专利名称：焦磷酸测序技术检测猪甲型h1n1流感病毒的方法
技术领域：
本发明属于动物病原的检测技术领域，涉及一种采用焦磷酸测序 (Pyrosequencing)技术检测猪甲型Hmi流感病毒的方法。
背景技术：
猪甲型Hmi流感病毒，是由一系列抗原结构可变的A型流感病毒引起的猪急性呼 吸系统疾病。在流感病毒侵袭猪群的近90年里，猪流感给全世界的养猪业带来了灾难性的 损失，其不断发生的抗原变异使猪流感很难被彻底清除。又由于猪可以充当禽流感与人流 感的中间宿主，猪流感病毒可以向人进行传播，从而给人类健康造成了潜在的威胁。2009年 爆发的猪甲型Hmi流感疫情不仅对世界公共卫生提出了严峻的考验，并对世界经济产生 了重大影响。疫情暴发后，一些国家相继禁止进口来自墨西哥、美国等疫情重灾区的猪肉及 相关肉制品，给两地肉食品加工和出口商带来经济损失。因此，深入加强对猪流感的研究刻 不容缓。目前，用于猪流感病原检测的方法主要有病毒的分离鉴定、血清学诊断方法、分子 生物学诊断等方法。病毒的分离鉴定耗时费力，要求较高的试验条件，不能满足急性传染 病紧急疫情防制工作的需要；血清学诊断方法主要包括血凝和血凝抑制试验、神经氨酸酶 抑制试验、中和试验、琼脂凝胶扩散试验、免疫荧光法、酶联免疫吸附试验，其方法具有特 异性强、敏感性高的优点，但方法相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测；分子生物学诊断 方法主要包括聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量聚合酶链式反应、核酸序列扩增实验 (NASBA)法，这些方法比较快速、灵敏，但准确度不够，并且交叉污染问题比较严重。焦磷酸测序技术是近年发展起来的新技术，它是目前唯一得到定量序列结果的检 测技术，具有极高的准确性，且重现性极佳，是一种通用型技术平台，功能多样，应用领域广 泛，具有高通量、低成本的特点，聚合酶链式反应产物即可直接用于测序，不需进行产物纯 化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小，符合出入境检验检疫的要求，鉴于猪流感病 毒危害的严重性，加强流感疫情的监控，提高检测方法的准确度和检测效率，对有效控制流 感病毒的传播在现阶段具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求提供一种猪甲型Hmi流感病 毒的焦磷酸测序技术检测方法，以克服现有检测技术的不足，为猪养殖业、肉食品加工和出 口商以及国际肉类食品贸易等方面提供一种快速、简便、高效、实用的检测方法。为了实现上述目的，本发明的主要原理是利用焦磷酸测序技术，通过测序引物和 聚合酶链式反应扩增单链脱氧核糖核酸模板杂交，与脱氧核糖核酸聚合酶、腺嘌呤核苷三 磷酸(ATP)硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物(APS)、荧光素孵育，逐一加入 四种三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)(三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP ；三磷酸胸腺嘧啶脱 氧核苷酸dTTP ；三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP ；三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP)，如与模板配对，此三磷酸碱基脱氧核苷酸与引物的末端形成共价键，释放焦磷酸基团(PPi)；腺嘌呤 核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶在底物(APS)存在的情况下催化焦磷酸形成腺嘌呤核苷三磷 酸，腺嘌呤核苷三磷酸驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，氧化荧光素发出与 腺嘌呤核苷三磷酸量成正比的可见光信号；光信号由电荷耦合器件(CCD)收集并由软件转 化为峰；每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比，腺嘌呤核苷三磷酸和未掺 入的三磷酸碱基脱氧核苷酸由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系，利 用光信号转化得到的峰图，对样品中的猪甲型Hmi流感病毒进行准确的检测。本发明的实现，首先设计猪甲型Hmi流感病毒特异性引物及焦磷酸测序引物；再 提取待测样品的核糖核酸(RNA)，然后分别以猪甲型Hmi流感病毒HI、m引物进行逆转 录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增；用进行琼脂糖凝胶电泳对扩增产物检测，若Hl引物扩 增片段长度为102bp，Nl引物扩增片段长度为249bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行 焦磷酸测序反应，最后根据RT-PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有猪 甲型Hmi流感病毒。本发明所述的设计猪甲型Hmi流感病毒特异性引物及焦磷酸测序引物是根据猪 流感病毒的基因序列，选取保守序列，通过Assay Design SW软件设计猪甲型Hmi流感病 毒特异性引物序列，以扩增出特异性单一条带，再根据扩增区域中包含的特异核苷酸序列 (目标序列)设计焦磷酸测序引物以确定病毒亚型；猪甲型Hmi流感病毒RT-PCR及测序 引物为Hl 基因上游引物 5，-GCCGGATTCATTGAAGGAG-3，，Hl 基因下游引物 5，-GCTTTTCTGATCTGCTGCGTAAC-3，，5，进行生物素标记Hl 基因测序引物 5，-TGAAGGAGGATGGACA-3，，Nl 基因上游引物 5，-AATTGGCATGGCTCAAATCG-3，，Nl基因下游引物5’ -TGGATCCCAAATCATCTCAAAA-3’，5’进行生物素标记Nl 基因测序引物 5，-CGTTTAAATACGGCAAT-3，。猪甲型Hmi流感病毒Hl目标序列ATGATAGATGG ；猪甲型Hmi流感病毒Nl目标 序列AATGGAGCAAATGG ；Hl亚型扩增片段长度为102bp，Nl亚型扩增片段长度为249bp。本发明所述的提取待测样品的RNA是利用TRIZOL裂解液处理猪甲型Hmi流感病 毒待测样品，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到RNA ；亦可用商业化的RNA提取试剂盒 提取。本发明所述的分别以猪甲型流感病毒HI、m引物进行RT-PCR扩增其中，Hl引 物扩增是将提取的待测样品RNA进行反转录，反转录反应体系为在3 μ LRNA模板中分别加 入 2 μ L 25mmol/L 氯化镁(MgCl2)，1 μ L 10XRNA PCR 缓冲液，1 μ L 2. 5mmol/L三磷酸碱基 脱氧核苷酸(dNTP)，0. 25 μ L 40U/ μ L RNA 酶抑制剂，0. 5 μ L 5U/μ L AMV RNA 反转录酶， 0. 5μ L 20pmol/y L Hl上游引物和Hl下游引物，用焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate, DEPC)水补足体积至10 μ L，瞬时离心混合，反转录条件为42°C 30min,98°C lmin，4°C，在 反转录后的IOyL cDNA(complementary DNA)溶液中加入10倍聚 合酶链式反应缓冲液 (10 XPCR buffer) 5 μ L, 5U/ μ L Taq DNA聚合酶 0. 25 μ L, 20pmol/μ L Hl 上游引物和 Hl 下 游引物0. 5 μ L，DEPC水补足体积至50 μ L，PCR循环条件为94°C预变性5min后，进入94°C 变性30s，54°C退火，72°C延伸30s，共循环50次；然后72°C再延伸IOmin ；Nl引物扩增是将提取的待测样品RNA进行反转录，反转录反应体系为在3 μ L RNA模板中分别加入2 μ L 25mmol/L MgC12,1 μ L IOXRNA PCRbuffer, 1 μ L 2. 5mmol/L dNTP,0. 25 μ L 40U/ μ L RNA 酶抑制剂，0. 5yL 5U/ μ LAMV RNA反转录酶，0. 5 μ L 20pmol/y L Nl上游引物和m下游 引物，用DEPC水补足体积至10 μ L，瞬时离心混合，反转录条件为42°C 30min,98°C lmin, 4°C，在反转录后的10 μ L cDNA溶液中加入10XPCR buffer 5 μ L, 5U/ μ L Taq DNA聚合酶 0. 25 μ L，20pmol/ μ L Nl上游引物和Nl下游引物0. 5 μ L，DEPC水补足体积至50 μ L，PCR循 环条件为94°C预变性5min后，进入94°C变性30s，59°C退火，72°C延伸30s，共循环50次； 然后72°C再延伸lOmin。本发明所述的PCR扩增产物电泳检测取2g琼脂糖，于IOOmL电泳缓冲液中加热， 充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0. 5μ g/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液， 使液面刚刚没过凝胶；将3 μ L 6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/ cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。本发明所述的制备焦磷酸测序单链模板使用50 μ 1标记有生物素的PCR产物与 200 μ g链霉亲和素包被的磁珠，在室温25°C下孵育20分钟，用vacuum prep tool将与磁珠 结合后的PCR产物吸起，然后在70%乙醇中清洗5s ；变性缓冲液(denatureation buffer) 洗5s ；最后移到冲洗缓冲液(washing buffer)中清洗IOs ；vaccum prep tool放入含有测 序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80°C烘箱2分钟，再冷却到室温。 本发明所述的焦磷酸测序反应测序反应在28°C下于焦磷酸测序仪上检测，加样 使用600毫巴/8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加 入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。本发明所述的关于根据RT-PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含 有猪甲型Hmi流感病毒H1和mRT-PCR反应均为阳性的，进行焦磷酸测序分析，测序片段 与HI、m目标片段完全相同的，确定为猪甲型Hmi流感病毒亚型；HI和mRT-PCR反应均 为阳性的，Hi和m测序片段与目标片段有一个以上碱基不同判定为非猪甲型Hmi流感病 毒；Hi、mRT-PCR反应全部或有一个为阴性的判定为非猪甲型Hmi流感病毒。本发明适用于对猪甲型Hmi流感病毒进行快速检测，可广泛应用于肉类加工厂、 猪养殖场的疫病监控及进出口贸易中肉类猪甲型Hmi流感病毒的检测；与现有技术相比， 其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程； 具有高通量、低成本的特点，PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操 作极为简便，所需样品量小。
图1为本发明对猪肉样品的HA基因扩增图谱，其中M:DL2000，1 猪肉样品。图2为本发明对猪肉样品的NA基因扩增图谱，其中M:DL2000，1 猪肉样品。图3为本发明对猪肉样品中HA基因焦磷酸测序结果。图4为本发明对猪肉样品中NA基因焦磷酸测序结果。
具体实施例方式下面通过具体实施例并结合附图进一步阐述本发明。
实施例1 检测出口的猪肉产品中是否含有猪甲型Hmi流感病毒1、设计特异性引物序列通过Internet登陆美国国立生物信息技术中心(NCBI)，查询检索已公布的猪流 感Hmi病毒HA和NA的核苷酸序列，不包含不明碱基成分序列，对同源性较近的同年份同 地点的毒株只选取一株，用DNAStar 7. 1软件包中的Editseq和MegAlign软件对所选样本 的HA、NA基因核苷酸序列进行编辑，逐一比对，用Clustal W Method (软件)默认参数对所 选的HA、NA核苷酸序列进行同源性比较，找到代表各个亚型的保守序列区域，以及表征该 区域的特异核苷酸序列(目标检测序列)。PCR扩增引物设计和测序引物设计均可以通过Assay Design SW软件来进行，使用 得分较高的一组引物进行实验，根据DNASTAR的同源性分析结果，选取样本基因中较保守 的序列区域，设计扩增引物，以便于扩增出特异性单一条带，为后续测序奠定基础。同时为 各个扩增区域中包含的特异核苷酸序列(目标序列)设计测序引物，Hl亚型扩增片段长度 为102bp，Nl亚型扩增片段长度为249bp。猪甲型Hmi流感病毒RT-PCR及测序引物为Hl 基因上游引物 5，-GCCGGATTCATTGAAGGAG-3，，Hl 基因下游引物 5，-GCTTTTCTGATCTGCTGCGTAAC-3，，5，进行生物素标记Hl 基因测序引物 5，-TGAAGGAGGATGGACA-3，，Nl 基因上游引物 5，-AATTGGCATGGCTCAAATCG-3，，Nl基因下游引物5’ -TGGATCCCAAATCATCTCAAAA-3’，5’进行生物素标记Nl 基因测序引物 5，-CGTTTAAATACGGCAAT-3，。2、提取待测样品的RNA利用TRIZOL裂解液法提取待测样品的RNA，具体步骤为取灭菌的1. 5mL离心管，力口 入600μ L TRIZOL裂解液，加入待测猪肉样品各200mg，再加入200μ L氯仿，研磨，混勻器上 振荡混勻30s，于4°C 12000r/min离心15min，吸取上清液500 μ L转移到新的1. 5mL离心管 中，再加入_20°C预冷500 μ L异丙醇，室温沉淀30min后，于4°C 12000r/min离心15min， 小心倒去上清，加入600 μ L 70%乙醇，颠倒洗涤，于4°C 12000r/min离心lOmin，再倒去上 清，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥。最后加入10μ L超纯水，轻轻混勻，溶解管壁上的 RNA, 2000r/min离心5s，即得到样本的RNA。提取的RNA须在2小时内进行PCR扩增；若需 长期保存须放置冰箱。3、以猪甲型Hmi流感病毒HI、m引物进行RT-PCR扩增(I)Hl引物扩增将提取的待测样品RNA进行反转录，反转录反应体系为在3 μ L RNA模板中分别加 入 2yL 25mmol/L MgC12,1 μ L 10XRNA PCR buffer, 1 μ L 2. 5mmol/LdNTP, 0. 25 μ L 40U/ μ L RNA 酶抑制剂，0. 5yL 5U/μ L AMV RNA 反转录酶，0. 5 μ L 20pmol/y L Hl 上游引物 和Hl下游引物，用DEPC水补足体积至10 μ L，瞬时离心混合，反转录条件为42 V 30min, 98°C lmin，4°C，在反转录后的 10μ L cDNA 溶液中加入 10XPCR buffer 5 μ L, 5U/ μ L Taq DN A聚合酶0. 25 μ L，20pmol/ μ L Hl上游引物和Hl下游引物0. 5 μ L，DEPC水补足体积至 50 μ L，PCR循环条件为94°C预变性5min后，进入94°C变性30s，54°C退火，72°C延伸30s， 共循环50次；然后72°C再延伸lOmin。
(2)m引物扩增 将提取的待测样品RNA进行反转录，反转录反应体系为在3 μ L RNA模板中分别加 入 2yL 25mmol/L MgC12,1 μ L 10XRNA PCR buffer, 1 μ L 2. 5mmol/LdNTP, 0. 25 μ L 40U/ μ L RNA 酶抑制剂，0. 5yL 5U/μ L AMV RNA 反转录酶，0. 5 μ L 20pmol/y L Nl 上游引物 和附下游引物，用DEPC水补足体积至10 μ L，瞬时离心混合，反转录条件为42 V 30min, 98°C lmin，4°C，在反转录后的 10μ L cDNA 溶液中加入 10XPCR buffer 5 μ L, 5U/ μ L Taq DNA聚合酶0. 25 μ L，20pmol/ μ L Nl上游引物和附下游引物0. 5 μ L，DEPC水补足体积至 50 μ L ；PCR循环条件为94°C预变性5min后，进入94°C变性30s，59°C退火，72°C延伸30s， 共循环50次；然后72°C再延伸lOmin。4、进行琼脂糖凝胶电泳将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于IOOmL电泳缓冲液中加热，充分 溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0. 5 μ g/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液 面刚刚没过凝胶；将3 μ L 6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm 恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果，待检猪肉样品 能够扩增出特异性条带，Hl亚型为102bp，Nl亚型为249bp，电泳结果见图1、图2。5、制备焦磷酸测序单链模板使用50 μ 1标记有生物素的PCR产物与200 μ g链霉亲和素包被的磁珠，在室温 25°C下孵育20分钟，用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70%乙 醇中 青；denatureation buffer ^ 5s ；washing buffer 中i青 1 IOs ；vaccum prep tool放入含有Hl基因、Nl基因测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80°C 烘箱2分钟，再冷却到室温。6、焦磷酸测序在焦磷酸测序仪(PYR0MARK ID)上进行反应，28°C条件下，加样使用600毫巴/8 毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延伸；随着核 酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，Hl基因、Nl焦磷酸测序结果及分别见图3、图 4，读取的序列分别为 ATGATAGATGG、AATGGAGCAAATGG。7、结果判定猪肉样品的Hl基因扩增片段长度为102bp，m基因扩增片段长度为249bp， 与标准一致；经过焦磷酸测序，测定的Hl序列与猪甲型Hmi流感病毒Hl目标序列一 致，为ATGATAGATGG ；测定的附序列与猪甲型Hmi流感病毒附目标序列一致，为 AATGGAGCAAATGG,因此判定猪肉样品中含有猪甲型Hmi流感病毒。实施例2 检测某养殖猪群中是否感染猪甲型Hmi流感病毒，采样为猪鼻腔拭子1、设计特异性引物序列同实施例1。2、提取待测样品的RNA 猪鼻腔拭子样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤 出，室温放置30min，取上清液，采用RNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST ViralRNA/DNA Extraction Kit Ver 3. 0)，按照说明书进行RNA的提取。3、以猪甲型Hmi流感病毒HI、m引物进行RT-PCR扩增
同实施例1。4、进行琼脂糖凝胶电泳将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于IOOmL电泳缓冲液中加热，充分 溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0. 5μ g/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液 面刚刚没过凝胶；将3 μ L 6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm 恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果。待检样品RT-PCR扩增未扩增出特异性条带，因此判定某养殖场的猪群样品中不含有猪甲型Hmi流感病毒。核苷酸序列表<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心<120>焦磷酸测序技术检测猪甲型Hmi流感病毒的方法<160>8<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1). . (19)<223>用于扩增猪甲型Hmi流感病毒Hl基因的上游引物<400>1gccggattca ttgaaggag19<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1). . (23)<223>用于扩增猪甲型Hmi流感病毒Hl基因的下游引物<400>2gcttttctga tctgctgcgt aac 23<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind
<222>(1). . (16)<223>用于猪甲型Hmi流感病毒Hl基因焦磷酸测序的引物<400>3tgaaggagga tggaca 16<210>4<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1). . (20)<223>用于扩增猪甲型Hmi流感病毒附基因的上游引物<400>4aattggcatggctcaaatcg 20<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1). . (22)<223>用于扩增猪甲型Hmi流感病毒附基因的下游引物<400>5tggatcccaa atcatctcaa aa 22<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1). . (17)<223>用于猪甲型Hmi流感病毒附基因焦磷酸测序的引物<400>6cgtttaaata cggcaat 17<210>7<211>11<212>DNA<213>swine influenza virus<220>
<221>gene<222>(1). . (11)<223>猪甲型HlNl流感病毒Hl基因焦磷酸测序的目标序列<400>7atgatagatg g 11<210>8<211>14<212>DNA<213>swine influenza virus<220><221>gene<222>(1). . (14)<223>猪甲型Hmi流感病毒附基 因焦磷酸测序的目标序列<400>8aatggagcaa atgg 1权利要求
一种焦磷酸测序技术检测猪甲型H1N1流感病毒的方法，其特征在于先设计猪甲型H1N1流感病毒特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的RNA，然后分别以猪甲型H1N1流感病毒H1、N1引物进行RT-PCR扩增；用进行琼脂糖凝胶电泳对扩增产物检测，若H1引物扩增片段长度为102bp，N1引物扩增片段长度为249bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据RT-PCR扩增结果和焦磷酸测序结果判定样品中是否含有猪甲型H1N1流感病毒。
2.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测猪甲型Hmi流感病毒的方法，其特征在 于所述的设计猪甲型Hmi流感病毒特异性引物及焦磷酸测序引物是根据猪流感病毒的基 因序列，选取保守序列，通过Assay Design SW软件设计猪甲型Hmi流感病毒特异性引物 序列，以扩增出特异性单一条带，再根据扩增区域中包含的特异核苷酸序列设计焦磷酸测 序引物以确定病毒亚型；猪甲型Hmi流感病毒RT-PCR及测序引物为Hl 基因上游引物 5，-GCCGGATTCATTGAAGGAG-3，Hl基因下游引物5，-GCTTTTCTGATCTGCTGCGTAAC-3，，5，进行生物素标记Hl 基因测序引物 5，-TGAAGGAGGATGGACA-3，Nl 基因上游引物 5，-AATTGGCATGGCTCAAATCG-3，Nl基因下游引物5’ -TGGATCCCAAATCATCTCAAAA-3’，5’进行生物素标记Nl 基因测序引物 5，-CGTTTAAATACGGCAAT-3，；猪甲型Hmi流感病毒Hl目标序列ATGATAGATGG ；猪甲型Hmi流感病毒m目标序列 AATGGAGCAAATGG ；Hl亚型扩增片段长度为102bp，Nl亚型扩增片段长度为249bp。
3.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测猪甲型Hmi流感病毒的方法，其特征在 于所述的提取待测样品的RNA是利用TRIZOL裂解液处理猪甲型Hmi流感病毒待测样品， 三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到RNA，或用商业化的RNA提取试剂盒提取。
4.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测猪甲型Hmi流感病毒的方法，其特 征在于所述的分别以猪甲型流感病毒HI、m引物进行RT-PCR扩增其中，Hl引物扩增是 将提取的待测样品RNA进行反转录，反转录反应体系为在3 μ L RNA模板中分别加入2 μ L 25mmol/L氯化镁，IyL 10XRNA PCR缓冲液，IyL 2. 5mmol/L三磷酸碱基脱氧核苷酸， 0. 25μ L 40U/ μ L RNA 酶抑制剂，0. 5μ L 5U/ μ LAMV RNA 反转录酶，0. 5 μ L 20pmol/y L Hl 上游引物和Hl下游引物，用焦碳酸二乙酯水补足体积至10 μ L，瞬时离心混合，反转录条件 为42V 30min,98°C lmin，4°C，在反转录后的IOyL cDNA溶液中加入10倍聚合酶链式反 应缓冲液5口1^，5"口1^ Taq DNA聚合酶0. 25 μ L，20pmol/μ L Hl上游引物和Hl下游引物 0. 5 μ L，DEPC水补足体积至50 μ L，PCR循环条件为94°C预变性5min后，进入94°C变性 30s，54°C退火，72°C延伸30s，共循环50次；然后72°C再延伸IOmin ；Nl引物扩增是将提取 的待测样品RNA进行反转录，反转录反应体系为在3 μ L RNA模板中分别加入2 μ L 25mmol/ L MgC12,1 μ L 10XRNA PCR buffer, 1 μ L 2. 5mmol/L dNTP,0. 25 μ L 40U/ μ L RNA 酶抑制 剂，0. 5yL 5U/y L AMVRNA反转录酶，0. 5 μ L 20pmol/y L Nl上游引物和附下游引物，用 DEPC水补足体积至10 μ L，瞬时离心混合，反转录条件为42°C 30min, 98°C lmin, 4°C，在反转 录后的 10 μ L cDNA 溶液中加入 10XPCR buffer 5 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 25 μ L， 20pmol/ μ L Nl上游引物和Nl下游引物0. 5 μ L, DEPC水补足体积至50 μ L，PCR循环条件 为94°C预变性5min后，进入94°C变性30s，59 °C退火，72 °C延伸30s，共循环50次；然后72°C再延伸 lOmin。
5.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测猪甲型Hmi流感病毒的方法，其特征在于所述的PCR扩增产物电泳检测取2g琼脂糖，于IOOmL电泳缓冲液中加热，充分溶化，力口 入溴化乙锭贮存液至终浓度为0. 5μ g/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚 没过凝胶；将3 μ L 6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电 泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。
6.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测猪甲型Hmi流感病毒的方法，其特征 在于所述的制备焦磷酸测序单链模板使用50 μ 1标记有生物素的PCR产物与200 μ g链霉 亲和素包被的磁珠，在室温25°C下孵育20分钟，用vacuum prep tool将与磁珠结合后的 PCR产物吸起，然后在70%乙醇中清洗5s ；变性缓冲液洗5s ；最后移到冲洗缓冲液中清洗 IOs ；vaccum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠，将样品放入80°C烘箱2 分钟，再冷却到室温。
7.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测猪甲型Hmi流感病毒的方法，其特 征在于所述的焦磷酸测序反应测序反应在28 °C下于焦磷酸测序仪上检测，加样使用 600mbar/8msec的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延 伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。
8.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测猪甲型Hmi流感病毒的方法，其特征在 于所述的关于根据RT-PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有猪甲型Hmi 流感病毒H1和WRT-PCR反应均为阳性的，进行焦磷酸测序分析，测序片段与HI、Nl目标 片段完全相同的，确定为猪甲型Hmi流感病毒亚型；Hl和mRT-PCR反应均为阳性的，Hl和 Nl测序片段与目标片段有一个以上碱基不同判定为非猪甲型Hmi流感病毒；Hl AlRT-PCR 反应全部或有一个为阴性的判定为非猪甲型Hmi流感病毒。
全文摘要
本发明属于动物病原的检测技术领域的一种采用焦磷酸测序技术检测猪甲型H1N1流感病毒的方法，先设计猪甲型H1N1流感病毒特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的RNA，然后分别以猪甲型H1N1流感病毒H1、N1引物进行扩增；用进行琼脂糖凝胶电泳对扩增产物检测，若H1引物扩增片段长度为102bp，N1引物扩增片段长度为249bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有猪甲型H1N1流感病毒，其应用焦磷酸测序技术快速、准确地进行短DNA序列分析；具有高通量、低成本特点，产物可直接用于测序，不需进行二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
文档编号G01N21/76GK101845515SQ20091023153
公开日2010年9月29日 申请日期2009年12月4日 优先权日2009年12月4日
发明者凌宗帅, 孙涛, 岳志芹, 张太翔, 徐彪, 梁成珠, 辛学谦 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心