专利名称：一种a型肉毒毒素检测试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型属于生物检测领域，具体涉及一种A型肉毒毒素检测试 纸条。
背景技术：
肉毒毒素(Botulinum neurotoxin, BoNT )是由厌氧的肉毒梭菌 (Clostridium botulinum)产生的一种毒性极强的蛋白类毒素，其中A、 B、 E型肉毒毒素可引起人类肉毒中毒，我国报道由肉毒毒素致病者大多数为 A型。各型肉毒毒素分子量均约150 000D;由二硫键链接重链和轻链组 成，包括一条重链(H，约100kD)和一条轻链(L，约50kD)， H链包含了 N-末端(约50kD)和C-末端(约50kD),轻链通过二石充键与重链的N-末端 连接。其中A型肉毒毒素的研究最为深入，其应用也最为广泛。从对A型 毒素的研究来推断，肉毒毒素分子是一种酸性蛋白质，各型毒素的等电 点(pl)在5.3~6. l之间。肉毒毒素是已知毒素中毒力最强(天然物质中 最强)的神经麻痹毒素，比氰化钾毒力大1万倍，其小鼠LD50介于0. 1 ~
lng/kg体重，少至0.1-1 jug的毒素就可导致成人中毒死亡，纯化的肉 毒毒素lmg能杀死2亿只小鼠。BoNT可以经消化道摄入、呼吸道吸入、 伤口或眼睛等吸收而导致人类肉毒中毒。此外，该毒素净皮一些国际恐怖 和极端组织利用来制造恐慌。自"9ar，恐怖袭击事件后，美英等西方国 家便把BoNT列为最有可能被使用的生物恐怖剂之一。因此，了解和认识 BoNT检测方法对于及早采取应对措施具有十分重要的医学和军事意义。
现阶段检测方法则根据肉毒毒素所具有的理化特性、生化特性和免 疫原性发展出的多种检测法，其中以免疫检测法为主。免疫检测法大多 是依赖于抗原抗体反应的免疫学方法，包括多克隆和/或单克隆为基础的 放射免疫法或酶联免疫吸附法(ELISA)，免疫层析试验和电化学发光生 物传感器等。尽管免疫检测法发展迅速，但经典的小鼠致死试验仍是检 测肉毒毒素的金标准。目前肉毒毒素中毒的实验室检验，检出污染物中存在肉毒毒素并鉴 定出毒素型别是确定肉毒中毒的关键。肉毒毒素检测的金标准是经典的
小鼠致死试验，其检出极限可达10-20 pg,但该实-睑也存在许多缺点， 主要表现在耗时长、工作量大、需要大量实验动物等。国内外许多实验 室都曾在血清学检测方法上做过大量研究，如酶联免疫分析(ELISA)、 放射免疫分析、肽链内切酶联免疫检测等，这些方法在克服耗时性、需 要特殊设备以及检验灵敏度和特异性矛盾等方面存在或多或少的缺陷， 从而限制了这些方法的推广应用，至今还没有哪种方法能真正替代经典 的动物实验。
实用新型内容
本实用新型的目的在于提供一种方便、快捷地检测A型肉毒毒素的抗 原试纸。该试纸的工作原理是利用特异性抗原-抗体的结合，用胶体金 标记抗体，与待检抗原结合后，使与试纸结合的捕获抗体显色。
本实用新型试纸在检测A型肉毒毒素的同时，可利用金标免疫分析仪
进行的半定量检测方法。
本实用新型一种方便、快捷地检测A型肉毒毒素的检测试纸，它包含
(1)反应支持物； (2 )吸水垫；
(3 )硝酸纤维膜，该膜包被有A型肉毒毒素的多克隆抗体条带和质 控羊抗兔IgG的条带；
(4 )金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的A型肉毒毒素单克隆抗体。
本实用新型涉及的上述A型肉毒毒素的检测试纸，它还包含样品垫， 该样品垫的材料选用聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。
本实用新型涉及的上述A型肉毒毒素的检测试纸，其中反应支持物 选用PVC板。
本实用新型涉及的上述A型肉毒毒素的检测试纸，其中吸水垫选用 滤油纸。
本实用新型涉及的上述A型肉毒毒素的检测试纸，其中金标抗体保 护膜的材料选用聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，其上均匀涂布有胶体金标记的A型肉毒毒素单克隆抗体。
另一方面，本实用新型涉及的上述A型肉毒毒素的检测试纸，其中， 吸水垫、硝酸纤维膜、金标抗体保护膜、样品垫和反应支持物按照附图1 所示方式构成；反应支持物5位于底层，硝酸纤维膜2位于反应支持物5 上的中部，该膜的T处是A型肉毒毒素单克隆抗体包被的检测条带，并 且C处是羊抗兔IgG包被的质控条带；金标抗体保护膜3位于硝酸纤维 膜上部的一侧并与之部分重叠，该膜含有胶体金标记的A型肉毒毒素单 克隆抗体；吸水垫1位于硝酸纤维膜2上部的相对于金标抗体保护膜3 而言的另一側并与2部分重叠；样品垫4位于2上与1相反的一侧并与3 部分重叠。
又一方面，本实用新型涉及的上述A型肉毒毒素的检测试纸，以吸 水垫一侧为起始端，样品垫一侧为末端，A型肉毒毒素单克隆抗体的检测 条带位于接近末端，羊抗兔IgG包被的质控条带接近于起始端。
再一方面，A型肉毒毒素单克隆抗体的条带与羊抗兔IgG包被的质控 条带之间的距离适宜是硝酸纤维膜长度的25%- 75%长，优选40% - 60% , 更优选45 - 55 %,最优选50%。
本实用新型A型肉毒毒素检测试纸的制备方法，该方法包括 (1)用隔流喷金划线机以一定喷膜速度喷涂A型肉毒毒素的多克隆 抗体和质控羊抗兔IgG两个条带的硝酸纤维膜；
在该喷涂包被膜的步骤中，喷膜速度优选是10-100mm/s,更优选是 45 - 55mm/s，最优选是50mm/s;所述A型肉毒毒素的单克隆抗体(由军 事医学科学院病毒所提供)的浓度为0.1-10 mg/ml更优选是0.5-2.5 mg/ml，最优选为lmg/ml，单克隆抗体的稀释液可以为PBS;质控羊抗兔 IgG可以购自鼎国生物技术公司，其浓度为0.1-10 mg/ml更优选是 0. 5-2. 5 mg/ml,最优选为lmg/ml;
(2 )制备一种含有胶体金标记的A型肉毒毒素单克隆抗体的玻璃纤 维膜，将胶体金标记的A型肉毒毒素单克隆抗体均匀涂布在聚脂膜、玻 璃纤维膜或滤纸纤维膜(购自Milipore公司)上；
(3)所述A型肉毒毒素的单克隆抗体(由军事医学科学院病毒所提 供)稳定胶体金的适当抗体量为5-25ug,优选抗体量为10-20ug,更 优选的抗体量为12-18ug，最优选抗体量为16. 8ug,该抗体可以用5mM本实用新型所述试纸在检测A型肉毒毒素中的应用(见图2)。首先 将标本放入装有稀释液的小瓶内，将试纸"4"处(即末端处)插入瓶内， 样品中的液体吸起上行， 一般10-15分钟后判读结果，试纸直至观察完 结果后方可取出。
如果标本中含有A型肉毒毒素抗原，则标本中的A型肉毒毒素抗原 将与试纸上胶体金标记的A型肉毒毒素单克隆抗体形成相应的复合物， 液体上行并将与硝酸纤维膜上的A型肉毒毒素多克隆抗体结合，并且显 示颜色，形成红色线条，即在"T"处形成红色条带。无论是否含有相对 应的抗原，胶体金标记单克隆抗体继续向上展开并与在硝酸纤维膜上的 羊抗兔IgG形成红色沉淀线，即在"C"处形成红色条带。此线是质控线， 如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸失效。阳性结果会出现2条 红色沉淀线，阴性结果出现1条红色沉淀线，如不出现线条说明试纸失 效。
在本实用新型的技术方案中，采用了纯化的A型肉毒毒素多克隆抗 体和羊抗兔IgG,将两者分别固相于硝酸纤维膜上，同时利用胶体金标记 的A型肉毒毒素单抗，基于膜层析双抗体夹心法的原理，从而成功地快 速简便检测出标本中的A型肉毒毒素。
图IA本实用新型试纸的正面示意图。 图IB本实用新型试纸的侧面示意图。
图1A和1B中，l吸水垫；2硝酸纤维膜(A:包被A型肉毒毒素多 克隆抗体条带，C:包被羊抗兔IgG的质控条带)；3:含有胶体金标记A 型肉毒毒素单克隆抗体的玻璃纤维膜；4:样品垫；5:反应支持物。
图2:检测结果示意图；T、 C两条线阳性；C一条线阴性；无效。
图3:检测结果示意图；图中，l.A型天然肉毒毒素50 pg/m, 2. A 型天然肉毒毒素IO ng/ml， 3 .A型天然肉毒毒素15 pg/ml， 4. PBS。
图4:检测结果示意图；图中1为A型天然肉毒毒素，2为E型天然 肉毒毒素。
具体实施方式
以下实施例用于说明本实用新型，但不用来限制本实用新型的范围。
实施例l、 A型肉毒毒素多克隆抗体的制备
(1 )抗A型肉毒毒素多克隆抗体的制备
用纯化的rBoNT/A蛋白200 jn g与等体积的福氏完全佐剂充分混匀， 首免新西兰纯种大耳白兔。两周后用0.5 mg蛋白和等体积福氏不完全佐 剂加强免疫1次；隔三周后再用0. 5 mg蛋白和等体积福氏不完全佐剂加 强免疫l次；此后每周耳缘静脉采血，间接ELISA测定效价。如还需再 进行加强免疫，每次免疫间隔两周，最后一次免疫一周后大量采血。
心脏或颈动脉或腹股静脉采血后于37 。C放置l h, 4 。C过夜，使血 块收缩。小心吸出析出的血清。在4。C下2500 g离心血块30 min，取上 清液即血清部分与此前析出的血清混合。4 。C 1500 g离心全部分离的血 清部分。将血清分装冻存于-70 。C。 (2 )抗rBoNT/A多克隆抗体的纯化
方法利用正辛酸-硫酸铵分步沉淀法纯化抗体。
具体实施例取1份血清加入4份60 mM pH 4. 0的醋酸緩沖液，用 NaOH调节pH为4. 5。以每毫升稀释液中加入70 pl正辛酸的比例，f兹力 搅拌30 min。 4 °C10000 r/min离心30 min，弃沉淀，耳又上清液通过滤 纸过滤，加入5倍体积的PBS,调节pH为7. 4，然后置冰浴中，按照每 毫升混合液加O. 27 g碌L酸铵，继续石兹力搅拌30 min, 9000 r/min， 4 。C 离心15min,收集沉淀物，溶于PBS中，透析至无NH4+, -70 。C保存， 并经SDS-PAGE鉴定其纯度。
实施例2、 A型肉毒毒素单克隆抗体的制备
(1)抗rBoNT/A单克隆抗体的制备
A型杂交瘤细胞均由河北省科学院生物科学研究所制备，拿到杂交瘤 细胞后，首先进行细胞培养，培养起细胞后，用间接ELISA法测定细胞培 养上清与天然毒素是否结合，选两抹鉴定为阳性且细胞生长状态良好的 杂交瘤细胞抹进行亚克隆筛选。再选取稳定性和效价均较高的两抹细胞 林用以大量制备单克隆抗体。利用细胞培养上清来进行单克隆抗体的亚 型鉴定，采用的是美国Roche公司Mouse Monclonal Antibody IsotypingKit。
Balb/c小鼠用石蜡油腹部注射致敏一周后，小鼠注射O. 5 ml约含l x 106个杂交瘤细胞的生理盐水悬液。l-2周后待小鼠腹部明显变大，精 神状态不好时，拉颈处死取腹水。于12000 rpm离心10 min以去除油状不 溶物，将腹水分装冻存于-20 'C。 (2)抗rBoNT/A单克隆抗体的纯化
用HiTrapTM Protein G HP和AKTAdesignTM System纯化小鼠腹水。 首先，将腹水用binding buffer以适当比例稀释，用0.45 pm滤器过滤 后备用。用10倍^主体积的binding buffer以5 ml/min的洗速平衡5 ml的 蛋白G柱后将备用样品上柱纯化，上样速度设为1 ml/min。此后，用binding buffer沖平直至流出液的紫外吸收值低于30即流出液中不再有蛋白。换 elution buffer进行洗脱，从紫外吸收值高于100时开始收集，低于80时 收集完毕，收集洗脱液的试管中预先加入10%的1 M, pH 9. O的Tris-HCl, 使pH恢复至7. 0左右，以免抗体失去活性。用elution buffer冲洗柱子 至紫外吸收值低于30时改用纯水沖洗l O个柱体积后，再用2 0%乙醇冲洗5 个柱体积，最终要将柱子浸泡于20%乙醇中并于4 。C保存。将纯化后的单 抗用5 mM PB于磁力搅拌下4 。C透析4 h后，分装，-70 。C保存备用，并 经SDS-PAGE鉴定其纯度为13. 52mg/ml。
实施例3、 A型肉毒毒素的检测试纸
参见附图1，反应支持物为6. 2cm x 0. 4cmPCV板；吸水垫为2cm x 0. 4cm的滤油纸；1. 8cm x 0. 4cm的硝酸纤维膜依次包被羊抗兔IgG， A 型肉毒毒素多克隆抗体(lmg/ml，稀释液为PBS );含有0. 4cm x 0. 4cm 胶体金标记的A型肉毒毒素单克隆抗体(16. 8ug，用5mMPB稀释)， 玻璃纤维膜；金标抗体(其标金PH为7. 5，浓度为0. 2mg/nd )保护膜为 2. 7cm x 0. 4cm的玻璃纤维；即形成了 A型肉毒毒素抗原检测试纸。
实施例4、 A型肉M素的试纸检测方法
参见图2，使用A型肉毒毒素试纸的检测方法包括 将标本放入装有稀释液的小瓶内，将实施例3-5中的任一试纸"4" 处插入瓶内，样品中的液体吸起上行，10分钟判读结果，直至观察完结果后方可取出试纸
如含有A型肉毒毒素抗原，则与试纸上胶体金标记的A型肉毒毒素 单抗形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的流A型肉毒毒素 多抗结合，形成红色线条，即在"A"处形成红色条带。
无论是否含有相对应的抗原，胶体金标记McAb继续向上爬行与包被 在膜上的羊抗兔IgG形成红色沉淀线，即在"C"处形成红色条带。此线 是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸失效。 阳性结果会出现2条红色沉淀线，阴性结果出现l条红色沉淀线，如不出 现线条说明试纸失效。如若肉眼无法辨别T处红色条带，可利用金标免疫 分析仪进行半定量检测。
实施例5、 DJM-3定量金标免疫分析仪半定量检测
1、 可先用检测法检测A型肉毒毒素试纸条20个阴性值，利用金标仪检 测试其T/C的比值平均计算出A型肉毒毒素试纸条的定阈值。
2、 其次利用定阈值来用金标仪机器检测A型肉毒毒素试纸条能达到的最 低浓度。
3、 判读结果时大于或等于定阈值为阳性，小于定阈值为阴性。
试验例1、胶体金免疫层析试纸敏感性检测
以天然肉毒毒素溶液(浓度为50 ng/ml、 10 pg/ml、 5 pg/ml )进 行检测，以不含肉毒毒素的PBS溶液样品为空白对照，检测结果见附图3。 结果显示A型免疫层析条检测灵敏度为5 pg/ml。
试验例2、胶体金免疫层析试纸特异性检测
优化检测带、质控带蛋白浓度和胶体金探针浓度以及层析条的特征 后，以样品稀释液(PBS)处理A型天然肉毒毒素素使其浓度均为50 jug/ml 以进行检测。结果如附图4所示，可见检测条对于检测无关毒素无非特异 现象出现。
本实用新型能够基于一份标本和一个试纸，快速方便地检测出标本 中的A型肉毒毒素抗原，能够一次性的捕获出A型肉毒毒素，节省了大量人力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训， 结杲清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大
批量现场检测，适合流行病学调查，对A型肉毒毒素的感染诊断起到辅 助作用。
权利要求1、一种检测试纸，其特征在于，它包含(1)反应支持物；(2)吸水垫；(3)硝酸纤维膜，该膜包被有A型肉毒毒素多克隆抗体条带和质控羊抗兔IgG的条带；(4)金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的A型肉毒毒素单克隆抗体。
2、 根据权利要求1所述的试纸，其特征在于，它还包含样品垫。
3、 根据权利要求2所述的试纸，其特征在于，所述反应支持物(5)位于 底层，所述硝酸纤维膜(2)位于反应支持物(5)上的中部，该膜的T处是A 型肉毒毒素单克隆抗体包被的检测条带，并且C处是羊抗兔IgG包被的 质控条带；所述金标抗体保护膜(3)位于硝酸纤维膜上部的一側并与之部 分重叠，该膜含有胶体金标记的A型肉毒毒素单克隆抗体；所述吸水垫 (1)位于硝酸纤维膜(2)上部的相对于金标抗体保护膜(3)而言的另一侧 并与硝酸纤维膜(2)部分重叠；所述样品垫(4)位于硝酸纤维膜(2)上与吸 水垫(1)相反的一側并与金标抗体保护膜(3)部分重叠。
4、 根据权利要求3所述的试纸，其特征在于，所述吸水垫一側为起始端， 所述样品垫一侧为末端，A型肉毒毒素多克隆抗体的条带位于接近末端， 羊抗兔IgG包被的质控条带接近于起始端。
专利摘要本实用新型公开了一种检测试纸，它包含反应支持物；吸水垫；硝酸纤维膜，该膜包被有A型肉毒毒素多克隆抗体条带和质控羊抗兔IgG的条带；金标抗体保护膜，其中含有含有胶体金标记的A型肉毒毒素单克隆抗体。本实用新型试纸能够基于一份标本和一个试纸，快速方便地检测出标本中的A型肉毒毒素抗原，能够一次性的捕获出A型肉毒毒素，节省了大量人力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合流行病学调查，对A型肉毒毒素的感染诊断起到辅助作用。
文档编号G01N33/577GK201373876SQ200920105709
公开日2009年12月30日 申请日期2009年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者孙晓红, 张晓龙, 宇 杨, 静 王, 王景林, 谢士嘉 申请人:中国检验检疫科学研究院