专利名称：通过毛细管电泳分离蛋白质的方法和毛细管电泳用的缓冲组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过毛细管电泳分离蛋白质和肽的方法和用于这种分离的含一 种添加剂的缓冲组合物。
背景技术：
为了诊断目的而分析生物液如血清中的蛋白质，尤其是经常通过电泳，或者凝胶 电泳或者毛细管电泳，分离蛋白质。毛细管电泳的一个优点在于分析时仅需要微量的生物 液。而且，由于可以使用高电压，并且在分离期间样品不用加热到太高温度，因此使用该技 术可以非常快速地进行分离。为了分离血液蛋白，常用碱性缓冲液进行毛细管电泳。通常，获得的蛋白质图谱含 有5或6种成分，即白蛋白成分、a工和a 2球蛋白成分、0球蛋白成分或^和日2球蛋白 成分、和Y球蛋白成分。可以借助于例如美国再授权专利US-Re-36011或欧洲专利EP_A_0518475中所述 的那些缓冲体系和技术使用毛细管电泳进行这种分离。然而，时至今日，通过毛细管电泳分离白蛋白和、球蛋白还不太令人满意。
发明内容
本申请人现已证实，提高分离，尤其是白蛋白/a工球蛋白分离，可以通过将一种添 加剂用于所述缓冲体系中实现，所述添加剂含有PH大于9的阴离子极和疏水部分。这种添 加剂能够与一种或多种蛋白质组分疏水相互作用并且还能够使所述蛋白质组分具有1个 或多个负电荷并且能够改进电泳迁移率。因此，本发明涉及一种碱性pH、自由溶液毛细管电泳分析含蛋白质组分的样品的 方法，其中将所述样品加入到含有缓冲体系的毛细管中，所述缓冲体系还含有至少一种添 加剂，所述添加剂能够与一种或多种蛋白质组分疏水相互作用并且能够使所述蛋白质组分 具有1个或多个负电荷并且能够改进电泳迁移率。该步骤之后通过迁移分离蛋白质组分并 测定这些组分。本发明还涉及一种在缓冲体系中电泳分离含有白蛋白和以下成分a i、a2> 3 (或日工和日2)、和、球蛋白的样品中的蛋白质组分的方法，其中所述缓冲体系含有另外 一种添加剂，所述添加剂至少能够与所述白蛋白疏水相互作用。本发明还涉及一种通过碱性pH、自由溶液毛细管电泳进行电泳分离液体样品中的 蛋白质组分的方法，在该方法中将含有所述组分的样品通过含缓冲体系的毛细管，所述缓 冲体系还含有至少一种添加剂，所述添加剂是一种含有pH大于9的阴离子极和疏水部分的 化合物。
能够用作本发明毛细管电泳缓冲体系中的添加剂的化合物能够与白蛋白疏水相 互作用；这些化合物例如可以是阴离子表面活性剂如用于MECC(胶束动电毛细管色谱法) 中的那些，但是浓度低于其临界胶束浓度。在本发明中，我们以自由溶液CE使用这些化合 物通过白蛋白的疏水残基与这些化合物的疏水部分之间的疏水相互作用所述化合物使白 蛋白带负电荷，因此与其它蛋白质的迁移率相比白蛋白的迁移率降低。结果提高了从a工成 分中分离白蛋白。最后，本发明涉及用于毛细管电泳的电解组合物，所述组合物是在适宜载体中含 有至少一种缓冲液和一种能够与白蛋白疏水相互作用的添加剂。从这些实施例中将清楚地看到，使用本发明的添加剂使得白蛋白和a :球蛋白成 分的分离提高。与常规缓冲液相比还提高了这两种成分之间的基线返回。由参照附图和实施例的以下详细描述，本发明的其它特征和优点将显而易见。
图1显示了使用甘氨酸缓冲液通过毛细管电泳分析正常人血清的电泳图谱。图2显示了使用含有本发明添加剂的相同甘氨酸缓冲液通过毛细管电泳分析正 常人血清的电泳图谱。图3显示了使用硼酸盐缓冲液通过毛细管电泳分析正常人血清的电泳图谱。图4显示了使用含有本发明添加剂的相同硼酸盐缓冲液通过毛细管电泳分析正 常人血清的电泳图谱。图5显示了通过琼脂糖凝胶电泳获得的正常人血清的电泳图谱。图6显示了使用甘氨酸缓冲液通过毛细管电泳获得的来自急性炎性综合症患者 的血清的电泳图谱。图7显示了使用含有本发明添加剂的甘氨酸缓冲液通过毛细管电泳获得的来自 急性炎性综合症患者的血清的电泳图谱。图8显示了使用硼酸盐缓冲液通过毛细管电泳获得的来自急性炎性综合症患者 的血清的电泳图谱。图9显示了使用含有本发明添加剂的硼酸盐缓冲液通过毛细管电泳获得的来自 急性炎性综合症患者的血清的电泳图谱。图10显示了通过琼脂糖凝胶电泳获得的来自急性炎性综合症患者的血清的电泳 图谱。图11显示了相对于加入到硼酸盐缓冲液的不同碳链长度的烷基磺酸盐的a :球 蛋白成分和白蛋白成分的迁移率。可以引用的能够与白蛋白的疏水部分相互作用的本发明缓冲液的添加剂是含有 PH大于9的阴离子极和疏水部分的化合物。所述疏水部分可以由至少一个烷基链组成，它 可以经过支化或者可以不经支化，含有4-22个碳原子，尤其是4-20个碳原子，和/或至少 1-10个环的组合，所述环可以是芳香环或者可以不是芳香环。优选使用1-4个环的组合。 本领域技术人员将容易地理解，该疏水部分例如可以含有基本上不改变其疏水性能的残基 或官能团，例如一个或多个羟基或胺官能团。所述阴离子极可以由来自以下的一个或多个化学基团或官能团构成磺酸盐、羧
5酸盐、硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐。 尤其可以引用以下的胆酸盐型阴离子表面活性剂、C6_C22烷基单、二或三磺酸盐、 十四碳烯磺酸盐、萘磺酸盐、C6-C22烷基单、二或三羧酸盐、萘羧酸盐、C6-C22烷基羧基硫酸 盐、C4-C14烷基硫酸盐、苯磺酸盐、C4-C14烷基碳酸盐、苯甲酸盐和两性离子生物缓冲液。上述二和三羧酸盐、二和三磺酸盐与在羧基磺酸盐因此是一或多个羧酸根或磺酸 根官能团与C6-C22烷基链的组合形式。作为非限制性实例，可以列举含有3个羧酸根官能 团和一个C19链的1，2，3-十九烷三羧酸、含有一个羧酸根官能团一个磺酸根官能团和一个 C18链的2-甲基-2-磺基十八烷酸以及含有2个羧酸根官能团和一个C12链的1，12-十二 烷二羧酸。更确切地，可以列举选自C6-C22烷基单、二或三烷基磺酸盐的C6-Cltl烷基磺酸盐与 选自C6-C22烷基单、二或三羧酸盐的C6-C14烷基羧酸盐。在上面的名称中，烷基残基优选为直链。可以引用作为添加剂的具体的两性离子生物缓冲液是CAPS(3_环己基氨基-1-丙 磺酸)和CHES (2-(N-环己基氨基)乙磺酸)，但是也可以将其它两性离子生物缓冲液用于 本发明上下文中。按照本发明，其它两性离子生物缓冲液也适用于本发明。氨基酸缓冲液却不构成 本发明的一部分。上面引用的添加剂中优选是C6-Cltl烷基磺酸盐，并且C6-Cltl烷基磺酸盐中优选辛 磺酸盐。这些化合物本身为已知并且可以商购获得。它们可以是酸或盐形式。术语“本发明的样品”意思是待分析的生物样品，例如用适宜的稀释溶液或缓冲体 系稀释过，或者是纯的。分析用的样品可以是来自健康人或患者的任何生物液体。人生物液可以是正常或 异常血清，并且还可以是溶血的血清、血浆、尿、或者脑脊液。除了人生物样品之外，还可以 分析动物源的样品。样品也可以是合成蛋白质，并且例如本发明的方法计划用于生产对照。本发明的添加剂具体用于分析血清，并用于分离来自人的样品中的血液蛋白。在血样中，待分离的血液蛋白主要是白蛋白和αι、α2、β (或^^和02)、和Y球 蛋白成分。所述缓冲体系可以是适用于所需分离的任何已知缓冲体系，用于一般电泳并且具 体地说是毛细管电泳。可以引用的实例是硼酸盐、磷酸盐和碳酸盐缓冲液、以氨基酸为基础 的缓冲液和已知为生物缓冲液的缓冲液。可以引用的生物缓冲液的实例是如下已知的那些双-TRIS(2_ 二 [2-羟基乙基] 氨基-2-羟基甲基-1，3-丙二醇)、ADA (N- [2-乙酰氨基]_2_亚氨二醋酸),ACES (2- [2-乙 酰氨基]-2-氨基乙磺酸)、PIPES (1，4-哌嗪二乙磺酸)、MOPSO (3-[N-吗啉基]_2_羟基 丙磺酸)、双-TRIS PR0PANE(1，3-二 [三(羟基甲基)甲基氨基丙烷])、BES(N，N-二 [2-羟基乙基]-2-氨基乙磺酸)、M0PS (3- [N-吗啉基]丙磺酸)、TES (2- [2-羟基-1，1- 二 (羟基甲基)乙基氨基]乙磺酸)、HEPES (N-[2-羟基乙基]哌嗪-N' _(2_乙磺)酸)、 DIPSO(3-N, N-二 [2-羟基乙基]氨基_2_羟基丙磺酸)、M0BS(4_N_吗啉基丁磺酸)、 TAPSO (3 [N-三-羟基甲基-甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)、TRIS (2-氨基-2-[羟基甲基]_1，3-丙二醇)、HEPPSO(N-[2-羟基乙基]哌嗪-N' -[2-羟基丙磺]酸)、POPSO(哌嗪-N， N' -二 [2-羟基丙磺]酸)、TEA(三乙胺)、EPPS(N-[2-羟基乙基]-哌嗪-N' _[3_丙 磺]酸)、TRICINE(N-三[羟基甲基]甲基甘氨酸)、61^-61^(二甘氨酸)、81(1服(队^二 [2-羟基乙基]甘氨酸)、HEPBS (N-[2-羟基乙基]哌嗪-N' _[4_ 丁磺]酸)、TAPS(N_三 [羟基甲基]甲基-3-氨基丙磺酸)、AMPD (2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)、TABS (N-三 [羟基甲基]甲基-4-氨基丁磺酸)、AMPS0(3-[(1，1-二甲基-2-羟基乙基)氨基]_2_羟 基丙磺酸)、CHES (2-(N-环己基氨基)乙磺酸)、CAPSO (3-[环己基氨基]_2_羟基-1-丙磺 酸)、AMP (2-氨基-2-甲基-1-丙醇)、CAPS (3-环己基氨基-1-丙磺酸)和CABS (4-[环己 基氨基]-I- 丁磺酸)，优选 AMPD、TABS、AMPSO、CHES、CAPSO、AMP、CAPS 或 CABS。含有所述添加剂的生物液体的缓冲体系中的pH可以是2-12。然而，就碱性pH毛细管电泳而言，其PH是8-12，优选9-11，更优选是约10。本发明的缓冲体系也可以含有至少一种pH调节化合物。所述pH调节化合物可以 是选自以下的化合物氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铷、氢氧化铯、氢氧化钫、或在 烷基部分中含有1-8个碳原子的氢氧化一、二、三或四烷基铵。根据本发明，所述生物缓冲液在常规条件下以缓冲体系的浓度级别为10_500mM， 优选20-400mM下使用。本发明的添加剂以0. lmM-500mM的浓度使用，然而不超过其在缓冲体系中的临界
胶束浓度。临界胶束浓度的值可用于为表面活性剂的添加剂。当使用辛磺酸盐时，其在缓冲液中的浓度是l_5mM，优选l_4mM，更优选其浓度是 约 2. 5mM。在本发明的方法中，缓冲体系也可以含有硫酸钠。本发明的缓冲组合物是以制备缓冲体系组合物时为正常的方式下制备的，即通过 将这些组分以液体形式加入，或者作为待稀释的固体加入到可接收的载体中。通常，所述载 体是经过蒸馏的或者经过软化的水。用于毛细管的材料是日常用于毛细管电泳的那些。可以使用内径为5-2000μπι的 熔融二氧化硅毛细管。优选使用内径低于200 μ m，更优选低于100 μ m的毛细管。优选使用 内表面未处理过的毛细管。熟练人员能够使用与分析需要相适应的毛细管的性能和大小。
具体实施例方式材料和方法A)毛细管电泳(方法A)使用配备有内径为25 μ m的熔融二氧化硅毛细管的CE设备对临床样品进行毛细 管电泳。在200nm下进行测定。将这些样品放置在设备的样品交换器中并通过液体动力注 射自动注射(50mbar，7秒钟)。在10分钟内通过施加约400V/cm的电场将样品分离。在每 次分析之前将毛细管用0. 5M氢氧化钠洗涤，然后用缓冲体系洗涤。缓冲体系使用分析级化学物质。150mM甘氨酸缓冲液是通过将11. 26g的甘氨酸(摩尔质量75. 07g/mol)溶于1升(1)软化水中制备的。最终浓度是150mM并通过加入氢氧化钠颗粒(摩尔质量40. Og/mol) 将其pH调整至10.0。150mM硼酸盐缓冲液是通过将9. 3g的硼酸(摩尔质量61. 83g/mol)溶于1升软化 水和5. lg的氢氧化钠(摩尔质量40. Og/mol)中制备的。最终浓度是150mM并且其pH是 10. 0。B)琼脂糖凝胶电泳(方法B)使用琼脂糖凝胶进行血液蛋白质的对比分析。将10iU血清载入欧洲专利 EP-A-0493996、US-A-5464515和US-A-5405516中所述膜敷料器的每一孔中。然后将负荷 的敷料器施加到琼脂糖凝胶的表面上持续30秒钟。在20W的功率下使用能够将温度调节 到20°C的仪器将涂敷到该琼脂糖凝胶上的样品通过电泳分离约7. 5分钟。迁移之后，将凝 胶干燥并用酸性黑染色。染色之后，将凝胶脱色并且再次干燥。然后通过测光密度术分析 这些凝胶以产生蛋白质图谱。C)临床样品就该CE而言，在缓冲体系中将人血清稀释至1/10倍。实施例1(对比)如上所述制备甘氨酸缓冲体系。分析正常血清。使用上面的方法A进行电泳。从图1可以看出，获得的电泳图谱呈现5个连续峰，从左至右读取分别属于Y、3、 a2> a工球蛋白和白蛋白成分。实施例2将辛磺酸盐以2. 5mM的浓度加入到实施例1的缓冲体系中。如实施例1中所述进行电泳。从图2可以看出，获得的电泳图谱呈现5个连续峰，分别属于Y、0、a 2、a工球蛋 白和白蛋白成分。与实施例1的结果比较后显示在两个成分_a工球蛋白和白蛋白之间的 分离大大提高，并且向基线的返回提高。实施例3 (对比)按照实施例1的步骤，缓冲体系是如上所述制备的硼酸盐缓冲液。如实施例1所述进行电泳。从图3可以看出，获得的电泳图谱呈现6个连续峰，分别属于Y、日2、f^、a2、ai 球蛋白和白蛋白成分。实施例4将辛磺酸盐以2. 5mM的浓度加入到实施例4的缓冲体系中。如实施例1中所述进行电泳。从图4可以看出，获得的电泳图谱呈现6个连续峰，分别属于Y、日2、f^、a2、ai 球蛋白和白蛋白成分。在两个成分工球蛋白和白蛋白之间的分离大大提高，并且向基线 的返回提高。实施例5 (对比)图5的电泳图谱是使用上面的方法B通过分析与前面实施例中相同的血清获得 的。与实施例2和4中获得的结果比较后显示，这些实施可以产生大体上与用琼脂糖凝胶获得的分辨率相类似的分辨率。实施例6 (对比)制备150mM甘氨酸缓冲体系。对具有高a工和a 2球蛋白含量的血清进行分析。如实施例1中所述进行电泳。从图6可以看出，获得的电泳图谱呈现5个连续峰，分别属于Y、0、a 2、a工球蛋 白和白蛋白成分。实施例7将辛磺酸盐以2. 5mM的浓度加入到实施例7的缓冲体系中。如实施例6中所述进行电泳。从图7可以看出，获得的电泳图谱呈现5个连续峰，分别属于Y、0、a 2、a工球蛋 白和白蛋白成分。与实施例6的结果比较显示，在两个成分-a工球蛋白和白蛋白之间的分 离大大提高，并且向基线的返回提高。实施例8 (对比) 按照实施例6的步骤，缓冲液是150mM硼酸盐缓冲液。如实施例6所述进行电泳。从图8可以看出，获得的电泳图谱呈现6个连续峰，分别属于Y、日2、^^、a2、ai 球蛋白和白蛋白成分。实施例9将辛磺酸盐以2. 5mM的浓度加入到实施例8的缓冲体系中。如实施例6中所述进行电泳。从图9可以看出，在相同条件下获得的电泳图谱呈现6个连续峰，分别属于、、 旦2、0i、a2、a工球蛋白和白蛋白成分。在两个成分-a工球蛋白和白蛋白之间的分离大大 提高，并且向基线的返回提高。所述a工成分可以看到是由2个峰组成的，其中一个相应于 血清类粘蛋白，并且在没有辛磺酸盐的情况下与白蛋白峰合并。实施例10 (对比)图10的电泳图谱是使用上面的方法B通过分析与实施例6-9中相同的血清获得 的。与实施例7和9中获得的结果比较后显示，这些实施可以产生大体上与用琼脂糖凝胶 获得的分辨率类似的分辨率。实施例11球蛋白和白蛋白的比较的迁移率(nm1)是使用上面的方法A在pH为10的硼 酸盐缓冲液(150mM)中测定的。将烷基链长度(n)增加的烷基磺酸盐(n代表4、6、8和10， 分别相应于C4、C6、C8和C1(l，并且n = 0相应于缓冲液中没有烷基磺酸盐)以2. 5mM的浓度 加入硼酸盐缓冲液中。计算a工成分和白蛋白成分的迁移率并显示在图11的图形上。超 过C6链可以看到，与ai成分( )相比白蛋白(■)的迁移率大大下降。
权利要求
一种碱性pH、自由溶液毛细管电泳分析含蛋白质组分的样品的方法，其特征在于它包括至少一个步骤，其中将所述生物样品加入到含有分析缓冲体系的毛细管中，所述分析缓冲体系还含有至少一种添加剂，所述添加剂能够与一种或多种蛋白质组分疏水相互作用并且能够使所述蛋白质组分具有1个或多个负电荷并且能够改进电泳迁移率，所述添加剂在缓冲液中的浓度是0.1mM-500mM，如果适当的话不超过所述添加剂在所述缓冲液中的临界胶束浓度，所述分析缓冲体系的pH是9-11。
2.如权利要求1的方法，其特征在于它还包括通过迁移分离蛋白质组分并测定这些组分。
3.如权利要求1-2中任一项的方法，其特征在于所述样品是血清、溶血的血液、血浆、 尿或脑脊液。
4.如权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于所述组分是血清蛋白。
5.如权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于所述组分是白蛋白和ai、a2、0(或 ^和和Y球蛋白成分。
6.如权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于所述添加剂含有pH大于9的阴离子极 和疏水部分，所述疏水部分由至少一个含有4-20个碳原子的支链或非支链烷基链，和/或 至少一种1-10个环的组合组成，所述环可以是芳香环或者可以不是芳香环，所述阴离子极 由来自以下的一个或多个基团构成磺酸根、羧酸根、硫酸根、磷酸根和碳酸根。
7.如权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于所述添加剂选自胆酸盐型阴离子表 面活性剂、C6-C10烷基磺酸盐、十四碳烯磺酸盐、萘磺酸盐、C6-C14烷基羧酸盐、萘羧酸盐、 c4-c14烷基硫酸盐、c4-c14烷基碳酸盐、苯磺酸盐和苯甲酸盐。
8.如权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于所述添加剂是C6-C1(l烷基磺酸盐。
9.如权利要求1-8中任一项的方法，其特征在于所述添加剂是辛磺酸盐。
10.如权利要求1-9中任一项的方法，其特征在于所述添加剂在所述缓冲液中的浓度 是 l-5mMo
11.如权利要求1-10中任一项的方法，其特征在于所述添加剂在所述缓冲液中的浓度 约为2. 5mM。
12.如权利要求1-11中任一项的方法，其特征在于所述毛细管是熔融二氧化硅。
13.如权利要求1-12中任一项的方法，其特征在于所述分析缓冲体系还含有至少一种 pH调节剂。
14.如权利要求1-13任一项的方法，其特征在于所述分析缓冲体系还含有硫酸钠。
15.一种用于毛细管电泳的电解组合物，其特征在于它是在适宜载体中含有至少一种 缓冲液和至少一种能够与白蛋白疏水相互作用的添加剂。
16.一种用于毛细管电泳的组合物，其特征在于它含有至少一种缓冲体系和添加剂，所 述添加剂含有一疏水部分和阴离子极，所述疏水部分由至少一个含有4-20个碳原子的支 链或非支链烷基链和/或至少一种1-10个环的组合组成，所述环可以是芳香环或者可以不 是芳香环，所述阴离子极由来自以下的一个或多个基团构成磺酸根、羧酸根、硫酸根、磷酸 根和碳酸根，所述添加剂选自胆酸盐型阴离子表面活性剂、C6-C1(l烷基磺酸盐、十四碳烯磺 酸盐、萘磺酸盐、C6-C14烷基羧酸盐、萘羧酸盐、C4-C14烷基硫酸盐、C4-C14烷基碳酸盐、苯磺酸 盐和苯甲酸盐。
17.如权利要求15或16的组合物，其特征在于所述添加剂是C6-C1(l烷基磺酸盐。
18.如权利要求15-17中任一项的组合物，其特征在于所述添加剂是辛磺酸盐。
全文摘要
本发明涉及通过毛细管电泳分离蛋白质的方法和毛细管电泳用的缓冲组合物。本发明涉及一种碱性pH、自由溶液毛细管电泳分析含蛋白质组分的生物样品的方法。所述方法其特征在于它包括至少一个步骤，其中将所述样品加入到含有分析缓冲液的毛细管中，所述分析缓冲液还含有至少一种添加剂，所述添加剂能够与一种或多种蛋白质组分疏水相互作用并且能够使所述蛋白质组分具有1个或多个负电荷并且能够改进其电泳迁移率。本发明还涉及用于进行这种方法的分析缓冲液组合物。
文档编号G01N27/447GK101799448SQ201010129950
公开日2010年8月11日 申请日期2002年1月18日 优先权日2001年1月19日
发明者F·罗伯特, G·诺瓦德耶 申请人:莎碧亚公司