专利名称：一种粘土基荧光探针的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种无机-有机杂化荧光探针的制备方法，特别是一种粘土基荧光探针的 制备方法。
背景技术：
荧光探针是指可以标记到生物分子上作为荧光检测探针的纳米发光颗粒，将荧光探针 用于各种医学和生命科学的分析检测中，表现出灵敏度高、选择性好、所需样品量少等优 势。目前已经开发的用于制备荧光探针的荧光材料包括荧光量子点、有机荧光素、稀土 配合物等。用于负载或固定荧光材料的基体材料包括碳纳米管、硅胶，高分子塑料等。 用于制备荧光探针的主要制备方法是将荧光材料吸附、键合、插入或被包覆到基体材料的 表面或内部。
专利CN1884430公开了一种荧光碳纳米管及其制备方法和应用，其制备方法为先用浓 硫酸和浓硝酸的混合酸氧化碳纳米管，然后将聚阳离子化合物吸附在碳纳米管管壁上 ，再 将荧光量子点通过静电作用力组装在碳纳米管上。该荧光碳纳米管使用的荧光材料为荧光 量子点，具有发光不稳定，易闪烁的缺点。荧光量子点与碳纳米管通过静电吸附作用连接 ，降低了荧光碳纳米管的稳定性和荧光量子点的负载量。
专利CN1493647公开了一种功能性纳米稀土荧光微粒及其制备和应用，其制备方法为 以稀土配合物为发光中心，采用正硅酸乙酯在反相微乳液体系中引发聚合，制得包裹稀土 配合物的纳米硅胶荧光微粒，然后在微粒表面导入活性官能团进行表面修饰。该荧光探针 使用稀土配合物作为荧光材料，具有发射光色纯度高、发光能力强、斯托克位移大、荧光 稳定性高等优点，但在表面修饰的过程中，可能会破坏硅胶外壳导致所包裹的稀土荧光配 合物泄露，使其荧光减弱。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于生物医药领域分析检测的性能稳定、易于分散、荧光 强度高，易于进一步修饰或标记生物分子的粘土基荧光探针的制备方法。
本发明一种粘土基荧光探针的制备方法如下，以下均以重量份表示 (a):将l份粘土分散在l(Tl00份的有机溶剂中以5(Tl00kHz超声波处理0. 1 0.5小时 后，加入O. riO份的硅烷偶联剂，5(TlO(TC下搅拌反应5 50小时，抽滤并用有机溶剂反复
4洗涤，3(T6(TC真空干燥，然后取l份在l(Tl00份有机溶剂中以5(Tl00kHz超声波处理
o. ro.5小时后，用氮气或氩气保护，翻口橡皮塞密封，缓慢加入a-卤代酰卤o. rio份，
在(T3(TC下搅拌反应5 50小时，抽滤并用有机溶剂反复洗涤，3(T6(TC真空干燥，得到表 面接有原子转移自由基聚合引发剂的粘土；
(b) :将表面接有原子转移自由基聚合引发剂的粘土l份，在5(T100份有机溶剂中以 5(Tl00kHz超声波处理0. 1 0. 5小时后，加入riO份的单体，0. 1 0. 5份的催化剂，0. 1 1份 的配体，在氮气或氩气保护，翻口橡皮塞密封，2(T5(TC温度下，搅拌反应1(T100小时， 离心分离并用有机溶剂反复洗涤，3(T6(TC真空干燥，然后取1份在5(T100份有机溶剂中以 5(Tl00kHz超声波处理0. 1 0. 5小时后，加入1 20份的丁二酸酐，20 5(TC下，搅拌反应 l(TlOO小时后，离心分离并用有机溶剂反复洗涤，3(T6(TC真空干燥，得到侧基含有羧基 的聚合物接枝的粘土；
(c) :将聚合物接枝的粘土l份，在5(T200份的有机溶剂中以5(Tl00kHz超声波处理 0. ro. 5小时后，用O. 5mol/L的NaOH水溶液调节体系pH至6 8，加入含O. 1 0. 5份的感光剂 的溶液，待充分分散后，缓慢加入含O. 1 0. 5份的稀土离子的溶液，2(T5(TC下，搅拌反应 riO小时后，陈化riO小时，离心分离并反复洗涤，3(T6(TC真空干燥，得到一种粘土基 荧光探针。
本发明使用的粘土为埃落石、蒙脱土、凹凸棒土、海泡石或水滑石。
本发明使用的硅烷偶联剂为y-氨基丙基三乙氧基硅烷、y-氨基丙基三甲氧基硅烷、
N-e (氨乙基)i-氨丙基三甲氧基硅烷、N-e (氨乙基)i-氨丙基甲基二甲氧基硅烷、
N- {3 (氨乙基)-y -氨丙基三乙氧基硅烷或氨乙基氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷。
本发明使用的a-卤代酰卤为a-溴代丁酰溴、a-溴代异丁酰溴、a-溴代丙酰溴、a
-氯代丁酰氯、a -氯代异丁酰氯或a -氯代丙酰氯。
本发明使用的单体为丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸
羟丙酯、丙烯酸羟丁酯、甲基丙烯酸羟丁酯、N，N-二羟乙基丙烯酰胺、N-羟乙基丙烯酰胺
，N-羟乙基甲基丙烯酰胺或N-(三羟甲基)甲烷基丙烯酰胺。 本发明使用的为催化剂为溴化亚铜或氯化亚铜。
本发明使用的配体为2，2'-联吡啶、四甲基乙二胺、五甲基-二乙基三胺或六甲基-三 甲基四胺。
本发明使用的感光剂为1，10-邻菲咯啉、2， 2'-联吡啶、a-噻吩基甲酰三氟丙酮，二 苯甲酰甲烷或乙酰丙酮。本发明使用的稀土离子为Eu針、Tb針、Sm針或Dy針。
本发明使用的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、甲苯、氯仿、乙腈、甲醇、吡啶、三乙 胺、二甲基亚砜、N-甲基-2-吡咯烷酮、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、4-二甲氨基 吡啶、丁酮或含有这些有机溶剂的混合有机溶剂。
本发明一种粘土基荧光探针的制备方法中，采用了在粘土表面共价接枝原子转移自由 基聚合引发剂，引发单体聚合，经过丁二酸酐化学修饰后生成侧基含有羧基的聚合物接枝 的粘土，然后和感光剂共同与稀土离子配位。
本发明一种粘土基荧光探针的制备方法中采用了(1)以粘土作为无机-有机核壳结 构荧光探针的无机内核；(2)与稀土离子配位的配体既包括有机小分子感光剂，也包括 以共价键接枝到粘土表面的侧基含有羧基的聚合物。
本发明一种粘土基荧光探针具有以下有益效果(1)聚合物和感光剂共同与稀土离 子配位，组分可以在分子水平上均匀分布，这样得到的配合物性质稳定，不易团聚成簇， 有助于减弱荧光浓度猝灭；(2)聚合物共价接枝于粘土表面，粘土为配合物壳层提供了 稳固的内核框架，对稀土离子的固定有很好的作用，制备的粘土基荧光探针在有机溶剂中 易于分散；(3)粘土原位接枝聚合物的聚合反应为原子转移自由基聚合，可以实现聚合 物接枝均匀，接枝量较大，达到80%;(4)粘土表面接枝的聚合物与丁二酸酐反应后含有 能进一步进行反应的羧酸基团，方便生物分子标记；(5)感光剂作为第二配体与稀土离 子配位，使稀土离子配位数趋于饱和，并起到能量通道的作用，将本身以及聚合物吸收的 能量传递到稀土离子；(6)本发明所选用的粘土、聚合物、稀土离子都具有优异的生物 相容性，对生物体系毒性小，为其应用到生物领域提供了可能。
图l是实施例l中埃落石和步骤(b)所得的聚合物接枝的粘土的热失重曲线。 图2是实施例1中步骤(b)所得的聚合物接枝的粘土与步骤(c)所得的粘土基荧光探 针的红外光谱光谱。
图3是实施例1步骤(c)所得的粘土基荧光探针的扫描电镜照片。 图4是实施例1步骤(c)所得的粘土基荧光探针的EDS能谱图。 图5是实施例1步骤(c)所得的粘土基荧光探针的荧光发射光谱。
具体实施例方式
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。 以下实施例使用的分析方法如下热重分析PerkinElmer公司TGA-7型的热重分析仪，N2气氛，升温速率20。C/min，温 度范围25 800。C;
红外光谱PerkinElmer公司ParagonlOOO型傅立叶变换红外光谱仪，KBr压片，摄谱 范围400(T500cm—、
荧光发射光谱PerkinElmer公司LS50B型荧光/磷光/发光分光光度计，乙醇介质，激 发波长300nm，摄谱范围55(T675nm;
扫描电镜分析美国FEI公司SIRI0N200型场发射扫描电子显微镜； EDS能谱分析OXFORD公司的INCAOXFORD型EDS能谱仪，工作电压20kV。 实施例l:
(a) :将4g埃落石分散在44g甲苯中，以99Hz超声波处理0. 5小时后，加入4g y-氨 基丙基三乙氧基硅烷，IO(TC下搅拌回流反应IO小时，抽滤并用甲苯反复洗涤，5(TC真空 干燥，然后取lg在30g氯仿中以99Hz超声波处理0. 3小时，加入O. 54g无水三乙胺，0. 24g4-二甲氨基吡啶，用氩气保护，翻口橡皮塞密封，用注射器缓慢加入含a-溴代异丁酰溴
0.487g的5mL氯仿溶液，在(TC下搅拌反应5小时后，25'C下继续反应48小时，抽滤并用氯 仿反复洗涤，5(TC真空干燥，得到表面接有原子转移自由基聚合引发剂的埃落石；
(b) :将表面接有原子转移自由基聚合引发剂的埃落石0.05g分散在4g甲醇中，以 99Hz超声波处理0. 2小时后，加入经过碱性氧化铝柱预处理的甲基丙烯酸羟乙酯O. 25g， CuBrl5mg， 2， 2'-联吡啶30mg，用氩气保护，翻口橡皮塞密封，20。C下搅拌反应48小时， 离心分离并用甲醇反复洗涤，5(TC真空干燥，然后取0.05g在3g吡啶中以99Hz超声波处理 0.2小时后，加入52mg丁二酸酐，2(TC下搅拌反应48小时后，离心分离并用甲醇反复洗涤 ，5(TC真空干燥，得到侧基含有羧基的聚合物接枝的粘土；
(c) :将聚合物接枝的埃落石0.02g分散在2g乙醇中，以99Hz超声波处理0.2小时后 ，用O. 5mol/L的NaOH水溶液调节体系pH至6 8，加入含有l， 10-邻菲咯啉4. lmg的乙醇溶液 lmL，待充分分散后，缓慢加入含有Eu"3.5mg的Eu(N03)3乙醇溶液lmL， 2(TC下搅拌反应6/J 时，陈化10小时，离心分离并用乙醇反复洗涤，5(TC真空干燥，得到一种粘土基荧光探针
图l给出了纯埃落石和步骤(b)所得的聚合物接枝的粘土的热重曲线，两条热重曲线 可以看出，经过实施例l步骤(a)和(b)得到的聚合物接枝的埃落石中聚合物质量分数 为80.4%，含有的羧基基团的浓度为3.4mmol/g，配位基团含量丰富。图2给出了步骤(b) 所得的聚合物接枝的粘土与步骤(c)所得的粘土基荧光探针的红外光谱光谱，对比两条红外光谱曲线，a曲线中1570cm—i和1450cm—i处的两个吸收峰分别是配合物的CO基团反对称 伸縮振动峰u as和对称伸縮振动峰u s，说明羧酸基团中的氧原子以双齿形式与Eu3+配位， 1384cm—工处的特征峰是由1， 10-邻菲咯啉苯环特征峰红移产生，说明l， 10-邻菲咯啉与Eu"发 生配位反应。图3给出了步骤(c)所得的粘土基荧光探针的扫描电镜照片，照片显示埃落 石表面被配合物层完全包覆，图4给出了步骤(c)所得的粘土基荧光探针的EDS能谱，其 中强烈的碳元素峰和明显的铕元素峰显示了粘土基荧光探针中聚合物和稀土元素Eu的存在 。图5给出了步骤(c)所得的粘土基荧光探针的荧光发射光谱，图中位于594nm和618nm处 的荧光发射峰分别是Eu5Do—7F^n5DQ—V2跃迀的特征峰，发射光色纯度高，半峰宽低于 15nm，信号强烈，根据本发明提供的制备方法较好地解决了荧光探针性能不稳定的缺陷。
权利要求
1.一种粘土基荧光探针的制备方法，其特征在于制备方法如下，以下均以重量份表示(a)将1份粘土分散在10~100份的有机溶剂中以50~100kHz超声波处理0.1~0.5小时后，加入0.1~10份的硅烷偶联剂，50~100℃下搅拌反应5~50小时，抽滤并用有机溶剂反复洗涤，30~60℃真空干燥，然后取1份在10~100份有机溶剂中以50~100kHz超声波处理0.1~0.5小时后，用氮气或氩气保护，翻口橡皮塞密封，缓慢加入α-卤代酰卤0.1~10份，在0~30℃下搅拌反应5~50小时，抽滤并用有机溶剂反复洗涤，30~60℃真空干燥，得到表面接有原子转移自由基聚合引发剂的粘土；(b)将表面接有原子转移自由基聚合引发剂的粘土1份，在50~100份有机溶剂中以50~100kHz超声波处理0.1~0.5小时后，加入1~10份的单体，0.1~0.5份的催化剂，0.1~1份的配体，在氮气或氩气保护，翻口橡皮塞密封，20~50℃温度下，搅拌反应10~100小时，离心分离并用有机溶剂反复洗涤，30~60℃真空干燥，然后取1份在50~100份有机溶剂中以50~100kHz超声波处理0.1~0.5小时后，加入1~20份的丁二酸酐，20~50℃下，搅拌反应10~100小时后，离心分离并用有机溶剂反复洗涤，30~60℃真空干燥，得到侧基含有羧基的聚合物接枝的粘土；(c)将聚合物接枝的粘土1份，在50~200份的有机溶剂中以50~100kHz超声波处理0.1~0.5小时后，用0.5mol/L的NaOH水溶液调节体系pH至6~8，加入含0.1~0.5份的感光剂的溶液，待充分分散后，缓慢加入含0.1~0.5份的稀土离子的溶液，20~50℃下，搅拌反应1~10小时后，陈化1~10小时，离心分离并反复洗涤，30~60℃真空干燥，得到一种粘土基荧光探针。
2 根据权利要求l所述的一种粘土基荧光探针的制备方法，其特征 是粘土为埃落石、蒙脱土、凹凸棒土、海泡石或水滑石。
3 根据权利要求l所述的一种粘土基荧光探针的制备方法，其特征是硅烷偶联剂为氨基硅烷偶联剂为y-氨基丙基三乙氧基硅烷、y-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-e (氨乙基)i-氨丙基三甲氧基硅烷、N-e (氨乙基)i-氨丙基甲基二甲氧基硅烷、 n- e (氨乙基)-y -氨丙基三乙氧基硅烷或氨乙基氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷。
4.根据权利要求l所述的一种粘土基荧光探针的制备方法，其特征 是a-卤代酰卤为a-溴代丁酰溴、a-溴代异丁酰溴、a-溴代丙酰溴、a-氯代丁酰氯、 a -氯代异丁酰氯或a -氯代丙酰氯。
5.根据权利要求l所述的一种粘土基荧光探针的制备方法，其特征 是单体为丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、丙烯酸 羟丁酯、甲基丙烯酸羟丁酯、N，N-二羟乙基丙烯酰胺、N-羟乙基丙烯酰胺，N-羟乙基甲基 丙烯酰胺或N-(三羟甲基)甲烷基丙烯酰胺。
6.根据权利要求l所述的一种粘土基荧光探针的制备方法，其特征 是催化剂为氯化亚铜或溴化亚铜。
7.根据权利要求l所述的一种粘土基荧光探针的制备方法，其特征 是配体为2，2'-联吡啶、四甲基乙二胺、五甲基-二乙基三胺或六甲基-三甲基四胺。
8.根据权利要求l所述的一种粘土基荧光探针的制备方法，其特征 是感光剂为l， 10-邻菲咯啉、2， 2'-联吡啶、a-噻吩基甲酰三氟丙酮，二苯甲酰甲烷或乙 酰丙酮。
9.根据权利要求l所述的一种粘土基荧光探针的制备方法，其特征曰^i亩為Eu3+、 Tb3+、 Sm3、Dy3+是禾布土呙子为 或 j 。
10.根据权利要求l所述的一种粘土基荧光探针的制备方法，其特征 是有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、甲苯、氯仿、乙腈、甲醇、吡啶、三乙胺、二甲基亚砜 、N-甲基-2-吡咯烷酮、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、4-二甲氨基吡啶、丁酮或含 有这些有机溶剂的混合有机溶剂。
全文摘要
本发明公开了一种粘土基荧光探针的制备方法，该荧光探针以粘土作为无机有机核壳结构的无机内核，通过有机小分子感光剂配体和以共价键接枝到粘土表面的侧基含有羧基的聚合物配体共同与稀土离子配位，制得荧光探针。该荧光探针具有聚合物壳层均匀可控，分散性良好，荧光强而稳定，生物相容性好等优点，在生物医药分析检测领域具有广泛的应用前景。
文档编号G01N21/64GK101671557SQ200910308548
公开日2010年3月17日 申请日期2009年10月21日 优先权日2009年10月21日
发明者万超瑛, 勇 张, 明 李 申请人:上海交通大学