专利名称：神经细胞立体生长及其电信号检测的装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测神经细胞电信号的装置，特别涉及使用微电极阵列传感器 检测神经细胞电信号的装置。
背景技术：
神经电信号的分析是目前神经信息学的研究的主要内容之一。现在比较常
用的装置是微电极阵列传感器(Micro-Electrode Array, MEA)。 MEA由嵌在基底 物质上的微电极组成。微电极主要由金属材料例如钼、金、钛氮化物和铟锡氧 化物等构成。微电极在基底物质(通常是玻璃)上排成阵列。微电极与用金或 透明的铟锡氧化物制成的导线相连，导线将微电极信号传送到外部的放大器， 或将外部施加的刺激传送到微电极。在MEA设备中，被试细胞或组织直接在电 极涂层物质上培养，可以允许测量到细胞外直接相邻的局部电变化，同时并行 记录多个细胞的电生理信号。基于体外MEA技术的神经生物学的研究有两个突 出优点， 一是可以同时记录和刺激不同位点，二是非侵入式不会损伤细胞。所 以MEA适用于在同一个培养样本上进行长时程记录，因而允许监视培养物对刺 激的响应的较长时间的演变。但是现有MEA技术存在两个固有的瓶颈 一是无 法使细胞定向生长，在体外培养的神经细胞的突触连接是随机的，跟实际生物 体中突触的连接有很大不同，而且每一次体外培养，神经细胞的连接也是不同 的。而每个神经元发放的电信号与这个神经元和周围神经元的连接方式有很大 关系。现有的这种体外随机连接方式不仅让神经生理的实验无法具有精确的重 复性，而且无法得到神经细胞连接的拓扑结构与神经信号对应关系；二是在MEA 平面微电极结构下，神经细胞只能在MEA基底表面生长，所以原本空间上互联 生长的神经突触的拓扑结构被限制在MEA表面上。在这种条件下获得的网络结 构与实际生物体中的神经细胞通过神经突触的连接形成具有空间立体结构的网 络是不相符的。因此，在一定程度上，当前以MEA技术为基础开展的神经细胞 电生理的科学研究与生物体内实际空间有序连接的神经网络是有差异的，目前 的平面培养技术制约了神经细胞电生理学的发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可控制神经细胞在立体空间中有序 连接并获得其电信号的装置。
为了克服现有技术中体外培养的神经细胞在平面上随机连接这个缺点，本 发明的发明构思是设置两层以上的细胞生长装置，将细胞生长装置的各微室 按矩阵方式排列，并在同一层的细胞生长装置的各微室之间设置连通的微通道， 各层细胞生长装置之间则通过连通器连通，且相互对应的底层细胞生长装置的 微室、顶层细胞生长装置的微室、连通器的微通孔之间形成通道，从而使得在
MEA上培养的细胞可以按照特定的方式在空间立体中连接成网络，通过MEA的微 电极记录细胞的电信号，这样可检测到特定立体连接方式下的细胞的电信号， 得到细胞电信号与其连接方式的关系。细胞生长装置的层数以及细胞生长装置 中的微室与微通道的排列方式可以根据生物体中的神经细胞和神经突触的连接 方式设置，这样培养在该装置上的神经细胞构成的网络将可以模拟实际生物体 内的神经网络，因此检测到的神经电信号接近于生物体内真实的神经电信号， 从而检测到的神经电信号会包含大量的生物学信息。细胞生长装置的层数以及 细胞生长装置中的微室与微通道的排列方式也可以按照人们想创造的神经网络 的连接方式设置，这样培养在本装置上的神经细胞就可以按照人们需要的连接 方式连接，从而可以得到立体的人工神经网络，MEA的微电极可以将这个人工祌 经网络的电信号检测出来。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下
本发明神经细胞立体生长及其电信号检测的装置主要包括底层微电极阵列 传感器、顶层微电极阵列传感器、底层细胞生长装置、顶层细胞生长装置和连 通器，所述底层细胞生长装置和顶层细胞生长装置设于底层微电极阵列传感器 和顶层微电极阵列传感器之间，所述底层微电极阵列传感器和顶层微电极阵列 传感器包括基底、设于所述基底上的大微电极和小微电极，所述底层细胞生长 装置与底层微电极阵列传感器的基底固定联接，所述顶层细胞生长装置与顶层 微电极阵列传感器的基底固定联接，所述底层细胞生长装置和顶层细胞生长装 置均包括按矩阵方式排列的微室，所述底层细胞生长装置的微室与顶层细胞生 长装置的相应微室上下相对，所述底层细胞生长装置和顶层细胞生长装置的同 一行的相邻微室之间以及同一列的相邻微室之间均有一个微通道连通；所述底 层细胞生长装置的微室内对应地置有所述底层微电极阵列传感器的一个大微电极，所述底层微电极阵列传感器的小微电极对应地位于所述底层细胞生长装置 的微通道内；所述顶层细胞生长装置的微室内对应地置有所述顶层微电极阵列 传感器的一个大微电极，所述顶层微电极阵列传感器的小微电极对应地位于顶 层细胞生长装置的微通道内；所述连通器设于底层细胞生长装置和顶层细胞生 长装置之间，且所述连通器与底层细胞生长装置和顶层细胞生长装置固定联接， 所述连通器内设有与所述底层细胞生长装置的微室和顶层细胞生长装置的微室 上下对应的按矩阵方式排列的微通孔，所述相互对应的底层细胞生长装置的微 室、顶层细胞生长装置的微室、连通器的微通孔之间形成通道，所述微室的大 小为仅容纳一个神经细胞，所述微通道的宽度为仅容纳一条神经突触。
进一步地，本发明所述连通器有两个，所述两个连通器分别与所述顶层细 胞生长装置和底层细胞生长装置固定联接，所述两个连通器之间还固定联接有 中间层细胞生长装置，所述中间层细胞生长装置设有与所述底层细胞生长装置 的微室和顶层细胞生长装置的微室对应的按矩阵方式排列的微室，所述中间层 细胞生长装置的同一行的相邻微室之间以及同一列的相邻微室之间均有微通道 连通，所述相互对应的底层细胞生长装置的微室、连通器的微通孔、中间层细 胞生长装置的微室、顶层细胞生长装置的微室之间形成通道。
与现有技术相比，本发明的优点是(1)由于本发明设有不同层数的细胞 生长装置，细胞生长装置又设有微室和微通道，使得培养在同层细胞生长装置 内的神经细胞按照微室和微通道的排列方式进行定向生长，不同层的细胞生长 装置中的细胞通过微通孔连接，从而在本装置中培养的神经细胞可以在立体空 间中有序连接；(2)细胞生长装置的层数以及细胞生长装置中的微室与微通道 的排列方式可以根据生物体中的神经细胞和神经突触的连接方式设置，这样培 养在该装置上的神经细胞构成的网络将可以模拟实际生物体内的神经网络，通 过微室与微通道内的微电极检测到神经电信号，因此检测到的神经电信号接近 于生物体内真实的神经电信号，从而检测到的神经电信号会包含大量的生物学 信息。(3)细胞生长装置的层数以及细胞生长装置中的微室与微通道的排列方 式以及也可以按照人们想创造的神经网络的连接方式设置，这样培养在本装置 上的神经细胞就可以按照人们需要的连接方式连接，从而可以得到人工神经网 络，微电极可以将这个人工神经网络的电信号检测出来。
图1是本发明装置的第一种实施方式的结构示意图2是图1的A-A剖视图3是图1的B-B剖视图4是本发明装置的第二种实施方式的结构示意图5是图4的A-A剖视图6是图4的B-B剖视图7是本发明的细胞生长装置的结构示意图8是图7的D-D剖视图9是本发明的连接器的结构示意图10是图9的C-C剖视图11是本发明的微电极阵列传感器的结构示意图； 图12是图11的F-F剖视图。
具体实施例方式
图l、图2和图3示出了本发明装置的第一种实施方式的结构。该装置包括 底层细胞生长装置2、顶层细胞生长装置l、底层微电极阵列传感器42、顶层微 电极阵列传感器41和连通器3。底层细胞生长装置2和顶层细胞生长装置1均 包括按矩阵方式排列的微室。以下举例说明，当底层细胞生长装置2和顶层细 胞生长装置1如图1和图7所示包括九个微室时，九个微室按照三排三列的矩 阵方式排列。底层细胞生长装置2的微室与顶层细胞生长装置1的相应微室上 下相对，以使培养在顶层细胞生长装置1的微室中的神经细胞和底层细胞生长 装置2的微室中的神经细胞中的突触可以相互连接起来。作为其中的一种优选 实施方式，顶层细胞生长装置中1的微室位于与其相对的底层细胞生长装置2 的微室的正上方，使上下相对的顶层细胞生长装置1的微室与底层细胞生长装 置2的微室的中心线重合，确保不同层的相应微室内的神经细胞能够相互连接。 底层细胞生长装置2和顶层细胞生长装置1的同一行的相邻微室之间以及同一 列的相邻微室之间均有一个微通道连通具体地说，例如如图1和图7所示， 在顶层细胞生长装置1中，位于同一行的微室第一微室12和第二微室13通 过第一微通道5连通，第三微室14和第四微室15通过第三微通道7连通；位 于同一列的第二微室13与第三微室14通过第二微通道6连通，第四微室15与 第一微室12通过第四微通道8连通；其它微室之间的连接以此类推。底层细胞生长装置2中的微室与微通道之间的连通方式与顶层细胞生长装置1的微室与 微通道之间的连通方式相同。如图2、图3、图11和图12所示，底层微电极阵 列传感器42和顶层微电极阵列传感器41包括基底4、设于基底4上的大微电极 9和小微电极10。如图l、图2和图3所示，底层细胞生长装置2与底层微电极 阵列传感器42的基底4固定联接，底层微电极阵列传感器42的大微电极9对 应地位于底层细胞生长装置2的微室内，即底层细胞生长装置2的每个微室内 置有底层微电极阵列传感器42上的一个大微电极9，底层微电极阵列传感器42 的小微电极10对应地位于底层细胞生长装置2的微通道内，即底层细胞生长装 置2的每个微通道内沿着长度a方向可置有底层微电极阵列传感器上的两个小 微电极10。顶层细胞生长装置1与顶层微电极阵列传感器41的基底4固定联接， 顶层细胞生长装置1的每个微室内置有顶层微电极阵列传感器41的一个大微电 极9，顶层微电极阵列传感器41的小微电极10对应地位于顶层细胞生长装置1 的微通道内，顶层细胞生长装置1中的微室和大微电极9的对应关系以及微通 道和小微电极10的对应关系与底层细胞生长装置2中的微室和大微电极9的对 应关系以及微通道和小微电极10的对应关系相同。底层细胞生长装置的微室和 顶层细胞生长装置之间固定联接有连通器3，连通器3内设有与底层细胞生长装 置2的微室和顶层细胞生长装置1的微室上下对应的按矩阵方式排列的微通孔 11。如图2、图3、图9和图10所示，连通器3内有九个微通孔11，九个微通 孔按照三排三列的矩阵方式排列，微通孔11的位置与底层细胞生长装置2的微 室和顶层细胞生长装置1的微室对应，即微通孔11对应地位于上下相对的底层 细胞生长装置2的微室和顶层细胞生长装置1的微室之间，上下相互对应的底 层细胞生长装置2的微室、顶层细胞生长装置1的微室、连通器3的微通孔11 之间形成通道，使得培养在顶层细胞生长装置1的微室中的神经细胞和底层细 胞生长装置2的微室中的神经细胞中的突触可以伸进微通孔11中连接起来，实 现了神经细胞在立体空间中有序生长。如果如图l、图3、图4和图6所示，使 微通孔11的一个侧壁与同其相对的上下微室的侧壁位于同一个平面上，则可以 更好地保证上下两个微室里的神经突触贴着侧壁伸进微通孔里进行连接。
底层细胞生长装置2的微室和顶层细胞生长装置1的微室的大小可等于或 略大于一个神经细胞的直径，使得每个微室的大小仅可容纳一个神经细胞；并 且不会因微室过大而使一些较短的神经突触可能伸不进微通道内。
如图1所示，每个微通道的宽度b为仅容纳一条神经突触。这样做的目的是 一条神经突触上的电信号仅被一个微通道中的小微电极检测到， 一个微通 道中的小微电极仅能检测到一条神经突触的电信号，使得微通道中的小微电极 检测到的电信号与神经突触形成一一对应关系。
如图1和图3所示，微通孔11的长度c和宽度d为大于一个神经突触的直 径，保证顶层细胞生长装置1中的微室里神经细胞的突触和底层细胞生长装置2 中对应微室里的神经细胞的突触可以伸进微通孔ll中相互连接，通过改变微通 孔11的长度c和宽度d，可以控制伸进微通孔中的神经突触的数量，从而控制 顶层细胞生长装置1中的神经细胞与底层细胞生长装置2中的神经细胞的连接 强度。
大微电极9的直径最好是约为所要检测的神经细胞的直径，这样做的目的 是既使大微电极能构完全位于微室中，又能检测到神经细胞的电信号。
小微电极10的直径最好是与所要检测的神经突触的直径相等或者略小于神 经突触直径，这是为了既使小微电极能构完全位于微通道中，又能检测到神经 突触的电信号。
以上给出了包含两层细胞生长装置的神经细胞立体生长及其电信号检测的 装置的第一种实施方式。本发明可在第一种实施方式的基础上，通过增加细胞 生长装置和连通器的个数得到两层以上的神经细胞立体生长及其电信号检测的 装置，下面介绍本发明装置的第二种实施方式，该第二种实施方式共有三层细 胞生长装置和两个连通器。
如图1和图4所示，本发明第二种实施方式和第一种实施方式的俯视图是 一样的。如图5和图6所示，本发明第二种实施方式的连通器有两个，即第一 连通器31和第二连通器32，第一连通器31和第二连通器32内均设有微通孔 11，第一连通器31和第二连通器32的结构相同。其中，第一连通器31与顶层 细胞生长装置1固定联接，第二连通器32与底层细胞生长装置2固定联接。第 一连通器31和第二连通器32之间固定联接有中间层细胞生长装置15。如图7 和图8所示，中间层细胞生长装置15与顶层细胞生长装置1和底层细胞生长装 置2的结构相同，即中间层细胞生长装置15也对应地设有与底层细胞生长装置 2的微室和顶层细胞生长装置1的微室相同的按矩阵方式排列的微室，且中间层 细胞生长装置15的同一行的各相邻微室之间以及同一列的各相邻微室之间均有 一个微通道连通。上下相互对应的底层细胞生长装置2的微室、第二连通器32 的微通孔ll、中间层细胞生长装置15的微室、第一连通器31的微通孔11、顶层细胞生长装置1的微室之间形成一通道，使得培养在顶层细胞生长装置1中
的神经细胞和中间层细胞生长装置15中的神经细胞的突触可以伸进第一连通器 31的微通孔11中连接起来，中间层细胞生长装置15中的神经细胞和底层细胞 生长装置2中的神经细胞中的突触可以伸进第二连通器32的微通孔11中连接 起来，实现了神经细胞在立体空间中有序生长。
在本发明第二种实施方式中，微室、微通道、大微电极9、小微电极10和 微通孔11的尺寸的要求与第一种实施方式相同。
本发明装置的使用方法
对于本发明第一种实施方式的神经细胞立体生长及其电信号检测的装置， 顶层细胞生长装置1、连通器3和底层细胞生长装置2之间的固定联接是可拆卸 式的。使用时，首先将已与底层微电极阵列传感器42固定联接的底层细胞生长 装置2、已与顶层微电极阵列传感器固定联接的顶层细胞生长装置1和连通器3 分离开来，分别在顶层细胞生长装置1和底层细胞生长装置2的不同微室内的 大微电极9上培养细胞，所培养的细胞附着在大微电极9上。两天后，顶层细 胞生长装置1和底层细胞生长装置2上的神经细胞沿着微通道生长出突触，突 触附着在小微电极10上，这时，在一个装有培养液的培养皿中，将顶层细胞生 长室1、连通器3和底层细胞生长装置2固定联接起来，注意培养液要没过顶层 细胞生长装置1，然后在培养皿中将本发明神经细胞立体生长及其电信号检测的 装置整体翻转一个面，这样原先处于竖直方向的上下两个位置的顶层细胞生长 装置1和底层细胞生长装置2现在位于水平方向的前后两个位置，因此水平方 向上前后两个位置的顶层细胞生长装置1和底层细胞生长装置2的神经细胞的 突触可以容易地伸进微通孔中连接起来。顶层微电极阵列传感器41和底层微电 极阵列传感器42上的大微电极9可以检测出附着在其上的神经细胞的电信号， 小微电极10可以检测出附着在其上的神经突触的电信号。
对于本发明第二种实施方式的神经细胞立体生长及其电信号检测的装置， 使用时，首先将顶层细胞生长装置1与第一连通器31分离开，第一连通器31 与中间层细胞生长15装置分离开，第二连通器32与底层细胞生长装置2分离 开。但不要将第二连通器32与中间层细胞生长装置15分离，因为顶层细胞生 长装置1和底层细胞生长装置2己经固定在MEA基底上，可以培养神经细胞； 而中间层细胞生长装置15由于没有固定在MEA基底上，其下端是敞口的，无法 培养细胞，因此需要将中间层细胞生长装置15固定在第二连通器32上。将顶层细胞生长装置1、底层细胞生长装置2、第一连通器31和第二连通器32放在 一个装有培养液的培养皿中，将细胞培养在中间层细胞生长装置15内的第二连 通器32的壁上，细胞会附着在第二连通器32的壁上，将细胞培养在顶层细胞 生长装置1和底层细胞生长装2置的不同微室内的大微电极9上，细胞会附着 在大微电极上9，两天后，神经细胞沿着微通道生长出突触，突触附着在小微电 极10，其中中间层细胞生长装置15内的突触只在中间层细胞生长装置15的微 通道内生长，无法附着在小微电极上。这时，将顶层细胞生长室装置l、第一连 通器31、中间层细胞生长装置15、第二连通器32和底层细胞生长装置2固定 联接起来，注意培养液要没过顶层细胞生长装置。然后在培养皿中将本发明神 经细胞立体生长及其电信号检测的装置整体翻转一个面，这样原先处于竖直方 向的顶层细胞生长装置1、中间层细胞生长装置15和底层细胞生长装置2现在 位于水平方向，因此水平方向上的顶层细胞生长装置1和中间层细胞生长装置 15内的神经细胞的突触可以容易地伸进第一连通器31的微通孔内连接起来，中 间层细胞生长装置15和底层细胞生长装置2的神经细胞的突触可以容易地伸进 第二连通器32的微通孔中连接起来。顶层微电极阵列传感器41和底层微电极 阵列传感器42上的大微电极9可以检测出附着在其上的神经细胞的电信号，小 微电极10可以检测出附着在其上的神经突触的电信号。
以上是本发明的两种实施方式，在实际应用中，可根据所要检测的细胞的 数量设置微室的数量；根据生物体中不同的神经细胞排列和连接的方式设置细 胞生长室的层数以及微室和微通道的排列方式，从而在本发明装置上培养的神 经细胞的连接方式可以模拟生物体中的神经细胞的连接方式，因此培养在本装 置上的神经细胞的电信号与生物体中的神经细胞的电信号类似，测到的电信号 携带了更多生物学信息；也可以按照想要创造的人工神经网络的连接方式设置 细胞生长室的层数以及微室与微通道的排列方式，从而本装置上培养的细 就 会连接成想要的人工神经网络，通过MEA的微电极检测得到人工神经网络的电 信号。
权利要求
1.一种神经细胞立体生长及其电信号检测的装置，其特征是它包括底层微电极阵列传感器、顶层微电极阵列传感器、底层细胞生长装置、顶层细胞生长装置和连通器，所述底层细胞生长装置和顶层细胞生长装置设于底层微电极阵列传感器和顶层微电极阵列传感器之间，所述底层微电极阵列传感器和顶层微电极阵列传感器包括基底、设于所述基底上的大微电极和小微电极，所述底层细胞生长装置与底层微电极阵列传感器的基底固定联接，所述顶层细胞生长装置与顶层微电极阵列传感器的基底固定联接，所述底层细胞生长装置和顶层细胞生长装置均包括按矩阵方式排列的微室，所述底层细胞生长装置的微室与顶层细胞生长装置的相应微室上下相对，所述底层细胞生长装置和顶层细胞生长装置的同一行的相邻微室之间以及同一列的相邻微室之间均有一个微通道连通；所述底层细胞生长装置的微室内对应地置有所述底层微电极阵列传感器的一个大微电极，所述底层微电极阵列传感器的小微电极对应地位于所述底层细胞生长装置的微通道内；所述顶层细胞生长装置的微室内对应地置有所述顶层微电极阵列传感器的一个大微电极，所述顶层微电极阵列传感器的小微电极对应地位于顶层细胞生长装置的微通道内；所述连通器设于底层细胞生长装置和顶层细胞生长装置之间，且所述连通器与底层细胞生长装置和顶层细胞生长装置固定联接，所述连通器内设有与所述底层细胞生长装置的微室和顶层细胞生长装置的微室上下对应的按矩阵方式排列的微通孔，所述相互对应的底层细胞生长装置的微室、顶层细胞生长装置的微室、连通器的微通孔之间形成通道，所述微室的大小为仅容纳一个神经细胞，所述微通道的宽度为仅容纳一条神经突触。
2. 根据权利要求1所述的神经细胞立体生长及其电信号检测的装置，其特 征是所述连通器有两个，所述两个连通器分别与所述顶层细胞生长装置和底 层细胞生长装置固定联接，所述两个连通器之间还固定联接有中间层细胞生长 装置，所述中间层细胞生长装置设有与所述底层细胞生长装置的微室和顶层细 胞生长装置的微室对应的按矩阵方式排列的微室，所述中间层细胞生长装置的 同一行的相邻微室之间以及同一列的相邻微室之间均有微通道连通，所述相互 对应的底层细胞生长装置的微室、连通器的微通孔、中间层细胞生长装置的微 室、顶层细胞生长装置的微室之间形成通道。
全文摘要
本发明公开了一种神经细胞立体生长及其电信号检测的装置，即在两层微电极阵列传感器之间固定联接有两层以上的细胞生长装置，各细胞生长装置均有按矩阵方式排列的微室，不同层的细胞生长装置的相应微室上下相对，各细胞生长装置的同一行和同一列的相邻微室之间均有一个微通道连通；底层和顶层的细胞生长装置的微室内对应地置有一个大微电极，微通道内则对应地置有小微电极；连通器设于两层细胞生长装置之间且有与上下微室对应的微通孔矩阵；上下相互对应的微室、连通器的微通孔之间形成通道；微室的大小为仅容纳一个神经细胞，微通道的宽度为仅容纳一条神经突触。本发明使得所培养的神经细胞可在立体空间中有序连接，并可检测神经细胞的电信号。
文档编号G01N33/483GK101639474SQ20091010195
公开日2010年2月3日 申请日期2009年8月21日 优先权日2009年8月21日
发明者军 刘, 峰 刘, 叶学松, 李一乔, 鹏 王, 高天昀 申请人:浙江大学