专利名称：一种用于检测叶绿素a的化学发光方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测叶绿素a的化学发光方法。
背景技术：
叶绿素a主要具有如下特点l.在植物的光合作用中，大多数叶绿素a和 全部的叶绿素b都是参与吸收和传递光能和的叶绿素。而另有一部分叶绿素a 位于光反应系统复合体上，起光反应中心的作用，它们吸收从其他天线色素传 递过来的能量用于推动光化学反应的进行。无论是天线色素或是反应中心色素， 叶绿素都是结合在特定的蛋白质上，组成色素蛋白复合体行使其功能。2.果蔬 的色泽是构成产品品质的重要因素，也是检验果蔬成熟衰老的依据，色泽不仅 反映果蔬的新鲜度，还可促进人们的食欲，美丽天然的食品颜色是优质果蔬的 一个重要特征，而果蔬的绿色主要来源于叶绿素，叶绿素决定了产品的品质特 征。3.无毒副作用，长期食用安全、可靠性高，FA0/WH0 (1985)对叶绿素每人日 允许摄入量未作规定。目前，叶绿素已广泛应用于口香糖、硬糖、果汁、琼脂、 糕点等食品(但不能用于酸性或含4丐食品，否则易产生沉淀)，日本已将其作为 绿色色素用在食品添加剂中。4.另外，叶绿素具有改善便秘、降低胆固醇、抗 衰老、排毒消炎、脱臭、抗癌抗突变、抗贫血、保肝等功能，用于治疗烫伤， 慢性溃疡，对皮肤组织有再生作用，能抑制葡萄球菌和链球菌生长，对齿龈炎、 口臭、中耳炎等有一定疗效。叶绿素含量的测定方法主要有紫外分光光度法、 荧光分析法、活体叶绿素仪法、光声光谱法和高效液相色谱法。不过目前应用 最为广泛的还是分光光度法。而对植物体外叶绿素活性的检测还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、灵敏的只能测定叶绿素a方法。 本发明是这样实现的
1. 流动注射化学发光分析系统的流路反相流动注射化学发光分析系统的 流路，Rl、 R2、 R3三个管道分别泵入铁氰化钾、叶绿素a或空白作为检测液 以及鲁米诺溶液。以检测液与鲁米诺溶液为载流，先经三通管混合，待基线稳 定后，将铁氰化钾溶液注入到4企测液与鲁米诺溶液充分反应后的合并流中，铁 氰化钾的进样时间为20s,分别记录空白信号强度/。，样品信号强度为/s,相对 发光强度为J 增敏率用/ %表示，/ % = f/广/J / /。XM。，以/ f进 行定量；
2. 试验参数的优化以5mg/L的叶绿素a溶液为试验对象，选4奪NaOH、铁 氰化钾和鲁米诺为试验因素，根据单因素实验确定NaOH浓度为《Oxio3mg/L ~ 4.0xl04mg/L ( 0. 1 mol/L~ 1 mol/L)，铁氰化钾浓度为3. 2925 mg/L ~ 3. 2925 x 102 mg/L ( 1 x 10-5 mol/L ~ 1 x 10_3mol/L ),鲁米诺浓度为11. 716 x 10—2mg/L ~ 11.716 mg/L (1x10—6 mol/L~ 1 x 1(Tmol/L);
43.铁氰化钾-鲁米诺体系测定叶绿素a的流动注射-化学发光分析方法的建立
(1) 标准曲线的绘制为提高检测精密度，在优化后的最佳试验因素水平 条件下，以叶绿素a的浓度在0. 5-10. Omg/L范围绘制标准曲线；
(2) 最低检测限的确定通过多次样品空白试验，求得其背景响应的标准 差，将三倍空白标准差作为检测限的估计值。然后配制相应检测限浓度的样品， 实际测试来验证方法的最低检测限，最终测定结果为O. 13 mg /L;
(3) 精密度试验对5mg/L的叶绿素a标准品溶液重复测定11次，计算 其测定浓度的RSD为1. 17 %;
(4 )重复性试验将1份5mg/L的叶绿素a标准品溶液分为6份，分别测 定其浓度，计算其RSD为3. 74%;
(5) 干扰试验为了评价所建立分析方法的选择性，在已优化的试验条件 下，考察了叶绿素a提取液中可能共存的组份对叶绿素a含量测定的干扰。由 于样品经过分离提纯，所得叶绿素a提取液中可能共存的组分基本上只有少量 的色素，据此，考察了叶绿素b、叶黄素和类胡萝卜素对试验的干扰，结果表明 这些物质的实际含量均低于允许量，因此可直接测定。
(6) 样品分析准确称取50-100g洗净晾干的植物叶片，加入体积百分比 浓度为80%的丙酮500mL,超声震荡30 min并浸泡过夜，于低温下抽滤后，量 准上清液体积，按二氧六环丙酮抽提液为1 : 7的体积比例加入二氧六环，然
后再按水丙酮抽提液为l : 6的体积比例，在搅拌的情况下逐滴加入蒸馏水，
直到出现沉淀，放在-2(TC冰箱静置30min,并以1500 x g离心5min,得到深蓝 黑色的粉末状叶绿素a和叶绿素b的混合物沉淀，将沉淀溶于60mL无水乙醇， 抽滤，除去难溶物，低温减压干燥成粉后溶于30mL体积百分比浓度为80%的丙 酮，测定时取出lmL再定容至100mL作为样品溶液，按实验所述方法测定其含 量。测得样品溶液浓度为7. 93mg/L，RSD。/。为1. 1 %( 6次重复)，计算出从50-100g 的植物叶片中提取出叶绿素a为23. 8mg。同时进行加标回收率试验，测得回收 率为97. 63 %~ 98. 32 °/。，表明该方法准确可靠，共存组份对测定无干扰。
本发明所基于的原理为化学发光是指吸收了化学反应能的分子由激发态 回到基态时所产生的光辐射现象。
一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足以下条件第一是该反应能 够产生足够的激发能，并由某一步骤单独提供，因为前一步反应产生的能量将 因振动弛豫而消失在溶液中；第二是要有有利的反应过程，使化学反应产生的 能量可以被某种反应产物或中间体吸收，使其处于激发态；第三是激发态分子 必须具有一定的化学发光量子产率，或者能够将其能量有效地转移给某种荧光 物质，产生光辐射。
化学发光反应之所以能够用于化学分析，主要是因为化学发光强度与被测 物质的浓度之间有一定的联系，因而可将影响反应速度的因素如浓度作为建立 测定方法的依据。
化学发光分析测定的物质可以分为三类第一类物质是化学发光反应中的反应物；第二类物质是化学发光反应中的催化剂、增敏剂或抑制剂；第三类物 质是偶合反应中的反应物、催化剂、增敏剂等。还可以通过标记这三类物质的 方法用来测定其他物质，这就进一步扩大了化学发光分析的应用范围。在碱性 条件下，鲁米诺可被铁氰化钾氧化而产生化学发光，而叶绿素a对这一发光具 有明显的增敏作用。据此，建立了流动注射化学发光测定叶绿素a的分析方法。
本发明的方法可快速、灵敏地检测叶绿素a,对植物的光合作用、环境污染 监测、果蔬存储、以及色素应用和保健品的开发应用都具有重要的理论意义和 实用价值。
图1为叶绿素a、 b的结构式。
图2为反相流动注射化学发光法测定叶绿素的分析系统流路图。
图3为本发明实施例铁氰化钾-鲁米诺体系测定叶绿素a的化学发光信号强度。
图4为本发明实施例叶绿素a、 b和空白的信号强度差异。
具体实施方式
实施例
1. 材料含有叶绿素a的生物体。
2. 仪器设备万分之一电子天平；流动注射化学发光分析测试系统；
紫外可见分光光度计。
3. 试剂
(1)叶绿素样品储备液以甜叶菊叶片为例，取100g洗净晾干的甜叶菊 叶片，加入体积百分比浓度为80°/。的丙酮500mL，超声震荡30min并浸泡过夜， 于低温下抽滤后，量准上清液体积，按二氧六环丙酮抽提液为1 : 7的体积比
例加入二氧六环，然后再按水丙酮抽提液为l : 6的体积比例，在搅拌的情况
下逐滴加入蒸馏水，直到出现沉淀，放在-2(TC冰箱静置30min,并以1500 x g 离心5min,得到深蓝黑色的粉末状叶绿素a和叶绿素b的混合物沉淀，将沉淀 溶于60mL无水乙醇，抽滤，除去难溶物，低温减压干燥成粉，再溶于30mL丙 酮，作为测定用样品储备液。
(2 )铁氰化钾储备液(1. 0 x 10-2 moi/mL ):准确称取0. 3293g铁氰化钾(分 析纯)用双蒸水溶解定容至100mL。
(3)鲁米诺储备液(L 0 x 10-3 mol/mL ):准确称取0. 0177g鲁米诺 (Sigma-Aldrich),用1 x l(T2 mol/L NaOH ;容液;:容解定容至100mL， 4°C ;水箱避 光放置7d后使用。
4. 流动注射化学发光分析系统的流路反相流动注射化学发光分析系统的 流路，Rl、 R2、 R3三个管道分别泵入铁氰化钟、叶绿素a或空白作为检测液 以及鲁米诺溶液。以;险测液与鲁米诺溶液为载流，先经三通管混合，待基线稳 定后，将铁氰化钾溶液注入到检测液与鲁米诺溶液充分反应后的合并流中，铁 氰化钾的进样时间为30s,分别记录空白信号强度厶，样品信号强度为"，相对
6发光强度为Zl 增敏率用/ %表示，/ % =广A-T^ / /。乂7M,以/ I进
行定量。
5. 试验参数的优化以5mg/L的叶绿素a溶液为试验对象，选择NaOH、铁 氰化钾和鲁米诺为试验因素，根据单因素实验确定NaOH浓度为0.05mol/L， 铁氰化钾浓度为lxlO—4mol/L,鲁米诺浓度为1x10—6mol/L。
6. 铁氰化钾-鲁米诺体系测定叶绿素a的流动注射-化学发光分析方法的建
立
(1) 标准曲线的绘制为提高检测精密度，在优化后的最佳试验因素水平 条件下，以叶绿素a的浓度在0. 5 ~ 10. Omg/L范围绘制标准曲线；
(2) 最低检测限的确定通过多次样品空白试验，求得其背景响应的标准 差，将三倍空白标准差作为检测限的估计值。然后配制相应检测限浓度的样品， 实际测试来一睑i正方法的最^f氐;f企测限，最终测定结果为0.13 mg /L;
(3 )精密度试验对5mg/L的叶绿素a标准品溶液重复测定11次，计算 其测定浓度的RSD为1. 17 %;
(4 )重复性试验将1份5mg/L的叶绿素a标准品溶液分为6份，分别测 定其浓度，计算其RSD为3. 74%;
(5) 干扰试验为了评价所建立分析方法的选择性，在已优化的试验条件 下，考察了叶绿素a提取液中可能共存的组份对叶绿素a含量测定的干扰。由 于样品经过分离提纯，所得叶绿素a提取液中可能共存的组分基本上只有少量 的色素，据此，考察了叶绿素b、叶黄素和类胡萝卜素对试验的干扰，结果表明 这些物质的实际含量均低于允许量，因此可直接测定。
(6) 样品分析(以收获期的甜叶菊叶片干燥后，制备成粉末为例)准确 称取lOOg洗净晾干的甜叶菊叶片，加入体积百分比浓度为80%丙酮500mL，超 声震荡30min并浸泡过夜，于低温下抽滤后，量准上清液体积，按二氧六环
丙酮抽-提液为l : 7的体积比例加入二氧六环，然后再按水丙酮抽提液为l : 6
的体积比例，在搅拌的情况下逐滴加入蒸馏水，直到出现沉淀，放在-2(TC水箱 静置30min，并以1500 xg离心5min,得到深蓝黑色的粉末状叶绿素a和叶绿 素b的混合物沉淀，将沉淀溶于60mL无水乙醇，抽滤，除去难溶物，低温冷 冻减压干燥成粉，再溶于30mL体积百分比浓度为80°/。丙酮，测定时取出lmL再 定容至100mL作为样品溶液，按实验所述方法测定其含量。测得样品溶液浓度 为7. 93mg/L， RSD %为1. 1 % (6次重复)，计算出从100g的甜叶菊叶片中提取 出叶绿素a为23. 8mg。同时进行加标回收率试—睑，测得回收率为97. 63%~ 98.32%，表明该方法准确可靠，粉剂中的共存组份对测定无干扰。
(7) 该测定方法的验证将叶绿素提取样品稀释成不同浓度，再将每种浓 度的溶液分为2份，分别用紫外分光光度法和该方法进行测定，结果发现，两 种方法测定叶绿素a含量相符，证明可以用该方法测定叶绿素a的含量。
权利要求
1.一种用于检测叶绿素a的化学发光方法，其特征在于具体步骤为(1)流动注射化学发光分析系统的流路反相流动注射化学发光分析系统的流路，R1、R2、R3三个管道分别泵入铁氰化钾、叶绿素a或空白作为检测液以及鲁米诺溶液；以检测液与鲁米诺溶液为载流，先经三通管混合，待基线稳定后，将铁氰化钾溶液注入到检测液与鲁米诺溶液充分反应后的合并流中，铁氰化钾的进样时间为20s，分别记录空白信号强度I0，样品信号强度为Is，相对发光强度为ΔI＝Is-I0，增敏率用I％表示，I％＝(IS-I0)/I0×100，以I％进行定量；(2)试验参数的优化以5mg/L的叶绿素a溶液为试验对象，选择NaOH、铁氰化钾和鲁米诺为试验因素，根据单因素实验确定NaOH浓度为4.0×103mg/L～4.0×104mg/L即0.1mol/L～1mol/L，铁氰化钾浓度为3.2925mg/L～3.2925×102mg/L即1×10-5mol/L～1×10-3mol/L，鲁米诺浓度为11.716×10-2mg/L～11.716mg/L即1×10-6mol/L～1×10-4mol/L；(3)铁氰化钾-鲁米诺体系测定叶绿素a的流动注射-化学发光分析方法的建立①标准曲线的绘制为提高检测精密度，在优化后的最佳试验因素水平条件下，以叶绿素a的浓度在0.5-10.0mg/L范围绘制标准曲线；②最低检测限的确定通过多次样品空白试验，求得其背景响应的标准差，将三倍空白标准差作为检测限的估计值；然后配制相应检测限浓度的样品，实际测试来验证方法的最低检测限，最终测定结果为0.13mg/L；③精密度试验对5mg/L的叶绿素a标准品溶液重复测定11次，计算其测定浓度的RSD为1.17％；④重复性试验将1份5mg/L的叶绿素a标准品溶液分为6份，分别测定其浓度，计算其RSD为3.74％；⑤干扰试验为了评价所建立分析方法的选择性，在已优化的试验条件下，考察了叶绿素a提取液中可能共存的组份对叶绿素a含量测定的干扰；由于样品经过分离提纯，所得叶绿素a提取液中可能共存的组分基本上只有少量的色素，据此，考察了叶绿素b、叶黄素和类胡萝卜素对试验的干扰，结果表明这些物质的实际含量均低于允许量，因此可直接测定；⑥样品分析准确称取50-100g洗净晾干的植物叶片，加入体积百分比浓度为80％的丙酮500mL，超声震荡30min并浸泡过夜，于低温下抽滤后，量准上清液体积，按二氧六环∶丙酮抽提液为1∶7的体积比例加入二氧六环，然后再按水∶丙酮抽提液为1∶6的体积比例，在搅拌的情况下逐滴加入蒸馏水，直到出现沉淀，放在-20℃冰箱静置30min，并以1500×g离心5min，得到深蓝黑色的粉末状叶绿素a和叶绿素b的混合物沉淀，将沉淀溶于60mL无水乙醇，抽滤，除去难溶物，低温减压干燥成粉后溶于30mL体积百分比浓度为80％的丙酮，测定时取出1mL再定容至100mL作为样品溶液，按实验所述方法测定其含量；测得样品溶液浓度为7.93mg/L，RSD％为1.1％，重复6次，计算出从50-100g的植物叶片中提取出叶绿素a为23.8mg；同时进行加标回收率试验，测得回收率为97.63％～98.32％，，共存组份对测定无干扰。
全文摘要
本发明公开了一种利用铁氰化钾-鲁米诺体系流动注射化学发光测定叶绿素a的分析方法。它包括流动注射化学发光分析系统试验参数的优化和铁氰化钾-鲁米诺体系测定叶绿素a的方法建立等过程，利用该方法可以测定叶绿素a，不能测定叶绿素b。叶绿素a质量浓度在0.5-10.0mg/L的范围内与增敏率呈良好的线性关系，其回归方程为I＝23.244C-4.2218(R<sup>2</sup>＝0.9991)，方法的检出限为0.13mg/L。对浓度为5.0mg/L的叶绿素a标准溶液进行了11次平行测定的精密度试验和分为6份进行测定的重复性试验，其RSD分别为1.17％和3.74％。本发明可快速、灵敏地检测叶绿素a。
文档编号G01N21/76GK101493419SQ20091011390
公开日2009年7月29日 申请日期2009年3月6日 优先权日2009年3月6日
发明者关锦毅, 李子院, 李海云, 丹 杨, 郝再彬 申请人:桂林工学院