，每次30ml，合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为白术对照药材溶液.吸取上述两种溶液各30iU点于同一硅胶G板上，以石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(9:2)为展开剂，展开，取出，凉干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，1051:烘烤IO分钟以上，在紫外光(365nm)下进行观察，供试品色谱中在与白术对照药材相对应的位置上显相同颜色的荧光斑点。(2)取本品20g，加无水乙醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇lml，作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，制成每lml乙醇含lmg对照品的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液15ia、对照品溶液5iU分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)为展开剂，展开，取出，凉干后，喷以5%香草醛浓硫酸溶液，电热吹风至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。含量测定色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(15:85)为流动相；检测波长为238nm。对照品溶液的制备精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成每lml含O.03mg的溶液，作为对照品溶液。供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约1.0g，精密称定，精密加甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45iim的滤头滤过，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10iU，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每袋含栀子以栀子苷(C17H24010)计，不得少于2.0mg。权利要求一种舒肝解郁，安神定志的中药组合物，其特征在于该药物组合物的原料药组成为柴胡20-60重量份、大枣10-50重量份、石菖蒲20-60重量份、半夏(制)10-50重量份、白术(炒)10--50重量份、浮小麦80-120重量份、远志(制)20-60重量份、甘草(炙)10-50重量份、栀子(炒)20-60重量份、百合80-120重量份、胆南星20-60重量份、郁金20-60重量份、龙齿80-120重量份、酸枣仁(炒)30-70重量份、茯苓30-70重量份、当归10-50重量份。2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料药组成为柴胡40重量份、大枣30重量份、石菖蒲40重量份、半夏(制)30重量份、白术(炒)30重量份、浮小麦100重量份、远志(制)40重量份、甘草(炙)30重量份、栀子(炒)40重量份、百合100重量份、胆南星40重量份、郁金40重量份、龙齿100重量份、酸枣仁(炒)50重量份、茯苓50重量份、当归30重量份。3.如权利要求1或2所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为十六味原药材，加水煎煮1-5次，每次1-5小时，合并煎液，滤过，滤液浓縮至干，粉碎，加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂。4.如权利要求1或2所述的药物组合物的质量控制方法，其特征在于包括如下鉴别方法中的一种或多种鉴别A:取中药组合物制剂10-40g加水5-80ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)、氯仿、乙酸乙酯中的一种或一种以上的混合溶剂轻轻振摇提取3-5次，每次20-80ml，合并有机溶液层，水浴浓縮至约0.5-2ml，作为供试品溶液；另取白术对照药材0.5-2g加水20-80ml的水煎煮15-45分钟，放冷，上清液用石油醚(6090°C)、氯仿、乙酸乙酯中的一种或一种以上的混合溶剂轻轻振摇提取1-3次，每次10-40ml，合并醚层，水浴浓縮至约0.5-2ml，作为白术对照药材溶液.吸取上述两种溶液各105-50y1点于同一硅胶G板上，以5-15:l-2比例的石油醚(609(TC)-醋酸乙酯混合溶剂为展开剂，展开，取出，凉干，喷以5-20%的硫酸乙醇溶液，95-120。C烘烤2-20分钟，置365nm紫外光下进行观察，供试品色谱中在与白术对照药材的相应的位置上显相同颜色的荧光斑点；鉴别B:取中药组合物制剂10-40g，加无水乙醇、甲醇、乙醇中的一种或一种以上的混合溶剂10-100ml，超声处理15-45分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇0.5-2ml，作为供试品溶液；另取栀子苷对照品，制成每lml无水乙醇、甲醇、乙醇中的一种或一种以上的的混合溶剂含0.2-2mg对照品的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液5-25y1、对照品溶液i-i5iU分别点于同一硅胶G薄层板上，以io-i:i-3:i:i为体积比例的醋酸乙酯_丙酮_甲酸_水混合溶剂为展开剂，展开，取出，凉干后，喷以1_10%香草醛浓硫酸溶液，95-12(TC加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。5.如权利要求4所述的药物组合物的质量控制方法，其特征在于包括如下鉴别方法中的一种或多种鉴别A:取中药组合物制剂20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取4次，各次的用量分别为40ml、40ml、30ml、30ml，合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为供试品溶液；另取白术对照药材lg加水40ml煎煮30分钟，放冷，上清夜用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取2次，每次30ml，合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为白术对照药材溶液.吸取上述两种溶液各30ii1点于同一硅胶G板上，以9:2的石油醚(6090°C)-醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，凉干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，1051:烘烤IO分钟，置365nm紫外光下进行观察，供试品色谱中在与白术对照药材的相应的位置上显相同颜色的荧光斑点；鉴别B:取中药组合物制剂20g，加无水乙醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇lml溶解，作为供试品溶液；另取栀子苷对照品，制成每lml乙醇含lmg对照品的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液15ia、对照品溶液5iU分别点于同一硅胶G薄层板上，以5:3:i:i的醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水为展开剂，展开，取出，凉干后，喷以5%香草醛浓硫酸溶液，电热吹风至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。6.如权利要求1或2所述的药物组合物的质量控制方法，其特征在于含量测定方法为色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以5-25:75-85比例的乙腈_水为流动相；检测波长为210-250nm;对照品溶液的制备精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成每lml含6-39i！g的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备取中药组合物制剂适量，研细，取约0.2-1.2g，精密称定，精密加甲醇、乙醇、水中的一种或一种以上的混合溶剂12.5-100ml，称定重量，超声处理15-45分钟，放冷，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，用0.2-0.45iim的滤膜滤过，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2-12ii1，注入液相色谱仪，测定。7.如权利要求6所述的药物组合物的质量控制方法，其特征在于含量测定方法为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以15:85的乙腈-水为流动相；检测波长为238nm;对照品溶液的制备精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成每lml含0.03mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备取中药组合物制剂，研细，取约l.Og，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45i！m的滤膜滤过，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10iU，注入液相色谱仪，测定。8.如权利要求1或2所述的药物组合物的质量控制方法，其特征在于该方法包括如下步骤含量测定以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以5-25:75-85比例的乙腈-水为流动相；检测波长为210-250nm;对照品溶液的制备精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成每lml含6-39i！g的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备取中药组合物制剂适量，研细，取约0.2-1.2g，精密称定，精密加甲醇、乙醇、水中的一种或一种以上的混合溶剂12.5-100ml，称定重量，超声处理15-45分钟，放冷，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，用0.2-0.45ym的滤膜滤过，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2-12iil，注入液相色谱仪，测定；鉴别A:取中药组合物制剂10-40g加水5-80ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)、氯仿、乙酸乙酯中的一种或一种以上的混合溶剂轻轻振摇提取3-5次，每次20-80ml，合并有机溶液层，水浴浓縮至约0.5-2ml，作为供试品溶液；另取白术对照药材0.5-2g加水20-80ml的水煎煮15-45分钟，放冷，上清液用石油醚(6090°C)、氯仿、乙酸乙酯中的一种或一种以上的混合溶剂轻轻振摇提取1-3次，每次10-40ml，合并醚层，水浴浓縮至约0.5-2ml，作为白术对照药材溶液.吸取上述两种溶液各105-50y1点于同一硅胶G板上，以5-15:l-2比例的石油醚(609(TC)-醋酸乙酯混合溶剂为展开剂，展开，取出，凉干，喷以5-20%的硫酸乙醇溶液，95-12(TC烘烤2_20分钟，置365nm紫外光下进行观察，供试品色谱中在与白术对照药材的相应的位置上显相同颜色的荧光斑点；鉴别B:取中药组合物制剂10-40g，加无水乙醇、甲醇、乙醇中的一种或一种以上的混合溶剂10-100ml，超声处理15-45分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇0.5_2ml，作为供试品溶液；另取栀子苷对照品，制成每lml无水乙醇、甲醇、乙醇中的一种或一种以上的的混合溶剂含0.2-2mg对照品的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液5-25iU、对照品溶液l-i5yi分别点于同一硅胶G薄层板上，以io-i:i-3:i:i为体积比例的醋酸乙酯_丙酮_甲酸_水混合溶剂为展开剂，展开，取出，凉干后，喷以1_10%香草醛浓硫酸溶液，95-12(TC加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。9.如权利要求8所述的药物组合物的质量控制方法，其特征在于该方法包括如下步骤含量测定以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以15:85的乙腈-水为流动相；检测波长为238nm;对照品溶液的制备精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成每lml含0.03mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备取中药组合物制剂，研细，取约1.0g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45i！m的滤膜滤过，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ill，注入液相色谱仪，测定；鉴别A:取中药组合物制剂20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为供试品溶液；另取白术对照药材lg加水40ml煎煮30分钟，放冷，上清夜用石油醚(6090°C)轻轻振摇提取2次，每次30ml，合并醚层，水浴浓縮至约lml，作为白术对照药材溶液.吸取上述两种溶液各30iU点于同一硅胶G板上，以石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(9:2)为展开剂，展开，取出，凉干，喷以10X的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤10分钟，置紫外光(365nm)下进行观察，供试品色谱中在与白术对照药材的相应的位置上显相同颜色的荧光斑点；鉴别B:取中药组合物制剂20g，加无水乙醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加无水乙醇lml溶解，作为供试品溶液；另取栀子苷对照品，制成每lml乙醇含lmg对照品的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液15ia、对照品溶液5iU分别点于同一硅胶G薄层板上，以5:3:i:i的醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水为展开剂，展开，取出，凉干后，喷以5%香草醛浓硫酸溶液，电热吹风至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。全文摘要本发明公开了一种舒肝解郁的中药组合物制剂及质量控制方法，该组合物由柴胡、大枣、石菖蒲、半夏、白术、浮小麦、远志、甘草、栀子、百合等原料药制成，该组合物制剂具有很好的抗抑郁的效果；本发明含量测定方法检测专属性好、稳定性高、重现性好、精密度高，更加适合工业化的生产，真正确保了临床用药的安全、有效、可靠。文档编号G01N30/90GK101773641SQ20091007615公开日2010年7月14日申请日期2009年1月12日优先权日2009年1月12日发明者付建家,付立家申请人:北京亚东生物制药有限公司